DE60106425T2

DE60106425T2 - Verfahren zur selektiven Metallisierung von Nukleinsäuren durch ex-situ hergestellte metallische Nanopartikel

Info

Publication number: DE60106425T2
Application number: DE60106425T
Authority: DE
Inventors: William E. Ford; Jurina Wessels; Oliver Harnack; Akio Yasuda
Original assignee: Sony International Europe GmbH
Current assignee: Sony Deutschland GmbH
Priority date: 2001-08-03
Filing date: 2001-08-03
Publication date: 2005-02-17
Anticipated expiration: 2021-08-04
Also published as: DE60106425D1; CN1402363A; EP1283526A1; EP1283526B1; CN1208852C; JP2003133541A; US20030027195A1; US6884587B2; KR20030011721A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die Metallisierung von Nukleinsäuren unter der Verwendung von vorgeformten Metall-Nanopartikeln, die spontan an Nukleinsäuren binden. Die angebrachten Partikel werden dann über elektrofreie Abscheidung erweitert. Die Partikel und die metallisierten Nukleinsäuren können bei der Bildung von Nanodrähten, für elektronische Netzwerke und Schaltkreise verwendet werden, was eine Anordnung mit hoher Dichte ermöglicht. Eine weitere Anwendung ist unter der Verwendung der einzelnen Elektronen-Ladungseigenschaften der isolierten Nukleinsäure-templierten Nanopartikel, z. B. für Speichervorrichtungen, möglich.
Die elektronische Industrie zeigt ein konstantes Bemühen bei dem Erhalten von Leitungen und Schaltkreisen mit hoher Dichte. Ein Schlüsselpunkt zur Erreichung dieses Ziels ist es, die einzelnen Leitungen so klein wie möglich zu machen. Ein im Stand der Technik bekannter Ansatz ist die Metallisierung von Nukleinsäuren, die, sobald metallisiert, als ein elektrisch leitender Draht dienen.
Zusätzlich ist die "Metallierung" von Nukleinsäuren bekannt, die den Prozeß der direkten Bindung zwischen einem Metallatom und einer Stelle innerhalb der Nukleinsäure, insbesondere an die N-7-Atome der Purin-Nukleotide (G und A) betrifft. Solche Reaktionen wurden aufgrund ihrer Relevanz für die Mechanismen von anti-Krebswirkstoffen, am herkömmlichsten Pt (II) oder Pt (IV)-Komplexen ("Platinierung") untersucht. Andere Metallkomplexe, die dieses Verhalten zeigen, schließen die Komplexe von Pd, Ru, Au, Rh ein. Der Komplex erfordert mindestens einen "labilen" Liganden als eine "Abspaltungsgruppe", um auf diese Weise zu binden.
Weiterhin wurden Nukleinsäure-bindende Mittel als anti-Krebswirkstoffe großflächig untersucht. Nicht-kovalente Bindungsmittel schließen "Interkalatoren" und "Furchen-Binder" ein. Mittel, die kovalent binden, werden im allgemeinen "Alkylatoren" genannt. Viele Beispiele dieser Klasse von Mitteln sind bekannt, sowie Moleküle mit kombinierten Funktionen. Die 55.393 Selektivität in Richtung spezifischer Basenpaarkombinationen oder Sequenzen oder anderer "Erkennungsstellen" ist in einem hohen Ausmaß einstellbar (z. B. "Wirkstoff-Targeting").
WO 99/0444, veröffentlicht am 28. Januar 1999, beschreibt ein 3-Schrittverfahren für die Metallisierung von DNA. Zuerst werden Silberionen (Ag⁺) entlang der DNA durch Ag⁺/Na⁺ Ionenaustausch und Bildung von Komplexen zwischen dem Ag⁺ und den DNA-Nukleotidbasen angeordnet. Der Silberionen/DNA-Komplex wird dann unter der Verwendung einer basischen Hydrochinonlösung reduziert, um Silber-Nanopartikel zu bilden, die an das DNA-Gerüst gebunden sind. Die Silber-Nanopartikel werden anschließend unter Verwendung einer sauren Lösung von Hydrochinon und Ag⁺ unter abgedunkelten Bedingungen "entwickelt", ähnlich zu Standard-photographischen Verfahren. Dieses Verfahren produziert Silberdrähte mit einer Breite von ungefähr 100 nm mit einem differentiellen Widerstand von ungefähr 10 MΩ.
Weiterhin beschreiben Pompe et al. (Pompe et al. (1999) Z. Metallkd. 90, 1085; Richter et al. (2000) Adv. Mater. 12, 507) DNA als ein Templat für die Metallisierung, um metallische Nanodrähte zu produzieren. Ihr Metallisierungsverfahren schließt eine Behandlung der DNA mit einer wäßrigen Lösung von Pd(CH₃COO)₂ für 2 Stunden ein, dann Hinzufügen einer Lösung von Dimethylboran (DMAB) als reduzierendem Mittel. Paladium-Nanopartikel mit einem Durchmesser von 3–5 nm wachsen innerhalb von ein paar Sekunden auf der DNA, nachdem das reduzierende Mittel hinzugefügt wurde. Nach ungefähr 1 Minute wird eine quasi-durchgehende Bedeckung erreicht, wobei die metallischen Aggregate in ihrer Größe 20 nm betragen.
Es gibt zwei kürzliche Publikationen, in denen positiv geladene Gold-Nanopartikel an die DNA über elektrostatische Anordnung angebracht wurden [Kumar et al. (2001) Advanced Materials, Vol. 13, S 341; Sastry et al. (2001) Applied Physics Letters, Vol. 78, S. 2943]. Diese Artikel diskutieren keine Vergrößerung der angebrachten Partikel über elektrofreies Überziehen. Richter et al. haben einen Artikel über die DNA-Metallisierung veröffentlicht [Richter et al. (2001) Applied Physic Letters, Vol 78, S. 536]. Auch bemerkt wurde ein Artikel, in dem DNA durch das Verdampfen von Gold metallisiert wurde [Quake and Scherer (2000) Science, Vol. 290, p. 1536] und einer, in dem DNA dazu verwendet wurde, vorgeformte Goldnanodrähte zusammenzufügen [Mbindyo et al. (2001) Advanced Materials, Vol. 13, S. 249]. Keine dieser oben erwähnten Publikationen scheint einen direkten Einfluß auf die vorliegende Erfindung zu haben. Es gibt ebenfalls mehrere kürzliche Artikel und Patente, in denen Metall-Nanopartikel, insbesondere Gold, für diagnostische Anwendungen an Oligonukleotide gebunden wurden, jedoch betreffen diese Dokumente die vorliegende Erfindung ebenfalls nicht.
EP 00 126 966.1 beschreibt die Metallisierung von Nukleinsäuren über Metall-Nanopartikel, die ex-situ produziert wurden. Dies stellt eine Verbesserung zu den oben genannten Verfahren des Stands der Technik dadurch dar, daß eine Selektivität über die an die Nanopartikel angebrachte(n) Nukleinsäure-bindende Gruppe(n) zur Verfügung gestellt wird. Trotzdem weist dieser Ansatz zwei nach Nachteile auf. Ein Nachteil ist, daß er die Synthese von Molekülen erfordert, die in der Lage sind, sowohl an Nukleinsäuren und Nanopartikel zu binden (als "Linkermoleküle" bezeichnet).
Der in EP 00 125 823.5 beschriebene "in-situ"-Ansatz umgeht viele dieser Nachteile, führt jedoch einen weiteren ein. Ein Nachteil des in-situ-Ansatzes ist, daß die Dichte von Nanopartikelkern-bildenden-Stellen durch die Dichte der Metallkomplexbindung an die Nukleinsäuren im ersten Schritt des Verfahrens begrenzt ist. Diese Begrenzung wird durch die Tatsache verstärkt, daß jeder während des zweiten (Reduktions-)Schritts gebildeter Partikel mehrere Zehnfache an Metallatomen enthalten kann. Weiterhin, obwohl einige Kontrolle über die Stellen auf den Nukleinsäuren vorhanden ist, wo die Komplexe binden, macht es die Diffusion der Atome während des zweiten Schritts schwierig, die Position der sich ergebenden Partikel vorherzusagen.
Die Techniken der Nukleinsäuresynthese und Modifikation waren der Gegenstand von zahlreichen Publikationen. Insbesondere sind diese Verfahren in den Büchern Bioorganic Chemistry: Nucleic Acids (herausgegeben von S. M. Hecht, Oxford University Press, 1996) und Bioconjugate Techniques (von G. T. Hermanson, Academic Press, 1996) beschrieben. Genauer gesagt beschreibt das Kapitel von M. van Cleve in Bioorganic Chemistry: Nucleic Acids (Kapitel 3, Seiten 75–104) die Techniken von "Annealing" und "Ligation" zur Zusammenfügung von doppelsträngigen Nukleinsäuren aus kleineren Einheiten. Das Kapitel von M. J. O'Donnell und L. W. McLaughlin in demselben Buch (Kapitel 8, Seiten 216–243) und ein Kapitel in Bioconjugate Techniques (Kapitel 17, Seiten 639–671) beschreibt Verfahren für die chemische Modifikation von Nukleinsäuren und Oligonukleotiden und die kovalente Anbringung von Reportergruppen (Fluorophore, Zentrifugationsmarker, usw.). Diese Techniken wurden auch dazu verwendet, um Metallkomplexe anzubringen, die zum Beispiel als redoxaktive Mittel und Katalysatoren für die Bindungsspaltung dienen, jedoch wurden sie nicht für Metallisierungszwecke verwendet.
Ein Beispiel der chemischen Modifikation ist die "Bromaktivierung". Die Reaktion mit N-Bromsuccinimid bewirkt zum Beispiel die Bromierung an der C-8-Position von Guaninresten und C-5 von Cytosin. Amin-Nukleophile können dann an diese Positionen durch nukleophilen Ersatz gekoppelt werden, um verschiedene funktionelle Gruppen in die Nukleinsäuren einzuführen. Die Stellen der Veränderung unter Verwendung dieses Verfahrens sind nicht an der Wasserstoffbrückenbildung während der Basenpaarung beteiligt, daher werden die Hybridisierungseigenschaften nicht wesentlich gestört.
"Zwei-Schritt" elektrofreie Überziehungsverfahren sind aus zum Beispiel US 5,503,877 und US 5,560,960 bekannt. Das zu überziehende Substrat wird zuerst gegenüber einer Lösung ausgesetzt, die Metallionenspezies enthält und dann gegenüber einer Lösung eines reduzierenden Mittels, das die Metallionenspezies zu einem Metallkatalysator reduziert. Das katalytische Metall ist gewöhnlicherweise Pd, kann aber auch mindestens eines von Pd, Cu, Ag, Au, Ni, Pt, Ru, Rh, Os und Ir sein und wird gewöhnlicherweise mit einem organischen Liganden kombiniert, der mindestens ein Stickstoffatom enthält. Das abgelagerte Metall kann magnetisch sein, z. B. Co, Ni, Fe und Legierungen, die durch das reduzierende Mittel eingeführtes B oder P enthalten können (z. B. Borhydrid oder Hypophosphit, siehe US 3,986,901 ; US 4,177,253 ).
Die gemäß dem Verfahren von Duff et al. präparierten Goldnanopartikel sind strukturell zu den Phosphin-stabilisierten M₅₅-Partikeln verwand, die durch Schmid patentiert wurden [U.S. Patent 4,454,070 (1984)], wobei M ein Übergangsmetall einschließlich Au, Rh, Ru, Pd, Ni und Co ist. Sie sind ähnlich zu den wasserlöslichen Phosphin-stabilisierten Goldpartikeln verwandt, die durch Heinfeld et al. [U.S. Patent 5,360,895 (1994) und U.S. Patent 5,521,289 (1996)] patentiert wurden, wobei das Phosphin ein Triphenylphosphinderivat ist. Es gibt keine Berichte von Goldpartikeln, die gemäß dem Verfahren von Duff et al. präpariert wurden, die mit Nukleinsäuren kombiniert wurden oder eine Verwendung dieses Ansatzes für die Synthese von Nanopartikeln von anderen Metallen oder Metallegierungen. Jedoch sollte das letztgenannte möglich sein, da stabile wasserlösliche Komplexe von Tris(hydroxymethyl)phosphin (THP) mit verschiedenen Metallen bekannt sind (z. B. Ni(0), Pd(0), Pt(0) [Ellis et al. (1992) Inorganic Chemistry, Vol. 31, S. 3026] zusätzlich zu Au(I) [Berning et al. (1998) Nuclear Medicine & Biology, Vol. 25, S. 577].
Während der Synthese der Partikel gemäß Duff et al. treten wahrscheinlich die folgenden Reaktionen auf.

(1) Neutralisierung von Tetrakis(hydroxymethyl)phosphoniumchlorid (THPC) durch Natriumhydroxid erzeugt Tris(hydroxymethyl)phosphin (THP) und Formaldehyd: P(CH₂OH)₄₊ + OH^– → P(CH₂OH₃) + H₂CO + H₂O
(2a) Reduktion von Wasserstofftetrachloraurat (III) durch THP in Anwesenheit von Natriumhydroxid erzeugt metallisches Gold und das Phosphinoxid: H[AuCl₄] + 3H₂CO + 16OH^– → 2Au⁰ + 2OP(CH₂OH)₃ + Cl^– + 5H₂O
(2b) Das in der Reaktion (1) erzeugte Formaldehyd kann auch als das reduzierende Mittel dienen: 4H[AuCl₄] + 3H₂CO + 16OH^– → 4Au⁰ + 3CO₂ + 16Cl^– + 13H₂O
(2c) Die Reduktion von H[AuCl₄] durch THP kann auch THP-Gold(I)-Komplexe erzeugen, z. B.: H[AuCl₄] + 5P(CH₂OH)₃ + 3OH^– → [Au{P(CH₂OH)₃}₄]⁺ + OP(CH₂OH)₃ + 4Cl^– + 2H₂O

Duff et al. führten eine Elementaranalyse ihrer getrockneten Präparation nach Dialyse derselben, um Nebenprodukte und Salze zu entfernen, durch und fanden, daß diese 7% P enthielt.
Aminomethylderivate von Tris(hydroxymethyl)phosphin (THP): THP (P(CH₂OH)₃) ist ein Derivat von Phosphin (PH₃) und Formaldehyd (3 × H₂CO). Als solches kondensiert es mit primären (RNH₂) und sekundären (R¹R²NH) Aminen in Reaktionen, die mit Mannich-Reaktionen verwandt sind, um Aminomethylphosphinderivate zu bilden (GB Patent 842,593 (1969); Daigle et al. (1974) Journal of Heterocyclic Chemistry, Vol 11, S. 407; Henderson et al. (1994) Journal of the Chemical Society, Chemical Communications, S. 1863; U.S. Patent 5,948,386 (1999); Berning et al. (1999) Journal of the American Chemistry Society, Vol. 121, S. 1658; Krauter und Beller (2000) Tetrahedron, Vol. 56, S. 771). Wie THP bilden Komplexe von Aminomethylphosphinderivaten stabile wasserlösliche Metallkomplexe [Joó et al. (1996) Journal of Oragnometallic Chemistry, Vol. 512, S. 45; Otto et al. (1998) Inorganic Chemistry Communications, Vol. 1, S. 415; Kovács et al. (2000) Comptes Rendus de l'Académie des Sciences – Series IIC – Chemistry, Vol. 3, S. 601]. Daher ist es möglich, DNA-bindende Mittel durch solche Modifikationen an Metall-Nanopartikel anzuhängen. Obwohl die THP-Au-Partikel bereits DNA-bindende Tendenzen aufweisen, können zum Beispiel angehängte Bindungsgruppen dazu verwendet werden, um die Bindung zu stärken oder eine größere Spezifität einzuführen.
Moleküle, die viele OH-Gruppen enthalten ("Polyole"), wie zum Beispiel Zucker, binden an DNA [Del Vechio et al. (1999) International Journal of Biological Macromolecules, Vol. 24, S. 361; Hayashida et al. (2001) Chemistry Letters, S. 272], und es wurde vorgeschlagen, daß die Saccharidreste von einigen Antibiotika und anderen anti-Krebsmitteln möglicherweise als generelle Bindungselemente für DNA-Furchen fungieren. [Nicolaou et al. (1992) Journal of the American Chemical Society, Vol. 114, S. 7555]. Die Wasserstoffbrückenbindung ist möglicherweise für solche Bindungsinteraktionen wichtig. Von bestimmten wasserlöslichen Verbindungen ist bekannt, daß sie die Wasserstoffbrückenbindung verstärken. Diese Verbindungen sind im allgemeinen als "Kosmotrophe" (d. h. Struktur-bildende) Mittel oder "Osmolytika" bekannt [Arakawa und Timasheff (1985) Biophysical Journal, Vol. 47, S. 411; Galinski et al. (1997) Comprehensive Biochemistry and Physiology, Vol. 117A, S. 357]. Beispiele von kosmotrophen Mitteln sind Betain, Prolin und Dimethylsulfoxid.
Demzufolge ist es die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe, ein verbessertes Verfahren zur Metallisierung von Nukleinsäuren über ex-situ produzierte Metall-Nanopartikel zur Verfügung zu stellen, das zum Beispiel bei der Bildung von Nanodrähten für elektronische Netzwerke und Schaltkreise verwendet werden kann und eine Anordnung hoher Dichte erlaubt. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren für die Metallisierung von Nukleinsäuren über Metall-Nanopartikel, produziert ex-situ, zur Verfügung zu stellen, das bei der Bildung von Nukleinsäuretemplat-isolierten Partikeln-Ketten verwendet werden kann, die für die Herstellung von z. B. Speichervorrichtungen basierend auf Einzelelektronen-Ladungscharakteristika verwendet werden können.
Diese Aufgabe wird durch das erfindungsgemäße Verfahren für die Metallisierung von Nukleinsäuren gelöst, wobei:
Tris(hydroxymethyl)phosphin-Au (THP-Au)-Partikel oder Derivate davon zur Verfügung gestellt werden, diese Partikel an eine Nukleinsäure gebunden werden, um eine Metallnanopartikel-Nukleinsäure-Kompositstruktur herzustellen, und, für den Fall das ein Nanodraht gewünscht wird, die Metallnanopartikel-Nukleinsäure-Kompositstruktur mit einer elektrofreien Überzugslösung behandelt wird.
Während Forschungsarbeiten im Zusammenhang mit der Metallisierung von Nukleinsäuren beobachteten wir überraschenderweise (durch AFM) ein sehr gutes Templieren der THP-Au-Partikel auf der Nukleinsäure, wenn sie miteinander in Lösung inkubiert wurden oder wenn die Nukleinsäure gegenüber den Partikeln auf dem Substrat ausgesetzt wurde. Wir fanden auch, daß die templierten Partikel recht aktiv gegenüber elektrofreien Gold- und Silber-überziehenden Lösungen waren. Wir wissen, daß die Partikel vorherrschend negativ geladen sind. Da Nukleinsäuren auch negativ geladen sind, ist der Bindemechanismus kein Ergebnis von elektrostatischen Interaktionen. Daher unterscheidet sich dieser Mechanismus von den im Stand der Technik beschriebenen Mechanismen für die Metallisierung von Nukleinsäuren.
Gemäß der Erfindung kann die Bindung der THP-Au-Partikel an die Nukleinsäure durchgeführt werden, wenn die Nukleinsäure frei in einer Lösung, fixiert an einem oder beiden seiner Enden, z. B. an eine Elektrode, immobilisiert auf einem Substrat oder in einem semi-festen Zustand, z. B. in einem Gel, vorliegt.
Weiterhin ist ein Verfahren der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wobei die Bindung der THP-Au-Partikel an die Nukleinsäuren in einer Lösung von Wasser oder gemischten Wasser-organischen Lösungsmitteln durchgeführt wird.
Die Nukleinsäure für die Metallisierung kann ausgewählt sein aus DNA, RNA, PNA, CNA, Oligonukleotiden, Oligonukleotiden von DNA, Oligonukleotiden von RNA, Primern, A-DNA, B-DNA, Z-DNA, Polynukleotiden von DNA, Polynukleotiden von RNA, T-Verbindungen von Nukleinsäuren, Triplexen und Quadruplexen von Nukleinsäuren, Domänen von nicht-Nukleinsäurepolymer-Nukleinsäureblockkopolymer und Kombinationen davon. Geeignete nicht-Nukleinsäurepolymere für die Blockkopolymere können Polypeptide, Polysaccharide, wie zum Beispiel Dextrose oder künstliche Polymere, wie zum Beispiel Polyethylenglykol (PEG) sein und sind dem Fachmann allgemein bekannt. Die Nukleinsäuren können entweder doppelsträngig oder einzelsträngig sein.
In einer noch weiter bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung ist die primäre Partikelgröße (Kerndurchmesser) 0,5–5 nm, bevorzugterweise 1–3 nm. Die Konzentrati on der THP-Au-Partikel während der Bindung an eine Nukleinsäure ist 1 μM–1 mM, bevorzugterweise 10 μM–0,1 mM. Die Bindung wird bei einer Temperatur von 0–80°C, bevorzugterweise 20–50°C durchgeführt. Der pH der Reaktion ist 2–10, bevorzugterweise 4–8. Für den Fall, daß Wasser-mischbare organische Lösungsmittel verwendet werden, ist deren Konzentration (Volumen%) 0,1–95%, bevorzugterweise 1–90%. Für den Fall, daß ein Gold(I)-THP-Komplex [AU(THP)_x]⁺ (worin X 1, 2, 3 oder 4 darstellt) verwendet wird, ist die Konzentration 1 μM–0,1 M, bevorzugterweise 0,1 mM–10 mM. Für den Fall, daß Salze verwendet werden, ist deren Konzentration 1 μM–10 M, bevorzugterweise 0,1 mM–1 M. Zuletzt, für den Fall das kosmotrophe Mittel verwendet werden, ist deren Konzentration 1 mM–10 M, bevorzugterweise 10 mM–1 M.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung kann das THP der THP-Au-Partikel modifiziert werden, z. B. mit primären (RNH₂) und sekundären (R¹R²NH) Aminen in Reaktionen, die mit Mannich-Reaktionen verwandt sind, um Aminomethylphosphinderivate zu bilden (GB Patent 842,593 (1969); Diagle et al. (1974) Journal of Heterocyclic Chemistry, Vol. 11, S. 407; Henderson et al. (1994) Journal of the Chemical Society, Chemical Communications, S. 1863; U.S. Patent 5,948,386 (1999); Berning et al. (1999) Journal of the American Chemical Society, Vol. 121, S. 1658, Krauter and Beller (2000) Tetrahedron, Vol. 56, S. 771). Der Ausdruck "Derivate" der THP-Au-Partikel im Kontext der vorliegenden Erfindung umfaßt alle diese Modifikationen.
In einer noch weiter bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung werden die Metall-Nanopartikel mit einer elektrofreien Überzugslösung behandelt, die ein Gemisch der Metalle ausgewählt aus der Gruppe umfassend Fe, Co, Ni, Cu, Ru, Rh, Pd, Ag, Pt, Au oder Kombinationen (z. B. Legierungen) dieser Metalle oder magnetisches und/oder magnetisiertes Fe, Co, Ni oder Kombinationen davon (z. B. Legierungen) dieser Metalle oder Kombinationen (z. B. Legierungen) dieser Metalle mit B oder P, enthält.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird weiterhin durch eine metallisierte Nukleinsäure gelöst, die in Übereinstimmung mit einem der erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden kann.
In einem noch weiteren Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe durch eine lineare Anordnung von metallischen Nanopartikeln oder einem gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Nanodraht gelöst. In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe durch einen Nanodraht gelöst, der durch eines der erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich ist. Die erfindungsgemäßen Nanodrähte können ein elektronisches Netzwerk bilden, umfassend mindestens einen Nanodraht oder einen elektronischen Schaltkreis, umfassend mindestens ein elektronisches Netzwerk gemäß der Erfindung. Zusätzlich können die erfindungsgemäßen Nanodrähte als elektronische Komponenten in ihrer nicht vollständig metallisierten Form verwendet werden, wobei mehr oder weniger isolierende Abstände zwischen den einzelnen Nanopartikeln, positioniert entlang des Nukleinsäurestranges so vorhanden sind, daß der Nanodraht einzelne leitende Inseln umfaßt. Diese erfindungsgemäßen Strukturen können ein elektronisches Netzwerk oder einen elektronischen Schaltkreis, umfassend mindestens einen Nanodraht, bilden oder ein Teil davon sein. In solch elektronischen Netzwerken oder elektronischen Schaltkreisen können Kreuzungen zwischen zwei oder mehr Drähten gebildet werden, wobei jeder der Drähte ein Verbindungssegment proximal zu der Kreuzung, die den Nanodraht umfaßt, aufweist. Weiterhin können die Nanodraht-umfassenden Netzwerkteile von Hybrid-elektronischen Strukturen sein.
Die Erfindung ist das Ergebnis unserer Entdeckung, daß wasserlösliche Gold-Nanopartikel, gemäß einem Literaturverfahren hergestellt, spontan an Nukleinsäuren binden. Wir haben auch ermittelt, daß die Partikel, nach ihrer Bindung, durch elektrofreie Gold- oder Silberbeschichtung vergrößert werden können. Weiterhin wurden die sich ergebenden Strukturen als elektrisch leitfähig gefunden.
Die durch die vorliegende Erfindung vorgeschlagene Lösung kombiniert die Vorteile von: (1) sie ist gegenüber Nukleinsäuren selektiv und (2) sie ist einfach und vielseitig.
Der unten beschriebene Metallisierungsansatz stellt eine signifikante Alternative zu denjenigen wie im Stand der Technik beschrieben zur Verfügung.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung schließen drei Schritte ein: (1) zur Verfügung stellen von THP-Au-Partikeln (2) Bindung von THP-Au-Partikeln an die Nukleinsäure und (3) Behandeln der Partikel-Nukleinsäurekompositstruktur mit einer elektrofreien Überzugslösung. Variablen schließen ein, ob Schritt (2) durchgeführt wird, während die Nukleinsäure in Lösung oder auf einer Oberfläche vorliegt, die exakten Anteile der während der Partikelsynthese verwendeten Reagenzien, die Partikelkonzentration, das verwendete Lösungs mittel (Wasser oder gemischtes Wasser – organisch), pH, Temperatur, die Art des Partikel-Gegenions und die Anwesenheit von Hilfsstoffen (Salzen, organischen Verbindungen, usw.) in der Partikellösung.
Die Schritte werden genauer wie folgt erklärt:
Schritt (1): Synthese von THP-Au-Partikeln
Partikelsynthese: Die Gold-Nanopartikel, die wir verwendeten wurden gemäß einem Verfahren beschrieben von Duff et al. (1993) Langmuir, Vol. 9, S. 2310 präpariert. Demzufolge "ergibt die Reduktion von Wasserstofftetrachlorborat (III) durch alkalisches Tetrakis(hydroxymethyl)phosphoniumchlorid einen Phosphor-enthaltenes Goldsol von einem mittleren Metall-Kerndurchmesser von 1–2 nm". Die Autoren berichteten verschiedene Variationen in den exakten Bedingungen (z. B. Konzentration und Stöchiometrie) und wie diese die Partikelgröße beeinflußten. Seit dann wurden Nanopartikel, die durch dieses allgemeine Verfahren präpariert wurden für die Beschichtung von Silikapartikeln mit Gold verwendet [Wescott et al. (1998) Langmuir, Vol. 14, S. 5936] und zur Herstellung von Träger-Goldkatalysatoren für niedrig-Temperatur-CO-Oxidation [Grunwaldt et al. (1999) Journal of Catalysis, Vol. 181, S. 223]. Es gibt keine Berichte von Kombinationen dieser Partikel mit Nukleinsäuren oder Berichte, diesen Ansatz für die Synthese von Nanopartikeln von anderen Metallen oder Metallegierungen zu verwenden.
Schritt (2): Bindung von THP-Au-Partikeln an die Nukleinsäure
Interaktion zwischen DNA und Polyolen: Diese Interaktionen sind nicht so gut dokumentiert, wie zum Beispiel die Interkalation und Furchenbindung, es wird jedoch angenommen, daß sie für die vorliegende Erfindung relevant sein können, da die THP-Liganden auf der Gold-Nanopartikeloberfläche jeweils 3 Hydroxyl (OH)-Gruppen aufweisen. Da es für THP wahrscheinlich ist, das es Gold durch das Phosphoratom bindet, ist es von den OH-Gruppen wahrscheinlich, daß sie nach außen gerichtet sind. Weiterhin, da jeder Goldkern durch eine Schale von ungefähr 10–15 THP-Liganden umgeben ist, sind die Partikel im wesentlichen mit OH-Gruppen bedeckt. Verschiedene physikalische Messungen haben Hinweise darauf ergeben, daß Polyole, wie zum Beispiel Zucker, mit DNA interagieren [Del Vecchio et al. (1999) International Journal of Biological Macromolecules, Vol. 24, S. 361; Hayashida, et al. (2001) Chemistry Letters, S. 272], und es wurde vorgeschlagen, daß die Saccharidreste auf einigen Antibiotika und anti-Krebsmitteln als generelle Bindungselemente für DNA-Furchen fungie ren können [Nicolaou et al. (1992) Journal of the American Chemical Society, Vol. 114, S. 7555]. Die Stärke der Bindung kann durch die Anwesenheit von Zusatzstoffen (Salzen, kosmotrophen Mitteln, usw.) in der Partikellösung verändert werden.
Schritt (3): Behandlung der Partikelnukleinsäure-Kompositstruktur mit einer elektrofreien Überzugslösung
Das kontrollierte Wachstum von Metall-Nanopartikeln über elektrofreie Beschichtung: Eine Zahl von Publikationen und Patenten sind in den letzten paar Jahren erschienen, die sich mit diesem Punkt beschäftigen. Am bemerkenswertesten ist die Arbeit der Gruppe von M. J. Natan [z. B. U.S. Patent 6,025,202 (2000) und Brown et al. (2000) Chemistry Materials, Vol. 12, s. 306]. Diese Arbeit richtet sich hauptsächlich auf die Verwendung von Metall-Nanopartikeln kontrollierter Größe, Form und Dichte für analytische Zwecke, insbesondere Oberflächen-verstärkte Raman-Streuung (SERS) und Elektrochemie.
Die Erfindung wird nun genauer durch verdeutlichende Beispiele im Hinblick auf die begleitenden Figuren beschrieben, worin:
1 ein AFM-Bild einer THP-Au-DNA-Kompositstruktur zeigt, die gemäß Beispiel 1 hergestellt wurde, vor Behandlung mit einer Lösung von GoldEnhance^®.
2 ein AFM-Bild einer THP-Au-DNA-Kompositstruktur zeigt, die gemäß Beispiel 1 hergestellt wurde, nach der Behandlung mit einer Lösung von GoldEnhance^®.
3 ein SEM-Bild einer THP-Au-DNA-Kompositstruktur zeigt, die gemäß Beispiel 1 hergestellt wurde, nach Behandlung mit einer Lösung von GoldEnhance^®.
4 ein AFM-Bild einer THP-Au-DNA-Kompositstruktur zeigt, die gemäß Beispiel 2 hergestellt wurde.
5 ein AFM-Bild einer THP-Au-DNA-Kompositstruktur zeigt, die gemäß Beispiel 3 hergestellt wurde.
Beispiel 1
THP-Au-Partikel wurden unter der Verwendung der größeres Volumen Goldlösungs-Variation, wie beschrieben durch Duff et al. (1993), synthetisiert. Die Stammlösung von THP-Au wurde mit ca. 9 Volumen Ethanol verdünnt und bei 4°C gelagert gehalten. Diese Lösung war ca. 1 Jahr alt, als sie für dieses Experiment verwendet wurde. DNA (aus Kalbsthymus) wurde auf O₂-Plasma-behandeltes Silizium immobilisiert. Dann wurde ausreichend der THP-Au-Lösung aufgetragen, um das Substrat zu bedecken und es ihm ermöglicht, bis zur Trocknung abzudampfen (ca. 10 Minuten). Danach wurde das Substrat mit Wasser gespült und getrocknet. 1 zeigt ein AFM, das ca. 2–5 nm große Partikel auf der DNA zeigt, mit sehr viel weniger auf dem Siliziumsubstrat. Anschließend wurde das Substrat mit frisch präparierter GoldEnhance^®-Lösung für 5 Minuten behandelt, dann mit Wasser gespült und getrocknet. Das AFM-Bild (2) zeigt Netzwerke von vergrößerten Partikeln. Das SEM-Bild (3) zeigt einen verlängerten Strang von metallisierter DNA.
Beispiel 2
Eine Lösung von THP-Au-Partikeln aus Beispiel 1 wurde sechsfach mit einer Lösung verdünnt, die 70 mg/l DNA (aus Kalbsthymus) und 0,01 M Natriumphosphat (pH 7,0) enthielt. Die Lösung wurde in einem Wasserbad aus 50°C für 1 Stunde erhitzt und dann bei 4°C für 24 Stunden gehalten. Diese Lösung wurde auf ein Mica-Substrat aufgetragen, das mit MgCl₂ behandelt wurde. Nach einer Minute wurde das Substrat mit Wasser gespült und getrocknet. Die AFM-Bilder zeigten DNA-Moleküle, die mit einzelnen Partikeln besetzt waren (4).
Beispiel 3
Eine wäßrige Lösung, die 0,065 M [Au(THP)₄]Cl enthielt, wurde durch reagieren von NaAuCl₄ mit THP in einem 1 : 6 molaren Verhältnis präpariert [Berning et al. (1997) Chemische Berichte/Recueil, Vol. 130, S. 907]. Das THP wurde durch Reagieren von THP mit einem Äquivalent an NaOH (Formel 1) hergestellt. Diese Lösung wurde mit Wasser verdünnt, um eine 1 mM Lösung des Au(I)-Komplexes zu ergeben. Ein Teil einer 1 Monate alten Präparation von THP-Au (synthetisiert unter der Verwendung der größere Volumen Gold-Lösungsvariation beschrieben von Duff et al. (1993)) wurde über eine Säule von Sephadex^®-G-50 passiert, die mit der 1 mM Lösung equilibriert wurde. Die Lösung, die aus der Säule eluierte, enthielt ca. 6 μM THP-Au-Partikel und 1 mM [Au(THP)₄]Cl. Ausreichend dieser Lösung, um ein Siliziumsubstrat mit immobilisierter DNA (wie in Beispiel 1 hergestellt) abzudecken, wurde auf das Substrat aufgetragen und da für 10 Minuten belassen. Danach wurde das Substrat mit Wasser gespült und getrocknet. Die AFM-Bilder ergaben DNA-Moleküle, die größtenteils mit 1–3 nm großen THP-Au-Partikeln bedeckt waren, und relativ Wenigen auf der Siliziumoberfläche (5).

Claims

Verfahren für die Metallisierung von Nukleinsäuren, umfassend: – zur Verfügung stellen von Tris(hydroxymethyl)phosphin-Au (THP-Au)-Partikel oder Derivate davon – Binden der THP-Au-Partikel an eine Nukleinsäure, um eine Metallnanopartikel-Nukleinsäure-Kompositstruktur herzustellen, und – Behandlung der Metall-Nanopartikel-Nukleinsäure-Kompositstruktur mit einer elektrofreien Überzugslösung.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung der THP-Au-Partikel an die Nukleinsäure durchgeführt wird, während die Nukleinsäure frei in einer Lösung, fixiert an einem oder beiden seiner Enden, immobilisiert auf einem Substrat oder in einem semi-festen Zustand, z. B. in einem Gel, vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend DNA, RNA, PNA, CNA, Oligonukleotiden, Oligonukleotiden von DNA, Oligonukleotiden von RNA, Primern, A-DNA, B-DNA, Z-DNA, Polynukleotiden von DNA, Polynukleotiden von RNA, T-Verbindungen von Nukleinsäuren, Triplexen und Quadruplexen von Nukleinsäuren, Domänen von nicht-Nukleinsäurepolymer-Nukleinsäureblockkopolymer und Kombinationen davon.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure doppelsträngig oder einzelsträngig ist.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung der THP-Au-Partikel an die DNA in einer Lösung von Wasser oder gemischten Wasser-organischen Lösungsmitteln durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die primäre Partikelgröße (Kerndurchmesser) 0,5–5 nm, bevorzugterweise 1–3 nm beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der THP-Au-Partikel während der Bindung an eine Nukleinsäure 1 μM–1 mM, bevorzugterweise 10 μM–0,1 mM, ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung bei einer Temperatur von 0–80°C, bevorzugterweise 20–50°C, durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der pH der Reaktion 2–10, bevorzugterweise 4–8, ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß ein Wassermischbares organisches Lösungsmittel in einer Konzentration (Volumen%) von 0,1–95%, bevorzugterweise von 1–90% verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gold(I)-Komplex Zusatzstoff in einer Konzentration von 1 μM–0,1 M, bevorzugterweise von 0,1 mM–10 mM, verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß ein Salz Zusatzstoff in einer Konzentration von 1 μM–10 M, bevorzugterweise von 0,1 mM–1 M, verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß ein kosmotropher Zusatzstoff in einer Konzentration von 1 mM–10 M, bevorzugterweise von 10 mM–1 M, verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Metall-Nanopartikel-Nukleinsäure-Kompositstruktur mit einer elektrofreien Überzugslösung behandelt wird, während die Kompositstruktur in einer Lösung, fixiert an einem oder beiden ihrer Enden, immobilisiert auf einem Substrat oder in einem semi-festen Zustand, z. B. in einem Gel, vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das THP der THP-Au-Partikel mit einem primären oder sekundären Amin kondensiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Metall-Nanopartikel mit einer elektrofreien Überzugslösung behandelt werden, umfassend mindestens eines der Metalle ausgewählt aus der Gruppe umfassend Fe, Co, Ni, Cu, Ru, Rh, Pd, Os, Ir, Ag, Pt, Au oder Kombinationen, insbesondere Legierungen, dieser Metalle.
Metallisierte Nukleinsäure, erhalten mittels eines Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16.
Verfahren zur Herstellung eines Nanodrahts, umfassend die Metallisierung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 16.
Nanodraht, erhalten mittels eines Verfahren nach Anspruch 18.
Nanodraht nach Anspruch 19, der eine Struktur aufweist, die eine THP-Au/Nukleinsäure-Kompositstruktur aufweist.
Elektronisches Netzwerk kleinen Maßstabs oder elektronischer Schaltkreis, umfassend mindestens einen Nanodraht nach Anspruch 19 oder 20.
Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Metallisierung einer Nukleinsäure.