DE19624332B4

DE19624332B4 - Metallische Nanostruktur auf der Basis hochgeordneter Proteine sowie Verfahren zu deren Herstellung

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Publication number: DE19624332B4
Application number: DE1996124332
Authority: DE
Inventors: Jürgen Dipl.-Ing. Dr. Hofinger; Reiner Wahl; Remo Kirsch; Michael Dr. Mertig; Wolfgang Prof.Dr. Pompe; Eberhard Prof. Unger
Original assignee: Namos GmbH
Current assignee: Namos GmbH
Priority date: 1996-06-19
Filing date: 1996-06-19
Publication date: 2009-12-24
Anticipated expiration: 2016-06-20
Also published as: DE19624332A1; WO1997048837A1

Abstract

Metallische Nanostruktur auf der Basis hochgeordneter Proteine mit einer morphologisch konformen Metallschicht in einer Dicke von 1 bis 100 nm, erhältlich durch Aktivierung von assemblierten, hochgeordneten Proteinen mit einer Edelmetall- oder Schwermetalllösung und anschließender stromloser Metallisierung in einem Nickel- oder Kupfermetallisierungsbad und einem Reduktionsmittel bei einem pH-Wert zwischen 6,2 und 7,0 und einer Temperatur von 22 bis 37°C unter für Protein verträglichen Bedingungen.

Description

Die Erfindung betrifft metallische Nanostrukturen auf der Basis hochgeordneter Proteine sowie ein Verfahren zu deren Herstellung auf der Basis der stromlosen Metallabscheidung auf elektrischen Isolatoren aus der wäßrigen Lösung. Dabei wird das hochgeordnete Protein als Templat (formgebendes Muster) benutzt, um eine morphologisch konforme Metallschicht einer Dicke von 1 bis 100 nm aufzubauen. Die Metallschicht ist elektrisch leitend, weist im Spezialfall spezifische magnetische Eigenschaften auf und kann prinzipiell zum weiteren Aufbau von Heterostrukturen (Isolatoren, Halbleiter, Metalle und Keramiken) benutzt werden.
So gewonnene Strukturen mit charakteristischen Dimensionen im Nanometerbereich weisen neue physikalische Eigenschaften auf und besitzen deshalb ein weites Anwendungsgebiet. Dabei ist nicht nur die Ausnutzung spezifischer elektrischer und magnetischer Eigenschaften wichtig. Die metallischen Nanostrukturen sind als mechanische Bauteile auf dem Gebiet der Mikrosystemtechnik anwendbar. Beispielsweise können derartige Strukturen als Sonden für die Atomkraftmikroskopie, Rastertunnelmikroskopie, Feldemission-Rasterelektronenmikroskopie und Feldemissions-Transmissionselektronenmikroskopie verwendet werden.
Die Herstellung biologischer Strukturen im Nanometerbereich ist bekannt. So be-schreibt beispielsweise DE 4038887 ein Verfahren zur Erzeugung von Kollagenmikropartikeln im Mikrometer- und Nonometerbereich. In CHEM. ABSTR. Vol. 118, 91920 (1993) wird die Herstellung metallischer Nanostrukturen unter Verwendung von Proteintemplaten beschrieben, wobei die Metallabscheidung aus der Gasphase erfolgt.
Aus der US-PS 4 911 981 ist ein Verfahren zur Erzeugung von Mikrostrukturen auf der Basis von Lipidstrukturen bekannt. Die Möglichkeit der Erzeugung von Feldemissionskathoden mit nach diesem Verfahren hergestellten Lipidröhren wird in der US-PS 5 089 742 näher erläutert. Der Nachteil dieser Lipidröhren besteht unter anderem in deren Dimension. Die beschriebenen Phospholipidstrukturen haben einen Außendurchmesser von 500 nm bis 1 μm, was die Herstellung von Strukturen mit kleinerem Durchmesser unmöglich macht. Desweiteren wird eine starke Streuung der Durchmesser der erzeugten Filamente beobachtet. Das in der US-PS 4 911 981 beschriebene Verfahren beschränkt sich nur auf makromolekulare Lipidstrukturen, die gegenüber der Variation ihrer Umgebungsbedingungen wie z. B. Temperatur und pH-Wert relativ beständig sind. Aus diesem Grunde ist ihre Beschichtung aus der wäßrigen Lösung leicht zu realisieren durch die direkte Anwendung der für die stromlose Metallisierung von Isolatoren/Plasten entwickelten und bei Brenner, A. und Riddell, G., Proc. Am. Electroplaters' Soc., 34, 156, 1947 oder bei Charles, R.; Shipley, Jr., „Historical Highlights of electroless plating”, Plating and Surface Finishing, 92–99, 1984 beschriebenen Verfahren.
Die Aufgabe der Erfindung besteht deshalb in der Schaffung von Metallstrukturen mit charakteristischen Strukturen im Nanometerbereich.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch eine metallische Nanostruktur und durch ein Verfahren zu deren Herstellung auf der Basis metallisierter, hochgeordneter Proteine mit einer Metallschicht in einer Dicke von 1 bis 100 nm gelöst, die durch Aktivierung von assemblierten, hochgeordneten Proteinen mit einer Edelmetall- oder Schwermetalllösung und anschließender stromloser Metallisierung in einem Nickel- oder Kupfermetallisierungsbad und einem Reduktionsmittel bei einem pH-Wert zwischen 6,2 und 7,0 und einer Temperatur von 22 bis 37°C unter für Protein verträglichen Bedingungen erhältlich ist.
Unter hochgeordneten Proteinen werden dabei Proteine verstanden, die im Prozeß der Selbstassemblierung hochgeordnete zwei- bzw. dreidimensionale Strukturen bilden, wie bakterielle Zellhüllenproteine, Kollagen, Actin- und Tubulinfilamente.
In einer Ausführungsform der Erfindung besteht das hochgeordnete Protein aus einer Tubulin enthaltenden Struktur, vorzugsweise Mikrotubuli. Bei Mikrotubuli handelt es sich um eine Filamentstruktur mit einem Außendurchmesser von rund 25 nm und mehreren Mikrometern Länge, die im Cytoskelett von eukaryontischen Zellen vorkommen. Die erfindungsgemäßen metallisierten Mikrotubuli bilden metallische Röhren mit einem Durchmesser von 30 nm bis zu 200 nm, je nachdem wieviel Metall auf den Tubulin enthaltenden Strukturen abgeschieden wird.
Die Metallisierung im erfindungsgemäßen Verfahren besteht aus einer homogenen Metallphase, in die Keimbildungszentren eines anderen Metalls eingearbeitet sind. Vorzugsweise bestehen dabei die Keimbildungszentren aus Edel- oder Schwermetallen, wie z. B. Gold, Platin, Palladium, Titan oder Zirkonium und die homogene Metallphase aus Nickel oder Kupfer.
Erfindungsgemäß werden metallische Nanostrukturen auf der Basis hochgeordneter Proteine so hergestellt, dass assemblierte, hochgeordnete Proteine mit einer Metallösung aktiviert und anschließend stromlos in einem Metallisierungsbad unter für Protein verträglichen Bedingungen metallisiert werden.
Als hochgeordnete Proteine werden in einer Ausführungsform der Erfindung Tubulin enthaltende Strukturen, vorzugsweise Mikrotubuli eingesetzt. Anwendbar sind auch andere hochgeordnete Proteine, wie z. B. Actin-Filamente, Kollagen und bakterielle Zellhüllenproteine.
Die Aktivierung der Proteine im erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt mit einer Edelmetall- oder Schwermetallösung, z. B. mit einer Au-, Pt- oder Pd-Ionen enthaltenden Lösung.
Die stromlose Metallisierung wird erfindungsgemäß mit einem Ni- oder Cu-Metallisierungsbad auf der Basis von Dimethylaminoboran als Reduktionsmittel und Ni- oder Cu-Salzen durchgeführt. Vorteilhaft kann auch Hypophosphit als Reduktionsmittel verwandt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Mikrotubuli metallisiert. Deren Isolation und Reinigung ist bei Shelanski, M.; Gaskin, F.; Cantor, C., „Mikrotubule assembly in the absence of added nuclotides”, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 70, 765–768, 1973 und Vater, W.; Böhm, K.; Unger, E., „Effects of DNA an the taxo stimulated in vitro assembly of microtubule Protein from porcine brain”, Studio Biophys. 97, 47–60, 1983 ausführlich beschrieben. Die Mikrotubuli werden in vitro mit GTP (Guano sin-5'-Triphosphat Trinatriumsalz Monohydrat) und Taxol (aus Taxus brevifolia) bei 37°C assembliert und weitgehend vom nicht assemblierten Protein getrennt.
Die Aktivierung der assemblierten Mikrotubuli erfolgt erfindungsgemäß so, daß den assemblierten Mikrotubuli eine gesättigte Pd-Acetatlösung zugesetzt wird und diese Lösung zur Ausbildung von Pd-Keimen auf der Oberfläche der Mikrotubuli führt. Vorteilhaft kann in diesem Prozeß neben der Adsorbtion der Pd-lösung an der Oberfläche der Mikrotubuli die Fähigkeit der die Tubulinstruktur bildenden Aminosäurengruppen zur Reduktion von Pd²⁺ zu Pd⁰ genutzt werden. Bei diesem Prozeß entstehen auf der Oberfläche der Mikrotubuli Pd-Cluster, deren Größe und Verteilung von der Länge des Aktivierungsprozesses abhängt. Bei einer mittleren Clustergröße von 2 nm ist auch eine Aktivierung der inneren Oberfläche der Mikrotubuli möglich. Vorteilhaft wird der Aktivierungsprozeß für die Dauer von 2 h geführt. Die aktivierten Mikrotubuli werden anschließend von der Aktivierungslösung getrennt, gewaschen und in eine Pufferlösung überführt.
An die Aktivierung schließt sich die eigentliche Metallisierung an. Die gebräuchlichsten Metallisierungsbäder für Kupfer und Nickel arbeiten bei Temperaturen über 60°C und einem pH-Wert größer 8 (siehe Charles, R.; Shipley, Jr., „Historical Highlights of elektroless plating”, Plating and Surface Finishing, 92–99, 1984 und Lang, K., „Die stromlose Vernickelung”, Galvanotechnik Nr. 6, 347–358, 1965). Um eine stromlose Beschichtung auf den aktivierten Proteinstrukturen zu realisieren, müssen aber die Beschichtungsbedingungen an die sehr empfindlichen Assemblierungsbedingungen der Proteinstrukturen angepaßt werden, damit während der Metallisierung das biomolekulare Templat nicht zerfällt bzw. dessen Morphologie nicht wesentlich gestört wird.
Die in vitro vorliegenden aktivierten Mikrotubuli werden mit einem Ni-Bad auf der Basis von Dimethylaminoboran als Reduktionsmittel und Ni-Acetat oder Ni-Sulfat als zu reduzierendes Metallsalz versetzt. Aus dieser Lösung scheiden nach einer Dauer von ca. 1 min die metallisierten Mikrotubuli aus. Die abgeschiedene Nickelschicht ist bei einer Schichtdicke von rund 10 nm auf den Mikrotubuli geschlossen und zeigt neben elektrischen auch magnetische Eigenschaften. Die Dicke der erzeugten Metallschichten, die bei pH zwischen 6,2 und 7,0 und Temperaturen zwischen 22°C und 37°C abgeschieden werden, hängt von der Dauer des Metallisierungsprozesses ab. Es sind neben sehr dünnen Metallschichten (Dicke rund 10 nm) auch Schichten von mehreren 100 nm Schichtdicke auf der Oberfläche der Mikrotubuli realisierbar, wobei die Ausgangsmorphologie der einzelnen Mikrotubuli erhalten bleibt.
Aufgrund dessen, dass die eingesetzten Mikrotubuli einen sehr kleinen Durchmesser von 25 nm besitzen, ist es möglich, metallische Röhren zu erzeugen, die einen Durchmesser von 35 nm bis zu einigen 100 nm besitzen, je nachdem wieviel Metall auf den Mikrotubuli abgeschieden wird. Da die eingesetzten Mikrotubuli in ihrem Durchmesser gleich sind, gibt es zwischen den einzelnen metallisierten Strukturen keine Unterschiede bezüglich deren Durchmesser, was gleiche elektrische und magnetische Eigenschaften zur Folge hat. Des weiteren besitzen die Mikrotubuli eine Länge von mehreren Mikrometer und somit ein großes Aspektverhältnis (Länge:Breite). Dies macht sie für Anwendungen, in denen es auf eine Positionierung und Fixierung der Metallröhrchen ankommt, besonders geeignet. Das beschriebene Verfahren der Aktivierung und Metallisierung ist nicht tubulinspezifisch. Es lässt sich somit auch auf andere Proteinstrukturen anwenden.
Anhand nachfolgender Ausführungsbeispiele soll die Erfindung näher erläutert werden.
Ausführungsbeispiel 1
Beschrieben wird die Herstellung von dreidimensionalen Metallstrukturen auf der Basis von Mikrotubulitemplaten. Zunächst werden die Mikrotubuli wie folgt assembliert:
Die Isolation und Reinigung von Tubulin ist bei Shelanski, M.; Gaskin, F.; Cantor, C., „Mikrotubule assembly in the absence of added nuclotides”, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 70, 765–768, 1973 und Vater, W.; Böhm, K.; Unger, E., „Effects of DNA an the taxo stimulated in vitro assembly of microtubule Protein from porcine brain”, Studio Biophys. 97, 47–60, 1983 ausführlich beschrieben. Die Assemblierung von Mikrotubuli aus einer Tubulinpräparation mit einer Konzentration von 1 mg/ml Tubulin erfolgt in einer Pufferlösung von 500 mM MES (2-Morpholinoethansulfonsäure Monohydrat), 1 mM EGTA (Ethylenglykol-bis-(2-Aminoethyl)-Tetraessigsäure) und 0,5 mM MgCl₂ durch Zugabe von 0,25 mM GTP und 10 μM Taxol bei einer Temperatur von 37°C. Um die Assemblierung zu verfolgen, wird die Trübung der Assemblierungslösung mit einem Spektrometer bei einer Wellenlänge von 350 nm aufgezeichnet, bis eine Sättigung zu beobachten ist. Danach wird die Lösung bei 14000 Umdrehungen/Minute 30 min zentrifugiert um die assemblierten Mikrotubuli und das nicht assemblierte Protein zu trennen. Der so erhaltene Bodensatz wird wieder in einen MES Buffer bei pH = 6,8 überführt. Die so erhaltene Präparation ist Ausgangspunkt für alle weiteren Aktivierung- und Metallisierungsschritte.
Ein Volumen von 30 ml dieser Lösung mit den assemblierten Mikrotubuli wird zum Zweck der Aktivierung der Mikrotubulioberfläche mit dem gleichen Volumen einer gesättigten Palladiumacetatlösung versetzt. Im Aktivierungsprozeß wird diese Lösung stehengelassen, bis eine ausreichende Anzahl von Pd-Keimen auf den Mikrotubuli entstehen (ca. 2 h). Danach werden die aktivierten Mikrotubuli mit MES-Puffer unter der Verwendung eines 300 kDa Membranfilters zweimal gewaschen. Der erzeugte Rückstand im Membranfilter wird in 500 ml MES-Puffer überführt.
Bei der Untersuchung dieser Probe im Transmissionselektronenmikroskop ist deutlich die Anlagerung von schwarzen Partikeln an der Oberfläche der Mikrotubuli sichtbar. Der Durchmesser der Partikel lag bei 2 Stunden Aktivierung bei rund 2 nm. Hier muß angemerkt werden, daß es für das Beschichtungsverfahren nicht wesentlich ist, ob die angelagerten Palladiumcluster bereits in reduzierter Form oder noch als Pd²⁺-Ionen vorliegen, die dann erst in der Startphase der Metallisierung im Dimethylaminoboranbad reduziert werden. Mit einem energiedispersiven Röntgenmikrobereichsanalysator wurde die Zusammensetzung dieser Cluster bestimmt und festgestellt, daß sie zu 99% aus Palladium bestehen.
Die so erhaltenen Mikrotubuli mit Pd⁰- bzw. Pd²⁺-Cluster auf der Oberfläche können stromlos beschichtet werden. Hierzu wird ein Nickelbad der folgenden Zusammensetzung verwendet:
50 g/l Ni(CH₃COO)₂6H₂O
25 g/l Natriumcitrat
25g/l 85%-ige Milchsäure
2,5 g/l Dimethylaminoboran.
Der pH-Wert dieses Metallisierungsbades lässt sich mit NH₄OH sehr genau zwischen 6,2 und 7,0 einstellen.
500 ml der Lösung mit den aktivierten Mikrotubuli werden mit der gleichen Menge des oben beschriebenen Metallisierungsbades versetzt. Nach rund 1 min fallen aus dieser Lösung schwarze Partikel, die die metallisierten Mikrotubuli darstellen, aus. Der weiterlaufende Metallisierungsprozeß lässt sich durch starkes Verdünnen der Lösung mit MES-Puffer abbrechen. Auf diese Weise können Mikrotubuli mit verschiedenen Metallfilmdicken erzeugt werden.
Die nickelmetallisierten Mikrotubuli wurden im Transmissionselektronenmikroskop und Rasterelektronenmikroskop bei einer Beschleunigungsspannung von 1 kV untersucht. Eine entsprechende Aufnahme ist als 1 dargestellt. Die dargestellten Mikrotubuli besitzen einen äußeren Durchmesser von 50 nm und eine Länge von einigen Mikrometern. Die abgeschiedenen Ni-Partikel besitzen eine Größe von rund 8–10 nm, die bei einer Schichtdicke ab 10 nm einen geschlossenen, elektrisch leitenden Film bilden. Ersichtlich ist, dass die Metallisierung nur an mit Pd-Keimen besetzten Stellen der Mikrotubuli beginnt. Das bedeutet, eine Abscheidung von Nickel aus der Metallisierungslösung ist nur nach einer Aktivierung der Mikrotubulioberfläche mit Katalysatorkeimen möglich.
Ausführungsbeispiel 2
Die Assemblierung der Mikrotubuli und deren Aktivierung wird wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Im Gegensatz zum Beispie 1 wird Nickel aus einem Nickelsulfatkomplex abgeschieden. Die Zusammensetzung des Metallisierungsbades ist wie folgt:
39,4 g/l NiSO₄6H₂O
20 g/l Natriumcitrat
10 g/l 85%-ige Milchsäure
4 g/l Dimethylaminoboran.
Die pH-Wert Einstellung von 6,8 erfolgt ebenfalls mit NH₄OH. Die Abscheideraten dieses Bades liegen in der gleichen Größenordnung wie des Bades im Beispiel 1, so dass eine Beschichtung von rund 1 min Dauer für die Erzeugung einer kontinuierlichen Ni-Schicht auf den Mikrotubuli ausreicht.

Claims

Metallische Nanostruktur auf der Basis hochgeordneter Proteine mit einer morphologisch konformen Metallschicht in einer Dicke von 1 bis 100 nm, erhältlich durch Aktivierung von assemblierten, hochgeordneten Proteinen mit einer Edelmetall- oder Schwermetalllösung und anschließender stromloser Metallisierung in einem Nickel- oder Kupfermetallisierungsbad und einem Reduktionsmittel bei einem pH-Wert zwischen 6,2 und 7,0 und einer Temperatur von 22 bis 37°C unter für Protein verträglichen Bedingungen.
Nanostruktur nach Anspruch 1 erhältlich durch Aktivierung von bakteriellen Zellhüllproteinen, Kollagen, Actin- oder Tubulinfilamenten.
Nanostruktur nach Anspruch 1 und 2 erhältlich durch Aktivierung von Mikrotubuli.
Verfahren zur Herstellung metallischer Nanostrukturen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man assemblierte, hochgeordnete Proteine mit einer Edelmetall- oder Schwermetalllösung aktiviert und anschließend stromlos in einem Nickel- oder Kupfermetallisierungsbad und einem Reduktionsmittel bei einem pH-Wert zwischen 6,2 und 7,0 und einer Temperatur von 22 bis 37°C metallisiert unter für Protein verträglichen Bedingungen.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die Proteine mit einer gesättigten Palladium-Acetatlösung aktiviert.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Reduktionsmittel Dimethylaminoboran einsetzt.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man als Reduktionsmittel Hypophosphit einsetzt.