DE60012502T2

DE60012502T2 - Neue cathechole als antimikrobielle mittel

Info

Publication number: DE60012502T2
Application number: DE60012502T
Authority: DE
Inventors: H. Aaron LEEMAN; L. Milton HAMMOND; Milana Maletic; M. Gina SANTORELLI; F. Sherman WADDELL; John Finn; Michael Morytko; Jason Hill; Dennis Keith
Original assignee: Merck and Co Inc; Cubist Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Merck and Co Inc; Cubist Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1999-05-05
Filing date: 2000-05-05
Publication date: 2005-07-28
Anticipated expiration: 2020-05-06
Also published as: WO2000066120A1; AU4819900A; EP1176958A1; EP1176958B1; US6348482B1; ATE271868T1; US6545015B2; AU776773B2; CA2372079A1; JP2002543130A; ES2226839T3; EP1176958A4; US20020040147A1; DE60012502D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Überträger-Ribonucleinsäure(tRNA)-Synthetase-Inhibitoren, deren Herstellung und deren Verwendung als antimikrobielle Mittel.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Aminoacyl-tRNA-Synthetasen (aaRS) sind eine Familie von essentiellen Enzymen, die in nahezu jeder biologischen Zelle vorkommen und für die Beibehaltung der Proteinsynthesetreue verantwortlich sind. Speziell katalysieren sie die Aminoacylierung von tRNA in einer Zwei-Schritt-Reaktion: Aminosäure (AA) + ATP => AA–AMP + PPi AA–AMP + tRNA => tRNA–AA + AMP
Das Enzym bindet Adenosintriphosphat (ATP) und dessen spezifische Aminosäure, um die Bildung eines Aminoacyladenylat-Komplexes (AA-AMP) bei gleichzeitiger Freisetzung von Pyrophosphat (PPi) zu katalysieren. Im zweiten Schritt wird die Aminosäure zum 2'- oder 3'-Terminus der tRNA übertragen, was "geladene" tRNA und Adenosinmonophosphat (AMP) ergibt. Die geladene tRNA transportiert die Aminosäure an die naszierende Polypeptidkette am Ribosom.
In dieser Familie gibt es für jeden Organismus wenigstens zwanzig essentielle Enzyme. Die Inhibierung irgendeiner der essentiellen tRNA-Synthetasen unterbricht die Proteintranslation, was letztlich zur Wachstumshemmung führt. Pseudomonassäure A, ein Antibakterikum, das derzeit bei der Therapie am Menschen verwendet wird, liefert einen deutlichen Beweis für den Nutzen von tRNA-Synthetaseinhibitoren als geeignete Pharmazeutika. Pseudomonassäure A bindet sich an eine spezielle tRNA-Synthetase, Isoleucyl-tRNA-Synthetase, und inhibiert die Isoleucyladenylatbildung in mehreren grampositiven bakteriellen Krankheitserregern, wie z.B. Staphylococcus aureus, was zur Inhibierung der Proteinsynthese, gefolgt von der Wachstumshemmung, führt.
Neue synthetische Verbindungen, die auf tRNA-Synthetasen abzielen, bieten deutliche Vorteile als geeignete therapeutische Mittel zur Verringerung der Gefahr einer Arzneistoffresistenz. Die Arzneistoffresi stenz ermöglicht es einem Krankheitserreger, die von einem antimikrobiellen Mittel hervorgerufene biochemische Unterbrechung zu umgehen. Diese Resistenz kann die Folge einer Mutation sein, die selektiert und beibehalten wurde. Krankheitserreger in der Natur waren wiederholt den derzeitigen Therapeutika ausgesetzt. Diese Einwirkung hat zur Selektion von varianten antimikrobiellen Stämmen geführt, welche gegen diese Arzneistoffe resistent sind. von neuen synthetischen antimikrobiellen Mitteln würde daher erwartet werden, daß sie zur Behandlung arzneistoffresistenter Krankheitserreger geeignet sind, da der Krankheitserreger nie dem neuen antimikrobiellen Mittel in Berührung kam. Die Entwicklung von Verbindungen oder Kombinationen aus Verbindungen, die auf mehr als 1 tRNA-Synthetase abzielen, ist ebenfalls vorteilhaft. Demnach sollte die Inhibierung von mehr als einem Enzym das Auftreten einer Resistenz verringern, da mehrere Mutationen in einem Krankheitserreger notwendig wären, und diese statistisch selten sind.
Mathur und Mathur, J. Chem. Research (S), 1998, 506–507, und J. Chem. Research (M), 1998, 2062–2078, offenbaren monomere Nickel(II)-Komplexe mit vierzähnigen Bis(benzimidazol)-Liganden. Für die Liganden wird keine pharmazeutische Wirkung angegeben.
Die WO-A-9840370 (G.D. Searle & Co.) offenbart Verbindungen der Formel Ar₁-OCH₂-Ar₂-OCH₂-Z, bei denen Ar¹ eine Aryl- oder Heteroarylgruppe ist, Ar² eine Phenylgruppe ist und Z ein stickstoffhaltiger Heterocyclus ist, als LTA₄-Hydrolaseinhibitoren zur Behandlung von Psoriasis, Colitis ulcerosa, IBD und Asthma.
Die WO-A-9705132 (Cubist Pharmaceuticals, Inc.) offenbart Verbindungen, wie z.B. [S-(R*,R*)]-3,6-Anhydro-1,2-didesoxy-1-[5-[4-[(5-nitro-2-thienyl)ethinyl]phenyl]-2H-tetrazol-2-yl]-D-alloheptitol-7-(2-amino-3-methyl-1-oxopentyl)sulfamat als Isoleucyl-tRNA-Synthetaseinhibitoren.
Lee et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 8, 1998, 3511–3514, offenbaren Methionin-Analoga als Inhibitoren von Methionyl-tRNA-Synthetase.
Die WO-A-9955677 (SmithKline Beecham plc) offenbart Chinolonderivate als Inhibitoren des bakteriellen Enzyms S.-aureus-Methionyl-tRNA-Synthetase.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung offenbart neue Verbindungen, die tRNA-Synthetasen inhibieren und eine Wirkung, einschließlich der Abtötung der ganzen Zelle, gegen ein breites Spektrum von Bakterien und Pilzen besitzen. Hierin beschrieben werden Verbindungen, die eine tRNA-Synthetaseinhibierung aufweisen.
Die vorliegende Erfindung umfaßt in einem Aspekt eine Verbindung der Formel
und wobei R₁, R₂, R₃, R₄, AR und Het ausgewählt sind aus der Tabelle, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon,
In einem weiteren Aspekt umfaßt die vorliegende Erfindung eine Verbindung, ausgewählt aus den Folgenden, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon,
In einem weiteren Aspekt umfaßt die vorliegende Erfindung eine Verbindung der folgenden Formel oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon:
Diese Erfindung umfaßt auch pharmazeutisch annehmbare Salze der obigen Verbindungen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfaßt die Verwendung der Verbindungen der Erfindung zur Herstellung einer Zusammensetzung _zur ^Inhibierung einer tRNA-SYnthetase und insbesondere zur Modulierung des Wachstums von Bakterien- oder Pilzorganismen in Säugetieren, einer Pflanze oder einer Zellkultur.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Inhibierung des Wachstums von Mikroorganismen in einer Zellkultur. Das Verfahren umfaßt das Einwirkenlassen einer Verbindung der Erfindung auf den Mikroorganismus unter Bedingungen, bei denen eine therapeutisch wirksame Menge der Verbindung in den Mikroorganismus eindringt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die Verbindung en) der Erfindung enthält, welche bei der Behandlung von mikrobiellen Infektionen, z.B. Bakterieninfektionen, Pilzinfektionen, geeignet sind. Ein verwandter Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Medikaments, das das Einbringen von (einer) Verbindung en) der Erfindung in einen geeigneten pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.
Diese und andere Aspekte der Erfindung werden mit Bezug auf die folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung offensichtlicher werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
2. Definitionen
Molekülbezeichnungen, wenn sie in dieser Anmeldung verwendet werden, haben, sofern nichts anderes angegeben ist, ihre übliche Bedeutung. Die Bezeichnung "Hydrid" bedeutet ein einzelnes Wasserstoffatom (H). Die Bezeichnung "Acyl" ist als Carbonylrest definiert, der an eine Hydrid-, Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Cycloalkyl-, Heterocyclyl-, Aryl- oder Heteroarylgruppe gebunden ist, Beispiel für solche Reste sind Formyl, Acetyl und Benzoyl. Die Bezeichnung "Amino" bedeutet einen Stickstoffrest mit zwei Substituenten, die unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Hydrid, Alkyl, Cycloalkyl, Heterocyclyl, Aryl und Heteroaryl. Bevorzugte Aminoreste sind NHa-Reste und "Niedrigamino"-Reste, bei denen die zwei Substituenten unabhängig ausgewählt sind aus Hydrid und Niedrigalkyl. Eine Unterklasse von Amino ist "Alkylamino", wobei der Stickstoffrest wenigstens 1 Alkylsubstituenten enthält. Bevorzugte Alkylaminogruppen enthalten Alkylgruppen, die zum Beispiel mit einer Carboalkoxygruppe substituiert sind. Die Bezeichnung "Acyloxy" bedeutet einen Sauerstoffrest neben einer Acylgruppe. Die Bezeichnung "Acylamino" bedeutet einen Stickstoffrest neben einer Acyl-, Carboalkoxy- oder Carboxyamidogruppe. Die Bezeichnung "Carboalkoxy" ist als Carbonylrest neben einer Alkoxy- oder Aryloxygruppe definiert. Die Bezeichnung "Carboxyamido" bedeutet einen Carbonylrest neben einer Aminogruppe. Eine Unterklasse von Carboxyamido ist "N-Sulfonylcarboxyamido", welches einen Carbonylrest neben einer N-sulfonylsubstituierten Aminogruppe bedeutet. Die Bezeichnung "Halogen" ist als Brom-, Chlor-, Fluor- oder Iodrest definiert. Die Bezeichnung "Thio" bedeutet einen Schwefelrest neben einer Substituentengruppe, ausgewählt aus Hydrid, Alkyl, Cycloalkyl, Heterocyclyl, Aryl und Heteroaryl, wie z.B. Methylthio und Phenylthio. Bevorzugte Thioreste sind "Niedrigthio"-Reste, die Niedrigalkylgruppen enthalten.
Die Bezeichnung "Alkyl" ist definiert als linearer oder verzweigter gesättigter Rest mit ein bis etwa zehn Kohlenstoffatomen, sofern nichts anderes angegeben ist. Bevorzugte Alkylreste sind "Niedrigalkyl"-Reste mit ein bis etwa fünf Kohlenstoffatomen. Ein oder mehrere Wasserstoffatome können auch durch eine Substituentengruppe, ausgewählt aus Acyl, Amino, Acylamino, Acyloxy, Carboalkoxy, Carboxy, Carboxyamido, Cyano, Halogen, Hydroxy, Nitro, Thio, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Heterocyclyl, Aryl, Heteroaryl, Alkoxy, Aryloxy, Sulfoxy, Sulfinyl, Sulfonyl, N-Sulfonylcarboxyamido und N-Acylaminosulfonyl, ersetzt sein. Bevorzugte Substituenten sind Carboalkoxy, Carboxy, N-Sulfonylcarboxyamido und N-Acylaminosulfonyl. Beispiele für Alkylgruppen sind u.a. Methyl, tert.-Butyl, Isopropyl, Methoxymethyl, Carboxymethyl und Carbomethoxymethyl. Die Bezeichnung "Alkenyl" umfaßt lineare oder verzweigte Reste mit zwei bis etwa zwanzig Kohlenstoffatomen, vorzugsweise drei bis etwa zehn Kohlenstoffatomen, und mit wenigstens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung. Ein oder mehrere Wasserstoffatome können auch durch eine Substituentengruppe, ausgewählt aus Acyl, Amino, Acylamino, Acyloxy, Carboalkoxy, Carboxy, Carboxyamido, Cyano, Halogen, Hydroxy, Nitro, Thio, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Heterocyclyl, Aryl, Heteroaryl, Alkoxy, Aryloxy, Sulfoxy, Sulfinyl, Sulfonyl, N-Sulfonylcarboxyamido und N-Acylaminosulfonyl, ersetzt sein. Beispiele für Alkenylgruppen sind u.a. Ethylenyl oder Phenylethylenyl. Die Bezeichnung "Alkinyl" bedeutet lineare oder verzweigte Reste mit zwei bis etwa zehn Kohlenstoffatomen und mit wenigstens einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindung. Ein oder mehrere Wasserstoffatome können auch durch eine Substituentengruppe, ausgewählt aus Acyl, Amino, Acylamino, Acyloxy, Carboalkoxy, Carboxy, Carboxyamido, Cyano, Halogen, Hydroxy, Nitro, Thio, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Heterocyclyl, Aryl, Heteroaryl, Alkoxy, Aryloxy, Sulfoxy, Sulfinyl, Sulfonyl, N-Sulfonylcarboxyamido und N-Acylaminosulfonyl, ersetzt sein. Beispiele für Alkinylgruppen sind u.a. Propinyl. Die Bezeichnung "Aryl" umfaßt aromatische Reste in einem einzelnen oder kondensierten carbocyclischen Ringsystem mit fünf bis zwölf Ringelementen. Ein oder mehrere Wasserstoffatome können auch durch eine Sub stituentengruppe, ausgewählt aus Acyl, Amino, Acylamino, Acyloxy, Carboalkoxy, Carboxy, Carboxyamido, Cyano, Halogen, Hydroxy, Nitro, Thio, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Heterocyclyl, Aryl, Heteroaryl, Alkoxy, Aryloxy, Sulfoxy, Sulfinyl, Sulfonyl, N-Sulfonylcarboxyamido und N-Acylaminosulfonyl, ersetzt sein. Beispiele für Arylgruppen sind u.a. Phenyl, 2,4-Dichlorphenyl, Naphthyl, Biphenyl, Terphenyl. "Heteroaryl" umfaßt aromatische Reste, die ein bis vier Heteroatome enthalten, ausgewählt aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel, in einem einzelnen oder kondensierten heterocyclischen Ringsystem mit fünf bis fünfzehn Ringelementen. Ein oder mehrere Wasserstoffatome können auch durch eine Substituentengruppe, ausgewählt aus Acyl, Amino, Acylamino, Acyloxy, Carboalkoxy, Carboxy, Carboxyamido, Cyano, Halogen, Hydroxy, Nitro, Thio, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Heterocyclyl, Aryl, Heteroaryl, Alkoxy, Aryloxy, Sulfoxy, Sulfinyl, Sulfonyl, N-Sulfonylcarboxyamido und N-Acylaminosulfonyl, ersetzt sein. Beispiele für Heteroarylgruppen sind u.a. Tetrazolyl, Pyridinyl, Thiazolyl.
Die pharmazeutisch annehmbaren Salze der Verbindungen der Erfindung sind u.a. Säureadditionssalze und Basenadditionssalze. Die Bezeichnung "pharmazeutisch annehmbare Salze" umfaßt Salze, die üblicherweise zur Bildung von Alkalimetallsalzen und zur Bildung von Additionssalzen von freien Säuren oder freien Basen verwendet werden. Die Beschaffenheit des Salzes ist nicht entscheidend, vorausgesetzt, es ist pharmazeutisch annehmbar. Geeignete pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze der Verbindungen der Erfindung (vorzugsweise einer Verbindung der Formel I) können aus einer anorganischen Säure oder einer organischen Säure hergestellt werden. Beispiele für solche anorganischen Säuren sind Salz-, Bromwasserstoff-, Iodwasserstoff-, Salpeter-, Carbon-, Schwefel- und Phosphorsäure. Geeignete organische Säuren können ausgewählt sein aus aliphatischen, cycloaliphatischen, aromatischen, arylaliphatischen, heterocyclischen, carboxylischen und sulfonischen Klassen organischer Säuren, Beispiele dafür sind Ameisen-, Essig-, Propion-, Succin-, Glycol-, Glucon-, Malein-, Embon-(Pamoa-), Methansulfon-, Ethansulfon-, 2-Hydroxyethansulfon-, Pantothen-, Benzolsulfon-, Toluolsulfon-, Sulfanil-, Mesyl-, Cyclohexylaminosulfon-, Stearin-, Algen- (algenic acid), β-Hydroxybutter-, Malon-, Galact- (galactic acid) und Galacturonsäure. Geeignete pharmazeutisch annehmbare Basenadditionssalze von Verbindungen der Erfindung (vorzugsweise einer Verbindung der Formel I) sind u.a., ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Metallsalze, die aus Aluminium, Calcium, Lithium, Magnesium, Kalium, Natrium und Zink hergestellt sind, oder organische Salze, die aus N,N'-Dibenzylethylendiamin, Chlorprocain, Cholin, Diethanolamin, Ethylendiamin, N-Methylglucamin und Procain hergestellt sind. Alle diese Salze können durch herkömmliche Mittel aus der entsprechenden Verbindung der Erfindung (vorzugsweise aus einer Verbindung der Formel I) zum Beispiel durch Behandlung der Verbindung der Erfindung (vorzugsweise einer Verbindung der Formel I) mit der entsprechenden Säure oder Base hergestellt werden.
So wie hier verwendet, bedeutet "Behandeln" das Verhindern des Ausbruchs, das Verlangsamen des Fortschreitens oder das Ausrotten der Existenz des behandelten Zustandes, wie z.B. einer mikrobiellen Infektion. Eine erfolgreiche Behandlung zeigt sich durch eine Verringerung und vorzugsweise ein Ausrotten der Bakterien- und/oder Pilzinfektion in dem behandelten Subjekt.
Die Verbindungen der Erfindung können ein oder mehrere asymmetrische Kohlenstoffatome besitzen und daher in der Lage sein, in Form von optischen Isomeren sowie in Form von racemischen oder nichtracemischen Mischungen davon zu existieren. Die Verbindungen der Erfindung können in der vorliegenden Erfindung als ein einzelnes Isomer oder als eine Mischung aus stereochemisch isomeren Formen verwendet werden. Diastereoisomere können durch herkömmliche Mittel, wie z.B. Chromatographie, Destillation, Kristallisation oder Sublimation, getrennt werden. Die optischen Isomere können durch Auftrennen der racemischen Mischungen gemäß herkömmlichen Verfahren erhalten werden, zum Beispiel durch Bildung diastereoisomerer Salze durch Behandlung mit einer optisch aktiven Säure oder Base. Beispiele für geeignete Säuren sind Wein-, Diacetylwein-, Dibenzoylwein-, Ditoluoylwein- und Camphersulfonsäure. Die Diastereomerenmischung kann durch Kristallisation, gefolgt von der Freisetzung der optisch aktiven Basen aus diesen Salzen, getrennt werden. Ein alternatives Verfahren zur Trennung optischer Isomere umfaßt die Verwendung einer chiralen Chromatographiesäule, die optimal gewählt wird, um die Trennung der Enantiomeren zu maximieren. Noch ein weiteres verfügbares Verfahren umfaßt die Synthese kovalenter diastereomerer Moleküle durch Umsetzung von Verbindungen der Erfindung mit einer optisch reinen Säure in einer aktivierten Form oder eines optisch reinen Isocyanats. Die synthetisierten Diastereoisomere können durch herkömmliche Mittel, wie z.B. Chromatographie, Destillation, Kristallisation oder Sublimation, getrennt und anschließend hydrolysiert werden, um die enantiomerenreine Verbindung zu erhalten. Die optisch aktiven Verbindungen der Erfindung (vorzugsweise Verbindungen der Formel I) können auf ähnliche Weise durch Verwendung optisch aktiver Ausgangsmaterialien erhalten werden. Diese Isomere können in Form einer freien Säure, einer freien Base, eines Esters oder eines Salzes vorliegen.
Die Erfindung umfaßt auch isolierte Verbindungen. Eine isolierte Verbindung ist eine Verbindung, die wenigstens 10%, vorzugsweise 20%, besonders bevorzugt 50% und ganz besonders bevorzugt 80% der in der Mischung vorliegenden Verbindung darstellt und eine nachweisbare (d.h. statistisch bedeutende) antimikrobielle Wirkung zeigt, wenn sie in herkömmlichen biologischen Tests, wie z.B. den hierin beschriebenen Tests, getestet wird.
II. Beschreibung
Die Verbindungen der Erfindung eignen sich zur Inhibierung der enzymatischen Aktivität einer tRNA-Synthetase in vivo oder in vitro. Die Verbindungen eigenen sich besonders als antimikrobielle Mittel, d.h. als Mittel, die das Bakterien- oder Pilzwachstum inhibieren.
Die Verbindungen der Erfindung sind gegen eine Vielzahl von Bakterienorganismen wirksam. Sie sind wirksam sowohl gegen grampositive als auch gegen gramnegative aerobe und anaerobe Bakterien, einschließlich Staphylococci, zum Beispiel S. aureus; Enterococci, zum Beispiel E. facalis; Streptococci, zum Beispiel S. pneumoniae; Haemophilus, zum Beispiel H. influenza; Morxella, zum Beispiel M. catarrhalis; und Escherichia, zum Beispiel E. coli. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind auch wirksam gegen Mycobacteria, zum Beispiel M. tuberculosis. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind auch wirksam gegen interzellulare Mikroben, zum Beispiel Chlamydia und Rickettsiae. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind auch wirksam gegen Mycoplasma, zum Beispiel M. pneumoniae.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind auch wirksam gegen Pilzorganismen, einschließlich, neben anderen Organismen, der Spezies Aspergillus, Blastomyces, Candida, Coccidioides, Cryptococcus, Epidermophyton, Hendersonula, Histoplasma, Microsporum, Paecilomyces, Paracoccidioides, Pneumocystis, Trichophyton und Trichosporium.
In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung, die eine Verbindung der Erfindung, vorzugsweise eine Verbindung gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger (nachstehend beschrieben) enthält. So wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "therapeutisch wirksame Menge" die Menge einer Verbindung der vorliegenden Erfindung, welche den Ausbruch einer mikrobiellen Infektion verhindert, die Symptome einer mikrobiellen Infektion verringert oder das Fortschreiten einer mikrobiellen Infektion stoppt. Die Bezeichnung "mikrobiell" bedeutet bakteriell und fungal, zum Beispiel bedeutet eine "mikrobielle Infektion" eine Bakterien- oder Pilzinfektion. Die Bezeichnung "Behandeln" ist definiert als die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung der Erfindung an ein Subjekt. Die Bezeichnung "Subjekt", so wie es hier beschrieben wird, ist definiert als ein Säugetier, eine Pflanze oder eine Zellkultur.
Ein Verfahren zur Inhibierung einer tRNA-Synthetase umfaßt das Inkontaktbringen einer tRNA-Synthetase mit einer Verbindung der Erfindung unter den Bedingungen, bei denen die tRNA-Synthetase mit seinen Substraten wechselwirkt und seine Substrate so reagieren, daß ein Aminoacyladenylat-Zwischenprodukt gebildet wird, und vorzugsweise weiter reagieren, um eine geladene tRNA zu bilden. Solche Bedingungen sind den Fachleuten bekannt (siehe auch z.B. die Beispiele für Bedingungen), und PCT/US 96/11910, eingereicht am 18. Juli 1996 (WO 97/05132, veröffentlicht am 13. Februar 1997), und US-Patent 5 726 195. Dieses Verfahren umfaßt das Inkontaktbringen einer tRNA-Synthetase mit einer Menge der Verbindung der Erfindung, die ausreicht, um eine nachweisbare tRNA-Synthetase-Inhibierung zu ergeben. Dieses Verfahren kann an einer tRNA-Synthetase durchgeführt werden, die sich innerhalb eines Organismus oder außerhalb eines Organismus befindet.
Ein Verfahren zur Inhibierung des Wachstums von Mikroorganismen, vorzugsweise Bakterien oder Pilzen, umfaßt das Inkontaktbringen der Organismen mit einer Verbindung der Erfindung unter Bedingungen, die das Eindringen der Verbindung in den Organismus und in den Mikroorganismus ermöglichen. Solche Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und sind in den Beispielen veranschaulicht. Dieses Verfahren umfaßt das Inkontaktbringen einer mikrobiellen Zelle mit einer therapeutisch wirksamen Menge von Verbindung (en) der Erfindung, z.B. um die Zell-tRNA-Synthetase in vivo oder in vitro zu inhibieren. Dieses Verfahren wird in vivo zum Beispiel zur Behandlung von mikrobiellen Infektionen bei Säugetieren angewandt. Alternativ wird das Verfahren in vitro zum Beispiel zur Beseitigung von mikrobiellen Verunreinigungen in einer Zellkultur oder in einer Pflanze angewandt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung werden die hierin offenbarten Zusammensetzungen zur Behandlung eines Subjekts, das an einer mikrobiellen Infektion leidet oder dafür empfindlich ist, verwendet. Das Verfahren umfaßt die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung der Erfindung an ein Subjekt. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung werden die hierin offenbarten neuen Zusammensetzungen in einen pharmazeutisch annehmbaren Träger gegeben und einem Empfänger (vorzugs weise einem Menschen) gemäß bekannten Verfahren zur Zufuhr von Arzneistoffen zugeführt. Beispielhafte Verfahren zur Zufuhr eines antibakteriellen, antifungalen oder antimykoplasmischen Mittels sind in US-Patent Nr. 5 041 567, erteilt an Rogers, und in der PCT-Patentanmeldung mit der Nummer EP94/02552 (Veröffentlichungsnummer WO 95/05384) beschrieben. Im allgemeinen wenden die Verfahren zur Zufuhr der Zusammensetzungen der Erfindung in vivo im Stand der Technik bekannte Vorschriften zur Zufuhr des Mittels an, wobei die einzige wesentliche Verfahrensmodifikation der Austausch der Arzneistoffe in den im Stand der Technik bekannten Vorschriften durch die Verbindungen der Erfindung ist. Ähnlich wenden die Verfahren zur Verwendung der beanspruchten Zusammensetzung zur Behandlung von Zellen in der Kultur, zum Beispiel zur Beseitigung oder Verringerung des Bakterienkontaminierungsgrades einer Zellkultur, im Stand der Technik bekannte Vorschriften zur Behandlung von Zellkulturen mit antibakteriellem/n Mittel(n) an, wobei die einzige wesentliche Verfahrensmodifikation der Austausch der in den im Stand der Technik bekannten Vorschriften verwendeten Mittel durch die Verbindungen der Erfindung ist.
Die hierin offenbarten pharmazeutischen Präparate werden gemäß Standardverfahren hergestellt und in Dosen verabreicht, die so gewählt werden, daß die Infektion verringert, verhindert oder beseitigt wird (siehe z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA und Goodman und Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, Pergamon Press, New York, NY, deren Inhalte durch Bezugnahme hierin aufgenommen sind, für eine allgemeine Beschreibung der Verfahren zur Verabreichung verschiedener antimikrobieller Mittel zur Therapie bei Menschen). Die Zusammensetzungen der Erfindung können durch Verwendung von Abgabesystemen mit gesteuerter (z.B. Kapseln) oder verzögerter (z.B. bioerodierbare Matrizen) Freisetzung zugeführt werden. Beispielhafte Abgabesysteme mit verzögerter Freisetzung, die für die Verabreichung der Zusammensetzungen der Erfindung geeignet sind, sind in den US-Patenten Nr. 4 452 775 (erteilt an Kent), 5 239 660 (erteilt an Leonard), 3 854 480 (erteilt an Zaffaroni) beschrieben.
Die pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen ein oder mehrere Verbindungen der Erfindung in Verbindung mit ein oder mehreren nichttoxischen pharmazeutisch annehmbaren Trägern und/oder Verdünnungsmitteln und/oder Hilfsstoffen und/oder Arzneistoffträgern, die gemeinsam hierin als "Träger"-Materialien bezeichnet werden, und, falls erwünscht, anderen Wirkstoffen.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden auf beliebigem Wege, vorzugsweise in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die für einen solchen Weg hergerichtet ist, wie nachstehend veranschaulicht verabreicht und hängen von dem zu behandelnden Zustand ab. Die Verbindungen und Zusammensetzungen können zum Beispiel oral, intravaskulär, intraperitoneal, subkutan, intramuskulär oder topisch verabreicht werden.
Zur oralen Verabreichung liegen die pharmazeutischen Zusammensetzungen zum Beispiel in Form einer Tablette, Kapsel, Suspension oder Flüssigkeit vor. Die pharmazeutische Zusammensetzung wird vorzugsweise in Form einer Dosiseinheit, die eine therapeutisch wirksame Menge des Wirkstoffes enthält, hergestellt. Beispiele für solche Dosiseinheiten sind Tabletten und Kapseln. Für therapeutische Zwecke können die Tabletten und Kapseln, zusätzlich zum Wirkstoff, herkömmliche Träger wie z.B. Bindemittel, zum Beispiel Akaziengummi, Gelatine, Polyvinylpyrrolidon, Sorbit oder Tragant; Füllstoffe, zum Beispiel Calciumphosphat, Glycin, Lactose, Maisstärke, Sorbit oder Saccharose; Gleitmittel, zum Beispiel Magnesiumstearat, Polyethylenglycol, Silica oder Talk; Sprengmittel, zum Beispiel Kartoffelstärke, Aroma- oder Farbstoffe oder annehmbare Benetzungsmittel enthalten. Orale Flüssigpräparate liegen im allgemeinen in Form von wäßrigen oder öligen Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Sirupen oder Elixieren vor und können herkömmliche Additive, wie z.B. Suspensionsmittel, Emulsionsmittel, nichtwäßrige Mittel, Konservierungsmittel, Farbmittel und Aromatstoffe, enthalten. Beispiele für Additive für Flüssigpräparate sind u.a. Akaziengummi, Mandelöl, Ethylalkohol, fraktioniertes Kokosnußöl, Gelatine, Glucosesirup, Glycerin, hydrierte eßbare Fette, Lecithin, Methylcellulose, Methyl- oder Propyl-para-hydroxybenzoat, Propylenglycol, Sorbit oder Sorbinsäure.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können durch Injektion verabreicht werden. Formulierungen zur parenteralen Verabreichung können in Form von wäßrigen oder nichtwäßrigen isotonischen sterilen Injektionslösungen oder -suspensionen vorliegen. Diese Lösungen oder Suspensionen können aus sterilen Pulvern oder Granulaten mit ein oder mehreren der zur Verwendung bei den Formulierungen zur oralen Verabreichung erwähnten Trägern hergestellt werden. Die Verbindungen können in Polyethylenglycol, Propylenglycol, Ethanol, Maisöl, Benzylalkohol, Natriumchlorid und/oder verschiedenen Puffern gelöst werden.
Zur topischen Verwendung können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung auch in geeigneten Formen, die auf die Haut oder die Schleimhäute der Nase und des Rachens aufgetragen werden, hergestellt werden, und sie nehmen die Form von Cremes, Salben, Flüssigsprays oder Inhalantien, Pastillen oder Rachentinkturen ein. Solche topischen Formulierungen können ferner chemische Verbindungen, wie z.B. Dimethylsulfoxid (DMSO) umfassen, um eine Oberflächenpenetration des Wirkstoffes zu fördern.
Zur Applikation in die Augen oder Ohren können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in flüssiger oder halbflüssiger Form, formuliert in hydrophoben oder hydrophilen Basen, als Salben, Cremes, Lotionen, Tinkturen oder Pulver dargereicht werden.
Zur rektalen Verabreichung können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in Form von Zäpfchen, die mit herkömmlichen Trägern, wie z.B. Kakaobutter, Wachs oder anderen Glyceriden vermischt sind, verabreicht werden.
Alternativ können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in Pulverform zur Wiederauflösung in dem geeigneten pharmazeutisch annehmbaren Träger zum Zeitpunkt der Zufuhr vorliegen.
Das Dosisregime zur Behandlung einer Infektion mit der/den Verbindung und/oder Zusammensetzungen dieser Erfindung wird anhand einer Vielzahl von Faktoren ausgewählt, einschließlich des Typs, Alters, Gewichts, Geschlechts und medizinischen Zustandes des Patienten, der Schwere der Infektion, des Verabreichungsweges und der Verabreichungshäufigkeit und der speziellen eingesetzten Verbindung. Im allgemeinen werden Dosen gemäß der Standardpraxis zur Optimierung der richtigen Dosierung zur Behandlung einer Infektion ermittelt.
Die Zusammensetzungen können, in Abhängigkeit des Verabreichungsverfahrens, 0,1 bis 99 Gew.-%, vorzugsweise 10–60 Gew.-%, des Wirkstoffes enthalten. Wenn die Zusammensetzungen Dosiseinheiten enthalten, enthält jede Dosiseinheit vorzugsweise 50–500 mg des Wirkstoffes. Zur Behandlung eines erwachsenen Menschen liegt die verwendete Dosis vorzugsweise im Bereich von 100 mg bis 3 g pro Tag, in Abhängigkeit von dem Verabreichungsweg und der Verabreichungshäufigkeit.
Wenn sie als Teil einer Gesamt-Nahrungsaufnahme verabreicht wird, kann die Menge der eingesetzten Verbindung weniger als 1 Gew.-% der Nahrung und vorzugsweise nicht mehr als 0,5 Gew.-% der Nahrung ausmachen. Die Nahrung für Tiere kann normales Futter sein, zu dem die Verbindung zugegeben werden kann, oder sie kann zu einer Vormischung hinzugegeben werden.
In den nachstehend beschriebenen Beispielen sind weitere Hinweise zu Merkmalen und Aspekten der Erfindung angegeben.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele sind detaillierte Beschreibungen der Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Erfindung. Diese detaillierten Beschreibungen fallen in den Umfang der Erfindung und dienen dazu, diese zu veranschaulichen. Diese Beispiele werden nur für Veranschaulichungszwecke angegeben und sollen keine Einschränkung des Umfangs der Erfindung sein.
Schema I
Schema II
Synthese von I
Eine Lösung von 5,0 g Ethyl-3,4-dihydroxybenzoat, 3,8 ml 2,4-Dichlorbenzylchlorid und 7,58 g Kaliumcarbonat in 50 ml wasserfreiem N,N-Dimethylformamid wurde bei Raumtemperatur 24 Stunden lang gerührt, bevor sie mit 500 ml Ethylacetat und 500 ml Salzlösung aufgetrennt wurde. Die organische Schicht wurde mit 10 g Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Die Reinigung durch Kieselgelchromatographie mit 5–20% Ethylacetat in Hexanen ergab 1,0 g I.
Synthese von II:
3,0 g 2-Chlormethylbenzimidazol und 3,0 ml Trimethylsilylethoxymethylchlorid wurden zu einer Lösung von 6 ml Triethylamin in 20 ml Dichlormethan zugegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 24 Stunden lang gerührt, bevor sie mit 250 ml Ethylacetat und 2 × 200 ml Salzlösung aufgetrennt wurde. Die organische Schicht wurde mit 5 g Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Die Reinigung durch Kieselgelchromatographie unter Verwendung von 20% Ethylacetat in Hexanen ergab 1,23 g II als einen weißen Feststoff.
Synthese von III:
Eine Lösung von 115 mg I, 100 mg II und 250 mg Kaliumcarbonat in 5 ml wasserfreiem N,N'-Dimethylformamid wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, bevor sie mit 100 ml Ethylacetat und 100 ml Salzlösung gereinigt wurde. Die organische Schicht wurde mit 5 g Natriumsulfat getrocknet und eingeengt, um 199 mg III als ein farbloses Öl zu ergeben.
Synthese von IV:
Zu einer Lösung von 199 mg III in 5 ml Dioxan wurden 0,2 ml konzentrierte Salzsäure zugegeben. Die Reaktion wurde 2 Stunden lang auf 100°C erwärmt, bevor sie mit 50 ml Ethylacetat und 50 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung aufgetrennt wurde. Die organische Schicht wurde mit 2 g Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Die Reinigung durch Kieselgelchromatographie unter Verwendung von 40% Ethylacetat in Hexanen ergab 135 mg IV als einen weißen Feststoff.
Synthese von V:
Eine Lösung von 130 mg IV und 200 mg Lithiumhydroxid in 2 ml Wasser und 4 ml Tetrahydrofuran wurde 48 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde mit 20 ml Wasser verdünnt und mit 1N Salzsäure versetzt, um den pH-Wert auf 7 einzustellen. Der Niederschlag wurde abfiltriert, um 77 mg V zu ergeben.
Synthese von VI:
Zu 1,0 g Ethyl-3,4-dihydroxybenzoat, 5,0 g Kaliumcarbonat in 30 ml wasserfreiem N,N'-Dimethylformamid wurden 0,42 ml Methoxymethylchlorid zugegeben. Die Reaktion wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, bevor sie mit 100 ml Ethylacetat und 2 × 100 ml Salzlösung aufgetrennt wurde. Die organische Schicht wurde mit 5 g Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Die Reinigung durch Kieselgelchromatographie mit 10% Ethylacetat in Hexanen ergab 0,41 g VI als ein farbloses Öl.
Synthese von VII:
Eine Lösung von 410 mg VI, 0,38 ml 2,4-Dichlorbenzylchlorid und 500 mg Kaliumcarbonat in 10 ml wasserfreiem N,N-Dimethylformamid wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, bevor sie mit 100 ml Ethylacetat und 100 ml Salzlösung aufgetrennt wurde. Die organische Schicht wurde mit 5 g Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt, um 0,5 g VII als ein farbloses Öl zu ergeben.
Synthese von VIII:
Zu einer Lösung von 0,5 g VII in 10 ml Methanol wurden 0,3 ml konzentrierte Salzsäure zugegeben. Die resultierende Lösung wurde 1 Stunde lang am Rückfluß erhitzt, bevor sie mit 100 ml Ethylacetat und 100 ml Salzlösung aufgetrennt wurde. Die organische Schicht wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Der resultierende Feststoff wurde aus Ethylacetat und Hexanen umkristallisiert, um 0,43 g VIII als einen weißen Feststoff zu ergeben.
Synthese von IX:
250 mg VIII wurden zu einer gerührten Suspension von 29 mg 60%igem Natriumhydrid in Mineralöl in 8 ml wasserfreiem N,N-Dimethylformamid zugegeben. Nach 10 Minuten wurden 217 mg II zu der Reaktion hinzugegeben. Man ließ die Reaktion bei Raumtemperatur 24 Stunden lang rühren, bevor sie zwischen 100 ml Ethylacetat und 100 ml Salzlösung aufgetrennt wurde. Die organische Schicht wurde mit 2 g Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Die Reinigung durch Kieselgelchromatographie unter Verwendung von 20% Ethylacetat in Hexanen ergab 325 mg IX als ein farbloses Öl.
Synthese von X:
Eine Lösung von 0,32 g IX in 0,4 ml konzentrierter Salzsäure und 10 ml 1,4-Dioxan wurde 2 Stunden lang auf 100°C erhitzt, bevor sie mit 50 ml Ethylacetat und 50 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung aufgetrennt wurde. Die organische Schicht wurde mit 2 g Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Die Reinigung durch Kieselgelchromatographie unter Verwendung von 40% Ethylacetat in Hexanen ergab 0,21 g X als einen weißen Feststoff.
Synthese von XI:
Eine Lösung von 0,19 g X in 8 ml Tetrahydrofuran und 5 ml 6N Natriumhydroxid wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Abdampfen des Tetrahydrofurans wurde die Reaktion mit 1N HCl auf pH = 4 angesäuert. Der resultierende weiße Niederschlag wurde filtriert und mit 2 × 10 ml Wasser gewaschen. Die Reinigung durch Kieselgelchromatographie unter Verwendung von 10% Methanol in Dichlormethan ergab 40 mg XI.
Synthese von XII:
Eine Lösung von 3,53 g III in 10 ml 6N Natriumhydroxid, 20 ml Methanol und 20 ml 1,4-Dioxan wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, bevor sie mit 200 ml Ethylacetat und 200 ml 1N Salzsäure aufgetrennt wurde. Die organische Schicht wurde mit 10 g Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Feststoff wurde mit Ether verrieben und filtriert, um 2,9 g XII als einen weißen Feststoff zu ergeben.
Synthese von XIII:
Zu einer Mischung aus 0,29 g XII, 0,6 ml Diisopropylethylamin und 0,12 g L-Serinmethylester in 10 ml wasserfreiem N,N'-Dimethylformamid wurden 0,15 g 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid zugegeben. Die Reaktion wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, bevor sie mit 50 ml Ethylacetat und 50 ml Salzsäure aufgetrennt wurde. Die organische Schicht wurde mit 50 ml Salzlösung gewaschen und mit 2 g Natriumsulfat getrocknet. Die Reinigung durch Kieselgelchromatographie unter Verwendung von 10% Methanol in Dichlormethan ergab 0,10 g XIII.
Synthese von XIV:
Eine Lösung von 0,10 g XIII in 2 ml 6N NaOH, 5 ml Methanol und 5 ml 1,4-Dioxan wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, bevor 4 ml HCl zugegeben wurden. Die Reaktion wurde mit 30 ml Ethylacetat und 30 ml Salzlösung aufgetrennt. Die organische Schicht wurde mit 1 g Natriumsulfat getrocknet und eingeengt, um 0,08 g XIV zu ergeben.
Synthese von XV:
Eine Lösung von 0,08 g XIV in 5 ml und 0,5 ml Tetrabutylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran wurde 4 Stunden lang refluxiert, bevor sie mit 20 ml Ethylacetat und 2 × 20 ml Salzlösung aufgetrennt wurde. Die organische Schicht wurde mit 1 g Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Die Reinigung durch Kieselgelchromatographie unter Verwendung von 10% Methanol in Dichlormethan ergab 20 mg XI als einen weißen Feststoff.
Schema III Synthese XVI:
Eine Probe aus 1,00 g Rink-Amid-AM-Harz (Novabiochem, nimmt 0,65 mmol/g auf) wurde mit 15 ml 20%igem Piperidin in DMF 10 Minuten lang behandelt, um die Fmoc-Schutzgruppe zu entfernen, und anschließend wurde sie 5mal mit DMF gewaschen. Zu dem Harz wurden 15 ml DMF, 400 mg 4-O-Allyl-3,4-dihydroxybenzoesäure (3 Äquiv.) und 400 mg EDC (3 Äquiv.) zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht in einem Reaktionsröhrchen geschwenkt, dann wurde das Harz abgegossen und fünfmal mit DMF, fünfmal mit MeOH, fünfmal mit CH₂Cl₂ gewaschen, dann unter Hochvakuum bis zu einem Gewicht von 3,04 g getrocknet. Um die Beladung zu messen, wurden 100 mg des Harzes mit 95%iger Trifluoressigsäure in Methylenchlorid gespalten und erzeugten 14 mg 4-O-Allyl-3,4-dihydroxybenzamid (MS 194, M+1), was auf eine 100%ige Beladung schließen läßt.
Synthese XVII:
Harz-Synthese von 4-O-(2-Benzimidazolyl)methyl-3-O-(2,4-dichlorbenzyl)-3,4-dihydroxybenzamid durch Mitsunobu, gefolgt von Alkylierung
Zu 0,175 g Rink-Amid-AM-4-O-allyl-3,4-dihydroxybenzamid-Harz (nimmt 0,65 mmol/g auf) wurden 1,5 ml destilliertes THF, 0,310 g 2,4-Dichlorbenzylalkohol (5 Äquiv.), 0,297 ml Bu₃P (5 Äquiv.) und schließlich 200 mg Diamid (5 Äquiv.) zugegeben. Die Mischung wurde 5 Stunden lang in einem Reaktionsröhrchen geschwenkt, dann wurde das Harz abgegossen und fünfmal mit DMF, fünfmal mit CH₂Cl₂ gewaschen, dann unter Hochvakuum getrocknet. Das Harz wurde in 1,5 ml CH₂Cl₂ aufgequollen und mit 0,200 ml PhSiH₃ (ca. 20 Äquiv.) und 15 mg Pd(Ph₃P)₄ (ca. 0,1 Äquiv.) versetzt. Die Mischung wurde über Nacht in einem Reaktionsröhrchen geschwenkt, dann wurde das Harz abgegossen und fünfmal mit DMF, fünfmal mit CH₂Cl₂ gewaschen, dann unter Hochvakuum getrocknet. Dieses Material wurde in 2,0 ml DMF aufgequollen und mit 89 mg 1-t-Boc-2-Chlormethylbenzimidazol (3 Äquiv.) und 0,050 ml DBU (3 Äquiv.) versetzt. Die Mischung wurde über Nacht in einem Reaktionsröhren geschwenkt, dann wurde das Harz abgegossen und fünfmal mit DMF, fünfmal mit CH₂Cl₂ gewaschen und anschließend durch 45 Minuten langes Behandeln mit 2 ml 95%iger Trifluoressigsäure in Methylenchlorid gespalten. Die Spaltlösung wurde abgegossen und das Lösungsmittel unter einem Stickstoffstrom entfernt. Der Rückstand wurde durch HPLC auf einer YMC-PACK ODS 100 × 20 mm-Säule mit 20 ml/Minute mit einem Gradienten, beginnend bei 90/10 Wasser/CH₃CN (0,1% TFA) und linear stufenweise ansteigend auf reines Acetonitril (0,1% TFA) innerhalb eines 11 Minuten langen Durchgangs, gereinigt. Die produkthaltigen Fraktionen wurden vereint und ihr Volumen unter einem Stickstoffstrom verringert, dann wurden sie gefriergetrocknet, um 24 mg eines weißen flockigen Feststoffs zu ergeben, der durch LC-Massenspektr. (409 M+1) analysiert wurde.
Synthese XVIIIc
Harz-Synthese von 4-O-(2-Benzimidazolyl)methyl-3-O-(2-fluor-4-brombenzyl)-3,4-dihydroxybenzamid durch Tandem-Alkylierung
Zu 0,175 g Rink-Amid-AM-4-O-allyl-3,4-dihydroxybenzamid-Harz (nimmt 0,65 mmol/g auf) wurden 1,5 ml siebgetrocknetes DMF, 0,154 g 2-Fluor-4-brombenzylbromid (5 Äquiv.), 0,085 ml Diazabicycloundecan (DBU, 1,55 mmol, 5 Äquiv.) zugegeben. Die Mischung wurde 5 Stunden lang in einem Reaktionsröhrchen geschwenkt, dann wurde das Harz abgegossen und fünfmal mit DMF, fünfmal mit CH₂Cl₂ gewaschen, dann unter Hochvakuum getrocknet. Das Harz wurde in 1,5 ml CH₂Cl₂ aufgequollen und mit 0,200 ml PhSiH₃ (ca. 20 Äquiv.) und 15 mg Pd(Ph₃P)₄ (ca. 0,1 Äquiv.) versetzt. Die Mischung wurde über Nacht in einem Reaktionsröhrchen geschwenkt, dann wurde das Harz abgegossen und fünfmal mit DMF, fünfmal mit CH₂Cl₂ gewaschen, dann unter Hochvakuum getrocknet. Dieses Material wurde in 2,0 ml DMF aufgequollen und mit 89 mg 1-t-Boc-2-Chlormethyl-6-methylbenzimidazol (3 Äquiv.) und 0,050 ml DBU (3 Äquiv.) versetzt. Die Mischung wurde über Nacht in einem Reaktionsröhren geschwenkt, dann wurde das Harz abgegossen und fünfmal mit DMF, fünfmal mit CH₂Cl₂ gewaschen und anschließend durch 45 Minuten langes Behandeln mit 2 ml 95%iger Trifluoressigsäure in Methylenchlorid gespalten. Die Spaltlösung wurde abgegossen und das Lösungsmittel unter einem Stickstoffstrom entfernt. Der Rückstand wurde durch HPLC auf einer YMC-PACK ODS 100 × 20 mm-Säule mit 20 ml/Minute mit einem Gradienten, beginnend bei 90/10 Wasser/CH₃CN (0,1% TFA) und linear stufenweise ansteigend auf reines Acetonitril (0,1% TFA) innerhalb eines 11 Minuten langen Durchgangs, gereinigt. Die produkthaltigen Fraktionen wurden vereint und ihr Volumen unter einem Stickstoffstrom verringert, dann wurden sie gefriergetrocknet, um 24 mg eines weißen flockigen Feststoffs zu ergeben, der durch LC-Massenspektr. (409 M+1) analysiert wurde.
Die gemäß diesem Schema hergestellten Carboxamide sind nachstehend in Tabelle 1 angegeben:
Tabelle 1 Carboxamide, hergestellt aus Rink-Amid-AM-4-O-allyl-3,4-dihydroxybenzamid-Harz
Tabelle 1, Forts.
Tabelle 1, Forts. Carboxamid, hergestellt aus Rink-Amid-AM-4-O- allyl-3,4-dihydroxybenzamid-Harz
Schema IV Synthese XIX: Ethyl-4-O-Allyl-3,4-dihydroxybenzoat
Zu 5,46 g (30 mmol) Ethyl-3,4-dihydroxybenzoat wurden 20 ml siebgetrocknetes DMF, 2,58 ml Allylbromid (30 mmol) und schließlich 2,07 g (15 mmol) Kaliumcarbonat zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, wobei zu diesem Zeitpunkt die Temperatur auf 55°C angehoben und das Rühren vier Stunden lang fortgesetzt wurde. Die DC-Analyse mit 9:1 Hexan/Ethylacetat zeigte das Ausgangsmaterial nahe der Grundlinie, das erwünschte monoalkylierte Produkt und dessen Isomer als zwei sehr nahe Punkte bei ca. Rf 0,5 mit mehr von dem erwünschten Isomer bei niedrigerem Rf und schließlich das dialkylierte Nebenprodukt bei ca.
Rf 0,8. Die Reaktionsmischung wurde am Rotationsverdampfer zu einer dicken Paste eingeengt, dann zwischen 500 ml EtOAc und 200 ml 1N HCl aufgetrennt. Die organische Schicht wurde abgetrennt und mit 100 ml 1N HCl, 100 ml Wasser, 100 ml Salzlösung gewaschen, dann über MgSO₄ getrocknet und filtriert. Das Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt, um ein dunkles gelbes Öl zu ergeben. Dieses Material wurde auf Silica (Säulenabmessung: 14" Länge × 2" Durchmesser) chromatographiert. Zunächst wurde die Säule mit 95:5 Hexan/EtOAc eluiert, bis das dialkylierte Nebenprodukt abging, dann wurde die Elution mit 90:10 Hexan/EtOAc unter stufenweiser Erhöhung bis 85:15 Hexan/EtOAc fortgesetzt, bis der Großteil des unerwünschten monoalkylierten Isomers eluierte. Die Fraktionen wurden eingeengt, um die erwünschte Verbindung, Ethyl-4-O-allyl-3,4-dihydroxybenzoat, als einen weißen amorphen Feststoff (2,86 g) zu ergeben. Ebenfalls isoliert wurden 785 mg des Isomers Ethyl-3-O-allyl-3,4-dihydroxybenzoat und 990 mg einer Mischung aus den zwei Isomeren.
Man beachte, daß das NMR der 2 monoalkylierten Isomere nahezu identisch ist, außer bei der Stellung des phenolischen Protons, die bei dem erwünschten 4-O-Allylisomer bei höherem Feld liegt.
Ethyl-4-O-allyl-3,4-dihydroxybenzoat (erwünschtes Hauptprodukt):
¹H-NMR 500 MHz, Aceton-d₆): δ 7,99 (s, 1H, phenolisches Proton), 7,51 (d, 1H), 7,49 (s, 1H), 6,93 (d, 1H), 6,1 (m, 1H), 5,45 (d, 1H), 5,25 (d, 1H), 4,71 (d, 2H), 4,28 (q, 2H), 1,25 (t, 3H).
MS (ESI): 223 (M+H⁺).
Ethyl-3-O-allyl-3,4-dihydroxybenzoat (unerwünschtes Nebenprodukt):
¹H-NMR 500 MHz, Aceton-d₆): δ 8,43 (s, 1H, phenolisches Proton), 7,58 (m, 2H), 7,03 (d, 1H), 6,1 (m, 1H), 5,45 (d, 1H), 5,25 (d, 1H), 4,71 (d, 2H), 4,28 (q, 2H), 1,25 (t, 3H).
MS (ESI): 223 (M+H⁺).
Synthese XX: Ethyl-4-O-allyl-3-O-(2,4-dichlorbenzyl)-3,4-dihydroxybenzoat
Zu 3,74 g (16,8 mmol) Ethyl-4-0-allyl-3,4-dihydroxybenzoat wurden 25 ml siebgetrocknetes DMF, 2,8 ml 2,4-Dichlorbenzylchlorid (20 mmol, 1,2 Äquiv.) und schließlich 2,8 g (20 mmol, 1,2 Äquiv.) Kaliumcarbonat zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, wonach die DC-Analyse mit 1:1 Hexan/Ethylacetat als Elutionsmittel die vollständige Umwandlung in das Produkt zeigte. Die Reaktionsmischung wurde am Rotationsverdampfer zu einer dicken Paste eingeengt, dann zwischen 500 ml EtOAc und 200 ml 1N HCl aufgetrennt. Die organische Schicht wurde abgetrennt und mit 100 ml 1N HCl, 100 ml Wasser, 100 ml Salzlösung gewaschen, dann über MgSO₄ getrocknet und filtriert. Das dabei erhaltene rohe Öl wurde ohne weitere Reinigung im nächsten Schritt verwendet.
Synthese XXI: Ethyl-3-O-(2,4-dichlorbenzyl)-3,4-dihydroxybenzoat:
Zu dem Rohprodukt aus der vorherigen Reaktion wurden 40 ml siebgetrocknetes Methylenchlorid, 25,0 ml Phenylsilan (201 mmol, 12 Äquiv.) und schließlich 2,3 g Pd(Ph₃P)₄ zugegeben. Die Mischung wurde 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, wonach die DC-Analyse mit 1:1 Hexan/Ethylacetat als Elutionsmittel die vollständige Umwandlung in das Produkt zeigte. Die Reaktionsmischung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und direkt auf Silica mit 10% EtOAc in Hexan als Elutionsmittel chromatographiert. Die Fraktionen wurden eingeengt, um die erwünschte Verbindung, Ethyl-3-O-(2,4-dichlorbenzyl)-3,4-dihydroxybenzoat, als einen weißen amorphen Feststoff (4,56 g, 13,4 mmol, 80% für zwei Schritte) zu ergeben.
Ethyl-3-O-(2,4-dichlorbenzyl)-3,4-dihydroxybenzoat
¹H-NMR 500 MHz, Aceton-d₆): δ 8,65 (s, 1H, phenolisches Proton), 7,74 (d, 1H) , 7, 66 (s, 1H) , 7, 61 (d, 1H) , 7, 59 (s, 1H) , 7, 44 (d, 1H) , 6, 98 (d, 1H), 5,28 (s, 2H), 4,28 (q, 2H), 1,32 (t, 3H).
MS (ESI): 341 (M+H⁺).
Synthese XXII: 1-t-Boc-2-Chlormethylbenzimidazol
Zu 4,0 g (24 mmol) Ethyl-2-chlormethylbenzimidazol wurden 40 ml destilliertes THF, 7,86 g t-Boc-Anhydrid (36 mmol, 1,5 Äquiv.), 5,0 ml Et₃N (36 mmol, 1,5 Äquiv.) und schließlich 2,93 g Dimethylaminopyridin (24 mmol, 1 Äquiv.) zugegeben. Die Mischung wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, wonach die Reaktion mit 300 ml EtOAc verdünnt und mit 100 ml 1N HCl, 100 ml Wasser, 100 ml Salzlösung extrahiert, dann über MgSO₄ getrocknet und filtriert wurde. Das Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt, um ein dunkles gelbes Öl zu ergeben. Dieses Material wurde auf Silica mit 90:10 Hexan/EtOAc als Elutionsmittel chromatographiert. Die Fraktionen wurden eingeengt, um die erwünschte Verbindung 1 t-Boc-2-Chlormethylbenzimidazol als ein blasses gelbes Öl zu ergeben (4,06 g, 63%).
Synthese XXIII: Ethyl-4-O-(2-(1-t-Boc-benzimidazolyl))methyl-3-O-(2,4-dichlorbenzyl)-3,4-dihydroxybenzoat
Zu 4,30 g (12,6 mmol) Ethyl-3-O-(2,4-dichlorbenzyl)-3,4-dihydroxybenzoat wurden 20 ml siebgetrocknetes DMF, 4,03 g 1-t-Boc-2-Chlormethylbenzimidazol (15,1 mmol, 1,2 Äquiv.) und schließlich 2,26 ml Diazabicycloundecan (DBU, 15,1 mmol, 1,2 Äquiv.) zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, wonach die DC-Analyse mit 9:1 Hexan/Ethylacetat die vollständige Reaktion zeigte. Die Reaktionsmischung wurde am Rotationsverdampfer zu einer dicken Paste eingeengt, dann direkt auf Silica unter Verwendung eines Elutionsgradienten von 10%, der auf 20% Ethylacetat in Hexan anstieg, chromatographiert. Die Fraktionen wurden eingeengt, um die erwünschte Verbindung, Ethyl-4-O-(2-(1-t-Bocbenzimidazolyl))methyl-3-O-(2,4-dichlorbenzyl)-3,4-dihydroxybenzoat als einen weißen amorphen Feststoff zu ergeben (5,48 g, 9,58 mmol, 76%).
Synthese XXIV: 4-O-(2-Benzimidazolyl)methyl-3-O-(2,4-dichlorbenzyl)-3,4-dihydroxybenzoesäure
Zu 5,48 g (9,58 mmol) Ethyl-4-O-(2-(1-t-Boc-benzimidazolyl))methyl-3-O-(2,4-dichlorbenzyl)-3,4-dihydroxybenzoat wurden 70 ml 1:1 THF/Wasser und 2,0 g LiOH-H₂O zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei 40°C gerührt, dann mit 1N HCl neutralisiert. Das Produkt fiel aus und wurde durch Filtration gesammelt und unter Hochvakuum getrocknet, um 4,2 g eines weißen amorphen Feststoffs zu ergeben, der für nachfolgende Umsetzungen ausreichend rein war.
Synthese XXV: Modulare Synthese von Amiden von 4-O-(2-Benzimidazolyl)methyl-3-O-(2,4-dichlorbenzyl)-3,4-dihydroxybenzoesäure
20 bis 40 dieser modularen Amidierungsreaktionen werden normalerweise gleichzeitig durch Einwiegen der primären oder sekundären Amine in Röhrchen, dann durch Versetzen eines jeden mit Stammlösungen von Catechol-Ausgangsmaterial und EDC/HOBt, durchgeführt.
Zunächst wurden 0,3–0,6 mmol eines jeden Amins in getrennte Röhrchen eingewogen. Läßt man die Schwankung der Masse um den Faktor 2 zu, so hat dies keine nachteilige Auswirkung auf die Reaktion und beschleunigt das Abwiegen, welches der langsamste und mühsamste Teil der Sequenz ist, beträchtlich. Flüssige Amine wurden basieren auf dem Volumen (0,4 mmol) unter Verwendung von Mikroliterspritzen eingebacht. Stammlösung A wurde durch Auflösen von 4-O-(2-Benzimidazolyl)methyl-3-O-(2,4-dichlorbenzyl)-3,4-dihydroxybenzoesäure in DMF bis zu einer Konzentration von 32 mg/ml hergestellt. Zu jedem Röhrchen wurden 0,25 ml (8 mg, 1,8 mmol Catechol) Stammlösung A zugegeben. Stammlösung B wurde durch Zugabe von DMF zu 132 mg EDC und 93 mg HOBt zu einem 5-ml-Lösungsvolumen hergestellt. Zu jedem Röhrchen wurden 0,25 ml (8 mg, 1,8 mmol Catechol) Stammlösung B zugegeben. In Fällen, wo das Amin ein Hydrochlorid- oder ein anderes Säuresalz war, wurden 0,006 ml Et₃N pro Mol Säure zugegeben (z.B. würde Diammoniumdichlorid 0,012 ml erfordern). Röhrchen, in denen Feststoff verblieb, wurden anschließend kurz mit einer Heizpistole erwärmt und mit Ultraschall behandelt. In den meisten Fällen führte dies zu einer homogenen Lösung, jedoch nicht immer, und es wurde festgestellt, daß eine homogene Lösung nicht immer notwendig war, damit eine Reaktion ablief. Alle Röhrchen wurden über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, wonach 1 ml Wasser und 1 ml gesättigte Natriumhydrogencarbonatlösung in jedes Röhrchen gegeben wurden. Die Mischung wurde mit 3 × 1 ml Ethylacetat pro Röhrchen extrahiert, welche in einem Teströhrchen vereint wurden, und das Lösungsmittel wurde unter einem Stickstoffstrom abgedampft. Der resultierende Feststoff wurde in 1 ml DMSO (unter Erwärmen, falls notwendig) gelöst und durch HPLC auf einer YMC-PACK ODS 100 × 20 mm-Säule mit 20 ml/Minute mit einem Gradienten, beginnend bei 90/10 Wasser/CH₃CN (0,1% TFA) und linear stufenweise ansteigend auf reines Acetonitril (0,1% TFA) innerhalb eines 11 Minuten langen Durchgangs, gereinigt. Die produkthaltigen Fraktionen wurden vereint und ihr Volumen unter einem Stickstoffstrom verringert, dann wurden sie gefriergetrocknet, um als Produkt einen flockigen Feststoff zu ergeben. Die Ausbeuten betrugen typischerweise 5 bis 10 mg. Tabelle 2 gibt Amide an, die gemäß Schema III hergestellt wurden (jedes wurde durch LCMS charakterisiert):
Tabelle 2 Modulare Synthese von 4-O-(2-Benzimidazolyl)methyl-3-O-(2,4-dichlorbenzyl)-3,4-dihydroxybenzoesäure
Tabelle 2, Forts. Modulare Synthese von 4-O-(2-Benzimidazolyl)methyl-3-O-(2,4-dichlorbenzyl)-3,4-dihydroxybenzoesäure
Tabelle 2, Forts. Modulare Synthese von 4-O-(2-Benzimidazolyl)methyl-3-O-(2,4-dichlorbenzyl)-3,4-dihydroxybenzoesäure
Tabelle 2, Forts. Modulare Synthese von 4-O-(2-Benzimidazolyl)methyl-3-O-(2,4-dichlorbenzyl)-3,4-dihydroxybenzoesäure
Tabelle 2, Forts. Modulare Synthese von 4-O-(2-Benzimidazolyl)methyl-3-O-(2,4-dichlorbenzyl)-3,4-dihydroxybenzoesäure
Tabelle 2, Forts. Modulare Synthese von 4-O-(2-Benzimidazolyl)methyl-3-O-(2,4-dichlorbenzyl)-3,4-dihydroxybenzoesäure
Schema V Synthese XXVI: Ethyl-4-O-allyl-3,4-dihydroxybenzoat
Zu 5,46 g (30 mmol) Ethyl-3,4-dihydroxybenzoat wurden 20 ml siebgetrocknetes DMF, 2,58 ml Allylbromid (30 mmol) und schließlich 2,07 g (15 mmol) Kaliumcarbonat zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, wonach die Temperatur auf 55°C angehoben und das Rühren 4 Stunden lang fortgesetzt wurde. Die DC-Analyse mit 9:1 Hexan/Ethylacetat als Elutionsmittel zeigte Ausgangsmaterial nahe der Grundlinie, das erwünschte monoalkylierte Produkt und dessen Isomer als zwei sehr nahe Punkte bei ca. Rf 0,5 mit mehr von dem erwünschten Isomer bei niedrigerem Rf und schließlich das dialkylierte Nebenprodukt bei ca. Rf 0,8. Die Reaktionsmischung wurde am Rotationsverdampfer zu einer dicken Paste eingeengt, dann zwischen 500 ml EtOAc und 200 ml 1N HCl aufgetrennt. Die organische Schicht wurde abgetrennt und mit 100 ml 1N HCl, 100 ml Wasser, 100 ml Salzlösung gewaschen, dann über MgSO₄ getrocknet und filtriert. Das Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt, um ein dunkles gelbes Öl zu ergeben. Dieses Material wurde auf Silica (Säulenabmessung: 14" Länge × 2" Durchmesser) chromatographiert. Zunächst wurde die Säule mit 95:5 Hexan/EtOAc eluiert, bis das dialkylierte Nebenprodukt abging, dann wurde die Elution mit 90:10 Hexan/EtOAc unter schrittweiser Erhöhung bis 85:15 Hexan/EtOAc fortgesetzt, bis der Großteil des unerwünschten monoalkylierten Isomers eluierte. Die Fraktionen wurden eingeengt, um die erwünschte Verbindung, Ethyl-4-Q-allyl-3,4-dihydroxybenzoat, als einen weißen amorphen Feststoff (2,86 g) zu ergeben. Ebenfalls isoliert wurden 785 mg des Isomers Ethyl-3-O-allyl-3,4-dihydroxybenzoat und 990 mg einer Mischung aus den zwei Isomeren.
Man beachte, daß das NMR der 2 monoalkylierten Isomere nahezu identisch ist, außer bei der Stellung des phenolischen Protons, die bei dem erwünschten 4-O-Allylisomer bei höherem Feld liegt.
Ethyl-4-O-allyl-3,4-dihydroxybenzoat (erwünschtes Hauptprodukt):
¹H-NMR 500 MHz, Aceton-d₆): δ 7,99 (s, 1H, phenolisches Proton), 7,51 (d, 1H) , 7, 49 (s, 1H) , 6, 93 (d, 1H) , 6, 1 (m, 1H) , 5, 45 (d, 1H) , 5, 25 (d, 1H), 4,71 (d, 2H), 4,28 (q, 2H), 1,25 (t, 3H).
MS (ESI): 223 (M+H⁺).
Ethyl-3-O-allyl-3,4-dihydroxybenzoat (unerwünschtes Nebenprodukt):
¹H-NMR 500 MHz, Aceton-d₆): δ 8,43 (s, 1H, phenolisches Proton), 7,58 (m, 2H) , 7, 03 (d, 1H) , 6, 1 (m, 1H) , 5, 45 (d, 1H) , 5, 25 (d, 1H) , 4, 71 (d, 2H), 4,28 (q, 2H), 1,25 (t, 3H).
MS (ESI): 223 (M+H⁺).
Synthese XXVII: 4-O-Allyl-3,4-dihydroxybenzoesäure
Zu 1,00 g (4,50 mmol) Ethyl-4-O-allyl-3,4-dihydroxybenzoat wurden 10 ml 1:1 THF/Wasser, 378 mg LiOH-H₂O (9,00 mmol, 2,0 Äquiv.) und schließlich 2,8 g (20 mmol, 1,2 Äquiv.) Kaliumcarbonat zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, wonach die DC-Analyse mit 5:1 Hexan/Ethylacetat als Elutionsmittel die unvollständige Umwandlung in das Produkt zeigte. Weitere 150 mg LiOH-H₂O (0,4 Äquiv.) wurden zugegeben und das Rühren weitere 24 Stunden fortgesetzt, wonach die Reaktion durch DC als beendet eingestuft wurde. Die Reaktionsmischung wurde mit 100 ml Wasser verdünnt und einmal mit 25 ml EtOAc und einmal mit 25 ml CH₂Cl₂ extrahiert. Die wäßrige Schicht wurde mit 1N HCl auf pH = 1 angesäuert, dann zweimal mit 25 ml EtOAc, dann zweimal mit 25 ml CH₂Cl₂ extrahiert. Diese organischen Bestandteile wurden vereint, über MgSO₄ getrocknet und filtriert. Das Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt und der resultierende amorphe weiße Feststoff unter Hochvakuum getrocknet, um 835 mg (96%) Rohprodukt mit ausreichender Reinheit zur Verwendung bei weiteren Reaktionen zu ergeben.
4-O-Allyl-3,4-dihydroxybenzoesäure:
¹H-NMR 500 MHz, Aceton-d₆): δ 7,37 (d, 1H), 7,36 (s, 1H), 6,97 (d, 1H), 6,05 (m, 1H), 5,40 (d, 1H), 5,25 (d, 1H), 4,60 (d, 2H).
MS (ESI) : 195 (M+H⁺).
Synthese XXVIII HMPB-4-O-Allyl-3,4-dihydroxybenzoatharz
Zu 2,65 g HMPB-Harz (Novobiochem, nimmt 0,51 mmol/g auf, 1,35 mmol) wurden 50 ml destilliertes THF, 0,655 g 4-O-Allyl-3,4-dihydroxybenzoesäure (3,38 mmol, 2,5 Äquiv.), 900 mg Ph₃P (3,38 mmol, 2,5 Äquiv.) und schließlich 0,675 ml Diisopropyldiazodicarboxylat (3,38 mmol, 2,5 Äquiv.) zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht in einem Reaktionsröhrchen geschwenkt, dann wurde das Harz abgegossen und fünfmal mit DMF, fünfmal mit MeOH, fünfmal mit CH₂Cl₂ gewaschen, dann unter Hochvakuum bis zu einem Gewicht von 3,04 g getrocknet. Um die Beladung zu messen, wurden 100 mg des Harzes mit 10%iger Trifluoressigsäure in Methylenchlorid gespalten und erzeugten 5,0 mg 4-O-Allyl-3,4-dihydroxybenzoesäure mit hervorragender Reinheit, was eine Beladung von 58% anzeigt.
4-O-Allyl-3,4-dihydroxybenzoesäure:
¹H-NMR 500 MHz, Aceton-d₆): δ 7,37 (d, 1H), 7,36 (s, 1H), 6,97 (d, 1H), 6,05 (m, 1H), 5,40 (d, 1H), 5,25 (d, 1H), 4,60 (d, 2H).
MS (ESI): 195 (M+H⁺).
Synthese XXIX Harzsynthese von 4-O-(2-Benzimidazolyl)methyl-3-O-(2-fluor-4-brombenzyl)-3,4-dihydroxybenzoesäure durch Tandem-Alkylierung
Zu 0,600 g HMPB-4-O-Allyl-3,4-dihydroxybenzoatharz (nimmt 0,51 mmol/g auf) wurden 5 ml siebgetrocknetes DMF, 0,415 g 2-Fluor-4-brombenzylbromid (1,55 mmol, 5 Äquiv.), 0,231 ml Diazabicycloundecan (DBU, 1,55 mmol, 5 Äquiv.) zugegeben. Die Mischung wurde über Nacht in einem Reaktionsröhrchen geschwenkt, dann wurde das Harz abgegossen und fünfmal mit DMF, fünfmal mit CH₂Cl₂ gewaschen, dann unter Hochvakuum getrocknet. Das Harz wurde in 3 ml CH₂Cl₂ aufgequollen und mit 0,500 ml PhSiH₃ (13 Äquiv.) und 40 mg Pd(Ph₃P)₄ (0,1 Äquiv.) versetzt. Die Mischung wurde über Nacht in einem Reaktionsröhrchen geschwenkt, dann wurde das Harz abgegossen und fünfmal mit DMF, fünfmal mit CH₂Cl₂ gewaschen, dann unter Hochvakuum bis zu einem Gewicht von 530 mg getrocknet. Eine Probe von 180 mg dieses Materials wurde in 2,0 ml DMF aufgequollen und mit 73 mg 1-t-Boc-2-Chlormethylbenzimidazol (3 Äquiv.) und 0,041 ml DBU (3 Äquiv.) versetzt. Die Mischung wurde über Nacht in einem Reaktionsröhren geschwenkt, dann wurde das Harz abgegossen und fünfmal mit DMF, fünfmal mit CH₂Cl₂ gewaschen und anschließend durch 30 Minuten langes Behandeln mit 2 ml 40%iger Trifluoressigsäure in Methylenchlorid gespalten. Die Spaltlösung wurde abgegossen und das Lösungsmittel unter einem Stickstoffstrom entfernt. Der Rückstand wurde durch HPLC auf einer YMC-PACK ODS 100 × 20 mm-Säule mit 20 ml/Minute mit einem Gradienten, beginnend bei 90/10 Wasser/CH₃CN (0,1% TFA) und linear stufenweise ansteigend auf reines Acetonitril (0,1% TFA) innerhalb eines 11 Minuten langen Durchgangs, gereinigt. Die produkthaltigen Fraktionen wurden vereint und ihr Volumen unter einem Stickstoffstrom verringert, dann wurden sie gefriergetrocknet, um 10 mg eines weißen flockigen Feststoffs zu ergeben, der durch LC-Massenspektr. (471 M+1) analysiert wurde.
Synthese XXX Harz-Synthese von 4-O-(2-Benzimidazolyl)methyl-3-O-(4-chlorbenzyl)-3,4-dihydroxybenzoesäure durch Mitsunobu, gefolgt von Alkylierung
Zu 0,250 g HMPB-4-O-Allyl-3,4-dihydroxybenzoatharz(nimmt 0,51 mmol/g auf) wurden 5 ml destilliertes THF, 0,180 g 4-Chlorbenzylalkohol (5 Äquiv.), 0,315 ml Bu₃P (5 Äquiv.) und schließlich 220 mg Diamid (5 Äquiv.) zugegeben. Die Mischung wurde 5 Stunden lang in einem Reaktionsröhrchen geschwenkt, dann wurde das Harz abgegossen und fünfmal mit DMF, fünfmal mit CH₂Cl₂ gewaschen, dann unter Hochvakuum getrocknet. Das Harz wurde in 1,5 ml CH₂Cl₂ aufgequollen und mit 0,300 ml PhSiH₃ (20 Äquiv.) und 15 mg Pd(Ph₃P)₄ (0,1 Äquiv.) versetzt. Die Mischung wurde über Nacht in einem Reaktionsröhrchen geschwenkt, dann wurde das Harz abgegossen und fünfmal mit DMF, fünfmal mit CH₂Cl₂ gewaschen, dann unter Hochvakuum mg getrocknet. Dieses Material wurde in 2,0 ml DMF aufgequollen und mit 102 mg 1-t-Boc-2-Chlormethylbenzimidazol (3 Äquiv.) und 0,060 ml DBU (3 Äquiv.) versetzt. Die Mischung wurde über Nacht in einem Reaktionsröhren geschwenkt, dann wurde das Harz abgegossen und fünfmal mit DMF, fünfmal mit CH₂Cl₂ gewaschen und anschließend durch 30 Minuten langes Behandeln mit 2 ml 40%iger Trifluoressigsäure in Methylenchlorid gespalten. Die Spaltlösung wurde abgegossen und das Lösungsmittel unter einem Stickstoffstrom entfernt. Der Rückstand wurde durch HPLC auf einer YMC-PACK ODS 100 × 20 mm-Säule mit 20 ml/Minute mit einem Gradienten, beginnend bei 90/10 Wasser/CH₃CN (0,1% TFA) und linear stufenweise ansteigend auf reines Acetonitril (0,1% TFA) innerhalb eines 11 Minuten langen Durchgangs, gereinigt. Die produkthaltigen Fraktionen wurden vereint und ihr Volumen unter einem Stickstoffstrom verringert, dann wurden sie gefriergetrocknet, um 12 mg eines weißen flockigen Feststoffs zu ergeben, der durch LC-Massenspektr. (409 M+1) analysiert wurde.
Auf diese Weise wurden die in der nachstehenden Tabelle 3 gezeigten Verbindungen synthetisiert und durch LCMS charakterisiert:
Tabelle 3 Carbonsäuren, hergestellt aus HMPB-4-O-Allyl-3,4-dihydroxybenzoatharz
Carbonsäuren, hergestellt aus HMPB-4-O-Allyl-3,4-dihydroxybenzoatharz
Tabelle 3, Forts. Carbonsäuren, hergestellt aus HMPB-4-O-Allyl-3,4-dihydroxybenzoatharz
Carbonsäuren, hergestellt aus HMPB-4-O-Allyl-3,4-dihydroxybenzoatharz
Tabelle 3, Forts. Carbonsäuren, hergestellt aus HMPB-4-O-Allyl-3,4-dihydroxybenzoatharz
Tabelle 3, Forts. Carbonsäuren, hergestellt aus HMPB-4-O-Allyl-3,4-dihydroxybenzoatharz
Tabelle 3, Forts. Carbonsäuren, hergestellt aus HMPB-4-O-Allyl-3,4-dihydroxybenzoatharz
Tabelle 3, Forts. Carbonsäuren, hergestellt aus HMPB-4-O-Allyl-3,4-dihydroxybenzoatharz
Tabelle 3, Forts.
Carbonsäuren, hergestellt aus HMPB-4-O-Allyl-3,4-dihydroxybenzoatharz
Die folgenden zwei Verbindungen erforderten eine leichte Abweichung von der Standardvorschrift: Die Abspaltung vom Harz erfolgte mit 5%iger TFA und CH₂Cl₂ innerhalb von 5 Minuten und ergab tBoc-geschütztes Produkt. Das tBoc wurde anschließend entfernt, wobei 2 ml 1:1 CH₂Cl₂/2N NH₃ in MeOH 30 Minuten lang verwendet wurde. Das Lösungsmittel wurde entfernt und die Verbindungen durch HPLC in der üblichen Weise gereinigt. Dies war notwendig, da die normalen Spaltungsbedingungen von 40% TFA/CH₂Cl₂ über 40 Minuten die p-Alkylbenzylgruppen spalteten.
BIOLOGISCHE UNTERSUCHUNG Enzymatische Aktivität
IC₅₀-Bestimmungen für die Aminoacyl-tRNA-Synthetasen (aaRS), die aus Krankheitserreger- oder HeLa-Zellen isoliert worden waren, wurden durch Verwendung einer Modifizierung des früher beschriebenen Tests (siehe Beispiele: D. Kern et al., Biochemie, 61, 1257–1272 (1979) und J. Gilbart et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 37(1), 32–38 (1993)) zur aaRS-Beschickung und Trichloressigsäurefällung durchgeführt. Die aaRS-Enzyme wurde durch Standard-Klonierungs und -Expressionsverfahren hergestellt und teilgereinigt oder aus Krankheitserreger- und HeLa-Zellextrakten teilgereinigt. Die Aktivität eines jeden aaRS-Enzyms wurde als mit Trichloressigsäure fällbare Zählimpulse (cpm), erhalten bei einer Reaktionszeit von 10 Minuten bei K_m-Substratkonzentrationen, standardisiert. Für praktische Zwecke ist der minimal annehmbare Wert etwa 2000 cpm pro 10minütiger Reaktion.
Vorinkubationen für die IC₅₀-Bestimmungen wurden durch Inkubation teilgereinigter aaRS-Extrakte in 50 mM HEPES (pH 7,5), 0,1 mM EDTA, 0,05 mg/ml Rinderserumalbumin, 10 mM Dithiothreit und 2,5% Dimethylsulfoxid mit und ohne Testverbindung (z.B. Verbindung der Erfindung (vorzugsweise eine Verbindung der Formel I) in einem Endvolumen von 20 Mikroliter in einer Mikrotiterplatte 20 Minuten lang bei 25°C eingeleitet. Die Testverbindungen lagen typischerweise als Reihenverdünnungen in Konzentrationsbereichen von 0,35 nM bis 35 µM vor. Die Testverbindungslösungen wurden durch Auflösen der Testverbindung in 100%igem Dimethylsulfoxid und Verdünnen bis zur Endkonzentration mit 50 mM HEPES, pH 7,5, hergestellt. Die IC₅₀-Bestimmungen wurden typischerweise doppelt durchgeführt, wobei jedes Experiment 4–8 Inhibitorkonzentrationen zusammen mit zwei Kontrollen ohne Inhibitor enthielt.
Die IC₅₀-Inkubationen wurden durch Ergänzung der Vorinkubationsmischung bis zu einer fertigen Testkonzentrationen von 10 mM MgCl₂, 30 mM KCl, 10 mM KF, 50 mM HEPES (pH 7,5), 20 µM-500 mM ATP, 2–20 µM [³H]-Aminosäure und 90–180 µM rohes tRNA in einem Endvolumen von 35 Mikrolitern initiiert. Die Reaktion wurde 5–20 Minuten lang bei 25°C inkubiert. Zu bestimmten Zeitpunkten wurde ein 15-Mikroliter-Aliquot entfernt und zu einer Vertiefung einer Millipore-Filterplatte (Multiscreen-FB, MAFB NOB 10), die 100 Mikroliter kalte 5%ige (Gew./Vol.) Trichloressigsäure enthielt, zugegeben. Durch Trichloressigsäure ausfällbares Material wurde durch Filtration auf einer Millipore-Multiscreen-Filterstation gesammelt, zweimal mit kalter 5%iger Trichloressigsäure, zweimal mit Wasser gewaschen und getrocknet. Typischerweise lieft man die Platten mehrere Stunden lang an Luft trocknen, oder sie wurden 30 Minuten lang in einem Vakuumofen auf 50°C erwärmt. Die Radioaktivität auf den getrockneten Platten wurde durch Zugabe von Packard Microscint-20 zu den Vertiefungen und Zählen mit einem Packard-TopCount-Szintillationszähler quantifiziert.
Die Inhibitoraktivität wurde typischerweise als Prozentsatz der Kontroll-aaRS-Aktivität ausgedrückt. Der IC₅₀-Wert wurde durch Auftragen der prozentualen Aktivität gegen die Verbindungskonzentration in dem Test und Identifizieren der Konzentration, bei der 50% der Aktivität verblieben waren, ermittelt.
Die IC₅₀-Werte (in µM) einiger repräsentativer Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind in Tabelle 4 angegeben.
Antimikrobielle Whole-cell-Screens
Die Verbindungen wurden auf ihre antimikrobielle Wirkung gegen eine Gruppe von Organismen gemäß den Standardverfahren, die vom National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS-Schrift M7–A3, Band 13, Nr. 25, 1993/NCCLS-Schrift M27-P, Band 12, Nr. 25, 1992) beschrieben wurden, getestet. Die Verbindungen wurden in 100%igem DMSO gelöst und bis zu einer Endreaktionskonzentration (0,1 µg/ml-500 µg/ml) in mikrobiellem Wachstumsmedium verdünnt. In allen Fällen beträgt die Endkonzentration von mit Zellen inkubiertem DMSO weniger als oder gleich 1%. Für Berechnungen der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) wurden 2fache Verdünnungen von Verbindungen zu Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, die 1×10⁵ Bakterien- oder Pilzzellen in einem Endvolumen von 200 lambda eines entsprechenden Mediums (Mueller-Hinton-Bouillon; Haemophilus-Testmedium; Mueller-Hinton-Bouillon + 5% Schafblut; oder RPMI 1690) enthielten, zugegeben. Die Platten wurden über Nacht bei einer geeigneten Temperatur (30°C–37°C) inkubiert, und die optischen Dichten (ein Maß für das Zellwachstum) wurden unter Verwendung eines handelsüblichen Plattenlesegeräts gemessen. Der MIC-Wert ist definiert als die niedrigste Verbindungskonzentration, die das Wachstum des Testorganismus inhibiert.
Die MIC-Werte (in µ/ml) repräsentativer Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind in Tabelle 4 angegeben.
In-Vivo-Wirksamkeit
Mausschutztest
Der Mausschutztest ist ein industrieller Standard zur Messung der Wirksamkeit einer Testverbindung in vivo [für Beispiele für dieses Modell siehe J. J. Clement et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 38(5), 1071–1078, (1994)]. Wie nachstehend veranschaulicht, wird dieser Test verwendet, um die In-vivo-Wirksamkeit der Verbindungen der vorliegenden Erfindung gegen Bakterien und Pilze zu zeigen.
Die Ermittlung der antimikrobiellen In-vivo-Wirksamkeit einer Verbindung der Erfindung, die hierin nachfolgend als Testverbindung bezeichnet wird, wird durch Infizieren männlicher oder weiblicher Mäuse (5 Mäuse/Dosisgruppe × 5 Dosen/Verbindung) mit einem Gewicht von 20–25 g intraperitoneal mit Krankheitserreger-Inokulum begonnen. Das Inokulum wird aus einer vom ATCC erhaltenen Probe eines Krankheitserregers hergestellt (zum Beispiel ATCC 29213, S. aureus; ATCC 14154, S. aureus; ATCC 8668, Strep. pyogenes; ATCC 25922, E. coli; ATCC 29212, E. faecalis; ATCC 25238, M. catarrhalis und ATCC 90028, C. albicans). Jeder Bakterienstamm wird in seinem passenden Medium 18 Stunden lang bei 37°C kultiviert, wobei die meisten Stämme unter diesen Bedingungen zwischen 10⁸ und 10⁹ kolonienbildende Einheiten (CFU)/ml ergeben. Die über Nacht gewachsene Kultur wird bis zu einem geeigneten Gehalt reihenverdünnt, und anschließend werden 0,5 ml einer jeden Verdünnung zu 4,5 ml 5%igem Schweinemagenschleim zugegeben, um das infizierende Inokulum herzustellen. Einer jeden Maus werden 0,5 ml des Inokulums intraperitoneal (i.p.) bei fünf Tieren pro Verdünnung injiziert. Die 50%-Lethaldosis (LD₅₀) und die minimale Lethaldosis (MLD, die Dosis die 100%ig den Tod der Tiere herbeiführt) werden auf der Basis der Anzahl der nach 7 Tagen überlebenden Mäuse berechnet. Die für jeden der Krankheitserreger aufgestellte MLD wird als Inokulum-Dosis in den Mausschutztests verwendet.
Die Testverbindung wird in einem für ihr Abgabeverfahren geeigrieten sterilen Vehikel gelöst (zum Beispiel 30% HPB (Hydroxypropyl-β-cyclodextrin), pH 7,4 oder 0,05M Tris.HCl). Eine Vehikelgruppe (Dosis = 0) dient als Placebo-Kontrolle für jede Verbindung und jeden Krankheitserreger. Die Dosis für die Testverbindung wird basierend auf den MIC-Daten ermittelt. Eine Reihe von Verdünnungen einer Testverbindung wird in dem Vehikel hergestellt. Eine Gruppe von 5 Mäusen wird für jede Test-verbindungsdosis und das Vehikel verwendet. Für jede Verbindung gibt es 5–6 Dosen. Jedes Tier wird nur für 1 Versuch verwendet.
Die Mäuse werden von einem Forscher i.p. mit 0,5 ml der MLD des Krankheitserregers in 5%igem Schweinemagenschleim infiziert, und sofort wird von einem zweiten Forscher die Verbindung (s.k., p.o. oder i.v. in den oben angegebenen Volumina) verabreicht. Die 50%-Schutzdosis (PD₅₀) wird aus der Dosis-Reaktion-Kurve, basierend auf der Anzahl von Mäusen, die 7 Tage nach der Behandlung überlebten, erzeugt wird, berechnet. Bei jedem Versuch ist auch eine positive Kontrollgruppe zum Beispiel mit einem im Handel erhältlichen Antibiotikum enthalten.
Obwohl diese Erfindung mit Bezug auf spezielle Ausführungsformen beschrieben worden ist, sollen die Details dieser Ausführungsformen nicht als Einschränkungen aufgefaßt werden.

Claims

Eine Verbindung der Formel
und wobei R₁, R₂, R₃, R₄, AR und Het ausgewählt sind aus der Tabelle, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon,
Eine Verbindung ausgewählt aus den Folgenden, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon,
oder ausgewählt aus
oder ausgewählt aus
Eine Verbindung der folgenden Formel oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon:
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.
Eine Verbindung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung des Menschen- oder Tierkörpers durch Therapie.
Die Verwendung einer Verbindung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Infektion, zur Inhibierung einer Aminoacyl-tRNA-Synthetase oder zur Inhibierung des Wachstums von Mikroorganismen.
Die Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei die Infektion bakteriell oder fungal ist.
Ein Verfahren zur Inhibierung des Wachstums von Mikroorganismen in einer Zellkultur, das die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 oder eines pharmazeutisch annehmbares Salzes davon umfaßt.