ES2226839T3 - Nuevos catecoles como agentes antimicrobianos. - Google Patents

Nuevos catecoles como agentes antimicrobianos.

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ES2226839T3 ES00930366T ES00930366T ES2226839T3 ES 2226839 T3 ES2226839 T3 ES 2226839T3 ES 00930366 T ES00930366 T ES 00930366T ES 00930366 T ES00930366 T ES 00930366T ES 2226839 T3 ES2226839 T3 ES 2226839T3
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Milton L. Hammond
Milana Maletic
Gina M. Santorelli
Sherman F. Waddell
John Finn
Michael Morytko
Jason Hill
Dennis Keith
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Abstract

Un compuesto de fórmula: **(Fórmula)** y en la que R1, R2, R3, R4, AR y Het se seleccionan de la tabla, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. **(Tabla)**

Description

Nuevos catecoles como agentes antimicrobianos.
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de los inhibidores de sintetasa de ácido ribonucleico de transferencia (ARNt), su preparación y su uso como agentes antimicrobianos.
Antecedentes de la invención
Las aminoacil ARNt sintetasas (aaRS) constituyen una familia de enzimas esenciales que se encuentran virtualmente en todas las células biológicas y son responsables del mantenimiento de la fidelidad de síntesis de proteínas. Específicamente, catalizan la aminoacilación de ARNt en una reacción en dos etapas:
aminoácido (AA) + ATP => AA-AMP + PPi
AA-AMP + ARNt => ARNt-AA + AMP
La enzima se une a adenosina trifosfato (ATP) y su aminoácido específico para catalizar la formación de un complejo de adenilato de aminoacilo (AA-AMP) con la liberación paralela de pirofosfato (PPi). En la segunda etapa, se transfiere el aminoácido al término 2' ó 3' del ARNt produciendo ARNt "cargado" y monofosfato de adenosina (AMP). El ARNt cargado suministra el aminoácido a la cadena de polipéptido naciente en el ribosoma.
Dentro de esta familia existen al menos veinte enzimas esenciales para cada organismo. La inhibición de cualquiera de las sintetasas de ARNt esenciales interrumpe la traducción de proteínas, con el resultado final de la inhibición del crecimiento. El ácido pseudomónico A, un agente antibacteriano usado actualmente en terapia en seres humanos, proporciona una clara prueba de la utilidad de los inhibidores de ARNt sintetasa como sustancias farmacéuticas útiles. El ácido pseudomónico A se une a una ARNt sintetasa en particular, isoleucil ARNt sintetasa, e inhibe la formación de adenilato de isoleucilo en varios patógenos bacterianos gram positivos, tales como Staphylococcus aureus, con el resultado de la inhibición de síntesis de proteínas, seguido de la inhibición del crecimiento.
Los nuevos compuestos sintéticos que se dirigen a sintetasas de ARNt ofrecen claras ventajas como agentes terapéuticos útiles para frenar la amenaza de resistencia a fármacos. La resistencia a fármacos hace posible que un patógeno esquive la interrupción bioquímica causada por un agente antimicrobiano. Esta resistencia puede ser consecuencia de una mutación que ha sido seleccionada y mantenida. Los patógenos del entorno han tenido una exposición repetida a agentes terapéuticos actuales. Esta exposición ha llevado a la selección de cepas antimicrobianas variantes resistentes a estos fármacos. Por consiguiente, sería de esperar que los nuevos agentes antimicrobianos sintéticos sean útiles para el tratamiento de patógenos resistentes a fármaco, ya que el patógeno nunca ha sido expuesto al nuevo agente antimicrobiano. El desarrollo de compuestos o combinaciones de compuestos dirigidos a más de una ARNt sintetasa resulta también ventajoso. Por lo tanto, la inhibición de más de una enzima debería reducir la incidencia de resistencia, ya que se requerirían múltiples mutaciones en un patógeno y son estadísticamente poco probables.
Mathur and Mathur, J. Chem. Research (S), 1998, 506-507 y J. Chem. Research (M), 1998, 2062-2078 desvelan complejos de níquel (II) monoméricos con ligandos de bis(bencimidazol) tetradentados. No se indica ninguna actividad farmacéutica para los ligandos.
En el documento WO-A-9840370 (G.D. Searle & Co.) se desvelan compuestos de fórmula Ar_{1}-OCH_{2}-Ar_{2}-OCH_{2}-Z, en la que Ar^{1} es un grupo arilo o heteroarilo, Ar^{2} es un grupo fenilo y Z es un heterociclo que contiene nitrógeno, como inhibidores de LTA_{4} hidrolasa para el tratamiento de psoriasis, colitis ulcerosa, enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) y asma.
En el documento WO-A-9705132 (Cubist Pharmaceuticals, Inc.) se desvelan compuestos como 7-(2-amino-3-metil-1-oxopentil)sulfamato de [S-(R*,R*)]-3,6-anhidro-1,2-didesoxi-1-[5-4-[(5-nitro-2-tienil)etinil]fenil]-2H- tetrazol-2-il]-D-alo-heptitol como inhibidores de isoleucil-ARNt sintetasa.
Lee y col., Bioorg. Med. Chem. Lett. 8, 1998, 3511-3514 desvela análogos de metionina como inhibidores de metionil-ARNt sintetasa.
En el documento WO-A-9955677 (SmithKline Beecham plc) se desvelan derivados de quinolona como inhibidores de la enzima bacteriana S. aureus metionil ARNt sintetasa.
Resumen de la invención
La presente invención desvela nuevos compuestos que inhiben ARNt sintetasas y son eficaces, incluida la destrucción celular completa, contra un amplio espectro de bacterias y hongos. En la presente invención se describen compuestos que presentan inhibición de ARNt sintetasa.
La presente invención comprende, en uno de sus aspectos, un compuesto de fórmula:
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y en la que R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, Ar y Het se seleccionan de la tabla, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
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En otro aspecto, la presente invención comprende un compuesto seleccionado entre los siguientes, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
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o que es:
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o seleccionado entre:
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o seleccionado entre:
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o seleccionado entre:
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En otro aspecto más, la presente invención comprende un compuesto representado por las siguientes fórmulas, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
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La invención engloba también sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos anteriores.
Un aspecto más de la invención comprende el uso de los compuestos de la invención para la fabricación de una composición para inhibir una ARNt sintetasa y, en particular, para modular el crecimiento de organismos bacterianos o fúngicos en mamíferos, una planta o un cultivo celular.
Otro aspecto más de la invención implica un procedimiento de inhibición del crecimiento de microorganismos en un cultivo celular. Este procedimiento implica la exposición del microorganismo a un compuesto de la invención en condiciones según las cuales una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto entra en el microorganismo.
Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende el o los compuestos de la invención útiles para el tratamiento de infecciones microbianas como, por ejemplo, infecciones bacterianas, infecciones fúngicas. Un aspecto relacionado de la invención es un procedimiento para preparar un medicamento que implica la combinación de un compuesto o compuestos de la invención en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Estos y otros aspectos de la invención se pondrán mejor de manifiesto con referencia a la siguiente descripción detallada de la invención.
Descripción detallada de la invención I. Definiciones
Los términos moleculares, cuando se usan en la presente solicitud, tienen su significado habitual, a no ser que se especifique de otra forma. El término "hidruro" se refiere a un átomo de hidrógeno simple (H). El término "acilo" se define como un radical carbonilo unido a un grupo hidruro, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclo, arilo o heteroarilo, algunos ejemplos de los cuales son formilo, acetilo y benzoílo. El término "amino" se refiere a un radical de nitrógeno que contiene dos sustituyentes seleccionados independiente del grupo constituido por hidruro, alquilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo. Los radicales amino preferidos son radicales NH_{2} y radicales "amino inferior", según lo cual los dos sustituyentes se seleccionan independientemente entre hidruro y alquilo inferior. Un subgrupo de amino es "alquilamino", según el cual el radical nitrógeno contiene al menos 1 sustituyente alquilo. Los grupos alquilamino preferidos contienen grupos alquilo que están sustituidos, por ejemplo, con un grupo carboalcoxi. El término "aciloxi" se refiere a un radical oxígeno adyacente a un grupo acilo. El término "acilamino" se refiere a un radical nitrógeno adyacente a un grupo acilo, carboalcoxi o carboxiamido. El término "carboalcoxi" se define como un radical carbonilo adyacente a un grupo alcoxi o ariloxi. El término "carboxiamido" se refiere a un radical carbonilo adyacente a un grupo amino. Un subgrupo de carboxiamido es "N-sulfonilcarboxiamido" que se refiere a un radical carbonilo adyacente a un grupo amino sustituido con N-sulfonilo. El término "halo" se define como un radical bromo, cloro, fluoro o yodo. El término "tio" se refiere a un radical azufre adyacente a un grupo sustituyente seleccionado entre hidruro, alquilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo y heteroarilo como, por ejemplo, metiltio y feniltio. Entre los radicales tio preferidos se incluyen radicales "tio inferiores" que contienen grupos alquilo inferiores.
El término "alquilo" se define como un radical saturado, lineal o ramificado, que tiene de uno a aproximadamente diez átomos de carbono, a no ser que se especifique de otra forma. Los radicales alquilo preferidos son radicales "alquilo inferior" que tienen de uno a aproximadamente cinco átomos de carbono. Se pueden sustituir uno o más átomos de hidrógeno por un grupo sustituyente seleccionado entre acilo, amino, acilamino, aciloxi, carboalcoxi, carboxi, carboxiamido, ciano, halo, hidroxi, nitro, tio, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo, alcoxi, ariloxi, sulfoxi, sulfinilo, sulfonilo, N-sulfonilcarboxiamido y N-acilaminosulfonilo. Los sustituyentes preferidos son carboalcoxi, carboxi, N-sulfonilcarboxiamido y N-acilaminosulfonilo. Entre los ejemplos de grupos alquilo se incluyen metilo, terc-butilo, isopropilo, metoximetilo, carboximetilo y carbometoximetilo. El término "alquenilo" engloba radicales lineales o ramificados que tienen de dos a aproximadamente veinte átomos de carbono, preferentemente de tres a aproximadamente diez átomos de carbono, y que contienen al menos un doble enlace carbono-carbono. Asimismo pueden estar sustituidos uno o más átomos de hidrógeno por un grupo sustituyente seleccionado entre acilo, amino, acilamino, aciloxi, carboalcoxi, carboxi, carboxiamido, ciano, halo, hidroxi, nitro, tio, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo, alcoxi, ariloxi, sulfoxi, sulfinilo, sulfonilo, N-sulfonilcarboxiamido y N-acilaminosulfonilo. Entre los ejemplos de grupos alquenilo se incluyen etilenilo y fenil etilenilo. El término "alquinilo" se refiere a radicales lineales o ramificados que tienen de dos a aproximadamente diez átomos de carbono, y que contienen al menos un triple enlace carbono-carbono. Pueden estar sustituidos uno o más átomos de hidrógeno por un grupo sustituyente seleccionado entre acilo, amino, acilamino, aciloxi, carboalcoxi, carboxi, carboxiamido, ciano, halo, hidroxi, nitro, tio, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo, alcoxi, ariloxi, sulfoxi, sulfinilo, sulfonilo, N-sulfonilcarboxiamido y N-acilaminosulfonilo. Entre los ejemplos de grupos alquinilo se incluye propinilo. El término "arilo" se refiere a radicales aromáticos en un sistema de anillo carbocíclico simple o condensado, que tiene de cinco a doce eslabones de anillo. Uno o más átomos de hidrógeno pueden estar sustituidos por un grupo sustituyente seleccionado entre acilo, amino, acilamino, aciloxi, carboalcoxi, carboxi, carboxiamido, ciano, halo, hidroxi, nitro, tio, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo, alcoxi, ariloxi, sulfoxi, sulfinilo, sulfonilo, N-sulfonilcarboxiamido y N-acilaminosulfonilo. Entre los ejemplos de grupos arilo se incluyen fenilo, 2,4-diclorofenilo, naftilo, bifenilo, terfenilo. "Heteroarilo" engloba radicales aromáticos que contienen de uno a cuatro heteroátomos seleccionados entre oxígeno, nitrógeno y azufre en un sistema de anillo heterocíclico simple o condensado, que tiene de cinco a quince eslabones de anillo. Asimismo, pueden estar reemplazados uno o más átomos de hidrógeno por un grupo sustituyente seleccionado entre acilo, amino, acilamino, aciloxi, carboalcoxi, carboxi, carboxiamido, ciano, halo, hidroxi, nitro, tio, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterociclilo, arilo, heteroarilo, alcoxi, ariloxi, sulfoxi, sulfinilo, sulfonilo, N-sulfonilcarboxiamido y N-acilaminosulfonilo. Entre los ejemplos de grupos heteroarilo se incluyen tetrazolilo, piridinilo, tiazolilo.
Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de base. El término "sales farmacéuticamente aceptables" engloba sales usadas habitualmente para formar sales de metal alcalino y para formar sales de adición de ácidos libres o bases libres. La naturaleza de la sal no es fundamental, siempre y cuando sea farmacéuticamente aceptable. Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención (preferentemente, un compuesto de fórmula I) pueden prepararse a partir de un ácido inorgánico o un ácido orgánico. Entre los ejemplos de dichos ácidos inorgánicos se incluyen ácido clorhídrico, bromhídrico, yodhídrico, nítrico, carbónico, sulfúrico y fosfórico. Los ácidos orgánicos apropiados pueden seleccionarse entre las clases de ácidos orgánicos alifáticos, cicloalifáticos, aromáticos, arilalifáticos, heterocíclicos, carboxílicos y sulfónicos, entre cuyos ejemplos se incluyen los ácidos fórmico, acético, propiónico, succínico, glicólico, glucónico, maleico, embónico (pamoico), metanosulfónico, etanosulfónico, 2-hidroxietanosulfónico, pantoténico, bencenosulfónico, toluensulfónico, sulfanílico, mesílico, ciclohexilaminosulfónico, esteárico, algénico, \beta-hidroxibutírico, malónico, galáctico y galacturónico. Entre las sales de adición de base farmacéuticamente aceptables adecuadas de los compuestos de la invención (preferentemente, un compuesto de fórmula I) se incluyen, sin carácter limitativo, sales metálicas obtenidas a partir de aluminio, calcio, litio, magnesio, potasio, sodio y cinc o sales orgánicas obtenidas a partir de N,N'-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, N-metilglucamina y procaína. Todas estas sales pueden prepararse por mediosconvencionales a partir del compuesto de la invención correspondiente (preferentemente, un compuesto de fórmula I) por tratamiento, por ejemplo, del compuesto de la invención (preferentemente, un compuesto de fórmula I) con el ácido o la base apropiados.
Tal como se usa en la presente invención, "tratamiento" significa prevenir el inicio, ralentizar la progresión o erradicar la existencia de la dolencia que se está tratando como, por ejemplo, una infección microbiana. El éxito del tratamiento se manifiesta por una reducción y, preferentemente, una erradicación de la infección bacteriana y/o fúngica en el sujeto que está siendo sometido a tratamiento.
Los compuestos de la invención pueden poseer uno o más átomos de carbono asimétricos y son, por lo tanto, capaces de existir en la forma de isómeros ópticos, así como en la forma de mezclas racémicas y no racémicas de los mismos. Los compuestos de la invención pueden usarse en la presente invención como un isómero simple o como una mezcla de formas isoméricas estereoquímicas. Los diastereoisómeros pueden separarse por medios convencionales tales como cromatografía, destilación, cristalización o sublimación. Los isómeros ópticos pueden obtenerse por resolución de mezclas racémicas según procedimientos convencionales como, por ejemplo, por formación de sales diastereoisómeras mediante tratamiento con un ácido o una base ópticamente activos. Entre los ejemplos de ácidos apropiados están los ácidos tartárico, diacetiltartárico, dibenzoiltartárico, ditoluoiltartárico y alcanforsulfónico. La mezcla de diastereómeros puede separarse por cristalización seguida de liberación de las bases ópticamente activas de estas sales. Un procedimiento alternativo para la separación de isómeros ópticos incluye el uso de una columna de cromatografía quiral seleccionada óptimamente para aumentar al máximo la separación de los enantiómeros. Otro procedimiento disponible más implica la síntesis de moléculas diastereoisómeras covalente por reacción de los compuestos de la invención con un ácido ópticamente puro en una forma activada o un isocianato ópticamente puro. Los diastereoisómeros sintetizados pueden separarse por medios convencionales tales como cromatografía, destilación, cristalización o sublimación e hidrolizarse después para obtener el compuesto enantioméricamente puro. Los compuestos ópticamente activos de la invención (preferentemente, compuestos de fórmula I) pueden obtenerse igualmente usando materiales de partida ópticamente activos. Estos isómeros pueden encontrarse en la forma de un ácido libre, una base libre, un éster o una sal.
La invención engloba también compuestos aislados. Un compuesto aislado se refiere a un compuesto que representa al menos el 10%, preferentemente el 20%, más preferentemente el 50%, y con la máxima preferencia el 80%, del compuesto presente en la mezcla, y muestra una actividad antimicrobiana detectable (es decir, estadísticamente significativa) cuando se comprueba en ensayos biológicos convencionales, tales como los que se describen en la presente invención.
II. Descripción
Los compuestos de la invención son útiles para inhibir la actividad enzimática de una ARNt sintetasa in vivo o in vitro. Los compuestos son particularmente útiles como agentes antimicrobianos, es decir, agentes que inhiben el crecimiento de bacterias u hongos.
Los compuestos de la invención son activos contra diversos organismos bacterianos. Son activos contra bacterias aerobias y anaerobias gram positivas y gram negativas, incluidos Staphylococci como, por ejemplo, S. aureus; Enterococci como, por ejemplo, E. faecalis; Streptococci como, por ejemplo, S. pneumoniae; Haemophilus como, por ejemplo, H. influenza; Moraxella como, por ejemplo, M. catarrhalis; y Escherichia como, por ejemplo, E. coli. Los compuestos de la presente invención son también activos contra Mycobacteria como, por ejemplo, M. tuberculosis. Los compuestos de la presente invención son también activos contra microbios intercelulares como, por ejemplo, Chlamydia y Rickettsiae. Los compuestos de la presente invención son también activos contra Mycoplasma como, por ejemplo, M. pneumoniae.
Los compuestos de la presente invención son también activos contra organismos fúngicos, incluyendo, entre otros organismos, las especies Aspergillus, Blastomyces, Candida, Coccidioides, Cryptococcus, Epidermophyton, Hendersonula, Histoplasma, Microsporum, Paecilomyces, Paracoccidioides, Pneumocystis, Trichophyton y Trichosporium.
En un segundo aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la invención, preferentemente un compuesto según el primer aspecto de la invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable (descrito más adelante). Tal como se usa en la presente invención, la expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la cantidad de un compuesto de la presente invención que previene el inicio, alivia los síntomas o detiene la progresión de una infección microbiana. El término "microbiano" significa bacteriano y fúngico; por ejemplo, "una infección microbiana" significa una infección bacteriana o fúngica. El término "tratamiento" se define como la administración a un sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención. El término "sujeto", tal como se describe en la presente invención, se define como un mamífero, una planta o un cultivo celular.
Un procedimiento para inhibir una ARNt sintetasa comprende el contacto de una ARNt sintetasa con un compuesto de la invención en condiciones en las que la ARNt sintetasa interacciona con sus sustratos y sus sustratos reaccionan para formar un producto intermedio de adenilato de aminoacilo y, preferentemente, reaccionan además para formar un ARNt cargado. Dichas condiciones son conocidas para los expertos en la materia (véase también, por ejemplo, los ejemplos de las condiciones), y el documento PCT/US 96/11910, registrado el 18 de julio de 1996 (WO 97/05132, publicado el 13 de febrero de 1997), y la patente de EE.UU. 5.726.195. Este procedimiento implica el contacto de una ARNt sintetasa con una cantidad del compuesto de la invención que sea suficiente para dar como resultado una inhibición detectable de ARNt sintetasa. Este procedimiento se puede realizar en la ARNt sintetasa que está contenida dentro de un organismo o fuera de un organismo.
Un procedimiento para la inhibición del crecimiento de microorganismos, preferentemente bacterias u hongos, comprende el contacto de dichos organismos con un compuesto de la invención en condiciones que permitan la entrada del compuesto en dicho organismo o en dicho microorganismo. Dichas condiciones son conocidas por los expertos en la materia y se ilustran en los ejemplos. Este procedimiento implica el contacto de una célula microbiana con una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto o compuestos de la invención como, por ejemplo, para inhibir la ARNt sintetasa celular in vivo o in vitro. Este procedimiento se usa in vivo, por ejemplo, para tratar infecciones microbianas en mamíferos. Alternativamente, el procedimiento se usa in vitro, por ejemplo, para eliminar contaminantes microbianos en un cultivo celular, o en una planta.
Según otro aspecto de la invención, las composiciones desveladas en la presente invención se usan para el tratamiento de un sujeto que padece o que es susceptible a una infección microbiana. El procedimiento implica la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención. De acuerdo con este aspecto de la invención, las nuevas composiciones desveladas en la presente invención se combinan con un vehículo farmacéuticamente aceptable y se suministran a un sujeto receptor (preferentemente, un ser humano) de acuerdo con los procedimientos conocidos para el suministro de fármacos. En la patente de EE.UU. nº 5.041.567, concedida a Rogers, y en la solicitud de patente PCT número EP94/02552 (publicación nº WO 95/05384) se desvelan ejemplos de procedimientos para el suministro de un agente antibacteriano, antifúngico y antimicoplásmico. En general, en los procedimientos para el suministro de las composiciones de la invención in vivo se usan protocolos reconocidos en la técnica para el suministro del agente, siendo la única modificación sustancial en el procedimiento la sustitución de los fármacos de los protocolos reconocidos en la técnica por compuestos de la invención. Igualmente, en los procedimientos para el uso de la composición reivindicada para el tratamiento de células en cultivo, por ejemplo, para eliminar o reducir el nivel de contaminación bacteriana de un cultivo celular, se utilizan protocolos reconocidos en la técnica para el tratamiento de cultivos celulares con agente o agentes antibacterianos, siendo la única modificación sustancial en el procedimiento la sustitución de los agentes usados en los protocolos reconocidos en la técnica por los compuestos de la invención.
Las preparaciones farmacéuticas desveladas en la presente invención se preparan según procedimientos estándar y se administran en dosis que se seleccionan para reducir, prevenir o eliminar la infección (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, y Goodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, Pergamon Press, Nueva York, NY, cuyo contenido se incorpora en la presente invención como referencia para una descripción general de los procedimientos para la administración de diversos agentes antimicrobianos para terapia humana). Las composiciones de la invención pueden suministrarse usando sistemas de suministro de liberación controlada (por ejemplo, cápsulas) o sostenida (por ejemplo, matrices bioerosionables). En las patentes de EE.UU. nº 4.452.775 (concedida a Kent), 5.239.660 (concedida a Leonard), 3.854.480 (concedida a Zaffaroni) se describen sistemas ejemplares de suministro de liberación retardada para el suministro de fármacos que son adecuados para la administración de las composiciones de la invención.
Las composiciones farmacéuticamente aceptables de la presente invención comprenden uno o más compuestos de la invención en asociación con uno o más vehículos y/o diluyentes y/o adyuvantes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos, que se denominarán conjuntamente en la presente invención materiales de "vehículo", y, si se desea, otros ingredientes activos.
Los compuestos de la presente invención se administran a través de cualquier ruta, preferentemente en forma de una composición farmacéutica adaptada para dicha ruta, tal como se ilustra más adelante, y dependen de la dolencia que se esté tratando. Los compuestos y composiciones pueden administrarse, por ejemplo, por vía oral, intravascular, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular o tópica.
Para la administración oral, las composiciones farmacéuticas se encuentran, por ejemplo, en forma de comprimido, cápsula, suspensión o líquido. La composición farmacéutica se presenta preferentemente en forma de una dosis unitaria que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz del ingrediente activo. Entre los ejemplos de dichas dosis unitarias se incluyen comprimidos y cápsulas. Para fines terapéuticos, los comprimidos y cápsulas que pueden contener, además del ingrediente activo, vehículos convencionales como son agentes aglutinantes como, por ejemplo, goma de acacia, gelatina, polivinilpirrolidona, sorbitol o tragacanto; cargas como, por ejemplo, fosfato de calcio, glicina, lactosa, almidón de maíz, sorbitol o sacarosa; lubricantes como, por ejemplo, estearato de magnesio, polietilenglicol, sílice o talco; disgregantes como, por ejemplo, almidón de patata, agentes aromatizantes y colorantes o agentes humectantes aceptables. Las preparaciones líquidas orales se presentan generalmente en forma de soluciones acuosas u oleosas, suspensiones, emulsiones, jarabes o elixires y pueden contener aditivos convencionales tales como agentes de suspensión, agentes emulsionantes, agentes no acuosos, conservantes, agentes colorantes y agentes aromatizantes. Entre los ejemplos de aditivos para preparaciones líquidas se incluyen acacia, aceite de almendras, alcohol etílico, aceite de coco fraccionado, gelatina, jarabe de glucosa, glicerina, grasas comestibles hidrogenadas, lecitina, metilcelulosa, para-hidroxibenzoato de metilo o propilo, propilenglicol, sorbitol o ácido sórbico.
Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por inyección. Las formulaciones para administración parenteral pueden presentarse en forma de soluciones o suspensiones para inyección estériles isotónicas no acuosas. Estas soluciones o suspensiones pueden prepararse a partir de polvos o granulados esterilizados que tengan uno o más de los vehículos mencionados para su uso en las formulaciones para administración oral. Los compuestos pueden disolverse en polietilenglicol, propilenglicol, etanol, aceite de maíz, alcohol bencílico, cloruro de sodio y/o diversos tampones.
Para uso tópico, los compuestos de la presente invención pueden prepararse también en formas adecuadas para su aplicación sobre la piel, o las membranas mucosas de la nariz y la garganta, y pueden adoptar la forma de cremas, pomadas, rociadores líquidos o inhaladores, grageas o gargarismos. Dichas formulaciones para uso tópico pueden incluir además compuestos químicos tales como dimetilsulfóxido (DMSO) para facilitar la penetración superficial del ingrediente activo.
Para su aplicación en los ojos o los oídos, los compuestos de la presente invención pueden presentarse en forma líquida o semilíquida formulada en bases hidrófobas o hidrófilas tales como pomadas, cremas, lociones, pinturas o polvos.
Para administración rectal, los compuestos de la presente invención pueden administrarse en forma de supositorios mezclados con vehículos convencionales como mantequilla de cacao, cera u otro glicérido.
Alternativamente, los compuestos de la presente invención pueden presentarse en forma de polvos para su reconstitución en el vehículo farmacéuticamente aceptable apropiado en el momento del suministro.
El régimen de dosis para el tratamiento de una infección con el compuesto y/o composiciones de la presente invención se selecciona según diversos factores, entre los que se incluyen el tipo, la edad, el peso, el sexo y el estado médico del paciente, la gravedad de la infección, la ruta y la frecuencia de administración y el compuesto empleado en particular. En general, las dosis se determinan con arreglo a la práctica normal para optimizar la dosis correcta para el tratamiento de una infección.
Las composiciones pueden contener entre el 0,1% y el 99% en peso, preferentemente entre el 10 y el 66% en peso, del ingrediente activo, dependiendo del procedimiento de administración. Si las composiciones contienen dosis unitarias, cada dosis unitaria contiene preferentemente entre 50 y 500 mg del material activo. Para el tratamiento de seres humanos adultos, la dosis empleada oscila preferentemente entre 100 mg y 3 g al día, dependiendo de la ruta y la frecuencia de administración.
Si se administra como parte de la ingestión de dieta total, la cantidad del compuesto empleada puede ser de menos del 1% en peso de la dieta y preferentemente no más del 0,5% en peso. La dieta para animales puede consistir en alimentos normales a los que se puede añadir el compuesto o se puede añadir antes para una mezcla previa.
En los ejemplos que se exponen seguidamente se proporcionan otras referencias a las características y aspectos de la invención.
Ejemplos
Los ejemplos siguientes son descripciones detalladas de los procedimientos de preparación de compuestos de la invención. Estas preparaciones detalladas entran dentro del ámbito de la invención y sirven para su ilustración. Estos ejemplos se presentan sólo con fines ilustrativos y no pretenden constituir una limitación al ámbito de la invención.
Esquema I
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Esquema II
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61
Síntesis de I
Se agitó una solución de 5,0 g de 3,4-dihidroxibenzoato de etilo, 3,8 ml de cloruro de 2,4-diclorobencilo y 7,58 g de carbonato de potasio en 50 ml de N,N-dimetilformamida anhidra a temperatura ambiente durante 24 horas antes de repartirlo con 500 ml de acetato de etilo y 500 ml de salmuera. Se secó la capa orgánica con 10 g de sulfato de sodio y se concentró. La purificación por cromatografía sobre gel de sílice usando 5-20% de acetato de etilo en hexanos proporcionó 1,0 g de I.
Síntesis de II
Se añadieron 3,0 g de 2-clorometilbencimidazol y 3,0 ml de cloruro de trimetilsilil etoximetilo a una solución de 6 ml de trietilamina en 20 ml de diclorometano. Se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 24 horas antes de repartirla con 250 ml de acetato de etilo y 2 x 200 ml de salmuera. Se secó la capa orgánica con 5 g de sulfato de magnesio y se concentró. La purificación por cromatografía sobre gel de sílice usando 20% de acetato de etilo en hexanos proporcionó 1,23 g de II como un sólido blanco.
Síntesis de III
Se agitó una solución de 115 ml de I, 100 mg de II y 250 mg de carbonato de potasio en 5 ml de N,N'-dimetilformamida anhidra a temperatura ambiente durante 24 horas antes de repartirla con 100 ml de acetato de etilo y 100 ml de salmuera. Se secó la capa orgánica con 5 g de sulfato de sodio y se concentró proporcionando 199 mg de III como un aceite incoloro.
Síntesis de IV
A una solución de 199 mg de III en 5 ml de dioxano se añadieron 0,2 ml de ácido clorhídrico concentrado. Se calentó la reacción a 100ºC durante 2 horas antes de repartirla con 50 ml de acetato de etilo y 50 ml de solución saturada de bicarbonato de sodio. Se secó la capa orgánica con 2 g de sulfato de magnesio y se concentró. La purificación por cromatografía sobre gel de sílice usando un 40% de acetato de etilo en hexanos proporcionó 135 mg de IV como un sólido blanco.
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Síntesis de V
Se agitó una solución de 130 mg de IV y 200 mg de hidróxido de litio en 2 ml de agua y 4 ml de tetrahidrofurano a temperatura ambiente durante 48 horas. Se diluyó la reacción con 20 ml de agua y se añadió ácido clorhídrico 1 N para ajustar el pH a 7. Se filtró el precipitado proporcionando 77 mg de V.
Síntesis de VI
A 1,0 g de 3,4-dihidroxibenzoato y 5,0 g de carbonato de potasio en 30 ml de N,N'-dimetilformamida anhidra se añadieron 0,42 ml de cloruro de metoximetilo. Se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 24 horas antes de repartirla con 100 ml de acetato de etilo y 2 x 100 ml de salmuera. Se secó la capa orgánica con 5 g de sulfato de magnesio y se concentró. La purificación por cromatografía sobre gel de sílice usando 10% de acetato de etilo en hexanos proporcionó 0,41 g de VI como un aceite incoloro.
Síntesis de VII
Se agitó una solución de 410 mg de VI, 0,38 ml de cloruro de 2,4-diclorobencilo y 500 mg de carbonato de potasio en 10 ml de N,N-dimetilformamida anhidra a temperatura ambiente durante 24 horas antes de repartirla con 100 ml de acetato de etilo y 100 ml de salmuera. Se secó la capa orgánica con 5 g de sulfato de magnesio y se concentró para dar 0,5 g de VII como un aceite incoloro.
Síntesis de VIII
A una solución de 0,5 g de VII en 10 ml de metanol se añadieron 0,3 ml de ácido clorhídrico concentrado. Se calentó la solución resultante a reflujo durante 1 hora antes de repartirla con 100 ml de acetato de etilo y 100 ml de salmuera. Se secó la capa orgánica con sulfato de magnesio y se concentró. Se recristalizó el sólido resultante en el acetato de etilo y hexanos para dar 0,43 g de VIII como un sólido blanco.
Síntesis de IX
Se añadieron 250 mg de VIII a una suspensión en agitación de 29 mg de hidruro de sodio al 60% en aceite mineral en 8 ml de N,N-dimetilformamida anhidra. Después de 10 minutos, se añadieron a la reacción 217 mg de II. Se dejó en agitación la reacción a temperatura ambiente durante 24 horas antes de repartirla entre 100 ml de acetato de etilo y 100 ml de salmuera. Se secó la capa orgánica con 2 g de sulfato de magnesio y se concentró. La purificación por cromatografía sobre gel de sílice usando un 20% de acetato de etilo en hexanos proporcionó 325 mg de IX como un aceite incoloro.
Síntesis de X
Se calentó una solución de 0,32 g de IX en 0,4 ml de ácido clorhídrico concentrado y 10 ml de 1,4-dioxano a 100ºC durante 2 horas antes de repartirla con 50 ml de acetato de etilo y 50 ml de solución saturada de bicarbonato de sodio. Se secó la capa orgánica con 2 g de sulfato de magnesio y se concentró. La purificación por cromatografía sobre gel de sílice usando 40% de acetato de etilo en hexanos proporcionó 0,21 g de X como un sólido blanco.
Síntesis de XI
Se agitó una solución de 0,19 g de X en 8 ml de tetrahidrofurano y 5 ml de hidróxido de sodio 6 N a temperatura ambiente durante 24 horas. Después de la evaporación del tetrahidrofurano, se aciduló la reacción con HCl 1 N a un pH = 4. Se filtró el precipitado blanco resultante y se lavó con 2 x 10 ml de agua. La purificación por cromatografía sobre gel de sílice usando un 10% de metanol en diclorometano proporcionó 40 mg de XI.
Síntesis de XII
Se agitó una solución de 3,53 g de III en 10 ml de hidróxido de sodio 6 N, 20 ml de metanol y 20 ml de 1,4-dioxano a temperatura ambiente durante 2 horas antes de repartirla con 200 ml de acetato de etilo y 200 ml de ácido clorhídrico 1 N. Se secó la capa orgánica con 10 g de sulfato de sodio y se concentró. Se trituró el sólido con éter y se filtró para dar 2,9 g de XII como un sólido blanco.
Síntesis de XIII
A una mezcla de 0,29 g de XII, 0,6 ml de diisopropiletilamina y 0,12 g de éster de L-serina metílico en 10 ml de N,N'-dimetilformamida anhidra se añadieron 0,15 g de hidrocloruro de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida. Se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 24 horas antes de repartirla con 50 ml de acetato de etilo y 50 ml de ácido clorhídrico. Se lavó la capa orgánica con 50 ml de salmuera y se secó con 2 g de sulfato de sodio. La purificación por cromatografía sobre gel de sílice usando metanol al 10% en diclorometano proporcionó 0,10 g de XIII.
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Síntesis de XIV
Se agitó una solución de 0,10 g de XIII en 2 ml de NaOH 6 N, 5 ml de metanol y 5 ml de 1,4-dioxano a temperatura ambiente durante 2 horas antes de añadir 4 ml de HCl 4 N. Se repartió la reacción con 30 ml de acetato de etilo y 30 ml de salmuera. Se secó la capa orgánica con 1 g de sulfato de sodio y se concentró proporcionando 0,08 g de XIV.
Síntesis de XV
Se llevó a reflujo una solución de 0,08 g de XIV en 5 ml y 0,5 ml de fluoruro de tetrabutilamonio en tetrahidrofurano durante 4 horas antes de repartirla con 20 ml de acetato de etilo y 2 x 20 ml de salmuera. Se secó la capa orgánica con 1 g de sulfato de sodio y se concentró. La purificación por cromatografía sobre gel de sílice usando metanol al 10% en diclorometano produjo 20 mg de XV como un sólido blanco.
Esquema III
Síntesis XVI
Resina de amida-AM 4-O-alil-3,4-dihidroxibenzamida de Rink
62
Se trató una muestra de 1,00 g de resina amida-AM de Rink (Novabiochem, cargas 0,65 mmoles/g) con 15 ml de piperidina al 20% en DMF durante 10 minutos para eliminar el grupo protector Fmoc, y después se lavó 5 veces con DMF. Se añadieron a la resina 15 ml de DMF, 400 mg de ácido 4-O-alil-3,4-dihidroxibenzoico (3 eq.) y 400 mg de EDC (3 eq.). Se hizo rotar la mezcla durante toda la noche en un tubo de reacción, después se drenó la resina y se lavó cinco veces con DMF, cinco veces con MeOH, cinco veces con CH_{2}Cl_{2}, después se secó con alto grado de vacío hasta alcanzar una masa de 3,04 g. Para medir la carga, se disociaron 100 mg de la resina con ácido trifluoroacético al 95% en cloruro de metileno y se produjeron 14 mg de 4-O-alil-3,4-dihidroxibenzamida (EM 194, M + 1), lo que indicó un 100% de carga.
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(Esquema pasa a página siguiente)
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Síntesis de XVII
Síntesis de resina de 4-O-(2-bencimidazolil)metil-3-O-(2,4-diclorobencil)-3,4-dihidroxibenzamida de Mitsunobu seguido de alquilación
63
A 0,175 g de resina de amida-AM 4-O-alil-3,4-dihidroxibenzamida de Rink (cargas 0,65 mmoles/g) se añadieron 1,5 ml de THF destilado, 0,310 g de alcohol 2,4-diclorobencílico (5 eq.), 0,297 ml de Bu_{3}P (5 eq.) y, finalmente, 200 mg de diamida (5 eq.). Se hizo rotar la mezcla durante 5 horas en un tubo de reacción, después se drenó la resina y se lavó cinco veces con DMF, cinco veces con CH_{2}Cl_{2}, y después se secó con un alto grado de vacío. Se hinchó la resina en 1,5 ml de CH_{2}Cl_{2} y se añadieron 0,200 ml de PhiSiH_{3} (20 eq. aproximadamente) y 15 mg de Pd(Ph_{3}P)_{4} (0,1 eq. aproximadamente). Se hizo rotar la mezcla durante toda la noche en un tubo de reacción, después se drenó la resina y se lavó cinco veces con DMF, cinco veces con CH_{2}Cl_{2}, y después se secó con un alto grado de vacío. Se hinchó este material en 2,0 ml de DMF, y se añadieron 89 mg de 1-t-Boc-2-clorometilbencimidazol (3 eq.) y 0,050 ml de DBU (3 eq.). Se hizo rotar la mezcla durante toda la noche en un tubo de reacción, después se drenó la resina y se lavó cinco veces con DMF, cinco veces con CH_{2}Cl_{2} y después se segmentó por tratamiento con 2 ml de ácido trifluoroacético al 95% en cloruro de metileno durante 45 minutos. Se drenó la solución disociada y se eliminó el disolvente bajo una corriente de nitrógeno. Se purificó el residuo por HPLC en una columna de 100 x 20 mm YMC-PACK ODS, eluyendo a 20 ml/min en un gradiente, comenzando con 90/10 de agua/CH_{3}CN (TFA al 0,1%) y ascendiendo en rampa linealmente a acetonitrilo directo (TFA al 0,1%) durante un ciclo de 11 minutos. Se combinaron las fracciones que contenían el producto y se redujeron de volumen en una corriente de nitrógeno, y después se liofilizaron produciendo 24 mg de un sólido esponjoso y blanco que se analizó por espectrometría de masas LC (409 M + 1).
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Síntesis de XVIII
Síntesis de resina de 4-O-(2-bencimidazolil)metil-3-O-(2-fluoro-4-bromobencil)-3,4-dihidroxibenzamida por alquilación en tándem
64
A 0,175 g de resina amida-AM 4-O-alquil-3,4-dihidroxibenzamida de Rink (cargas 0,65 mmoles/g) se añadieron 1,5 ml de DMF secado por tamiz, 0,154 g de bromuro de 2-fluoro-4-bromobencilo (5 eq.), 0,085 ml de diazabicicloundecano (DBU, 1,55 mmoles, 5 eq.). Se hizo rotar la mezcla durante 5 horas en un tubo de reacción, después se drenó la resina y se lavó cinco veces con DMF, cinco veces con CH_{2}Cl_{2}, y después se secó con un alto grado de vacío. Se hinchó la resina en 1,5 ml de CH_{2}Cl_{2}, y se le añadieron 0,200 ml de PhSiH_{3} (20 eq. aproximadamente) y 15 mg de Pd(Ph_{3}P)_{4} (0,1 eq. aproximadamente). Se hizo rotar la mezcla durante toda la noche en un tubo de reacción, después se drenó la resina y se lavó cinco veces con DMF, cinco veces con CH_{2}Cl_{2}, y después se secó con un alto grado de vacío. Se hinchó este material en 2,0 ml de DMF y después se añadieron 89 mg de 1-t-Boc-2-clorometil-6-metilbencimidazol (3 eq.) y 0,050 ml de DBU (3 eq.). Se hizo rotar la mezcla durante toda la noche en un tubo de reacción, después se drenó la resina y se lavó cinco veces con DMF, cinco veces con CH_{2}Cl_{2} y después se segmentó por tratamiento con 2 ml de ácido trifluoroacético al 95% en cloruro de metileno durante 45 minutos. Se drenó la solución de segmentación y se eliminó el disolvente bajo una corriente de nitrógeno. Se purificó el residuo por HPLC sobre una columna de 100 x 20 mm YMC-PACK ODS, eluyendo a 20 ml/min en un gradiente, comenzando con 90/10 de agua/CH_{3}CN (TFA al 0,1%) y ascendiendo en rampa linealmente hasta acetonitrilo directo (TFA al 0,1%) durante un ciclo de 11 minutos. Se combinaron las fracciones que contenían el producto y se redujeron en volumen bajo una corriente de nitrógeno, después se liofilizaron produciendo 24 mg de un sólido esponjoso y blanco que se analizó por espectrometría de masas LC (409 M + 1).
En la tabla 1 se presentan las carboxamidas preparadas según este esquema:
TABLA 1 Carboxamidas preparadas a partir de resina de amida-AM-4-O-alil-3,4-dihidroxibenzamida de Rink
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TABLA 1 (continuación)
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TABLA 1 (continuación)
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Esquema IV
Síntesis de XIX
4-O-alil-3,4-dihidroxibenzoato de etilo
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A 5,46 g (30 mmoles) de 3,4-dihidroxibenzoato de etilo se añadieron 20 ml de DMF secado con tamiz, 2,58 ml de bromuro de alilo (30 mmoles) y, finalmente, 2,07 g (15 mmoles) de carbonato de potasio. Se agitó la mezcla durante toda la noche a temperatura ambiente, en cuyo punto se elevó la temperatura a 55ºC y se continuó agitando durante cuatro horas. El análisis por TLC eluyendo con 9:1 de hexano/acetato de etilo mostró el material de partida cerca de la línea de referencia, el producto monoalquilado deseado y su isómero como dos puntos muy próximos a aproximadamente Rf 0,5 con el isómero principal deseado y Rf inferior, y, finalmente, el producto secundario dialquilado a aproximadamente Rf 0,8. Se concentró la mezcla de reacción hasta obtener una pasta espesa en un evaporador rotatorio, después se repartió entre 500 ml de EtOAc y 200 ml de HCl 1 N. Se separó la capa orgánica y se lavó con 100 ml de HCl 1N, 100 ml de agua, 100 ml de salmuera, después se secó sobre MgSO_{4} y se filtró. Se eliminó el disolvente sobre un evaporador rotatorio proporcionando un aceite amarillo oscuro. Se cromatografió este material sobre sílice (dimensiones de columna: 14'' de longitud x 2'' de diámetro). Inicialmente, se eluyó la columna con 95:5 de hexano/EtOAc hasta que se desprendió el producto secundario dialquilado, después se llevó a cabo la elución con 90:10 de hexano/EtOAc aumentando en rampa hasta 85:15 de hexano/EtOAc una vez que se hubo eluido la mayor parte del isómero monoalquilado no deseado. Se concentraron las fracciones proporcionando el compuesto deseado, 4-O-alil-3,4-dihidroxibenzoato de etilo, como un sólido amorfo blanco (2,86 g). También se aislaron 785 mg del isómero, 3-O-alil-3,4-dihidroxibenzoato de etilo, y 990 mg de una mezcla de los dos isómeros.
Debe advertirse que las RMN de los 2 isómeros monoalquilados son prácticamente idénticas, a excepción de la posición del protón fenólico, que está más alejado hacia arriba en el isómero 4-O-alilo deseado.
4-O-alil-3,4-dihidroxibenzoato de etilo (producto principal, deseado)
RMN ^{1}H (500 MHz, acetona-d6): \delta 7,99 (s, 1H protón fenólico), 7,51 (d, 1H), 7,49 (s, 1H), 6,93 (d, 1H), 6,1 (m, 1H), 5,45 (d, 1H), 5,25 (d, 1H), 4,71 (d, 2H), 4,28 (q, 2H), 1,25 (t, 3H).
EM (ESI): 223 (M + H^{+}).
3-O-alil-3,4-dihidroxibenzoato de etilo (producto menor, no deseado)
RMN ^{1}H (500 MHz, acetona-d6): \delta 8,43 (s, 1H protón fenólico), 7,58 (m, 2H), 7,03 (d, 1H), 6,1 (m, 1H), 5,45 (d, 1H), 5,25 (d, 1H), 4,71 (d, 2H), 4,28 (q, 2H), 1,25 (t, 3H).
EM (ESI): 223 (M + H^{+})
Síntesis de XX
4-O-alil-3-O-(2,4-diclorobencil)-3,4-dihidroxibenzoato de etilo
69
A 3,74 g (16,8 mmoles) de 4-O-alil-3,4-dihidroxibenzoato de etilo se añadieron 25 ml de DMF secado con tamiz, 2,8 ml de cloruro de 2,4-diclorobencilo (20 mmoles, 1,2 eq.) y, finalmente, 2,8 g (20 mmoles, 1,2 eq.) de carbonato de potasio. Se agitó la mezcla durante toda la noche a temperatura ambiente, después de lo cual el análisis por TLC eluyendo con 1:1 de hexano/acetato de etilo mostró la conversión completa al producto. Se concentró la mezcla de reacción hasta obtener una pasta espesa sobre un evaporador rotatorio, después se repartió entre 500 ml de EtOAc y 200 ml de HCl 1 N. Se separó la capa orgánica y se lavó con 100 ml de HCl 1 N, 100 ml de agua, 100 ml de salmuera, después se secó sobre MgSO_{4} y se filtró. Se siguió usando el aceite en bruto en la siguiente etapa sin purificación.
Síntesis de XXI
3-O-(2,4-diclorobencilo)3,4-dihidroxibenzoato de etilo
70
Al producto en bruto de la reacción anterior se añadieron 40 ml de cloruro de metileno secado con tamiz, 25,0 ml de fenilsilano (201 mmoles, 12 eq.) y, finalmente, 2,3 g de Pd(Ph_{3}P)_{4}. Se agitó la mezcla durante 4 horas a temperatura ambiente, después de lo cual el análisis por TLC eluyendo con 1:1 de hexano/acetato de etilo presentó una conversión completa al producto. Se concentró la mezcla de reacción sobre el evaporador rotatorio y se cromatografió directamente sobre sílice, eluyendo con EtOAc al 10% en hexano. Se concentraron las fracciones proporcionando el compuesto deseado, 3-O-(2,4-diclorobencil)-3,4-dihidroxibenzoato de etilo, como un sólido amorfo blanco (4,56 g, 13,4 mmoles, 80% para las dos etapas).
3-O-(2,4-diclorobencil)-3,4-dihidroxibenzoato de etilo
RMN ^{1}H (500 MHz, acetona-d6): \delta 8,65 (s, 1H protón fenólico), 7,74 (d, 1H), 7,66 (s, 1H), 7,61 (d, 1H), 7,59 (s, 1H), 7,44 (d, 1H), 6,98 (d, 1H), 5,28 (s, 2H), 4,28 (q, 2H), 1,32 (t, 3H).
EM (ESI): 341 (M + H^{+}).
Síntesis de XXII
1-t-Boc-2-clorometilbencimidazol
71
A 4,0 g (24 mmoles) de etil 2-clorometilbencimidazol se añadieron 40 ml de THF destilado, 7,86 g de anhidrido de t-boc (36 mmoles, 1,5 eq.), 5,0 ml de Et_{3}N (36 mmoles, 1,5 eq.) y, finalmente, 2,93 g de dimetilaminopiridina (24 mmoles, 1 eq.). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 3 horas, después de lo cual se diluyó la reacción con 300 ml de EtOAc y se extrajo con 100 ml de HCl 1 N, 100 ml de agua, 100 ml de salmuera, después se secó sobre MgSO_{4} y se filtró. Se eliminó el disolvente sobre el evaporador rotatorio proporcionando un aceite amarillo oscuro. Se cromatografió el material sobre sílice eluyendo con 90:10 de hexano/EtOAc. Se concentraron las fracciones proporcionando el compuesto deseado, 1-t-boc-2-clorometilbencimiadol como un aceite amarillo pálido (4,06 g, 63%).
Síntesis de XXIII
4-O-(2-(1-t-Boc-bencimidazolil)metil-3-O-(2,4-diclorobencil)-3,4-dihidroxibenzoato de etilo
72
A 4,30 g (12,6 mmoles de 3-O-(2,4-diclorobencil)-3,4-dihidroxibenzoato de etilo se añadieron 20 ml de DMF secado con tamiz, 4,03 g de 1-t-boc-2-clorometilbencimidazol (15,1 mmoles, 1,2 eq.) y, finalmente, 2,26 ml de diazabicicloundecano (DBU, 15,1 mmoles, 1,2 eq.). Se agitó la mezcla durante toda la noche a temperatura ambiente, momento en el cual el análisis por TLC eluyendo con 9:1 de hexano/acetato de etilo mostró una reacción completa. Se concentró la mezcla de reacción hasta obtener una pasta espesa sobre el evaporador rotatorio, después se cromatografió directamente sobre gel de sílice usando un gradiente de elución del 10% aumentando hasta el 20% de acetato de etilo en hexano. Se concentraron las fracciones proporcionando el compuesto deseado, 4-O-(2-(1-t-boc-bencimidazolil))metil-3-O-(2,4-diclorobencil)-3,4- dihidroxibenzoato de etilo, como un sólido amorfo blanco (5,48 g, 9,58 mmoles, 76%).
Síntesis de XXIV
Ácido 4-O-(2-bencimidazolil)metil-3-O-(2,4-diclorobencil)-3,4-dihidroxibenzoico
73
A 5,48 g (9,58 mmoles) de 4-O-(2-(1-t-boc-bencimidazolil)metil-3-O-(2,4-diclorobencil)-3,4-dihidroxibenzoato de etilo se añadieron 70 ml de 1:1 de THF/agua y 2,0 g de LiOH-H_{2}O. Se agitó la mezcla durante toda la noche a 40ºC, después se neutralizó con HCl 1 N. Se hizo precipitar el producto y se recogió por filtración y se secó bajo un alto grado de vacío produciendo 4,2 g de un sólido amorfo blanco suficientemente puro para posteriores
reacciones.
Síntesis de XXV
Síntesis modular de amidas de ácido 4-O-(2-bencimidazolil)metil-3-O-(2,4-diclorobencil)-3,4-dihidroxibenzoico
74
Estas reacciones de amidación modular se realizan normalmente en grupos de 20 a 40 de una vez pesando las aminas primarias o secundarias en viales, añadiendo después a cada solución de reserva de catecol material de partida y EDC/HOBt.
En primer lugar, se pesaron 0,3-0,6 mmoles de cada amina en un vial distinto. Dejar una variación de dos veces la masa no supone ningún efecto negativo en la reacción y acelera considerablemente la pesada, que es la parte más lenta y laboriosa de la secuencia. Se introdujeron aminas líquidas según el volumen (0,4 mmoles), usando jeringuillas de microlitro. Se obtuvo una solución de reserva A disolviendo ácido 4-O-(2-bencimidazolil)metil-3-O-(2,4-diclorobencil)-3,4-dihidroxibenzoico en DMF hasta una concentración de 32 mg/ml. Se añadieron a cada uno de los viales 0,25 ml (8 mg, 1,8 mmoles de catecol) de solución de reserva A. Se obtuvo una solución de reserva B añadiendo DMF a 132 mg de EDC y 93 mg de HOBt a un volumen de solución de 5 ml. Se añadieron a cada uno de los viales 0,25 ml (8 ml, 1,8 mmoles de catecol) de la solución B. En los casos en que la amina era hidrocloruro u otra sal ácida, se añadieron 0,006 ml de Et_{3}N por cada mol de ácido (por ejemplo, un dicloruro de diamonio requeriría 0,012 ml). Después se templaron los viales en los que quedaba sólido, brevemente, con una pistola de calor y se sonicaron. En la mayoría de los casos, esto tuvo como resultado una solución homogénea, aunque no siempre, y se descubrió que no siempre era necesaria una solución homogénea para que funcionara la reacción. Se agitaron todos los viales durante toda la noche a temperatura ambiente, después de lo cual se introdujeron 1 ml de agua y 1 ml de solución saturada de bicarbonato de sodio en cada vial. Se extrajo esta mezcla con 3 x 1 ml de acetato de etilo para cada vial, que se combinó en un tubo de ensayo, y se evaporó el disolvente bajo una corriente de nitrógeno. Se disolvió el sólido resultante en 1 ml de DMSO (con calentamiento cuando fue necesario) y se purificó por HPLC sobre una columna de 100 x 20 mm YMC-PACK ODS, eluyendo a 20 ml/min en un gradiente, comenzando con 90/10 de agua/CH_{3}CN (TFA al 0,1%) y aumentando en rampa linealmente hasta acetonitrilo directo (TFA al 0,1%) a lo largo de un ciclo de 11 minutos. Se combinaron las fracciones que contenían el producto y se redujeron en volumen bajo una corriente de nitrógeno, después se liofilizaron para producir como producto un sólido esponjoso. Los rendimientos fueron típicamente 5 a 10 mg. La tabla 2 proporciona amidas que fueron preparadas según el esquema III (cada una de ellas fue caracterizada por LC-EM):
TABLA 2 Síntesis modular de ácido 4-O-(2-bencimidazolil)metil-3-O-(2,4-diclorobencil)-3,4-dihidroxibenzoico
75
TABLA 2 (continuación)
76
TABLA 2 (continuación)
77
TABLA 2 (continuación)
78
79
80
Síntesis de XXVI
4-O-alil-3,4-dihidroxibenzoato de etilo
81
A 5,46 g (30 mmoles) de 3,4-dihidroxibenzoato de etilo se añadieron 20 ml de DMF secado por tamiz, 2,58 ml de bromuro de alilo (30 mmoles) y, finalmente, 2,07 g (15 mmoles) de carbonato de potasio. Se agitó la mezcla durante toda la noche a temperatura ambiente, en cuyo punto se elevó la temperatura a 55ºC y se continuó agitando durante 4 horas. El análisis por TLC eluyendo con 9:1 de hexano/acetato de etilo mostró material de partida próximo a la línea de referencia, el producto monoalquilado deseado y su isómero como dos puntos muy cercanos a aproximadamente Rf 0,5, con el isómero principal deseado y Rf inferior, y, finalmente, el producto secundario dialquilado a aproximadamente Rf 0,8. Se concentró la mezcla de reacción hasta obtener una pasta espesa en el evaporador rotatorio, después se repartió entre 500 ml de EtOAc y 200 ml de HCl 1 N. Se separó la capa orgánica y se lavó con 100 ml de HCl 1 N, 100 ml de agua, 100 ml de salmuera, después se secó sobre MgSO_{4} y se filtró. Se eliminó el disolvente en el evaporador rotatorio proporcionando un aceite amarillo oscuro. Se cromatografió este material sobre sílice (dimensiones de columna: 14'' de longitud x 2'' de diámetro). Inicialmente, se eluyó la columna con 95:5 hexano/EtOAc hasta que se desprendió el producto lateral dialquilado, después se llevó a cabo la elución con 90:10 hexano/EtOAc aumentando en rampa hasta 85:15 hexano/EtOAc hasta que se eluyó la mayor parte del isómero monoalquilado no deseado. Se concentraron las fracciones proporcionando el compuesto deseado, 4-O-alil-3,4-dihidroxibenzoato de etilo, como un sólido amorfo blanco (2,86 g). Asimismo, se aislaron 785 mg del isómero, 3-O-alil-3,4-dihidroxibenzoato de etilo y 990 mg de una mezcla de los dos isómeros.
Debe advertirse que las RMN de los dos isómeros monoalquilados son prácticamente idénticas, a excepción de la posición del protón fenólico, que está más alejado hacia arriba en el isómero 4-O-alilo deseado.
4-O-alil-3,4-dihidroxibenzoato de etilo (producto principal, deseado)
RMN ^{1}H (500 MHz, acetona-d6): \delta 7,99 (s, 1H protón fenólico), 7,51 (d, 1H), 7,49 (s, 1H), 6,93 (d, 1H), 6,1 (m, 1H), 5,45 (d, 1H), 5,25 (d, 1H), 4,71 (d, 2H), 4,28 (q, 2H), 1,25 (t, 3H).
EM (ESI): 223 (M + H^{+})
3-O-alil-3,4-dihidroxibenzoato de etilo (producto menor, no deseado)
RMN ^{1}H (500 MHz, acetona-d6): \delta 8,43 (s, 1H protón fenólico), 7,58 (m, 2H), 7,03 (d, 1H), 6,1 (m, 1H), 5,45 (d, 1H), 5,25 (d, 1H), 4,71 (d, 2H), 4,28 (q, 2H), 1,25 (t, 3H).
EM (ESI): 223 (M + H^{+}).
Síntesis de XXVII
Ácido 4-O-alil-3,4-dihidroxibenzoico
82
A 1,00 g (4,50 mmoles) de 4-O-alil-3,4-dihidroxibenzoato de etilo se añadieron 10 ml de 1:1 de THF/agua, 378 mg de LiOH-H_{2}O (9,00 mmoles, 2,0 eq.) y, finalmente, 2,8 g (20 mmoles, 1,2 eq.) de carbonato de potasio. Se agitó la mezcla durante toda la noche a temperatura ambiente, después de lo cual se realizó el análisis por TLC eluyendo con 5:1 de hexano/acetato de etilo con una conversión incompleta al producto. Se añadieron 150 mg más de LiOH-H_{2}O (0,4 eq.) y se continuó agitando durante otras 24 horas; una vez transcurrido este tiempo se juzgó como completada la reacción por TLC. Se diluyó la mezcla de reacción con 100 ml de agua y se extrajo una vez con 25 ml de EtOAc y una vez con 25 ml de CH_{2}Cl_{2}. Se aciduló la capa acuosa a un pH = 1 con HCl 1 N, después se extrajo dos veces con 25 ml de EtOAc, después dos veces con 25 ml de CH_{2}Cl_{2}. Se combinaron estos materiales orgánicos, se secaron con MgSO_{4} y se filtraron. Se eliminó el disolvente en un evaporador rotatorio y se secó el sólido blanco amorfo resultante con un alto grado de vacío proporcionando 835 mg (96%) de producto en bruto de suficiente pureza para usarlo en posteriores reacciones.
Ácido 4-O-alil-3,4-dihidroxibenzoico
RMN ^{1}H (500 MHz, DMSO-d6): \delta 7,37 (d, 1H), 7,36 (s, 1H), 6,97 (d, 1H), 6,05 (M, 1H), 5,40 (d, 1H), 5,25 (d, 1H), 4,60 (d, 2H).
EM (ESI): 195 (M + H^{+})
Síntesis de XXVIII
Resina 4-O-alil-3,4-dihidroxibenzoato de HMPB
83
A 2,65 g de HMPB (Novobiochem, cargas 0,51 mmoles/g, 1,35 mmoles) se añadieron 50 ml de THF destilado, 0,655 g de ácido 4-O-alil-3,4-dihidroxibenzoico (3,38 mmoles, 2,5 eq.), 900 mg de Ph_{3}P (3,38 mmoles, 2,5 eq.) y, finalmente, 0,675 ml de diazodicarboxilato de diisopropilo (3,38 mmoles, 2,5 eq.). Se hizo rotar la mezcla durante toda la noche en un tubo de reacción, después se drenó la resina y se lavó cinco veces con DMF, cinco veces con MeOH, cinco veces con CH_{2}Cl_{2}, después se secó con un alto grado de vacío hasta una masa de 3,04 g. Para medir la carga se segmentaron 100 mg de resina con ácido trifluoroacético al 10% en cloruro de metileno y se produjeron 5,0 g de ácido 4-O-alil-3,4-dihidroxibenzoico de pureza excelente, lo que indicó una carga del 58%.
Ácido 4-O-alil-3,4-dihidroxibenzoico
RMN ^{1}H (500 MHz, DMSO-d6): \delta 7,37 (d, 1H), 7,36 (s, 1H), 6,97 (d, 1H), 6,05 (m, 1H), 5,40 (d, 1H), 5,25 (d, 1H), 4,60 (d, 2H).
EM (ESI): 195 (M + H^{+})
Síntesis de XXIX
Síntesis de resina de ácido 4-O-(2-bencimidazolil)metil-3-O-(2-fluoro-4-bromobencil)-3,4-dihidroxibenzoico por alquilación en tándem
84
A 0,600 g de resina 4-O-alil-3,4-dihidroxibenzoato de HMPB (0,51 mmoles/g) se añadieron 5 ml de DMF secado en tamiz, 0,415 g de bromuro de 2-fluoro-4-bromobencilo (1,55 mmoles, 5 eq.), 0,231 ml de diazabicicloundecano (DBU, 1,55 mmoles, 5 eq.). Se hizo rotar la mezcla durante toda la noche en un tubo de reacción, después se drenó la resina y se lavó cinco veces con DMF, cinco veces con CH_{2}Cl_{2}, después se secó con un alto grado de vacío. Se hinchó la resina en 3 ml de CH_{2}Cl_{2}, y se añadieron 0,500 ml de PhSiH_{3} (13 eq.) y 40 mg de Pd(Ph_{3}P)_{4} (0,1 eq.). Se hizo rotar la mezcla durante toda la noche en un tubo de reacción, después se drenó la resina y se lavó cinco veces con DMF, cinco veces con CH_{2}Cl_{2}, después se secó con un alto grado de vacío hasta obtener una masa de 530 mg. Se hinchó una muestra de 180 mg de este material en 2,0 ml de DMF, y se añadieron 73 mg de 1-t-Boc-2-clorometilbencimidazol (3 eq.) y 0,041 ml de DBU (3 eq.). Se hizo rotar la mezcla durante toda la noche en un tubo de reacción, después se drenó la resina y se lavó cinco veces con DMF, cinco veces con CH_{2}Cl_{2} y después se segmentó por tratamiento con 2 ml de ácido trifluoroacético al 40% en cloruro de metileno durante 30 minutos. Se drenó la solución de segmentación y se eliminó el disolvente bajo una corriente de nitrógeno. Se purificó el residuo por HPLC en una columna de 100 x 20 mm YMC-PACK ODS, eluyendo a 20 ml/min en un gradiente, comenzando con 90/10 de agua/CH_{3}CN (TFA al 0,1%) y aumentando en rampa lineal hasta acetonitrilo directo (TFA al 0,1%) a lo largo de un ciclo de 11 minutos. Se combinaron las fracciones que contenían el producto y se redujo en volumen bajo una corriente de nitrógeno, después se liofilizó produciendo 10 mg de un sólido esponjoso blanco que se analizó por espectrometría de masas LC (471 M + 1).
Síntesis de XXX
Síntesis de resina de ácido 4-O-(2-bencimidazolil)metil-3-O-(4-clorobencil)-3,4-dihidroxibenzoico de Mitsonobu seguida de alquilación
85
A 0,250 g de resina de 4-O-alil-3,4-dihidroxibenzoato de HMPB (cargas 0,51 mmoles/g) se añadieron 5 ml de THF destilado, 0,180 g de alcohol 4-clorobencílico (5 eq.), 0,315 ml de Bu_{3}P (5 eq.) y, finalmente, 220 mg de diamida (5 eq.). Se hizo rotar la mezcla durante 5 horas en un tubo de reacción, después se drenó la resina y se lavó cinco veces con DMF, cinco veces con CH_{2}Cl_{2}, después se secó con un alto grado de vacío. Se hinchó la resina en 1,5 ml de CH_{2}Cl_{2}, y se añadieron 0,300 ml de PhSiH_{3} (20 eq.) y 15 mg de Pd(Ph_{3}P)_{4} (0,1 eq.). Se hizo rotar la mezcla durante toda la noche en un tubo de reacción, después se drenó la resina y se lavó cinco veces con DMF, cinco veces con CH_{2}Cl_{2}, después se secó con un alto grado de vacío. Se hinchó este material en 2,0 ml de DMF, y se añadieron 102 mg de 1-t-Boc-2-clorometilbencimidazol (3 eq.) y 0,060 ml de DBU (3 eq.). Se hizo rotar la mezcla durante toda la noche en un tubo de reacción, después se drenó la resina y se lavó cinco veces con DMF, cinco veces con CH_{2}Cl_{2}, y después se segmentó por tratamiento con 2 ml de ácido trifluoroacético al 40% en cloruro de metileno durante 30 minutos. Se drenó la solución de segmentación y se eliminó el disolvente bajo una corriente de nitrógeno. Se purificó el residuo por HPLC en una columna de 100 x 20 mm YMC-PACK ODS, eluyendo a 20 ml/min en un gradiente, comenzando con 90/10 de agua/CH_{3}CN (TFA al 0,1%) y aumentando en rampa lineal hasta acetonitrilo directo (TFA al 0,1%) a lo largo de un ciclo de 11 minutos. Se combinaron las fracciones que contenían el producto y se redujeron en volumen bajo una corriente de nitrógeno, después se liofilizaron para producir 12 mg de un sólido esponjoso blanco que se analizó por LC-espectrometría de masas (409 M +1).
De esta misma manera, se sintetizaron y se caracterizaron por LC-EM los compuestos que se muestran seguidamente en la tabla 3:
TABLA 3 Ácidos carboxílicos preparados a partir de resina de 4-O-alil-3,4-dihidroxibenzoato de HMPB
86
TABLA 3 (continuación)
87
TABLA 3 (continuación)
88
TABLA 3 (continuación)
89
TABLA 3 (continuación)
90
TABLA 3 (continuación)
91
TABLA 3 (continuación)
92
TABLA 3 (continuación) 
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93 
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Tabla 3 (continuación)
Los dos siguientes compuestos requirieron una ligera desviación con respecto al protocolo estándar: la escisión de la resina se consiguió con TFA al 5% en CH_{2}Cl_{2} durante 5 minutos, y dio el producto protegido tBoc. Posteriormente se extrajo el tBoc usando 2 ml de CH_{2}Cl_{2} / NH_{3} 2 N 1:1 en MeOH durante 30 minutos. Se extrajo el disolvente y se purificaron los compuestos por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) de la forma habitual. Esto fue necesario porque las condiciones normales de escisión de TFA al 40% / CH_{2}Cl_{2} durante 40 minutos escindieron los grupos p-alquil bencilo.
94
Evaluación biológica Actividad enzimática
Se llevaron a cabo las determinaciones de CI_{50} para las aminoacil-ARNt sintetasas (aaRS) aisladas de patógeno o células HeLa usando una modificación del ensayo de precipitación de ácido tricloroacético y carga de aaRS descrito anteriormente (véase ejemplos: D. Kern y col., Biochemie, 61, 1257-1272 (1979) y J. Gilbart y col. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 37(1), 32-38 (1993)). Se prepararon las enzimas aaRS por clonación normal y procedimientos de expresión y se purificaron parcialmente o se purificaron parcialmente a partir de patógenos y extractos de células HeLa. Se normalizó la actividad de cada enzima aaRS como recuentos precipitables (cpm) de ácido tricloroacético obtenidos a un tiempo de reacción de 10 minutos a concentraciones K_{m} de sustratos. Para fines prácticos, el valor mínimo aceptable es aproximadamente 2.000 cpm por cada 10 minutos de reacción.
Se iniciaron las incubaciones previas para determinaciones de CI_{50} por incubación de extractos de aaRS parcialmente purificados en HEPES 50 mM (pH 7,5), EDTA 0,01 mM, 0,05 mg/ml de albúmina de suero bovino, ditiotreitol 10 mM y sulfóxido de dimetilo al 2,5% con y sin el compuesto de ensayo (por ejemplo, compuesto de la invención (preferentemente el compuesto de fórmula I)) en un volumen final de 20 microlitros en una placa de microvaloración durante 20 minutos a 25ºC. Los compuestos de ensayo se presentaron típicamente como diluciones en serie en intervalos de concentración de 0,35 nM a 35 \muM. Se prepararon las soluciones del compuesto de ensayo disolviendo el compuesto de ensayo en sulfóxido de dimetilo al 100% y diluyendo hasta la concentración final con HEPES 50 mM, pH 7,5. Se llevaron a cabo las determinaciones de CI_{50} típicamente por duplicado, conteniendo cada experimento de 4 a 8 concentraciones de inhibidor junto con dos controles sin inhibidor.
Se iniciaron incubaciones CI_{50} suplementando la mezcla de incubación previa hasta una concentración de ensayo final de MgCl_{2} 10 mM, KCl 30 mM, KF 10 mM, HEPES 50 mM (pH 7,5), ATP 20 \muM-500 mM, aminoácido 2-20 \muM [^{3}H] y ARNt 90-180 \muM en bruto en un volumen final de 35 microlitros. Se incubó la reacción a 25ºC durante 5-20 minutos. En momentos puntuales de tiempo específicos se eliminó una parte alícuota de 15 microlitros y se añadió a un pocillo de una placa de filtración Millipore (Multiscreen-FB, MAFB NOB 10) que contenía 100 microlitros de ácido tricloroacético al 5% (peso/vol). Se recogió el material precipitable de ácido tricloroacético por filtración en una estación de filtración Millipore Multiscreen, se lavó dos veces con ácido tricloroacético al 5%, dos veces con agua y se secó. Se dejaron secar al aire típicamente las placas durante varias horas y después se hornearon a 50ºC en un horno de vacío durante 30 minutos. Se determinó cuantitativamente la radioactividad en las placas secas por adición de Packard Microscint-20 a los pocillos y recuento con contador de centelleo Packard TopCount.
Se registró típicamente la actividad de inhibidor como un porcentaje de la actividad aaRS de control. Se determinó el valor CI_{50} representando gráficamente el porcentaje de actividad frente a la concentración de compuesto en el ensayo e identificando la concentración a la que permanecía un 50% de la actividad.
En la tabla 4 se enumeran los valores CI_{50} (en \muM) de algunos compuestos representativos de la presente invención.
Análisis antimicrobiano de células completas
Se sometieron a ensayo los compuestos para determinar la actividad antimicrobiana frente a un panel de organismos según los procedimientos convencionales descritos por el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS documento M7-A3, vol. 13, nº 25, 1993/NCCLS documento M27-P, vol. 12, nº 25, 1992). Se disolvieron los compuestos en DMSO al 100% y se diluyeron hasta la concentración de reacción final (0,1 \mug/ml-500 \mug/ml) en medio de crecimiento microbiano. En todos los casos, la concentración de DMSO incubado con células es menor o igual al 1%. Para los cálculos de concentración de inhibición mínima (MIC), se añadieron diluciones dobles de compuestos a los pocillos en una placa de microvaloración que contenía 1 x 10^{5} bacterias o células fúngicas en un volumen final de 200 lambda de un medio apropiado (Mueller-Hinton Broth; Haemophilus Test Media; Mueller-Hinton Broth + 5% Sheep Blood; o RPMI 1690). Se incubaron las placas durante toda la noche a una temperatura apropiada (30ºC-37ºC) y se midieron las densidades ópticas (medida de crecimiento celular) usando un lector de placa comercial. El valor MIC se define como la concentración de compuesto mínima que inhibe el crecimiento de los organismos de ensayo.
En la tabla 4 se enumeran los valores CMI (en \mug/mg) en compuestos representativos de la presente invención.
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(Tabla pasa a página siguiente)
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Eficacia in vivo Ensayo de protección de ratones
El ensayo de protección de ratones es una norma industrial para medir la eficacia de un compuesto de ensayo in vivo (para los ejemplos de este modelo véase J. J. Clement, y col., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 38(5), 1071-1078, (1994)). Tal como se ilustra más adelante, el presente ensayo se usa para demostrar la eficacia in vivo de los compuestos de la presente invención contra bacterias u hongos.
Se estableció la actividad antimicrobiana in vivo de un compuesto de la invención, denominado en lo sucesivo compuesto de ensayo, infectando ratones macho y hembra (5 ratones/grupos de dosis x 5 dosis/compuesto) que pesaban 20-25 g por vía intraperitoneal con inóculo de patógeno. Se preparó el inóculo a partir de una muestra de patógeno obtenida del ATCC (por ejemplo, ATCC 29213, S. aureus; ATCC 14154, S. aureus; ATCC 8668, Strep. pyogenes; ATCC 25922; E. coli; ATCC 29212. E. faecalis; ATCC 25238, M. catarrhalis; y ATCC 90028, C. albicans). Se cultivó cada cepa bacteriana en su medio apropiado a 37ºC durante 18 horas, produciendo la mayoría de las cepas entre 10^{8} y 10^{9} unidades formadoras de colonias (CFU)/ml en estas condiciones. Se diluyó en serie el cultivo de toda la noche hasta conseguir un contenido apropiado y se añadieron 0,5 ml de cada dilución a 4,5 ml de mucina gástrica de cerdo al 5% para preparar el inóculo infectante. Se inyectó a cada ratón 0,5 ml del inóculo por vía intraperitoneal (i.p.), con cinco animales por dilución. Se calculó el 50% de dosis letal (DL_{50}) y la dosis letal mínima (DLM, la dosis que causa un 100% de muertes de los animales) basándose en el número de ratones que sobrevivieron al cabo de 7 días. Se usó la DLM establecida para cada uno de los patógenos como dosis de inóculo en los ensayos de protección de ratones.
Se disolvió el compuesto de ensayo en un vehículo esterilizado apropiado para su procedimiento de suministro (por ejemplo, HPB (hidroxipropil-\beta-ciclodextrina) al 30%, pH 7,4 ó Tris.HCl 0,05 M). Un grupo de vehículo (dosis = 0) sirvió como control de placebo para cada compuesto y cada patógeno. Se determinó la dosis para el compuesto de ensayo en función de los datos de CMI. Se preparó una serie de diluciones de un compuesto de ensayo en el vehículo. Se usó un grupo de 5 ratones para cada dosis de compuestos de ensayo y el vehículo. Hay 5-6 dosis para cada compuesto. Se usó cada animal solamente para un experimento.
Un primer investigador infectó ratones i.p. con 0,5 ml de la DLM de patógeno en mucina gástrica de cerdo al 5% y un segundo investigador administró inmediatamente el compuesto (s.c., p.o. o i.v. en los volúmenes indicados anteriormente). Se calculó el 50% de dosis de protección (Dp_{50}) a partir de la curva de dosis-respuesta establecida en función del número de ratones que sobrevivieron durante 7 días tras el tratamiento. En cada uno de los experimentos se incluyó también un grupo de control positivo con un antibiótico comercial, por ejemplo.
Si bien la invención se ha descrito en relación con formas de realización específicas, los detalles de estas formas de realización no se deben interpretar como limitativos.

Claims (8)

1. Un compuesto de fórmula:
97
98
y en la que R_{1}, R_{2}, R_{3}, R_{4}, AR y Het se seleccionan de la tabla, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
99
2. Un compuesto seleccionado entre los siguientes, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
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o seleccionado entre
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o seleccionado entre
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o seleccionado entre
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o seleccionado entre
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o seleccionado entre
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o seleccionado entre
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o seleccionado entre
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o seleccionado entre
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o seleccionado entre
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o seleccionado entre
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o seleccionado entre
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o que es
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o seleccionado entre
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o seleccionado entre
139
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o seleccionado entre
141
3. Un compuesto de las siguientes fórmulas, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
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4. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
5. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
6. Uso de un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para la fabricación de un medicamento para tratamiento de infección, inhibición de aminoacil-ARNt sintetasa o inhibición del crecimiento de microorganismos.
7. Uso según la reivindicación 6, en el que la infección es bacteriana o fúngica.
8. Un procedimiento de inhibición del crecimiento de microorganismos en un cultivo celular, que comprende la administración de una cantidad eficaz de un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
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