CN101434645B - 一种合成寡肽及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含有三个氨基酸的合成寡肽,其序列中间为半胱氨酸,一端为谷氨酸或甘氨酸,另一端为具有抗逆作用的氨基酸脯氨酸或γ-氨基丁酸,其功能与谷胱甘肽类似,能够在离体条件下清除1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基,提高盐胁迫下鱼腥藻和烟草细胞的抗氧化能力和氧化酶活性,提高小麦幼苗的抗热性。
Description
技术领域
本发明属于农业技术领域,本发明涉及模拟谷胱甘肽结构,合成的新的具有抗氧化活性的寡肽,本发明还涉及这些寡肽物质的体外抗氧化效应、提高细胞抗氧化能力以及提高小麦幼苗的抗热性。
背景技术
生物体在正常生理条件下,体内活性氧自由基(ROS)的产生和清除相对均衡,而在遭受各种生物和非生物逆境胁迫时,体内的ROS的产生和清除平衡遭到破坏(王丰等,高等学校化学学报,2007,28:1071~1076),造成氧负离子(·O2-)和过氧化氢(H2O2)等ROS的大量积累,引发蛋白质、核酸和脂类的氧化损伤。
谷胱甘肽(GSH)是植物体内一种非常重要的抗氧化肽,参与植物对多种逆境的抵抗过程。它能够直接和间接地清除ROS,使细胞免受ROS以及各种有害物质的毒害,具有抵抗逆境和解毒的作用,已被广泛用于医疗保健方面(陈坤明等,西北植物学报,2004,24:1119~1130)。有研究表明,外源施加GSH能够提高逆境胁迫下植物内源抗氧化酶的活性和抗氧化物物质的水平,降低丙二醛(MDA)的含量,保护植物免受活性氧的伤害(刘传平等,南京农业大学学报,2004,27:26~30)。但是由于植物体内存在GSH的代谢途径,效应浓度和成本较高,目前尚难在农业生产中大面积应用。
在逆境胁迫条件下,植物体内还会积累一些与抗逆相关的氨基酸,如脯氨酸(Pro)、甘氨酸(Gly)、γ-氨基丁酸(GABA)等,它们有些可以作为渗透调解物质,有些可以作为信号物质,参与植物抵抗逆境的过程。也有报道表明,在外源施加某些氨基酸时,也能够提高植物对逆境胁迫的抵抗能力(贺岩等,大豆科学,2000,19(4):314~319;王宝山等,植物生理学通讯,1993,29(3):182~184;高洪波等,植物生理与分子生物学学报,2004,30(6):651~659;田小磊等,实验生物学报,2005,38(1):75~79)。
本发明通过模拟GSH的结构,将一些与逆境相关的氨基酸重新组合,合成新的具有抗氧化活性寡肽。本发明对于现有的发明专利具有两点明确的优势:其一,相对于植物生长调节剂来说,合成的寡肽来源的氨基酸均为生物体内天然存在的氨基酸,对人体不存在任何毒性,处理作物后不存在残毒残效;其二,相对于GSH外源施加,合成的寡肽物质不是植物体内本身存在的物质,因此不易被植物所专一的降解,能在极低的使用浓度发挥高效的生物活性,能超过GSH的抵抗逆境功能。
模拟GSH的结构,将一些与逆境相关的氨基酸重新组合,合成一些新的寡肽可能也具有抗氧化活性,而且由于是非天然物质而不易被植物所专一的降解。有关人工合成GSH类似物的抗氧活性的研究未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供新的寡肽物质,能有效缓解逆境胁迫对细胞的抑制生长,增强细胞抵抗逆境胁迫的能力。
本发明人充分研究谷胱甘肽与其它氨基酸的抵抗逆境性能,模拟谷胱甘肽结构合成类似寡肽,完成了本发明。
本发明提供的寡肽含有三个氨基酸,序列中间为半胱氨酸,一端为谷氨酸或甘氨酸,另一端为具有抗逆作用的其他氨基酸脯氨酸或γ-氨基丁酸。
本发明的合成寡肽包括但不限于:谷氨酰-半胱氨酰-γ-氨基丁酸(Glu-Cys-GABA)、γ-氨基丁酰-半胱氨酰-谷氨酸(GABA-Cys-Glu)、脯氨酰-半胱氨酰-甘氨酸(Pro-Cys-Gly)以及甘氨酰-半胱氨酰-脯氨酸(Gly-Cys-Pro)。
实验表明,本发明提供的合成寡肽其对DPPH的体外清除率显著高于游离氨基酸的组合,也显著高于谷胱甘肽本身,其中谷氨酰-半胱氨酰-γ-氨基丁酸(Glu-Cys-GABA)对DPPH的体外清除效果尤其好。
在本发明的一个实施例中,合成寡肽提高了盐胁迫下鱼腥藻7120细胞抗氧化能力;另一个实施例中,合成寡肽提高了盐胁迫下烟草BY-2细胞的抗氧化能力;另一个实施例中,合成寡肽提高了盐胁迫下烟草BY-2细胞系抗氧化酶活性;再一个实施例中,合成寡肽提高了小麦幼苗的抗热性。由此可见,由于合成寡肽具有清除自由基和抗逆的作用,其能提高在盐胁迫下植物细胞的抗氧化能力和氧化酶活性。
本发明的优点在于:(1)发明制备了未见报道的具有增强植物细胞和幼苗在盐胁迫和高温胁迫条件下抗氧化能力的寡肽;(2)发明制备的寡肽较其它常规的植物生长调节剂有更高的安全性和生理效应;(3)发明制备的寡肽生理活性高效、稳定,有理论支持(GSH结构类似物);相对与GSH而言,又不容易被植物所代谢降解,提高了其在植物体内的稳定性和高效活性;(4)发明制备的寡肽结合了一些与逆境相关的氨基酸,如脯氨酸(Pro)、γ-氨基丁酸(GABA)等,发明的新寡肽比GSH有更高的生物活性。
附图说明
图1是寡肽谷氨酰-半胱氨酰-γ-氨基丁酸的质谱图;
图2是寡肽谷氨酰-半胱氨酰-γ-氨基丁酸高效液相色谱图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1:寡肽谷氨酰-半胱氨酰-γ-氨基丁酸的制备
称取2克2-氯三苯甲基氯树脂,加入20毫升N-甲基吡咯烷酮溶胀树脂2小时后排净液体;加入二氯甲烷20毫升,混匀1分钟,清空反应器,再加入N-甲基吡咯烷酮20毫升,混匀1分钟,清空反应器,重复2次;称取2克9-芴甲氧羰基γ-氨基丁酸,用5毫升N-甲基吡咯烷酮溶解并转移至反应器,加入40微升3M的二异丙基乙胺,混匀后加入反应器,再加入15毫升N-甲基吡咯烷酮反应2小时。清空反应器,加入二氯甲烷20毫升,混匀1分钟,清空反应器,再加入N-甲基吡咯烷酮20毫升,混匀1分钟,清空反应器,重复2次。取样检测。
加入20%六氢吡啶20毫升,反应30分钟后清空反应器,再加入20%六氢吡啶20毫升,反应30分钟后清空,加入二氯甲烷20毫升,混匀1分钟,清空反应器,再加入N-甲基吡咯烷酮20毫升,混匀1分钟,清空反应器,重复2次;称取2克9-芴甲氧羰基半胱氨酸,用5毫升N-甲基吡咯烷酮溶解,加入40微升3M的二异丙基乙胺,混匀后加入反应器,再加入15毫升N-甲基吡咯烷酮反应2小时。清空反应器,加入二氯甲烷20毫升,混匀1分钟,清空反应器,再加入N-甲基吡咯烷酮20毫升,混匀1分钟,清空反应器,重复2次。取样检测。
加入20%六氢吡啶20毫升,反应30分钟后清空反应器,再加入20%六氢吡啶20毫升,反应30分钟后清空,加入二氯甲烷20毫升,混匀1分钟,清空反应器,再加入N-甲基吡咯烷酮20毫升,混匀1分钟,清空反应器,重复2次;称取2克9-芴甲氧羰基谷氨酸,用5毫升N-甲基吡咯烷酮溶解,加入40微升3M的二异丙基乙胺,混匀后加入反应器,再加入15毫升N-甲基吡咯烷酮反应2小时。清空反应器,加入二氯甲烷20毫升,混匀1分钟,清空反应器,再加入N-甲基吡咯烷酮20毫升,混匀1分钟,清空反应器,重复2次。取样检测。
加入20%六氢吡啶20毫升,反应30分钟后清空反应器,再加入20%六氢吡啶20毫升,反应30分钟后清空,加入二氯甲烷20毫升,混匀1分钟,清空反应器,再加入N-甲基吡咯烷酮20毫升,混匀1分钟,清空反应器,重复2次。加入切割液三氟乙酸,反应4小时,过沙芯漏斗过滤,收集滤液,用冰乙醚离心沉淀,冻干即得目标寡肽产物。产物用质谱和高效液相色谱进行确证与含量测定。
合成寡肽的质谱和液相色谱检测图谱见附图1和附图2。质谱分析数据表明所合成产物即为目标寡肽谷氨酰-半胱氨酰-γ-氨基丁酸,实测合成产物分子量为334.43(M+H+),与理论值分子量333.39接近。高效液相色谱的分析数据表明,合成寡肽的纯度为99.36%。
寡肽γ-氨基丁酰-半胱氨酰-谷氨酸的制备步骤与上述谷氨酰-半胱氨酰-γ-氨基丁酸的步骤类似。产物经上述液相色谱和质谱分析验证为目标寡肽。
寡肽甘氨酰-半胱氨酰-谷氨酸、寡肽谷氨酰-半胱氨酰-甘氨酸的制备步骤与上述谷氨酰-半胱氨酰-γ-氨基丁酸、γ-氨基丁酰-半胱氨酰-谷氨酸的步骤类似。产物经上述液相色谱和质谱分析验证为目标寡肽。
实施例2:寡肽脯氨酰-半胱氨酰-甘氨酸(Pro-Cys-Gly)的制备
称取2克2-氯三苯甲基氯树脂,加入20毫升N-甲基吡咯烷酮溶胀树脂2小时后排净液体;加入二氯甲烷20毫升,混匀1分钟,清空反应器,再加入N-甲基吡咯烷酮20毫升,混匀1分钟,清空反应器,重复2次;称取2克9-芴甲氧羰基甘氨酸,用5毫升N-甲基吡咯烷酮溶解并转移至反应器,加入40微升3M的二异丙基乙胺,混匀后加入反应器,再加入15毫升N-甲基吡咯烷酮反应2小时。清空反应器,加入二氯甲烷20毫升,混匀1分钟,清空反应器,再加入N-甲基吡咯烷酮20毫升,混匀1分钟,清空反应器,重复2次。取样检测。
加入20%六氢吡啶20毫升,反应30分钟后清空反应器,再加入20%六氢吡啶20毫升,反应30分钟后清空,加入二氯甲烷20毫升,混匀1分钟,清空反应器,再加入N-甲基吡咯烷酮20毫升,混匀1分钟,清空反应器,重复2次;称取2克9-芴甲氧羰基半胱氨酸,用5毫升N-甲基吡咯烷酮溶解,加入40微升3M的二异丙基乙胺,混匀后加入反应器,再加入15毫升N-甲基吡咯烷酮反应2小时。清空反应器,加入二氯甲烷20毫升,混匀1分钟,清空反应器,再加入N-甲基吡咯烷酮20毫升,混匀1分钟,清空反应器,重复2次。取样检测。
加入20%六氢吡啶20毫升,反应30分钟后清空反应器,再加入20%六氢吡啶20毫升,反应30分钟后清空,加入二氯甲烷20毫升,混匀1分钟,清空反应器,再加入N-甲基吡咯烷酮20毫升,混匀1分钟,清空反应器,重复2次;称取2克9-芴甲氧羰基脯氨酸,用5毫升N-甲基吡咯烷酮溶解,加入40微升3M的二异丙基乙胺,混匀后加入反应器,再加入15毫升N-甲基吡咯烷酮反应2小时。清空反应器,加入二氯甲烷20毫升,混匀1分钟,清空反应器,再加入N-甲基吡咯烷酮20毫升,混匀1分钟,清空反应器,重复2次。取样检测。
加入20%六氢吡啶20毫升,反应30分钟后清空反应器,再加入20%六氢吡啶20毫升,反应30分钟后清空,加入二氯甲烷20毫升,混匀1分钟,清空反应器,再加入N-甲基吡咯烷酮20毫升,混匀1分钟,清空反应器,重复2次。加入切割液三氟乙酸,反应4小时,过沙芯漏斗过滤,收集滤液,用冰乙醚离心沉淀,冻干即得目标寡肽产物。产物用质谱和高效液相色谱进行确证与纯度测定(方法同谷氨酰-半胱氨酰-γ-氨基丁酸)。
寡肽甘氨酰-半胱氨酰-脯氨酸的制备步骤与上述脯氨酰-半胱氨酰-甘氨酸的步骤类似。产物经上述液相色谱和质谱分析验证为目标寡肽。
寡肽脯氨酸-半胱氨酰-γ-氨基丁酸、寡肽γ-氨基丁酰-半胱氨酰-脯氨酸的制备步骤与上述脯氨酰-半胱氨酰-甘氨酸、甘氨酰-半胱氨酰-脯氨酸的步骤类似。产物经上述液相色谱和质谱分析验证为目标寡肽。
实施例3:合成寡肽对离体条件下自由基的清除
1、实验方法
寡肽对离体条件下自由基的清除通过对1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基的清除率进行评价:将寡肽配置成0.2m mol/L溶液,与DPPH乙醇溶液混合反应30分钟,用CARY 100紫外可见分光光度计(CARY 100Bio UV-visible spectrophotometer,美国VARIAN公司生产)在517nm波长下测定吸光值,以乙酸缓冲液作为空白,以GSH作为阳性对照。寡肽对DPPH的体外清除率用以下公式计算:
各样品重复5次,取平均值。
2、实验结果
八种合成寡肽对有机自由基DPPH的体外清除率优于阳性对照GSH;合成寡肽的组成氨基酸组合施用以及氨基酸Cys也具有体外清除DPPH的作用,但显著低于合成寡肽与阳性对照GSH。
表1合成寡肽对DPPH的体外清除
实施例4:合成寡肽提高盐胁迫下鱼腥藻7120细胞抗氧化能力
1、实验方法
用BG-11培养基,2%鱼腥藻7120(购自华中农业大学)接种于50mL三角瓶中,25℃光照静置培养并定时摇动。继代时用0.2mmol/L的合成寡肽进行处理;培养2天后用100m mol/L NaCl处理,3天后进行取样测定细胞生长量、细胞提取液对DPPH的清除率以及细胞内氧负离子(·O2-)的产生速率和过氧化氢(H2O2)的含量。细胞生长量用OD750表示,用CARY 100紫外可见分光光度计(CARY 100 BioUV-visible spectrophotometer,美国VARIAN公司生产)测定。·O2-和H2O2测定按照Verma S.和Mishra S.N.的方法(Jouurnal of PlantPhysiology,2005年,162卷,669-677页)。以GSH作为阳性对照。各样品作5个平行重复,取平均值。
2、实验结果
盐胁迫显著抑制了鱼腥藻的生长,降低了细胞的抗氧化水平;盐胁迫下八种合成寡肽处理均促进了鱼腥藻的生长,对DPPH的清除率显著提高,而·O2-的产生速率和H2O2的含量均明显降低。结果表明,八种合成多肽显著提高盐胁迫下鱼腥藻7120的抗氧化能力。
表2合成寡肽对鱼腥藻7120抗氧化能力的影响
实施例5:合成寡肽提高盐胁迫下烟草BY-2细胞的抗氧化能力
1、实验方法
用改良的LS培养基,5%烟草BY-2细胞(购自中国农业大学植物生理与生物化学国家重点实验室)接种于50mL三角瓶中,27℃130r min-1避光震荡培养。继代时用0.2m mol/L的合成寡肽进行处理;培养2天后用100m mol/L NaCl处理,3天后进行取样测定细胞鲜重、细胞提取液对DPPH的清除率以及细胞内氧负离子(·O2-)的产生速率和过氧化氢(H2O2)的含量。·O2-和H2O2测定按照Verma S.和Mishra S.N.的方法(Jouurnal of Plant Physiology,2005年,162卷,669-677页)。以GSH作为阳性对照。各样品作5个平行重复,取平均值。
2、实验结果
盐处理明显抑制了烟草细胞的生长,降低了细胞的抗氧化水平。盐胁迫下八种合成寡肽处理烟草细胞,其鲜重提高30%以上,细胞提取液对DPPH的清除率提高23%以上,·O2-的产生速率和H2O2的含量也显著降低。结果表明,合成多肽能显著的提高盐胁迫下烟草BY-2细胞的抗氧化能力。
表3合成寡肽对烟草BY-2细胞抗氧化能力的影响
实施例6:合成寡肽提高盐胁迫下烟草BY-2细胞系抗氧化酶活性
1、实验方法
供试材料与培养、处理方法同实施例4。收集烟草细胞,加入50m mol L-1pH=7.0磷酸缓冲液,在冰浴上研磨提取,12,000g离心15min,取上清液备用。测定SOD、CAT和POD的活性。·O2-测定按照Verma S.和Mishra S.N.的方法(Jouurnal of Plant Physiology,2005年,162卷,669-677页)。SOD、POD、CAT活性测定方法和具体操作见邹琦等主编的植物生理学实验指导(中国农业出版社,2000年)。
2、实验结果
盐胁迫明显提高了烟草细胞的SOD活性,而POD和CAT的活性则降低。盐胁迫下八种寡肽处理的烟草细胞SOD和POD的活性显著提高,使细胞的抗氧化能力提高。
表4合成寡肽对烟草BY-2细胞抗氧化酶活性的影响
实施例7:合成寡肽提高小麦幼苗的抗热性
1、实验方法
供试小麦品种为京都40,购自中国农业科学院国家农作物种质保存中心,将表面消毒的种子培养于装有蛭石∶花土为1∶1的塑料花盆(长×宽×高=8cm×8cm×10cm)中,25℃下培养。当小麦苗龄7天时,用0.2m mol/L的合成寡肽对小麦叶片进行涂抹处理,以GSH作为阳性对照。两天后进行高温胁迫处理,白天(14小时,光强5000Lux)40℃/晚上(10小时)30℃。48小时后取样,测定小麦叶片·O2-产生速率和抗氧化酶SOD、POD、CAT的活性。·O2-测定按照Verma S.和Mishra S.N.的方法(Jouurnal of Plant Physiology,2005年,162卷,669-677页)。SOD、POD、CAT活性测定方法和具体操作见邹琦等主编的植物生理学实验指导(中国农业出版社,2000年)。
2、实验结果
高温胁迫使小麦叶片中·O2-的产生速率显著加快。八种寡肽处理均显著的降低了高温胁迫下小麦叶片中·O2-的产生速率,效果与GSH相当。八种合成寡肽处理提高了高温胁迫下SOD、POD和CAT的活性,增强了小麦幼苗在高温胁迫下的抗氧化能力。
表5合成寡肽对高温胁迫下小麦叶片氧自由基产生速率和抗氧化酶活性的影响
Claims (4)
1.合成寡肽在离体条件下清除活性氧自由基DPPH中的应用,其特征在于,所述合成寡肽为谷氨酰-半胱氨酰-γ-氨基丁酸。
2.合成寡肽在提高盐胁迫下植物细胞的抗氧化能力和/或活性氧清除酶活性中的应用,其特征在于,所述合成寡肽为谷氨酰-半胱氨酰-γ-氨基丁酸。
3.如权利要求2所述的应用,其中所述植物为鱼腥藻或烟草。
4.合成寡肽在提高小麦幼苗抗热性中的应用,其特征在于,所述合成寡肽为谷氨酰-半胱氨酰-γ-氨基丁酸。
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