WO1997048837A1 - Metallische nanostruktur auf der basis selbstassemblierter, geometrisch hochgeordneter proteine sowie verfahren zu deren herstellung - Google Patents

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Jürgen HOFINGER
Reiner Wahl
Remo Kirsch
Michael Mertig
Wolfgang Pompe
Eberhard Unger
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Hofinger Juergen
Reiner Wahl
Remo Kirsch
Michael Mertig
Wolfgang Pompe
Eberhard Unger
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    • B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
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    • C23C18/38—Coating with copper
    • C23C18/40—Coating with copper using reducing agents

Definitions

  • the invention relates to metallic nanostructures based on self-assembled, geometrically highly ordered proteins and a process for their production based on the electroless metal separation on electrical insulators from the aqueous solution.
  • the prerequisite for the protein is that the protein forms reproducible, geometrically highly ordered structures in a self-assembly process, which can be described by a characteristic dimension (D). This means identical diameters for cylindrical structures and identical periodicity of the protein crystal for two-dimensional protein structures.
  • the metallic nanostructures can be used as mechanical components in the field of microsystem technology.
  • structures of this type can be used as probes for atomic force microscopy, scanning tunnel microscopy, field emission scanning electron microscopy and field emission transmission electron microscopy.
  • US Pat. No. 4,911,981 discloses a method for producing microstructures based on lipid structures.
  • the possibility of producing field emission cathodes with lipid tubes produced by this method is explained in more detail in US Pat. No. 5,089,742.
  • the disadvantage of these lipid tubes is, among other things, their size.
  • the phospholipid structures described have an outer diameter of 500 nm to 1 ⁇ m, which makes the production of structures with a smaller diameter impossible. Furthermore, a large scatter in the diameter of the filaments produced is observed.
  • the method described in US Pat. No. 4,911,981 is limited only to macromolecular lipid structures which are able to withstand the variation of their environmental conditions, such as e.g. B. temperature and pH are relatively stable.
  • the object of the invention is therefore to create metal structures with characteristic structures in the nanometer range.
  • the object is achieved by a metallic nanostructure which consists of a metallized, self-assembled, geometrically highly ordered protein.
  • the protein can be partially or completely metallized.
  • Geometrically highly ordered proteins mean proteins that form highly ordered two- or three-dimensional structures in the process of self-assembly, such as bacterial cell envelope proteins, collagen, actin and tubulin filaments and DNA strands (deoxyribonucleic acid).
  • the metallic nanostructures according to the invention with complete metallization have a homogeneous metal phase into which nucleation centers of another metal are incorporated.
  • the nucleation centers consist of precious or heavy metals, such as. As gold, platinum, palladium, titanium or zirconium and the homogeneous metal phase made of nickel or copper or cobalt.
  • the morphologically compliant metal layer has a thickness of 1 nm up to the characteristic dimension (D) of the protein.
  • the metal layer is electrically conductive, has magnetic properties in the case of a nickel or cobalt coating and can in principle be used for the further construction of heterostructures (insulators, semiconductors, metals and ceramics).
  • the metallic nanostructures can also have only a partial metallization.
  • the partial metallization can consist of a metal phase into which nucleation centers of another metal are incorporated, or only consist of nucleation centers.
  • the nucleation centers consist of precious or heavy metals, such as. As gold, platinum, palladium, titanium or zirconium and the metal phase made of nickel or copper or cobalt.
  • the self-assembled, geometrically highly ordered protein consists of a tubulin-containing structure, preferably microtubules.
  • Microtubules are a filament structure with an outer diameter of around 25 ran and several micrometers in length that occur in the cytoskeleton of eukaryotic cells.
  • the metallized microtubules according to the invention form metallic tubes with a diameter of 30 nm to 200 nm, depending on how much metal is deposited on the structures containing tubulin. A partial coating is also possible.
  • the self-assembled, geometrically highly ordered protein consists of bacterial cell envelope proteins.
  • Bacterial cell envelope proteins also known as S-layers (surface layers), are two-dimensional protein crystals that form the outer cell wall layer in many bacteria. These S-layers, which consist of only one protein or glycoprotein, have the ability to assemble into monomolecular lattices in vitro.
  • the unit cell size of the grids varies between 10 and 40 nm depending on the S-Layer type, whereby a unit cell can consist of several monomers depending on the symmetry of the grid (e.g. square or hexagonal).
  • the S-layers used according to the invention preferably form the basis for a periodic arrangement of metallic particles with diameters between 0.5 to 20 nm, depending on the reaction time after which the metal deposition process is terminated.
  • the periodic arrangement of the metallic particles is determined by the Symmetry of the S-layer, its lattice periodicity and the density of the reactive centers per protein monomer.
  • metallic nanostructures are produced on the basis of self-assembled, geometrically highly ordered proteins in such a way that assembled, highly ordered proteins are activated with a metal solution and then electrolessly metallized in a metallization bath under conditions compatible with protein. If only partial metallization is to be realized, activation with a metal solution is sufficient. However, it is also possible to coat the activated proteins in a currentless manner in a metallization bath.
  • the high-order proteins can additionally be assembled in vitro.
  • the activation of the proteins according to the invention takes place with a noble metal or heavy metal solution, e.g. B. with a solution containing Au, Pt or Pd ions.
  • the electroless metallization is carried out using a Ni or Cu or Co metallization bath based on dimethylaminoborane as a reducing agent and Ni or Cu or Co salts.
  • Hypophosphite can also advantageously be used as a reducing agent.
  • microtubules are metallized. Their isolation and cleaning is by Shelanski, M .; Gaskin, F .; Cantor, C, "Microtubule assembly in the absence of added nuclotides", Proc. Nat. Acad. Sci. USA 70, 765-768, 1973 and Vater, W .; Böhm, K .; Unger, E., "Effects of DNA on the taxo stimulated in vitro assembly of microtubule protein from porcine brain ", Studio Biophys. 97, 47-60, 1983 described in detail.
  • the microtubules are assembled in vitro with GTP (guanosine 5'-triphosphate trisodium salt monohydrate) and taxol (from Taxus brevifolia) at 37 ° C and largely separated from the unassembled protein.
  • GTP guanosine 5'-triphosphate trisodium salt monohydrate
  • taxol from Taxus brevifolia
  • the assembled microtubules are activated according to the invention in such a way that a saturated Pd acetate solution is added to the assembled microtubules and this solution leads to the formation of Pd nuclei on the surface of the microtubules.
  • a saturated Pd acetate solution is added to the assembled microtubules and this solution leads to the formation of Pd nuclei on the surface of the microtubules.
  • Amino acid groups can be used to reduce Pd to Pd. This process creates Pd clusters on the surface of the microtubules, the size and distribution of which depend on the length of the activation process. With an average cluster size of 2 nm, activation of the inner surface of the microtubules is also possible. The activation process is advantageously carried out for a period of 2 hours. The activated microtubules are then separated from the activation solution, washed and transferred to a buffer solution.
  • the actual metallization follows the activation.
  • the most common metallization baths for copper and nickel operate at temperatures above 60 ° C and a pH greater than 8 (see Charles, R .; Shipley, Jr., "Historical Highlights of electroless plating”, Plating and Surface Finishing, 92-99, 1984 and Lang, K., "The electroless nickel plating", electroplating No. 6, 347-358, 1965).
  • the coating conditions have to be adapted to the very sensitive assembly conditions of the protein structures, so that the biomolecular template does not disintegrate or its morphology is not significantly disturbed during the metallization.
  • the activated microtubules in vitro are mixed with a Ni bath based on dimethylaminoborane as a reducing agent and Ni acetate or Ni sulfate as the metal salt to be reduced.
  • the metallized microtubules separate from this solution after a period of about 1 min.
  • the deposited nickel layer is closed at a layer thickness of around 10 nm on the microtubules and shows not only electrical but also magnetic properties.
  • microtubules In addition to very thin metal layers (thickness around 10 nm), layers of several 100 nm layer thickness can also be realized on the surface of the microtubules, the original morphology of the individual microtubules being retained. Due to the fact that the microtubules used have a very small diameter of 25 nm, it is possible to produce metallic tubes which have a diameter of 35 nm to a few 100 nm, depending on how much metal is deposited on the microtubules. Since the diameter of the microtubules used is the same, there is no difference in diameter between the individual metallized structures, which results in the same electrical and magnetic properties. Furthermore, the microtubules have a length of several micrometers and thus a large aspect ratio (length: width). This makes them particularly suitable for applications in which the positioning and fixing of the metal tubes is important.
  • the described activation and metallization process is not tubulin-specific. It can also be applied to the other protein structures according to the invention.
  • the activation of the proteins can, according to a further embodiment of the method according to the invention, also take place in such a way that, for. B. S-layers of the Sporosarcina ureae obtained after cleaning are either mixed with a K 2 PtCl 4 solution or that the S-layers previously as in Pum, D .; Weinhandl, M .; Hödl, C; Sleytr, U., "Large-scale recrystallization of the S-Layer of Bacillus coagulans E38-66 at the air / water interface and on lipid films", J. Bacteriology, May 2762-2766, 1993, recrystallize at an interface and then the subphase of the recrystallization solution is replaced by a K 2 PtCl 4.
  • Pt clusters are formed on the surface of the S layer.
  • the Pt 2+ reduction to Pt ° can be advantageous
  • the specific absorption of the Pt clusters can be used due to the pronounced charge distribution on the S-layer.
  • microtubules are assembled as follows:
  • tubulin isolation and purification of tubulin is by Shelanski, M .; Gaskin, F .; Cantor, C, "Microtubule assembly in the absence of added nuclotides", Proc. Nat. Acad. Sci. USA 70, 765-768, 1973 and Vater, W .; Böhm, K .; Unger, E., "Effects ofDNA on the taxo stimulated in vitro assembly of microtubule protein from porcine brain ", Studio Biophys. 97, 47-60, 1983 described in detail.
  • Microtubules from a tubulin preparation with a concentration of 1 mg / ml tubulin are assembled in a buffer solution of 500 mM MES (2-morpholinoethanesulfonic acid monohydrate), 1 mM EGTA (ethylene glycol bis (2-aminoethyl) tetraacetic acid) and 0. 5 mM MgCl 2 by adding 0.25 mM GTP and 10 ⁇ M taxol at a temperature of 37 ° C.
  • MES morpholinoethanesulfonic acid monohydrate
  • 1 mM EGTA ethylene glycol bis (2-aminoethyl) tetraacetic acid
  • 0. 5 mM MgCl 2 by adding 0.25 mM GTP and 10 ⁇ M taxol at a temperature of 37 ° C.
  • the turbidity of the assembly solution is recorded with a spectrometer at a wavelength of 350 nm until saturation is observed.
  • the solution is then centrifuged at 14,000 revolutions / minute for 30 min in order to separate the assembled microtubules and the unassembled protein.
  • the preparation obtained in this way is the starting point for all further activation and metallization steps.
  • a volume of 300 ⁇ l of this solution with the assembled microtubules is mixed with the same volume of a saturated palladium acetate solution for the purpose of activating the microtubule surface. This solution is left in the activation process until a sufficient number of Pd nuclei form on the microtubules (approx. 2 h). After that 8, the activated microtubules are washed twice with MES buffer using a 300 kDa membrane filter. The residue generated in the membrane filter is transferred to 500 ⁇ l MES buffer.
  • microtubules thus obtained with Pd or Pd clusters on the surface can be coated without current.
  • a nickel bath of the following composition is used for this:
  • the nickel-metallized microtubules were examined in the transmission electron microscope and scanning electron microscope at an acceleration voltage of 1 kV. A corresponding picture is shown in Fig. 1.
  • the deposited Ni particles have a size of around 8-10 nm, which form a closed, electrically conductive film with a layer thickness of 10 nm or more. It can be seen that the metallization only begins at the sites of the microtubules occupied by Pd nuclei. This means that nickel can only be deposited from the metallization solution after the microtubule surface has been activated with catalyst nuclei.
  • the magnetic character of the nickel coating could be demonstrated by manipulating the metallized microtubules in aqueous solution with the help of an electromagnetic field and by magnetic atomic force microscopy.
  • Example 1 The assembly of the microtubules and their activation is carried out as described in Example 1.
  • nickel is deposited from a nickel sulfate complex.
  • the composition of the metallization bath is as follows:
  • the pH value of 6.8 is also set with NH 4 OH.
  • the deposition rates of this bath are of the same order of magnitude as those of the bath in Example 1, so that a coating of about 1 min is sufficient to produce a continuous Ni layer on the microtubules.
  • the magnetic character of the nickel coating could be demonstrated, as set out in Example 1.
  • Embodiment 3 The assembly of the microtubules and their activation is carried out as described in Example 1. In contrast to example 1, a cobalt layer is deposited on the activated microtubules instead of nickel.
  • the composition of the metallization bath is as follows:
  • the pH of the bath is adjusted to 6.8 with NH 4 OH.
  • the deposition rate of this bath is somewhat lower by a factor of 2 than the deposition rate of the Ni baths, so that a coating time of around 2 minutes is sufficient for the generation of a continuous Co layer on the microtubules.
  • microtubules are assembled as described in Example 1.
  • a volume of 300 ⁇ l of assembled microtubules is mixed with a 3 mM K 2 PtCl 4 solution or a 3 mM Na 2 PdCl 4 solution.
  • the total volume of the activation solution is made up to 1000 ⁇ l with MES buffer. This solution is left in the activation process until a sufficient number of Pt or Pd nuclei have formed on the microtubules (approx. 2 hours).
  • the activated microtubules are then filtered as indicated in exemplary embodiment 1.

Abstract

Die Erfindung betrifft metallische Nanostrukturen auf der Basis selbstassemblierter, geometrisch hochgeordneter Proteine sowie ein Verfahren zu deren Herstellung. Unter geometrisch hochgeordneten Proteinen werden dabei Proteine verstanden, die im Prozeß der Selbstassemblierung hochgeordnete zwei- bzw. dreidimensionale Strukturen bilden, wie bakterielle Zellhüllenproteine, Kollagen, Actin- und Tubulinfilamente und DNA-Stränge. Erfindungsgemäß werden die assemblierten Proteine mit einer Metallösung aktiviert und anschließend stromlos in einem Metallisierungsbad unter für Protein verträglichen Bedingungen metallisiert. Die Proteine können teilweise oder vollständig metallisiert sein.

Description

Metallische Nanostruktur auf der Basis selbstassemblierter, geometrisch hochgeordneter Proteine sowie Verfahren zu deren Herstellung
Die Erfindung betrifft metallische Nanostrukturen auf der Basis selbstassemblierter, geometrisch hochgeordneter Proteine sowie ein Verfahren zu deren Herstellung auf der Basis der stromlosen Metal labscheidung auf elektrischen Isolatoren aus der wäßrigen Lösung. Die Voraussetzung bezüglich des Proteins bestehen darin, daß das Protein in einem Selbstassemblierungsprozeß reproduzierbar, geometrisch hochgeordnete Strukturen bildet, die sich durch eine charakteristische Dimension (D) beschreiben lassen. Bei zylindrischen Strukturen bedeutet dies identische Durchmesser und bei zweidimensionalen Proteinstrukturen identische Periodizität des Proteinkristalls.
So gewonnene Strukturen mit charakteristischen Dimensionen im Nanometerbereich weisen neue physikalische Eigenschaften auf und besitzen deshalb ein weites Anwendungsgebiet. Dabei ist nicht nur die Ausnutzung spezifischer elektrischer und magnetischer Eigenschaften wichtig. Die metallischen Nanostrukturen sind als mechanische Bauteile auf dem Gebiet der Mikrosystemtechnik anwendbar. Beispielsweise können derartige Strukturen als Sonden für die Atomkraftmikroskopie, Rastertunnelmikroskopie, Feldemissions-Rasterelektronenmikro- skopie und Feldemissions-Transmissionselektronenmikroskopie verwendet werden.
Aus der US-PS 4 911 981 ist ein Verfahren zur Erzeugung von MikroStrukturen auf der Basis von Lipidstrukturen bekannt. Die Möglichkeit der Erzeugung von Feldemissionskathoden mit nach diesem Verfahren hergestellten Lipidröhren wird in der US-PS 5 089 742 näher erläutert. Der Nachteil dieser Lipidröhren besteht unter anderem in deren Dimension. Die beschriebenen Phospholipidstrukturen haben einen Außendurchmesser von 500 nm bis 1 μm, was die Herstellung von Strukturen mit kleinerem Durchmesser unmöglich macht. Desweiteren wird eine starke Streuung der Durchmesser der erzeugten Filamente beobachtet. Das in der US-PS 4 911 981 beschriebene Verfahren beschränkt sich nur auf makromolekulare Lipidstrukturen, die gegenüber der Variation ihrer Umgebungsbedingungen wie z. B. Temperatur und pH-Wert relativ beständig sind. Aus diesem Grunde ist ihre Beschichtung aus der wäßrigen Lösung leicht zu realisieren durch die direkte Anwendung der für die stromlose Metallisierung von Isolatoren/Plasten entwickelten und bei Brenner, A. und Riddell, G., Proc. Am. Electroplaters ' Soc, 34, 156, 1947 oder bei Charles, R.; Shipley, Jr., „Historical Highlights of electroless plating", Plating and Surface Finishing, 92-99, 1984 beschriebenen Verfahren. Ganz allgemein wird auf die Möglichkeit der Erzeugung metallischer Nanostrukturen auf der Basis biologischer Objekte in der Arbeit von Douglas, K.; Devaud, G.; Lyon, M.; Clark, N., „Nanostructure fabrication using biomolecular templates", NATO ASI Ser., Ser. C 1183-1191, 1992 eingegangen. In einem deutschen Patent DE 40 38 887 AI ist ein Verfahren zur Herstellung von Kollagenpartikeln als Wirkstoffträger bekannt. Der Aufbau von Nanostrukturen durch äußere stromlose Metallisierung mit elektrischen oder magnetischen Schichten wird hierbei nicht in Betracht gezogen.
Die Aufgabe der Erfindung besteht deshalb in der Schaffung von Metallstrukturen mit charakteristischen Strukturen im Nanometerbereich.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch eine metallische Nanostruktur gelöst, die aus einem metallisierten, selbstassemblierten, geometrisch hochgeordneten Protein besteht. Dabei kann das Protein teilweise oder vollständig metallisiert sein.
Unter geometrisch hochgeordneten Proteinen werden dabei Proteine verstanden, die im Prozeß der Selbstassemblierung hochgeordnete zwei- bzw. dreidimensionale Strukturen bilden, wie bakterielle Zellhüllenproteine, Kollagen, Actin- und Tubulinfilamente und DNA- Stränge (Desoxyribonukleinsäure).
Die erfindungsgemäßen metallischen Nanostrukuren mit vollständiger Metallisierung weisen eine homogene Metallphase auf, in die Keimbildungszentren eines anderen Metalls eingearbeitet sind. Vorzugsweise bestehen dabei die Keimbildungszentren aus Edel- oder Schwermetallen, wie z. B. Gold, Platin, Palladium, Titan oder Zirkonium und die homogene Metallphase aus Nickel oder Kupfer oder Cobalt. Die morphologisch konforme Metallschicht besitzt einer Dicke von 1 nm bis zur charakteristischen Dimension (D) des Proteins. Die Metallschicht ist elektrisch leitend, weist im Fall einer Nickel oder Cobaltbeschichtung magnetische Eigenschaften auf und kann prinzipiell zum weiteren Aufbau von HeteroStrukturen (Isolatoren, Halbleiter, Metalle und Keramiken) benutzt werden. Erfindungsgemäß können die metallischen Nanostrukturen auch nur eine teilweise Metallisierung aufweisen. Die teilweise Metallisierung kann dabei aus einer Metallphase, in die Keimbildungszentren eines anderen Metalls eingearbeitet sind, oder nur aus Keimbildungszentren bestehen. Vorzugsweise bestehen dabei die Keimbildungszentren aus Edel- oder Schwermetallen, wie z. B. Gold, Platin, Palladium, Titan oder Zirkonium und die Metallphase aus Nickel oder Kupfer oder Cobalt.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung besteht das selbstassemblierte, geometrisch hochgeordnete Protein aus einer Tubulin enthaltenden Struktur, vorzugsweise Mikrotubuli. Bei Mikrotubuli handelt es sich um eine Filamentstruktur mit einem Außendurchmesser von rund 25 ran und mehreren Mikrometern Länge, die im Cytoskelett von eukaryontischen Zellen vorkommen. Die erfindungsgemäßen metallisierten Mikrotubuli bilden metallische Röhren mit einem Durchmesser von 30 nm bis zu 200 nm, je nachdem wieviel Metall auf den Tubulin enthaltenden Strukturen abgeschieden wird. Auch eine teilweise Beschichtung ist möglich.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung besteht das selbstassemblierte, geometrisch hochgeordnete Protein aus bakteriellen Zeilhüllenproteinen. Bei bakteriellen Zellhüllenproteinen, auch als S-Layer (surface layer) bezeichnet, handelt es sich um zweidimensionale Proteinkristalle, die bei vielen Bakterien die äußere Zellwandschicht bilden. Diese aus nur einem Protein oder Glycoprotein bestehenden S-layer besitzen die Fähigkeit, in vitro in monomolekulare Gitter zu assemblieren. Die Einheitszellengröße der Gitter variiert je nach S-Layer Typ zwischen 10 bis 40 nm, wobei eine Einheitszelle abhängig von der Symmetrie des Gitters (z. B. quadratisch oder hexagonal) aus mehreren Monomeren bestehen kann.
Die erfindungsgemäß verwendeten S-Layer bilden vorzugsweise die Grundlage für eine periodische Anordnung von metallischen Partikeln mit Durchmessern zwischen 0,5 bis 20 nm, je nachdem nach welcher Reaktionsdauer der Prozeß der Metallabscheidung abgebrochen wird. Die periodische Anordnung der metallischen Partikel wird dabei bestimmt durch die Symmetrie des S-Layers, seine Gitterperiodizität und die Dichte der reaktiven Zentren je Proteinmonomer.
Erfindungsgemäß werden metallische Nanostrukturen auf der Basis selbstassemblierter, geometrisch hochgeordneter Proteine so hergestellt, daß assemblierte, hochgeordnete Proteine mit einer Metallösung aktiviert und anschließend stromlos in einem Metallisierungsbad unter für Protein verträglichen Bedingungen metallisiert werden. Soll nur eine teilweise Metallisierung realisiert werden, ist die Aktivierung mit einer Metallösung ausreichend. Möglich ist es aber auch, die aktivierten Proteine begrenzt in einem Metallisierungsbad stromlos zu beschichten.
In einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens können die hochgeordneten Prote¬ ine in vitro zusätzlich assembliert werden. Die erfindungsgemäße Aktivierung der Proteine erfolgt mit einer Edelmetall- oder Schwermetallösung, z. B. mit einer Au-, Pt- oder Pd-Ionen enthaltenden Lösung.
Die stromlose Metallisierung wird nach einer Ausgestaltung der Erfindung mit einem Ni- oder Cu- oder Co-Metallisierungsbad auf der Basis von Dimethylaminoboran als Reduktionsmittel und Ni- oder Cu-, oder Co-Salzen durchgeführt. Vorteilhaft kann auch Hypophosphit als Reduktionsmittel verwandt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Mikrotubuli metallisiert. Deren Isolation und Reinigung ist bei Shelanski, M.; Gaskin, F.; Cantor, C, „Mikrotubule assembly in the absence of added nuclotides", Proc. Nat. Acad. Sei. USA 70, 765-768, 1973 und Vater, W.; Böhm, K.; Unger, E., „Effects of DNA on the taxo stimulated in vitro assembly of microtubule protein from porcine brain ", Studio Biophys. 97, 47-60, 1983 ausführlich beschrieben. Die Mikrotubuli werden in vitro mit GTP (Guanosin-5'-Triphosphat Trinatriumsalz Monohydrat) und Taxol (aus Taxus brevifolia) bei 37 °C assembliert und weitgehend vom nicht assemblierten Protein getrennt.
Die Aktivierung der assemblierten Mikrotubuli erfolgt erfindungsgemäß so, daß den assemblierten Mikrotubuli eine gesättigte Pd-Acetatlösung zugesetzt wird und diese Lösung zur Ausbildung von Pd-Keimen auf der Oberfläche der Mikrotubuli führt. Vorteilhaft kann in diesem Prozeß neben der Adsorbtion von in der Aktivierungslösung gebildeten Pd-Partikeln an der Oberfläche der Mikrotubuli die Fähigkeit der die Tubulinstruktur bildenden
2-f- Ω
Aminosäurengruppen zur Reduktion von Pd zu Pd genutzt werden. Bei diesem Prozeß entstehen auf der Oberfläche der Mikrotubuli Pd-Cluster, deren Größe und Verteilung von der Länge des Aktivierungsprozesses abhängt. Bei einer mittleren Clustergröße von 2 nm ist auch eine Aktivierung der inneren Oberfläche der Mikrotubuli möglich. Vorteilhaft wird der Aktivierungsprozeß für die Dauer von 2 h geführt. Die aktivierten Mikrotubuli werden anschließend von der Aktivierungslösung getrennt, gewaschen und in eine Pufferlösung überführt.
An die Aktivierung schließt sich die eigentliche Metallisierung an. Die gebräuchlichsten Metallisierungsbäder für Kupfer und Nickel arbeiten bei Temperaturen über 60 °C und einem pH-Wert größer 8 (siehe Charles, R.; Shipley, Jr., „Historical Highlights of elektroless plating", Plating and Surface Finishing, 92-99, 1984 und Lang, K., „Die stromlose Vernickelung", Galvanotechnik Nr. 6, 347-358, 1965). Um eine stromlose Beschichtung auf den aktivierten Proteinstrukturen zu realisieren, müssen aber die Beschichtungsbedingungen an die sehr empfindlichen Assemblierungsbedingungen der Proteinstrukturen angepaßt werden, damit während der Metallisierung das biomolekulare Templat nicht zerfällt bzw. dessen Morphologie nicht wesentlich gestört wird.
Die in vitro vorliegenden aktivierten Mikrotubuli werden mit einem Ni-Bad auf der Basis von Dimethylaminoboran als Reduktionsmittel und Ni-Acetat oder Ni-Sulfat als zu reduzierendes Metallsalz versetzt. Aus dieser Lösung scheiden nach einer Dauer von ca. 1 min die metallisierten Mikrotubuli aus. Die abgeschiedene Nickelschicht ist bei einer Schichtdicke von rund lO nm auf den Mikrotubuli geschlossen und zeigt neben elektrischen auch magnetische Eigenschaften. Die Dicke der erzeugten Metallschichten, die bei pH zwischen 6,2 und 7,0 und Temperaturen zwischen 22 °C und 37 °C abgeschieden werden, hängt von der Dauer des Metallisierungsprozesses ab. Es sind neben sehr dünnen Metallschichten (Dicke rund 10 nm) auch Schichten von mehreren lOO nm Schichtdicke auf der Oberfläche der Mikrotubuli realisierbar, wobei die Ausgangsmorphologie der einzelnen Mikrotubuli erhalten bleibt. Aufgrund dessen, daß die eingesetzten Mikrotubuli einen sehr kleinen Durchmesser von 25 nm besitzen, ist es möglich, metallische Röhren zu erzeugen, die einen Durchmesser von 35 nm bis zu einigen 100 nm besitzen, je nachdem wieviel Metall auf den Mikrotubuli abgeschieden wird. Da die eingesetzten Mikrotubuli in ihrem Durchmesser gleich sind, gibt es zwischen den einzelnen metallisierten Strukturen keine Unterschiede bezüglich deren Durchmesser, was gleiche elektrische und magnetische Eigenschaften zur Folge hat. Des weiteren besitzen die Mikrotubuli eine Länge von mehreren Mikrometer und somit ein großes Aspektverhältnis (Länge : Breite). Dies macht sie für Anwendungen, in denen es auf eine Positionierung und Fixierung der Metallröhrchen ankommt, besonders geeignet.
Das beschriebene Verfahren der Aktivierung und Metallisierung ist nicht tubulinspezifisch. Es läßt sich auch auf die anderen erfindungsgemäßen Proteinstrukturen anwenden.
Die Aktivierung der Proteine kann nach einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens auch so erfolgen, daß z. B. nach der Reinigung erhaltene S-Layer der Sporosarcina ureae entweder mit einer K2PtCl4 Lösung versetzt werden oder daß die S-Layer zuvor wie bei Pum, D.; Weinhandl, M.; Hödl, C; Sleytr, U., „Large-Scale recrystallization of the S-Layer of Bacillus coagulans E38-66 at the air/water interface and on lipid films", J. Bacteriology, May 2762-2766, 1993 beschrieben, an einer Grenzfläche rekristallisieren und anschließend die Subphase der Rekristallisationslösung durch eine K2PtCl4 Lösung ersetzt wird. Je nach Dauer der Reaktionszeit kommt es zur Bildung von Pt-Cluster auf der Oberfläche der S-Layer. Vorteilhaft kann in diesem Prozeß der Pt2+- Reduktion zu Pt° neben dem im Fall der Aktivierung der Mikrotubuli angegeben reduzierenden Wirkung bestimmter Aminosäuren und der Reduktion des Pt-Salzes durch in der Lösung enthaltende Zusätze wie NaN3, die spezifischen Absorption der Pt-Cluster auf Grund der ausgeprägten Ladungsverteilung auf dem S-Layer genutzt werden.
Die so erhaltenen regelmäßigen Anordnungen von Pt-Cluster mit einer Größe von 1 bis 2 nm sind vor allem hinsichtlich der Anwendung der katalytischen Aktivität der abgeschiedenen Cluster interessant. Zudem kann auch wie im Ausführungsbeispiel für die Metallisierung der Mikrotubuli angegeben, durch stromlose Metallisierung ein kontinuierlicher Metallfilm abgeschieden werden. Anhand nachfolgender Ausführungsbeispiele und beigefügter Abbildungen soll die Erfindung näher erläutert werden. Dabei zeigen:
Abb. 1 REM- Aufnahme metallisierter Mikrotubuli
Abb. 2 TEM- Aufnahme aktivierter S-Layer der Sporosarcina ureae
Ausfuhrungsbeispiel 1
Beschrieben wird die Herstellung von dreidimensionalen Metallstrukturen auf der Basis von Mikrotubulitemplaten. Zunächst werden die Mikrotubuli wie folgt assembliert:
Die Isolation und Reinigung von Tubulin ist bei Shelanski, M.; Gaskin, F.; Cantor, C, „Mikrotubule assembly in the absence of added nuclotides" , Proc. Nat. Acad. Sei. USA 70, 765-768, 1973 und Vater, W.; Böhm, K.; Unger, E., „Effects ofDNA on the taxo stimulated in vitro assembly of microtubule protein from porcine brain ", Studio Biophys. 97, 47-60, 1983 ausführlich beschrieben. Die Assemblierung von Mikrotubuli aus einer Tubulinpräparation mit einer Konzentration von 1 mg/ml Tubulin erfolgt in einer Pufferlösung von 500 mM MES (2-Morpholinoethansulfonsäure Monohydrat), 1 mM EGTA (Ethylenglykol-bis-(2- Aminoethyl)-Tetraessigsäure) und 0,5 mM MgCl2 durch Zugabe von 0,25 mM GTP und 10 μM Taxol bei einer Temperatur von 37 °C. Um die Assemblierung zu verfolgen, wird die Trübung der Assemblierungslösung mit einem Spektrometer bei einer Wellenlänge von 350 nm aufgezeichnet, bis eine Sättigung zu beobachten ist. Danach wird die Lösung bei 14000 Umdrehungen/Minute 30 min zentrifugiert um die assemblierten Mikrotubuli und das nicht assemblierte Protein zu trennen. Der so erhaltene Bodensatz wird wieder in einen MES Buffer bei pH = 6,8 überfuhrt. Die so erhaltene Präparation ist Ausgangspunkt für alle weiteren Aktivierungs- und Metallisierungsschritte.
Ein Volumen von 300 μl dieser Lösung mit den assemblierten Mikrotubuli wird zum Zweck der Aktivierung der Mikrotubulioberfläche mit dem gleichen Volumen einer gesättigten Palladiumacetatlösung versetzt. Im Aktivierungsprozeß wird diese Lösung stehengelassen, bis eine ausreichende Anzahl von Pd-Keimen auf den Mikrotubuli entstehen (ca. 2 h). Danach 8 werden die aktivierten Mikrotubuli mit MES-Puffer unter der Verwendung eines 300 kDa Membranfilters zweimal gewaschen. Der erzeugte Rückstand im Membranfilter wird in 500 μl MES-Puffer überführt.
Bei der Untersuchung dieser Probe im Transmissionselektronenmikroskop ist deutlich die Anlagerung von schwarzen Partikeln an der Oberfläche der Mikrotubuli sichtbar. Der Durchmesser der Partikel lag bei 2 Stunden Aktivierung bei rund 2 nm. Hier muß angemerkt werden, daß es für das Beschichtungsverfahren nicht wesentlich ist, ob die angelagerten Palladiumcluster bereits in reduzierter Form oder noch als Pd2+-Ionen vorliegen, die dann erst in der Startphase der Metallisierung im Dimethylaminoboranbad reduziert werden. Mit einem energiedispersiven Röntgenmikrobereichsanalysator wurde die Zusammensetzung dieser Cluster bestimmt und festgestellt, daß sie zu 99 % aus Palladium bestehen.
Die so erhaltenen Mikrotubuli mit Pd - bzw. Pd -Cluster auf der Oberfläche können stromlos beschichtet werden. Hierzu wird ein Nickelbad der folgenden Zusammensetzung verwendet:
50 g/1 Ni(CH3COO)2-6H2O 25 g/1 Natriumeitrat 25g/l 85%-ige Milchsäure 2,5 g/1 Dimethylaminoboran.
Der pH-Wert dieses Metallisierungsbades wird mit NH4OH auf einen Wert von 6,8 eingestellt.
500 μl der Lösung mit den aktivierten Mikrotubuli werden mit der gleichen Menge des oben beschriebenen Metallisierungsbades versetzt. Nach rund 1 min fallen aus dieser Lösung schwarze Partikel, die die metallisierten Mikrotubuli darstellen, aus. Der weiterlaufende Metallisierungsprozeß läßt sich durch starkes Verdünnen der Lösung mit MES-Puffer abbrechen. Auf diese Weise können Mikrotubuli mit verschiedenen Metallfilmdicken erzeugt werden.
Die nickelmetallisierten Mikrotubuli wurden im Transmissionselektronenmikroskop und Rasterelektronenmikroskop bei einer Beschleunigungsspannung von 1 kV untersucht. Eine entsprechende Aufnahme ist in Abb. 1 dargestellt. Die abgeschiedenen Ni-Partikel besitzen eine Größe von rund 8 - 10 nm, die bei einer Schichtdicke ab 10 nm einen geschlossenen, elektrisch leitenden Film bilden. Ersichtlich ist, daß die Metallisierung nur an mit Pd-Keimen besetzten Stellen der Mikrotubuli beginnt. Das bedeutet, eine Abscheidung von Nickel aus der Metallisierungslösung ist nur nach einer Aktivierung der Mikrotubulioberfläche mit Katalysatorkeimen möglich.
Der magnetische Charakter der Nickelbeschichtung konnte durch Manipulation der metallisierten Mikrotubuli in wäßriger Lösung mit Hilfe eines elektromagnetischen Feldes und durch magnetische Rasterkraftmikroskopie nachgewiesen werden.
Ausführungsbeispiel 2
Die Assemblierung der Mikrotubuli und deren Aktivierung wird wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Im Gegensatz zum Beispiel 1 wird Nickel aus einem Nickelsulfatkomplex abgeschieden. Die Zusammensetzung des Metallisierungsbades ist wie folgt:
39,4 g/1 NiSO4-6H2O 20 g/1 Natriumeitrat 10g/l 85%-ige Milchsäure 4g/l Dimethylaminoboran.
Die pH- Wert Einstellung von 6,8 erfolgt ebenfalls mit NH4OH. Die Abscheideraten dieses Bades liegen in der gleichen Größenordnung wie die des Bades im Beispiel 1, so daß eine Beschichtung von rund 1 min Dauer für die Erzeugung einer kontinuierlichen Ni-Schicht auf den Mikrotubuli ausreicht.
Der magnetische Charakter der Nickelbeschichtung konnte, wie in Ausführungsbeispiel 1 dargelegt, nachgewiesen werden.
Ausführungsbeispiel 3 Die Assemblierung der Mikrotubuli und deren Aktivierung wird wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Im Gegensatz zum Beispiel 1 wird statt Nickel eine Cobaltschicht auf den aktivierten Mikrotubuli abgeschieden. Die Zusammensetzung des Metallisierungsbades ist wie folgt:
25g/l CoS04 »7H20
25g/l Bernsteinsäure
4g/l Dimethylaminoboran
Der pH- Wert des Bades wird mit NH4OH auf 6.8 eingestellt. Die Abscheiderate dieses Bades ist etwas um den Faktor 2 geringer als die Abscheideraten der Ni-Bäder, so daß eine Beschichtungsdauer von rund 2min für die Erzeugung einer kontinuierlichen Co-Schicht auf den Mikrotubuli ausreicht.
Der magnetische Charakter der Cobaltbeschichtung konnte wie in Ausführungsbeispiel 1 dargelegt nachgewiesen werden.
Ausführungsbeispiel 4
Die Assemblierung der Mikrotubuli wird wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
Zum Zweck der Aktivierung der Mikrotubulioberfläche wird ein Volumen von 300 μl assemblierter Mikrotubuli mit einer 3 mM K2PtCl4-Lösung oder einer 3 mM Na2PdCl4- Lösung versetzt. Das Gesamtvolumen der Aktivierungslösung wird auf 1000 μl mit MES- Puffer aufgefüllt. Im Aktivierungsprozeß wird diese Lösung stehengelassen, bis eine ausreichende Anzahl von Pt- bzw. Pd-Keimen auf den Mikrotubuli entstanden sind (ca. 2h). Danach erfolgt die Filtration der aktivierten Mikrotubuli wie im Ausführungsbeispiel 1 angegeben.
Die anschließende Metallisierung wird analog zum Ausführungsbeispiel 1 durchgeführt.

Claims

Ausführungsbeispiel 5Beschrieben wird die Herstellung einer zweidimensionalen regelmäßigen Anordnung von Pt- Cluster auf der Oberfläche des S-Layer Proteins Sporosarcina ureae.Die Isolation und Reinigung des S-Layerproteins ist bei Engelhard H.; Saxton, W.; Baumeister, W., „Three-dimensional structure of the tetragonal surface layer of Sporosarcina ureaa", J. Bacteriology, Oct. 309-317, 1986 ausführlich beschrieben. Die so enthaltenen S- layersheets werden in einer 50mM Phosphatpufferlösung (pH 7,8) mit ImM MgCl2 bei 4°C gelagert. Um das Bakterienwachstum in der Proteinlösung zu unterbinden und als zusätzliches Reduktionsmittel für die Aktivierungsreaktion hat sich ein Zusatz von 3mM NaN3 als hilfreich erwiesen. Diese S-Layer Lösung mit einer Proteinkonzentration von lOmg/ml ist Ausgangspunkt für alle weiteren Aktivierungsschritte.Ein Volumen von 30 μl dieser Proteinlösung wird mit einer 3mM K2PtCl4 Lösung , die ein Tag zuvor angesetzt wurde, versetzt. Das Gesamtvolumen der Aktivierungslösung beträgt lml. die Aktivierungslösung wird 24h stehen gelassen bis eine ausreichende Anzahl von Pt- Clustern auf der S-Layer Oberfläche entstanden sind. Danach werden die aktivierten S-Layer mit Phosphatpuffer unter Verwendung eines 300kDa Membranfilters gewaschen. Der erzeugte Rückstand im Membranfilter wird in 500μl Phosphatpuffer überführt.Zur Untersuchung der Proben werden die aktivierten S-Layer auf einem Transmissionselektronenmikroskop-Grid imobilisiert. Die transmissions- elektronenmikroskopische Aufnahme in Abbildung 2 zeigt deutlich die Ablagerung von Pt- Cluster mit einem mittleren Durchmesser von 1,5 nm. Weiterhin erkennt man deutlich, die periodische Anordnung der Pt-Cluster, die sich an der vielzähligen Symmetrie des S-Layers Sporosarcina ureae orientieren. Der mittlere Abstand zwischen den Pt-Cluster von rund 3 nm, läßt den Schluß zu, daß pro Einheitszelle 4 Pt-Cluster abgeschieden wurden. Die chemische Zusammensetzung der abgeschiedenen Cluster wurde mittels einer energiedispersiven Röntgenmikrobereichsanalyse mit 99 % Platin bestimmt. 12Patentansprüche:
1. Metallische Nanostruktur, bestehend aus einem metallisierten, selbstassemblierten, geometrisch hochgeordneten Protein.
2. Metallische Nanostruktur nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das selbstassemblierte hochgeordnete Protein teilweise oder vollständig metallisiert ist.
3. Metallische Nanostruktur nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das selbstassemblierte, geometrisch hochgeordnete Protein eine Tubulin enthaltende Struktur oder ein bakterielles Zeilhüllenprotein oder ein Kollagen oder ein Actinfϊlament oder ein DNA-Strang ist.
4. Metallische Nanostruktur nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das selbstassemblierte geometrisch hochgeordnete Protein ein Mikrotubuli ist.
5. Metallische Nanostruktur nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das selbstassemblierte geometrisch hochgeordnete Protein ein S-Layer ist.
6. Metallische Nanostruktur nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das selbstassemblierte geometrisch hochgeordnete Protein ein S-Layer der Sporosarcina ureae ist.
7. Metallische Nanostruktur nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die selbstassemblierten, geometrisch hochgeordneten Proteine mit vollständiger Metallisierung eine Metallisierung aus einer homogenen Metallphase aufweisen, in die Keimbildungszentren eines anderen Metalles eingebettet sind.
8. Metallische Nanostruktur nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die selbstassemblierten, geometrisch hochgeordneten Proteine mit teilweiser Metallisierung eine Metallisierung aus einer Metallphase, in die Keimbildungszentren eines anderen Metalles eingebettet sind, oder Keimbildungszentren eines Metalles aufweisen.
9. Metallische Nanostruktur nach Anspruch 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Keimbildungszentren aus Edelmetallen oder Schwermetallen und die Metallphase aus Kupfer oder Nickel oder Cobalt besteht.
10. Verfahren zur Herstellung metallischer Nanostrukturen auf der Basis selbstassemblierter, geometrisch hochgeordneter Proteine, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteine mit einer Metallösung aktiviert und anschließend stromlos in einem Metallisierungsbad unter für Protein verträglichen Bedingungen metallisiert werden.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß als selbstassemblierte, geometrisch hochgeordnete Proteine Tubulin enthaltende Strukturen oder bakterielle Zeilhüllenproteine oder Kollagen oder Actinfilamente oder DNA-Stränge eingesetzt werden.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß als selbstassemblierte, geometrisch hochgeordnete Proteine Mikrotubuli oder S-Layer eingesetzt werden.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß als selbstassemblierte geometrisch hochgeordnete Proteine S-Layer des Sporosarcina ureae eingesetzt werden
14. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die selbstassemblierten geometrisch hochgeordneten Proteine vor der Aktivierung zusätzlich in vitro assembliert werden.
15. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteine mit einer Edelmetall- oder Schwermetallösung aktiviert werden.
16. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteine mit einer Palladium- oder Platinsalzlösung aktiviert werden.
17. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteine mit einer gesättigten Palladium-Acetatlösung, oder eine K2PtCl4 oder eine Na2PdCl4 Lösung aktiviert werden.
18. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Metallisierung mit einem Metallisierungsbad auf Basis Dimethylaminoboran als Reduktionsmittel und Nickel- oder Kupfer- oder Cobaltsalzen erfolgt.
19. Verfahren nach Anspruch 10, gekennzeichnet dadurch, daß die Metallisierung mit einem Metallisierungsbad erfolgt, indem Hypophosphit als Reduktionsmittel verwendet wird.
20. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung metallischer Nanostrukturen mit teilweiser Metallsierung die Proteine mit einer Metallösung aktiviert werden.
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