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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die direkte und selektive
Metallisierung von Nukleinsäuren über Metall-Nanopartikel,
die in-situ hergestellt werden, die bei der Bildung von Nanodrähten, für elektronische
Netzwerke und Schaltkreise verwendet werden können, was eine Anordnung mit
hoher Dichte ermöglicht.
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Die
elektronische Industrie zeigt ein konstantes Bemühen bei dem Erhalt von Leitungen
und Schaltkreisen mit hoher Dichte. Ein Schlüsselpunkt zur Erreichung dieses
Ziels ist es, die einzelnen Leitungen so klein wie möglich zu
machen. Ein im Stand der Technik bekannter Ansatz ist die Metallisierung von
Nukleinsäuren,
die, sobald metallisiert, als ein elektrisch leitender Draht dienen.
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Zusätzlich ist
die "Metallierung" von Nukleinsäuren bekannt,
die den Prozeß der
direkten Bindung zwischen einem Metallatom und einer Stelle innerhalb
der Nukleinsäure,
insbesondere an den N-7-Atomen der Purin-Nukleotide (G und A) betrifft. Solche
Reaktionen wurden aufgrund ihrer Relevanz für die Mechanismen von anti-Krebswirkstoffen,
am herkömmlichsten
bei Pt (II) oder Pt (IV)-Komplexen ("Platinierung") untersucht. Andere Metallkomplexe, die
dieses Verhalten zeigen, schließen
die Komplexe von Pd, Ru, Au, Rh ein. Der Komplex erfordert mindestens
einen "labilen" Liganden als eine "Abspaltungsgruppe", um auf diese Weise
zu binden.
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Weiterhin
wurden Nukleinsäure-bindende Mittel
als anti-Krebswirkstoffe großflächig untersucht. Nicht
kovalente Bindungsmittel schließen "Interkalatoren" und "Furchen-Binder" ein. Mittel, die
kovalent binden, werden im allgemeinen "Alkylatoren" genannt. Viele Beispiele dieser Klasse
von Mitteln sind bekannt, sowie Moleküle mit kombinierten Funktionen.
Die Selektivität
in Richtung spezifischer Basenpaarkombinationen oder Sequenzen oder
anderer "Erkennungsstellen" ist in einem hohen
Ausmaß einstellbar
(z.B. "Wirkstoff-Targeting").
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WO
99/04440, veröffentlicht
am 28. Januar 1999, beschreibt ein 3-Schritt-Verfahren für die Metallisierung
von DNA. Zuerst werden Silberionen (Ag+)
entlang der DNA durch Ag+/Na+ Ionenaustausch
und Bildung von Komplexen zwischen dem Ag+ und den DNA-Nukleotidbasen angeordnet.
Der Silberionen/DNA-Komplex wird dann unter der Verwendung einer
basischen Hydrochinonlösung
reduziert, um Silber-Nanopartikel zu bilden, die an das DNA-Gerüst gebunden
sind. Die Silber-Nanopartikel werden anschließend unter Verwendung einer
sauren Lösung
von Hydrochinon und Ag+ unter abgedunkelten
Bedingungen "entwickelt", ähnlich wie
photographische Standardverahren. Dieses Verfahren produziert Silberdrähte mit
einer Breite von ungefähr
100 nm mit einem differentiellen Widerstand von ungefähr 10 MΩ.
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Jedoch
erfüllen
eine Breite von 100 nm und insbesondere ein differentieller Widerstand
von ungefähr
10 MΩ von
Silberdrähten,
die gemäß dem in WO
99/04440 beschriebenen Verfahren hergestellt werden, nicht den Bedarf
der Industrie im Hinblick auf Leitungen mit hoher Dichte und Schaltkreisen
mit hoher Dichte.
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Das
in WO 99/04440 beschriebene Metallisierungsverfahren ist ähnlich zu
Verfahren zum Nachweis von DNA-Fragmenten mittels Silberfärbung. Von
solchen Verfahren ist bekannt, daß sie zu unspezifischer Färbung von
DNA-Fragmenten führen und
nicht zwischen verschiedene DNA-Sequenzen unterscheiden. Die Fähigkeit,
bestimmte Regionen des Nukleinsäurestranges
und nicht andere zu metallisieren, kann für die Entwicklung von DNA-basierten
nanoelektischen Vorrichtungen wichtig sein.
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Weiterhin
beschreiben Pompe et al. (Pompe et al. (1999) Z. Metallkd. 90, 1085;
Richter et al. (2000) Adv. Mater. 12, 507) DNA als ein Templat für die Metallisierung,
um metallische Nanodrähte
herzustellen. Ihr Metallisierungsverfahren schließt eine Behandlung
der DNA mit einer wäßrigen Lösung von Pd(CH3COO)2 für 2 Stunden
ein, dann Hinzufügen
einer Lösung
von Dimethylboran (DMAB) als reduzierendem Mittel. Paladium-Nanopartikel
mit einem Durchmesser von 3–5
nm wachsen innerhalb von ein paar Sekunden auf der DNA, nachdem
das reduzierende Mittel hinzugefügt
wurde. Nach ungefähr
1 Minute wird eine quasidurchgehende Bedeckung erreicht, wobei die
metallischen Aggregate in ihrer Größe 20 nm betragen.
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Die
Techniken der Nukleinsäuresynthese und
-modifikation waren Gegenstand von zahlreichen Publikationen. Insbesondere
sind diese Verfahren in den Büchern
Bioorganic Chemistry: Nucleic Acids (herausgegeben von S. M. Hecht,
Oxford University Press, 1996) und Bioconjugate Techniques (von
G. T. Hermanson, Academic Press, 1996) beschrieben. Genauer gesagt
beschreibt das Kapitel von M. van Cleve in Bioorganic Chemistry:
Nucleic Acids (Kapitel 3, Seiten 75–104) die Techniken von "Annealing" und "Ligation" zur Zusammenfügung von doppelsträngigen Nukleinsäuren aus
kleineren Einheiten. Das Kapitel von M. J. O'Donnell und L. W. McLaughlin in dem
selben Buch (Kapitel 8, Seiten 216–243) und ein Kapitel in Bioconjugate
Techniques (Kapitel 17, Seiten 639–671) beschreibt Verfahren
für die
chemische Modifikation von Nukleinsäuren und Oligonukleotiden und
die kovalente Anbringung von Reportergruppen (Fluorophoren, Zentrifugationsmarkern,
usw.). Diese Techniken wurden auch dazu verwendet, um Metallkomplexe
anzubringen, die zum Beispiel als redoxaktive Mittel und Katalysatoren
für die
Bindungsspaltung dienen, jedoch wurden sie nicht für Metallisierungszwecke
verwendet.
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Ein
Beispiel der chemischen Modifikation ist die "Bromaktivierung". Die Reaktion mit N-Bromsuccinimid bewirkt zum Beispiel
die Bromierung an der C-8-Position von Guaninresten und C-5 von
Cytosin (7). Amin-Nukleophile können dann
an diese Positionen durch nukleophilen Ersatz gekoppelt werden,
um verschiedene funktionelle Gruppen in die Nukleinsäuren einzuführen. Die
Stellen der Veränderung
unter Verwendung dieses Verfahrens sind nicht an der Wasserstoffbrückenbildung
während
der Basenpaarung beteiligt, daher werden die Hybridisierungseigenschaften
nicht wesentlich gestört.
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Die
zwei oben angegebenen Beispiele der DNA-Metallisierung des Standes
der Technik, sowie der vorliegenden Erfindung wenden ein Prinzip
an, das sowohl in der photographischen Filmentwicklung als auch
der elektrofreien Beschichtung vorhanden ist. Die Verfahren schließen zwei
Schritte ein: (1) Bildung von kleinen Metall-Nanopartikeln (oder
Clustern) und (2) Vergrößerung der
Partikel durch die elektrofreie Abscheidung von Metall, das Dasselbe oder
verschieden von dem Ersten sein kann. Die anfänglich gebildeten Partikel
dienen daher als Kernstellen für
die anschließende
Metallabscheidung.
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"Zwei-Schritt" elektrofreie Überziehungsverfahren
sind zum Beispiel aus
US 5,503,877 und
US 5,560,960 bekannt. Das
zu überziehende
Substrat wird zuerst gegenüber
einer Lösung
ausgesetzt, die Metallionenspezies enthält und dann gegenüber einer
Lösung
eines reduzie renden Mittels, das die Metallionenspezies zu einem
Metallkatalysator reduziert. Das katalytische Metall ist gewöhnlicherweise Pd,
kann aber auch mindestens eines von Pd, Cu, Ag, Au, Ni, Pt, Ru,
Rh, Os und Ir sein und wird gewöhnlicherweise
mit einem organischen Liganden kombiniert, der mindestens ein Stickstoffatom
enthält.
Das abgelagerte Metall kann magnetisch sein, z.B. Co, Ni, Fe und
Legierungen, die durch das reduzierende Mittel eingeführtes B
oder P enthalten können
(z.B. Borhydrid oder Hypophosphit, siehe
US 3,986,901 ;
US 4,177,253 ).
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Demzufolge
ist es die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe,
ein verbessertes Verfahren für
die direkte und selektive Metallisierung von Nukleinsäuren über Metall-Nanopartikel, die in-situ
hergestellt werden, die z.B. bei der Bildung von Nanodrähten, für elektronische
Netzwerke und Schaltkreise verwendet werden können, zur Verfügung zu
stellen, was eine Anordnung mit hoher Dichte ermöglicht.
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Diese
Aufgabe wird durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung
von Metall-Nanopartikel-Nukleinsäure-Kompositstrukturen
gelöst,
wobei ein Nukleinsäure-spezifischer
Metallkomplex mit einer Nukleinsäure
reagiert wird, um ein Metallkomplex-Nukleinsäure-Konjugat zu bilden, nicht-konjugierter
Metallkomplex und/oder nicht-konjugierte Nebenprodukte entfernt
werden, und das Metallkomplex-Nukleinsäure-Konjugat mit einem reduzierenden
Mittel reagiert wird, um eine Metall-Nanopartikel-Nukleinsäure-Kompositstruktur
herzustellen.
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Die
Erfindung stellt ein verbessertes Verfahren für die direkte und selektive
Metallisierung von Nukleinsäuren,
wie z. B. DNA, zur Verfügung.
Nach der Hinzufigung des Reduktionsmittels kann keine Clusterbildung
auf der DNA unter der Verwendung von AFM beobachtet werden. Dies
steht im Gegensatz zu dem durch Richter et al. beschriebenen Verfahren,
wobei unregelmäßige Cluster
auf der DNA gebildet werden, die eine minimale Größe von ungefähr demselben
Durchmesser der DNA selber aufweisen, was das unkontrollierte Wachstum
der Metallpartikel auf der DNA unter der Verwendung dieses Verfahrens
anzeigt. Die GoldEnhance®-Behandlung der DNA, die
gemäß der Erfindung
metallisiert wurde, zeigt weiter, daß die Metallisierung hauptsächlich auf die
DNA begrenzt ist und daher sehr eng ist. Nichtsdestotrotz kann die
metallisierte DNA immer noch für eine
elektrofreie Metallaufbringung verwendet werden, um Nanodrähte oder
andere Nanokomponenten herzustellen.
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Obwohl
das durch Pompe et al. beschriebene Metallisierungsverfahren einen
signifikanten Fortschritt über
das in WO 99/04440 darstellt, sind die anfänglich wachsenden Palladium-Nanopartikel nichtsdestotrotz
wesentlich breiter als die DNA selber (ca. 2 nm für doppelsträngige DNA).
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Mittel zur Herstellung
von Platin-Nanopartikeln
auf doppelsträngiger
DNA, die nicht breiter als die DNA sind; diese Partikel sind katalytisch
gegenüber
elektrofreier Abscheidung von Gold und können dadurch auf eine kontrollierte
Weise vergrößert werden.
Im Unterschied zu auch dem Verfahren von Pompe et al. ist die Sub-Nanometergröße der Platinpartikel
in der Nanopartikel/DNA-Kompositstruktur wie hergestellt gemäß der vorliegenden
Erfindung über
die Zeit hinweg stabil, mindestens für Wochen oder Monate. Daher
kann eine einzelne Präparation
der Kompositstruktur für,
z. B., die Nanodrahtproduktion zu verschiedenen Zeiten unter verschiedenen
Bedingungen verwendet werden. Weiterhin erweitert die vorliegende
Erfindung die Möglichkeiten
für Metallisierungen
von vorherdefinierten Stellen oder Segmenten innerhalb von Nukleinsäuren durch
ein zur Verfügung
stellen von verschiedenen Typen von Nanopartikel-Vorläufern und
-Mitteln, um diese an Nukleinsäuren
zu binden.
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Gemäß der Erfindung
kann die Nukleinsäurekomponente
gelöst
in einer Lösung,
immobilisiert auf einem Substrat oder in einem semi-festen Zustand,
z.B. in einem Gel, reagiert werden.
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Die
Nukleinsäure
für die
Metallisierung kann ausgewählt
sein aus DNA, RNA, PNA, CNA, Oligonukleotiden, Oligonukleotiden
von DNA, Oligonukleotiden von RNA, Primern, A-DNA, B-DNA, Z-DNA, Polynukleotiden von
DNA, Polynukleotiden von RNA, T-Verbindungen
von Nukleinsäuren,
Triplexen und Quadruplexen von Nukleinsäuren, Domänen von nicht-Nukleinsäurepolymer-Nukleinsäureblockkopolymeren
und Kombinationen davon. Geeignete nicht-Nukleinsäurepolymere
für die
Blockkopolymere können
Polypeptide, Polysaccharide, wie zum Beispiel Dextrose, oder künstliche
Polymere, wie zum Beispiel Polyethylenglykol (PEG) sein und sind
dem Fachmann allgemein bekannt. Die Nukleinsäuren können entweder doppelsträngig oder
einzelsträngig sein.
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In
einem bevorzugten Verfahren gemäß der Erfindung
wird das Metallkomplex-Nukleinsäure-Konjugat
durch Metallierung und/oder interaktive Ligandenbindung gebildet.
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Noch
weiter bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der Erfindung, das dadurch
gekennzeichnet ist, daß der
Nukleinsäure-spezifische
Metallkomplex ausgewählt
ist aus der Gruppe umfassend Dichlor(2,2':6',2"-terpyridin)platin(II),
Cis-diaminodichlorplatin(II) und Metallkomplexen mit angebrachten oder
integrierten Nukleinsäure-interagierenden Gruppen,
wie interkalierenden, Furchenbindungs- und alkylierenden Mittel.
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In
einer noch weiter bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung
wird das Metallkomplex-Nukleinsäure-Konjugat
von nicht konjugiertem Metallkomplex und/oder nicht-konjugierten
Nebenprodukten durch Chromatographie, wie z.B. Gelfiltration oder
Ionenaustausch, Ausfällen, wie
z.B. Ethanolfällung,
oder Spülen,
z.B. mit Wasser oder einer wäßrigen Salzlösung, abgetrennt.
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In
einer weiteren Ausführungsform
des Verfahrens gemäß der Erfindung
wird das Metallkomplex-Nukleinsäure-Konjugat
mit mindestens einem reduzierenden Mittel ausgewählt aus der Gruppe umfassend
Borhydride, Borhydridsalze, Lewisbase:Borankomplexe der allgemeinen
Formel L:BH3, worin L Amin, Ether, Phosphin
oder Sulfid sein kann, Hydrazin und Derivate, Hydroxylamin und Derivate,
Hypophosphitsalzen, Formatsalze, Dithionitsalze und H2 reagiert.
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Eine
noch weiter bevorzugte Ausführungsform
ist dadurch gekennzeichnet, daß das
reduzierende Mittel in Form eines gasförmigen reduzierenden Mittels
verwendet wird.
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Allgemein
kann das Verfahren gemäß der Erfindung
für die
selektive Metallisierung einer Nukleinsäure verwendet werden. Bevorzugte
Metall-Nanopartikel sind diejenigen, die mindestens ein Metall ausgewählt aus
der Gruppe von Fe, Co, Ni, Cu, Ru, Rh, Pd, Ag, Os, Ir, Pt, Au oder
Kombinationen (z.B. Legierungen) dieser Metalle enthalten.
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Bevorzugt
ist ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der Metall-Nanopartikel
katalytisch aktiv gegenüber
elektrofreier Metallisierung ist. Weiter bevorzugt ist ein Verfahren,
bei dem der Metall-Nanopartikel nicht durch Rasterkraftmikroskopie sichtbar
gemacht werden kann und/oder das der Durchmesser des Metall-Nanopartikels
kleiner als 3 nm ist.
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Die
der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird weiterhin durch ein
Verfahren gelöst,
das weiter den Schritt von Behandeln der Metall-Nanopartikel innerhalb
der Metall-Nanopartikel-Nukleinsäure-Kompositstruktur
mit einer elektrofreien Überzugslösung umfaßt, um die
Metall-Nanopartikel zu vergrößern.
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In
einer weiteren Ausführungsform
wird die Metall-Nanopartikel-Nukleinsäure-Kompositstruktur in einer Lösung gelöst, immobilisiert
auf einem Substrat oder in einem semi-festen Zustand, z.B. in einem
Gel, behandelt.
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In
einer noch weiter bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung
werden die Metall-Komplexe mit einer elektrofreien Überzugslösung behandelt,
umfassend ein Gemisch der Metalle ausgewählt aus der Gruppe umfassend Fe,
Co, Ni, Cu, Ru, Rh, Pd, Os, Ir, Ag, Pt, Au oder Kombinationen (z.B.
Legierungen) dieser Metalle oder magnetisches und/oder magnetisiertes
Fe, Co, Ni oder Kombinationen (z.B. Legierungen) dieser Metalle
oder Kombinationen (z.B. Legierungen) dieser Metalle mit B oder
P.
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Die
der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird weiterhin durch eine
Metall-Nanopartikel-Nukleinsäure-Kompositstruktur
gelöst,
die mittels eines der erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden kann.
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Bevorzugt
ist die Metall-Nanopartikel-Nukleinsäure-Kompositstruktur dadurch
gekennzeichnet, daß die
Durchmesser der Metall-Nanopartikel kleiner als 3 nm sind. Weiter
bevorzugt ist eine Metall-Nanopartikel-Nukleinsäure-Kompositstruktur, die dadurch gekennzeichnet
ist, daß die
Nanopartikel nicht durch Rasterkraftmikroskopie sichtbar gemacht
werden können.
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In
einem noch weiteren Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe durch
ein Verfahren zur Herstellung eines Nanodrahts gelöst, das
durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist: a) Zur Verfügung stellen einer
Metall-Nanopartikel-Nukleinsäure-Kompositstruktur
gemäß der Erfindung
und b) Wachstum, bevorzugt kontrolliertes Wachstum, des Nanopartikel durch
elektrofreies Aufbingen eines Metalls gemäß der Erfindung.
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In
einem noch weiteren Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe durch
eine lineare Anordnung von metallischen Nanopartikeln oder einem
Nanodraht gelöst,
erhältlich
gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Die metallischen Nanopartikel können
katalytisch oder magnetisiert sein. In einem noch weiteren Aspekt
wird die Aufgabe durch einen Nanodraht gelöst, der durch eines der erfindungsgemäßen Verfahren
erhältlich
ist. Die erfindungsgemäßen Nanodrähte können ein
elektrisches Netzwerk bilden, umfassend mindestens einen Nanodraht
oder einen elektronischen Schaltkreis, umfassend mindestens ein
elektrisches Netzwerk gemäß der Erfindung.
Zusätzlich
können
die erfindungsgemäßen Nanodrähte als
elektronische Komponenten in ihrer nicht vollständig metallisierten Form verwendet
werden, wobei mehr oder weniger isolierende Zwischenräume zwischen
den einzelnen Nanopartikeln vorhanden sind, die entlang dem Nukleinsäurestrang
angeordnet sind. In einem anderen Aspekt können die Nanodrähte vollständig leitend
sein oder können
entweder an einem oder beiden Enden isolierende Teile enthalten
oder die isolierenden Teile können
innerhalb des Drahtes selber vorhanden sein, so daß der Nanodraht
aus einzelnen leitfähigen
Inseln zusammengesetzt ist. Diese erfindungsgemäße Strukturen können ein
elektrisches Netzwerk oder einen elektronischen Schaltkreis bilden,
der mindestens einen Nanodraht umfaßt, oder ein Teil davon sein.
In solch elektronischen Netzwerken oder elektronischen Schaltkreisen können Kreuzungen
zwischen zwei oder mehr Drähten
gebildet werden, wobei jeder der Drähte ein leitfähiges Segment
proximal zu der Kreuzung aufweist, die den Nanodraht umfaßt. Weiterhin
können
die Nanodraht-umfassenden Netzwerke Teile von Hybrid-elektrischen
Strukturen sein.
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Weiterhin
wird die Aufgabe durch eine Kreuzung zwischen zwei oder mehr Drähten eines
elektrischen Schaltkreises gelöst,
wobei jeder der Drähte ein
Endsegment, proximal zu der Kreuzung aufweist, umfassend einen Nanodraht
gemäß der Erfindung.
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Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung schließen im wesentlichen vier Schritte
ein:
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Schritt
(1): Bindung eines Metallkomplexes an eine Nukleinsäure, um
ein Metallkomplex-Nukleinsäure-Konjugat
herzustellen.
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Die
Spezifität
des Metallisierungsverfahrens für
Nukleinsäuren
und für
spezifische Domänen
darin wird vorherrschend durch die An der Bindung in diesem Schritt
bestimmt. Der direkteste Bindungsansatz ist die "Metallierung". Dieses Verfahren betrifft die direkte
("kovalente") Bindung zwischen
einem Metallatom und einer Stelle auf der Nukleinsäure, insbesondere
den N-7-Atomen der Purin-Nukleotide (G und A). Diese Positionen
sind in 7 angegeben. Solche Reaktionen
wurden aufgrund ihrer Relevanz für die
Mechanismen von anti- Krebswirkstoffen
weit untersucht, meistens bei Pt (II)- oder Pt (IV)-Komplexen ("Platinierung"). Die Pt (IV)-Komplexe
werden allgemein als "pro-Wirkstoffe" angesehen, da sie
in vivo zu den entsprechenden PT (II)-Komplexen reduziert werden,
bevor sie aktiv werden.
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Pt
(II)-Komplexe, von denen bekannt ist, daß sie kovalent an Nukleinsäuren binden,
sind im allgemeinen quadratische, planare, 4-Koordinatenspezies,
die die allgemeine Formel Pt(L1)(L2)(X)(Z) und Pt (L1)(L2)(L3)(X) aufweisen,
worin L1, L2 und
L3 Liganden darstellen, die relativ inert
gegenüber
Ersetzen sind ("nicht-labil") und X und Z stellen
Liganden dar, die relativ reaktiv gegenüber Ersetzen sind ("labil"). In diesen allgemeinen
Formeln können
die Liganden L1, L2 und
L3 dieselben oder verschieden sein und die
Liganden X und Z können
dieselben oder verschieden sein. Weiterhin können die Liganden L1, L2 und L3 durch eine überbrückende Gruppe miteinander oder an
die Liganden X oder Z verbunden sein. Weiterhin können die
Liganden X und Z "cis"- oder "trans"-Positionen relativ
zueinander im Hinblick auf das Pt (II)-Atom einnehmen. Noch weiter
kann der Komplex zwei oder mehr Pt (II)-Atome enthalten. Einige dieser Variationen
sind in 8 gezeigt.
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Die
Atome in den nicht-labilen Liganden (L1, L2 und L3), die direkt
mit Pt (II) koordiniert sind, sind im allgemeinen N, P oder S. Liganden,
die nicht durch überbrückende Gruppen
verbunden sind, werden "Monodentat" genannt. Wenn zwei
Liganden verbunden sind, werden sie "Bidentat" genannt, und wenn drei miteinander
verbunden sind, sind sie "Tridentate". Monodentat-N-Liganden
sind typischerweise Amine, Monodentat-P-Liganden sind typischerweise
Phosphine, und Monodentat-S-Liganden sind typischerweise Thiole,
Thioester oder Thiocarbonyle. Die Aminliganden können Ammonium, primäre Amine,
sekundäre
Amine oder tertiäre
Amine sein. Diese schließen
aromatische Amine, wie zum Beispiel Pyridine und Anilin, ein. Es
gibt ähnlich
viele Beispiele von Bidentat N-N-Liganden in Pt (II)-Komplexen,
von denen bekannt ist, das sie kovalent an Nukleinsäuren binden.
Diese schließen,
zum Beispiel, 1,2-Diaminoethan, 1,2-Diaminopropan, 1,3-Diaminopropan, 1,2-Diaminocyclohexan
und 2,2'-Bipyridin
ein. Beispiele von Bidentat N-P- und N-S-Liganden sind auch bekannt,
sowie Tridentat N-N-N-Liganden, wie zum Beispiel 2,2':6',2"-Terpyridin(terpy)
und Diethylentriamin(dien).
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Beispiele
der labilen Liganden X und Z, die allgemein als gute abspaltbare
Gruppen dienen, schließen
Halid, Wasser, (Dialkyl)sulfoxide, Nitrat, Sulfat, Carboxylate,
Dicarboxylate, Carbonat, Phosphat, Pyrophosphat, Phosphatester,
Phosphonat, Nitrit, Sulfat, Sulfonate, β- Diketonate, Alkene, Selenat, Squarat,
Ascorbat und Hydroxid ein. Diese Liganden können Bidentat sein, wie im
Fall von Selenat und den Dicarboxylaten Oxalat und 1,1-Cyclobutandicarboxylat,
zum Beispiel. Sie können
auch Teil eines Moleküls
sein, das nicht-labile
Ligand(en) enthält, wie
zum Beispiel in Aminosäuren
(Carboxylat- und primäre
Amingruppen) und Picolinsäure
(Carboxylat- und Pyridingruppen).
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Von
Komplexen mit anderen Metallen neben Platin wurde gezeigt, daß sie Potential
zur Verwendung als ein anti-Krebswirkstoff aufweisen. Diese schließen Komplexe
von Pd, Ru, Au und Rh ein, die dazu neigen, entweder 4-koordiniert
(z. B. quadratische planare Geometrie) oder 6-koordiniert (z.B.
oktahedrale Geometrie) zu sein. Wie im Fall von Pt (II)-anti-Krebswirkstoffen
besitzen sie auch mindestens eine abspaltbare Gruppe, durch die
die Metallierung von Nukleinsäure
stattfindet. Aufgrund der stringenten Kriterien für anti-Krebswirkstoffe waren
wenige dieser anderen Metallkomplexe klinisch erfolgreich. Falls
der Komplex zu labil ist, ist es wahrscheinlich, daß er mit
physiologischen Nukleophilen (Proteinen usw.) interagiert, bevor
er seine Wirkungsstelle im Tumor erreicht, wodurch er deaktiviert
wird oder anders das Risiko von Toxizität erhöht. Auf der anderen Seite,
wenn der Komplex zu inert ist, kann er dabei versagen, mit seinem
biomolekularen Ziel zu interagieren, was erforderlich ist, um die
anti-Krebswirkung herzustellen. Komplexe von Pd(II) sind im allgemeinen
zu labil, während
diejenigen von Rh(III) im allgemeinen zu inert sind; ein Problem
mit Au(III)-Komplexen ist die Tatsache, daß sie durch physiologische
Reduktionsmittel leicht reduziert werden. Während diese Eigenschaften für die Anwendung
der Komplexe als anti-Krebswirkstoffe problematisch sind, ist dies
viel weniger so für
die Anwendung in Richtung der Metallisierung von Nukleinsäuren. In
der Tat kann die erhöhte
Reaktivität
von Pd(II)-Komplexen, verglichen mit ihren Pt (II)-Analoga, für diese
Anwendung vorteilhaft sein, und zusätzliche Reduktionsmittel können im
Fall von Au(III)-Komplexen vermieden werden.
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Neben
dem Aufweisen von mindestens einer Abspaltungsgruppe, sollte der
Metallationskomplex in der Lage sein, zu einem metallischen Zustand
reduziert zu werden, der eine katalytische Aktivität in Richtung
auf elektrofreie Beschichtungsverfahren aufweist. Zusätzlich zu
Pt werden diese Kriterien im allgemeinen am wahrscheinlichsten durch
Komplexe von Pd und Au erfüllt.
Komplexe von Ru und Rh können
jedoch auch verwendet werden. Die Verwendung dieser Metallationsmittel
erweitert die Selektivität
in Richtung Sequenzen oder Segmen-
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In
einer weiteren Ausführungsform
von Schritt (I) der Erfindung werden spezifische Basen innerhalb
von Oligonukleotid-Untereinheiten metalliert. Diese Untereinheiten
werden durch Hybridisierung auf komplementären Abschnitte von längeren Nukleinsäuren zusammengesetzt.
Die Metallierung der abgezielten Basen in den Oligonukleotid-Untereinheiten
kann entweder vor oder nach Hybridisierung durchgeführt werden.
Nicht-komplementäre
Segmente der längeren
Nukleinsäurekomponente
werden nicht durch die metallierten Oligonukleotide hybridisiert,
diese Lücken
können
mit anderen komplementären
Oligonukleotiden aufgefüllt
werden, die, zum Beispiel, nicht metalliert sind. Zwei Variationen dieser
Ausführungsform
sind schematisch in den 9 und 10 verdeutlicht.
In einem Fall (9) findet die Metallisierung
an einer Stelle statt, die inhärent
in Nukleinsäuren
vorhanden ist, und im anderen Fall (10) findet
die Metallierung an einer Stelle statt, die durch chemische Modifizierung
eingeführt wurde.
Die chemische Modifizierung von spezifischen Basen in den Oligonukleotid-Untereinheiten kann
entweder vor oder nach der Hybridisierung durchgeführt werden.
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In
dem schematisch in 9 gezeigten Beispiel wird ein
Pentanukleotid, das die Sequenz TTGTT aufweist, als eine Untereinheit
verwendet, die der Metallierung unterzogen wird, und ein Metallkomplex,
der einen Tridentat (N-N-N)-Liganden und eine abspaltbare Gruppe
(X) aufweist, wird als ein Metallierungsmittel verwendet. Unter
milden Bedingungen, (z. B. Raumtemperatur und neutralem pH) ist
der Thymin (T)-Rest im wesentlichen inert und nur der Guanin (G)-Rest
wird metalliert: Zwei Routen der Zusammenfügung des metallierten hybridisierten
Konstrukts sind in der Figur gezeigt. In einem Verfahren wird das
Oligonukleotid metalliert (i) und dann an die längere Nukleinsäurekomponente
(ii) hybridisiert. In dem anderen Verfahren wird das Oligonukleotid
zuerst hybridisiert (iii) und dann metalliert (iv). Dieses zweite
Verfahren kann die Verwendung von modifizierten Basen in der längeren Nukleinsäurekomponente
erforderlich machen, um eine Metallierung dieser Komponente während Schritt
(iv) zu verhindern. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Oligonukleotid-Untereinheiten aus
4–20 Basen
zusammengesetzt und die Metallierungsmittel sind Komplexe von Pt,
Pd, Au, Ru oder Rh.
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In
dem schematisch in 10 gezeigten Beispiel wird ein
Pentanukleotid, das die Sequenz TTC*TT aufweist, als die Untereinheit
verwendet die der Metallierung unterzogen wird, wobei C* einen Cytosin-Rest
darstellt, der chemisch modifiziert wurde, um eine Imidazol (Im)-
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In
dem schematisch in 10 gezeigten Beispiel wird ein
Pentanukleotid, das die Sequenz TTC*TT aufweist, als die Untereinheit
verwendet die der Metallierung unterzogen wird, wobei C* einen Cytosin-Rest
darstellt, der chemisch modifiziert wurde, um eine Imidazol (Im)-Gruppe als einen
Metall-Liganden anzubringen. Die Imidazolgruppe könnte zum Beispiel
an die C-5-Position des Cytosins durch Bromaktivierung und nukleophile
Verdrängung
mit 1-(3-Aminopropyl)imidazol,,
angebracht werden. Ein Metallkomplex, der einen Tridentat (N-N-N)-Liganden und eine
abspaltbare Gruppe (X) aufweist, wird als Metallierungsmittel verwendet,
wie in dem Beispiel in 9. Wie in diesem Beispiel sind
zwei Routen der Zusammenfügung
des metallierten hybridisierten Konstrukts möglich. In einem Verfahren wird
das Oligonukleotid metalliert (i) und dann hybridisiert (ii). In dem
anderen Verfahren wird zuerst das Oligonukleotid hybridisiert (iii)
und dann metalliert (iv). Dieses zweite Verfahren kann die Verwendung
von modifizierten Basen in der längeren
Nukleinsäurekomponente
erforderlich machen, um eine Metallierung dieser Komponente während Schritt
(iv) zu verhindern. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Oligonukeotid-Untereinheiten
aus 4–20
Basen zusammengesetzt, und die Metallierungsmittel sind Komplexe
von Pt, Pd, Au, Ru oder Rh.
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In
einer anderen Ausführungsform
der Erfindung wird Schritt (1) durch ein Verfahren erreicht, wobei
in dem Komplex an das Metall-koordinierte Liganden nach der Bindung
nicht ersetzt werden. Dieser Typ von Bindung kann als ein Verfahren "äußerer Sphäre" klassifiziert werden. Gegen-Ionenaustausch,
wodurch ein Metallion (z.B. Mg2+) durch
einen ähnlich
geladenen Metallkomplex (z.B. [Pt(NH3)4]2+ ersetzt wird,
ist ein Beispiel, jedoch stellt solch ein einfacher Austauschungsprozeß wenig,
falls überhaupt,
Unterscheidung zwischen Nukleotid-Basensequenzen innerhalb der Nukleinsäure oder
zwischen der Nukleinsäure
und anderen negativ geladenen Substanzen zur Verfügung. Die
Spezifität
für Nukleinsäuren und
spezifische Domänen
darin wird durch Anbringen von Nukleinsäure-interaktiven Gruppen an
den Metallkomplex erreicht. Solche Gruppen schließen interkalierende,
Furchenbindungs- und alkylierende Mittel ein, die aus dem Stand
der Technik bekannt sind. Die Nukleinsäureinteraktive Gruppe kann
ein integraler Teil eines Liganden sein, der mit dem Metallion koordiniert
ist (wie in "Metallointerkalatoren") oder anders kann
sie auch kovalent an einen Liganden angebracht sein. Die hauptsächlichen
Erfordernisse eines Metallkomplexes, der gemäß der Erfindung verwendet wird,
sind, daß er
relativ stabil gegenüber
Ligandenaustausch ist, so daß der
Komplex intakt zu abgezielten Nukleinsäure-Bindungsstellen zugeführt werden
kann. Weiterhin sollte er in der Lage sein, zu einem metallischen
Zustand reduziert zu werden, der eine katalytische Aktivität in Richtung
auf elektrofreie Beschichtungsverfahren zeigt.
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Beide
Erfordernisse werden zum größten Teil
durch Komplexe der Metalle der Gruppe 8 und 1B des Periodensystems
erfüllt.
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Verbindungen,
die für
diese Ausführungsform
von Schritt (1) brauchbar sind, weisen die allgemeine Struktur INT-CON-LIG-M(L)n auf, worin INT eine Nukleinsäure-interaktive
Gruppe ist, LIG ein nicht-labiler Ligand ist und M(L)n ein
koordinativ-ungesättigter
Metall-Ligandkomplex, der an LIG bindet, um die Koordinationserfordernisse
des Metalls M zu vervollständigen.
Die Gruppe CON verbindet die INT- und LIG-Gruppen und kann dazu
dienen, um die INT- und LIG-Gruppen spatial zu trennen und/oder
ihre relativen Orientierungen auszurichten.
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Metallinterkalator-Komplexe,
die zur Verwendung gemäß dieser
Ausführungsform
brauchbar sind, stellen einen speziellen Fall der allgemeinen Struktur
INT-CON-LIG-M(L)n dar. Da die Funktionen von
INT und LIG integriert sind, ist CON nicht als eine getrennte Gruppe
definierbar. Geeignete Metallinterkalatoren schließen Komplexe
ein, die die folgende allgemeine Formel (ICL)M(L)n aufweisen,
worin ICL ein planarer aromatischer Ligand ist und M(L)n ein
koordinativ-ungesättigter
Metall-Ligandenkomplex ist, der an ICL bindet, um die Koordinationserfordernisse des
Metalls M zu vervollständigen.
Geeignete Metalle M schließen
Pt, Pd und Au ein. Planare aromatische Bidentat-Liganden, von deren
Metallkomplexen bekannt ist, daß sie
mit Nukleinsäuren
durch Interkalation interagieren, schließen 8-Hydroxychinolin und α-Diimine,
wie zum Beispiel 2,2'-Bipyridin, 1,10-Phenanthrolin,
2,2-Bichinolin, Dipyrido[3,2-α:2'3'-c]phenazin und Derivate davon ein. 2,2':6',2"-Terpyridin (terpy)
ist ein Beispiel eines Tridentat-Interkalator-Liganden. Die Funktion
des/der Ligand(en) L in der Gruppe M(L)n ist
es hauptsächlich,
eine relativ substitutionsinerte Koordinationsumgebung für das Metall
zur Verfügung
zu stellen, so sind eine Vielzahl von nicht-labilen Monodentat oder Polydentat
N-, P- oder S-Liganden möglich.
Geeignete Bidentat-Liganden schließen Diamine, wie zum Beispiel
1,2-Diaminoethan, 1,2-Diaminopropan, 1,3-Diaminopropan und 1,2-Diaminocyclohexan
ein.
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Spezifische
Beispiele von solchen Verbindungen, die Komplexe von Pt(II), Pd(II)
oder Au(III) inkorporiert haben, sind in 11 gezeigt.
Diese Verbindungen werden durch kova lentes Kuppeln des Reagenz 1-(3-Aminopropyl)imidazol
an eine Nukleinsäure-interagierende
Gruppe hergestellt, um Beispiele von INT-CON-LIG zu produzieren,
worin der Ligand das N-3-Atom der angefügten Imidazolgruppe ist. Die
INT-CON-LIG-Verbindungen werden dann mit dem Metallkomplex der Form
M(Dien)(X) reagiert, worin Dien Diethylentriamin ist und X eine
abspaltbare Gruppe, wie zum Beispiel Nitrat. Die Nukleinsäure-interagierenden
Gruppen in den Beispielen bestehen aus Anthrachinon (einem interkalierenden
Mittel), einem kationischen Porphyrin (einem Furchen-bindenden Mittel)
und einem Stickstofflost (einem alkylierenden Mittel).
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In
einer weiteren Ausführungsform
von Schritt (1) der Erfindung werden substitutionsinerte Metallkomplexe
kovalent an spezifische Basen innerhalb von Oligonukleotid-Untereinheiten
angebracht. Diese Untereinheiten werden durch Hybridisierung auf
komplementäre
Segmente von längeren
Nukleinsäuren
zusammengesetzt. Die kovalente Modifikation der spezifischen Basen
in dem Oligonukleotid kann entweder vor oder nach der Hybridisierung durchgeführt werden.
Nichtkomplementäre
Segmente der längeren
Nukleinsäurekomponente
werden nicht durch das so modifizierte Oligonukleotid hybridisiert;
diese Lücken
können
mit anderen komplementären
Oligonukleotiden aufgefüllt
werden, an die zum Beispiel keine Metallkomplexe angebracht sind. In
dem schematisch in 12 gezeigten Beispiel wird ein
Pentanukleotid, das die Sequenz TTG*TT aufweist, als die Untereinheit
verwendet, die der Metallierung unterzogen wird, worin G* einen
Guaninrest darstellt, der chemisch modifiziert wurde, um eine Amingruppe
(-NH2) als eine kovalente Bindungsstelle
anzubringen. Die Amingruppe könnte zum
Beispiel an die C8-Position des Guanins durch Bromaktivierung und
nukleophiles Ersetzen mit 1,4-Diaminobutan angebracht werden. Der
substitutionsinerte Metallkomplex in diesem Beispiel weist einen
Tridentat-(N-N-N)-Liganden und einen Monodentat-Aminliganden auf. Der Monodentat-Aminligand
wird zur Anbringung einer freien Carboxylsäuregruppe (-COOH) an einen
Metallkomplex verwendet. Die Kondensation der Carbonsäuregruppe
an den Metallkomplex mit der Amingruppe auf der Oligonukleotid-Untereinheit,
um eine Amidgruppe -(CONH-) zu bilden, stellt eine Verbindung zwischen diesen
Komponenten zur Verfügung.
Diese Kondensation kann zum Beispiel unter der Verwendung von Carbodiimid
als dem Kupplungsreagenz erreicht werden.
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Zwei
mögliche
Routen des Zusammensetzens des hybridisierten Konstrukts sind in 12 gezeigt.
In einem Verfahren wird das Oligonukleotid an den Metallkomplex
(i) gekuppelt und dann an die längere
Nukleinsäurekomponente
(ii) hybridisiert. In dem anderen Verfahren wird das Oligonukleotid
zuerst hybridisiert (iii) und dann an den Metallkomplex (iv) gekoppelt.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind
die Oligonukleotid-Untereinheiten aus 4–20 Basen zusammengesetzt und
die Metallkomplexe sind Komplexe von Pt, Pd, Ru, Au oder Rh.
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Bevorzugte
Ausführungsformen
für Schritt (2)
hängen
davon ab, ob das Metallkomplex-Nukleinsäure-Konjugat
in Lösung
gelöst
ist oder auf einem Substrat immobilisiert ist. Wenn in Lösung vorhanden,
kann das Konjugat von nicht gebundenem Metallkomplex durch einige
Form von Chromatographie (z.B. Gelfiltration oder Ionenaustausch)
oder durch Ausfällen
(z.B. Ethanolfällung
des Konjugats) abgetrennt werden. Wenn das Konjugat immobilisiert
vorliegt, kann nicht gebundener Metallkomplex durch Spülen (z.B.
mit Wasser oder einer wäßrigen Salzlösung) entfernt
werden.
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Relativ
stark reduzierende Mittel können
für Schritt
(3) erforderlich sein. Geeignete Verbindungen sind Borhydride, insbesondere
Borhydrid-(BH4)-Salze, Lewis-Base: Boran-Komplexe
der allgemeinen Formel L:BH3 in denen L
Amin, Ether, Phosphin oder Sulfid, Hydrazin und Derivate, Hydroxylamin
und Derivate, Hypophosphitsalze, Dithionitsalze, Formatsalze und
H2 sein kann. Einige dieser Reagenzien sind als
gasförmige
Reduktionsmittel für
nicht-Lösungsphase-Behandlungen
geeignet.
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Verfahren,
die mit Schritt (4) zusammenhängen,
sind aus dem Stand der Technik bekannt. Kurz gesagt, wirken die
Metall-Nanopartikel in der Kompositstruktur als katalytische Stellen
für die
Reduktion von Metallionen in Lösung,
die sich darauf ablagern und die Nanopartikel vergrößern. Das
abgelagerte Metall kann dasselbe oder verschieden von dem im Nanopartikel
sein. Das Verfahren kann dazu verwendet werden, um die elektrische
Leitfähigkeit
der Kompositstruktur zu verbessern oder die Partikel mit magnetischen
Eigenschaften zu versehen.
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Die
Erfindung wird nun in weiteren Einzelheiten im Hinblick auf die
beigefügten
Figuren beschrieben, worin
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1 das
UV-sichtbare Absorptionsspektrum des Pt(II)-Terpyridin-DNA-Konjugats
und der Pt-DNA-Kompositstruktur zeigt, die gemäß Beispiel 1 hergestellt wurde.
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2 ein
AFM-Bild einer Pt-DNA-Kompositstruktur, hergestellt gemäß Beispiel
1, vor der Behandlung mit einer Lösung von GoldEnhance® gemäß Beispiel
4 zeigt.
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3 ein
AFM-Bild einer Pt-DNA-Kompositstruktur hergestellt gemäß Beispiel
1 nach der Behandlung mit einer Lösung von GoldEnhance® gemäß Beispiel
4 zeigt.
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4 ein
AFM-Bild eines weiteren Bereichs der Probe zeigt, die in 3 gezeigt
wird.
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5 ein
AFM-Bild einer Pt-DNA-Kompositstruktur, hergestellt gemäß Beispiel
2, vor der Behandlung mit einer Lösung von GoldEnhance® gemäß Beispiel
5 zeigt.
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6 ein
AFM-Bild einer Pt-DNA-Kompositstruktur, hergestellt gemäß Beispiel
2, nach der Behandlung mit einer Lösung von GoldEnhance® gemäß Beispiel
6 zeigt.
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7 die
wahrscheinlichsten Positionen für die "Metallierung" an den N-7-Atomen
der Purin-Nukleotide (G und A) einer Nukleinsäure zeigt.
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8 verschiedene
Variationen von Metall (M)-Ligand (L1, L2 und L3, X oder
Z)-Komplexen zeigt (die
Ladungen wurden zur Vereinfachung weggelassen);
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9 schematisch
die Metallierung von spezifischen Basen mit Oligonukleotid-Untereinheiten an Stellen
zeigt, die inhärent
vorhanden sind (die Ladungen wurden zur Vereinfachung weggelassen);
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10 schematisch
die Metallierung von spezifischen Basen innerhalb von Oligonukleotid-Untereinheiten an
Stellen zeigt, die durch chemische Modifikation eingeführt wurden
(die Ladungen wurden zur Vereinfachung weggelassen);
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11 Beispiele
von substitutionsinerten Metall (M)-Komplexen zeigt, die an Nukleinsäure-interagierende
Gruppen der allgemeinen Formel INT-CON-LIG-M(L)n angebracht
sind.
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12 schematisch
die kovalente Anbringung von substitutionsinerten Metallkomplexen
an spezifische Basen innerhalb von Oligonukleotid-Untereinheiten
vor oder nach der Hybridisierung an komplementäre Segmente von längeren Nukleinsäuren zeigt
(die Ladungen wurden zur Vereinfachung weggelassen); und
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13 ein
AFM-Bild einer unmodifizierten nicht-platinierten DANN nach Behandlung
mit einer Lösung
von GoldEnhance® zeigt.
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14 ein
AFM-Bild einer unmodifizierten nicht-platinierten DANN nach Behandlung
mit einer Lösung
von GoldEnhance® zeigt.
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Zwei
Bilder von Pt(terpy)-metallisierten DNA-Molekülen sind in 3 und 4 gezeigt. 3 zeigt
die Anwesenheit von kontinuierlicher Metallbeschichtung, die die
verlängerten
Segmente an DNA überlagert.
Die Gesamtdicke dieser Strukturen ist an den meisten Stellen zwischen
3 nm und 6 nm, es gibt jedoch auch Inseln, wo die Dicke ca. 50 nm
erreicht. 4 ist dieselbe Probe, wobei
diskontinuierliche Stränge
von Metallpartikeln entlang der verlängerten Segmente an DNA gezeigt
werden.
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Ähnliche
Ergebnisse wurden mit cis-Pt(NH3)2-metallisierter DNA erhalten, wie in 6 gezeigt.
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Nanopartikel-DNA-Kompositstrukturen über platiniertes
Natriumborhydrid
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Beispiel 1.
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DNA
(Kalbsthymus, Sigma Aldrich, Produkt Nummer D-1501) wurde in einer
wäßrigen Lösung gelöst, die
0,02 M HEPES/NaOH-Puffer, pH 7,5 enthielt. Die äquivalente Konzentration von
Nukleotidbasen in der Lösung,
abgeschätzt
durch UV-sichtbare Absorptions-Spektroskopie,
war 80 μM.
Zu 2,5 ml dieser Lösung
wurden 2,5 μl
einer 0,020 M Lösung von
Dichlor(2,2':6',2"-terpyridin)platin
(II) hinzugefügt (Sigma-Aldrich
Produktnummer 28, 809-8)
in Wasser. Von diesem Komplex ist bekannt, das er die DNA durch
einen Zwei-Schritt-Prozeß bindet,
einen schnelleren, der die Interkalierung des Terpyridin-(terpy)-Liganden
einschließt
und einem langsameren, der die kovalente Bindungsbildung (Platinierung)
einschließt
[Peyratout et al. (1995) Inorg. Chem. 34, 4484]. Die erhaltene Lösung wurde
im Dunkeln bei Raumtemperatur für
24 Stunden gelagert. Sie wurde dann durch eine Säule von kationischem Austauschgel
(Sephadex-Schutzbereich C-25, Sigma-Aldrich Produktnummer 27, 131-4)
unter der Verwendung von 0,02 M HEPES/NaOH-Puffer als ein Lösungsmittel
passiert, um Pt-Komplexe
zu entfernen, die nicht an die DNA konjugiert waren. Das UV-sichtbare
Absorptionsspektrum der Lösung nach
dieser Behandlung, dargestellt in 1, zeigt distinkte
Ma ximanahe 340 nm aufgrund des Terpy-Liganden, der an Pt koordiniert
ist, und 260 nm hauptsächlich
aufgrund der DNA. Durch Vergleich der Intensität der Absorption bei 340 nm
zu dem vor Ionenaustausch gemessen Wert wurde abgeschätzt, daß 30 % der
anfänglichen
Menge von (Terpy)Pt-Komplex in dem sich ergebenden (Terpy)Pt-DNA-Konjugat
enthalten war.
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Natriumborhydrid
(2 mg, Sigma-Aldrich Produktnummer 21, 346-2) wurde in 0,002 M HEPES/NaOH-Puffer
(100 μl)
gelöst,
und 20 μl
dieser Lösung
wurden zu 2,0 ml der Lösung
von (Terpy)Pt-DNA-Konjugat hinzugefügt. Die Farbe der Lösung veränderte sich
unmittelbar von blaßgelb
zu blaßgrau,
jedoch blieb die Lösung
optisch klar. Die sich ergebende Veränderung in dem UV-sichtbaren Absorptionsspektrum,
das nach 30 Minuten erhalten wurde, ist mit der Bildung an kolloidalem
Pt (1) konsistent. Der pH der Lösung war 7,8.
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Beispiel 2.
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Im
wesentlichen das selbe Verfahren wie in Beispiel 1 wurde verwendet,
mit der Ausnahme, daß statt
dessen 3,8 μl
einer 0,013 M Lösung
von cis-Diamindichlorplatin(II) ("Cis-Platin", Sigma-Aldrich Produktnummer P-4394)
in 67%-Wasser-33%-Dimethylsulfoxid verwendet wurden und nur 2,5
Stunden vor der Isolierung des (Diamin)Pt-DNA-Konjugats durch Kationenaustausch
ermöglicht
wurden. Von Cis-Platin ist bekannt, das es kovalent an DNA bindet,
wobei vorherrschend die bifunktionellen Intrastrangaddukte zwischen
N-7-Atomen von aneinanderliegenden G-G-Paaren oder G-A-Paaren gebildet
werden [Kelland (2000) Drugs 59 Suppl. 4,1].
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Rasterkraftmikroskopie
vor und nach Behandlung mit GoldEnhance®
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Beispiel 3.
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Die
polierte Oberfläche
eines Stücks
eines Silizium-Wafers (Halbleitergrad, p-Typ, Bordotiert, mit einem
nativen Oberfächen-Oxid)
wurde mit einem O2-Plasma für 4 Minuten
(0,4 mbar, bei ungefähr 33
Watt, geringe Leistung) behandelt (Gala Instruments PlasmaPrep-5).
Der behandelte Wafer wurde dann auf einen Spin-Beschichter (Mikasa
Spin-Coater 1H-D3) montiert. Mehrere Tropfen der Lösung von Pt-DNA-Komposit,
das in Beispiel 1 erhalten wurde, wurden auf das Substrat aufgetragen.
Nach 2 Minuten wurde die Probe bei 1000 U/min gedreht, dann unmittelbar
danach bei 5000 U/min für
90 Sekunden. Zwei Tropfen Wasser wurden auf die Probe während der
zweiten Drehphase getropft, um Salze zu entfernen. Die Probe wurde
durch Tapping-Modus AFM (Digital Instruments, Multi-Mode Atomic
Force Microscope) unter der Verwendung von Siliziumnitrit-Trägern (Olympus
Optical, Micro Cantilever OMCL-AC160TS-W, ungefähr 250 kHz Resonanzfrequenz,
ungefähr
25 N/m Federkonstante) untersucht. Die Bilder (z.B. in 2 gezeigt)
zeigten verlängerte Segmente
an DNA ohne jeglichen Hinweis von Pt-Partikeln.
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Beispiel 4.
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Eine
Lösung
von GoldEnhance® (Nanoprobes,
Katalognummer 2113) wurde auf die Oberfläche des Substrats aus Beispiel
3 für 10
Minuten aufgetragen, dann wurde die Oberfläche mit Wasser gespült und mit
einem Luftstrom getrocknet. Zwei AFM-Bilder dieser Probe sind in 3 und 4 gezeigt. 3 zeigt
die Anwesenheit von kontinuierlichen Metallbeschichtungen, die die
verlängerten
Segmente von DNA überlagern.
Die Gesamtdicke dieser Strukturen liegt an den meisten Stellen zwischen
3 nm und 6 nm, es gibt jedoch auch Inseln, wo die Dicke ca. 50 nm
erreicht. 4 ist ein Bild einer anderen
Stelle derselben Probe, das diskontinuierliche Stränge von
Metallpartikeln entlang der verlängerten
Segmente von DNA zeigt. Die Gesamtdicke dieser Strukturen liegt zwischen
2 nm und 6 nm, es gibt jedoch auch Inseln, wo die Dicke ca. 50 nm
erreicht. Es ist auch aus dem Bild ersichtlich, daß einige
Segmente der DNA nicht metallisiert wurden. Beide Bilder zeigen
die Oberfläche
des Siliziumsubstrats relativ frei von Metallablagerungen, d.h.
die Metallisierung ist hauptsächlich auf
die DNA beschränkt.
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Beispiel 5.
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Ein
zweiter Silizium-Wafer wurde wie in Beispiel 3 unter der Verwendung
der Pt-DNA-Kompositlösung aus
Beispiel 2 präpariert.
AFM-Bilder (gezeigt z.B. in 5) zeigten
wiederum verlängerte
Segmente der DNA ohne jeglichen Hinweis von Pt-Partikeln.
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Beispiel 6.
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Die
Probe in Beispiel 5 wurde mit GoldEnhance®-Lösung, wie
beschrieben in Beispiel 4, behandelt. Ein nach dieser Behandlung
erhaltenes AFM-Bild wird in 6 gezeigt. Ähnlich zu 4, zeigt
dieses Bild diskontinuierliche Stränge von Metallpartikeln entlang
der ver längerten
Segmente von DNA, deren Gesamtdicke zwischen 2 nm und 6 nm liegt,
mit nicht-metallisierten
Segmenten einer Dicke zwischen 0,7 nm und 0,9 nm. Die Silizium-Wafer-Oberfläche ist
im wesentlichen frei von Metallablagerungen.
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Beispiel 7.
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Unmodifizierte
ct-DNA wurde immobilisiert und auf einem Siliziumsubstrat getrocknet,
wie in Beispiel 3 beschrieben. Sie wurde dann mit GoldEnhance®-Lösung für 15 Minuten
behandelt. AFM-Bilder wie die in 13 und 14 zeigten
einige relativ große
Partikel auf der Oberfläche,
jedoch waren keine Partikel auf der DNA selber nachweisbar. Diese Ergebnisse
zeigen, daß die
Platinierung für
die DNA-lokalisierten Partikel, wie in 3, 4 und 6 gesehen,
erforderlich ist.