DE60005308T2

DE60005308T2 - Verfahren zur aufbereitung von molke aus der milchsäurevergärung mittels elektrodialyse

Info

Publication number: DE60005308T2
Application number: DE60005308T
Authority: DE
Inventors: Shuji Kitamura; Takashi Ueyama
Original assignee: Calpis Co Ltd
Current assignee: Asahi Soft Drinks Co Ltd
Priority date: 1999-01-11
Filing date: 2000-01-11
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2020-01-12
Also published as: JP4205227B2; JP2000204099A; DE60005308D1; AU1892000A; NZ512720A; WO2000042066A1; AU770294B2; US6204362B1; EP1159295A1; EP1159295B1; ATE250081T1; ID29451A

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Reinigen von Molke, welche aus Milchsäure-Fermentationsflüssigkeit durch Elektrodialyse abgetrennt wird. Die Molke enthält hemmende Peptide für Angiotensin-umwandelnde Enzyme. Die Peptide, die gemäß der vorliegenden Endung aus gereinigter Molke erhalten werden, können als Bluthochdruckgegenmittel und als Nahrungsmittel verwendet werden, wenn die Molke für die orale Verabreichung weiter behandelt wird.
Hintergrund der Erfindung
Das Angiotensin-umwandelnde Enzym, welches hierin später als ACE bezeichnet wird, kommt hauptsächlich in Lungen und gefäßreichen Endothelialzellen vor und wirkt auf Angiotensin I (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu), um ein Dipeptid (His-Leu) an seinem C-terminalen Ende zu entfernen und Angiotensin II zu bilden, welches eine starke Blutdruck steigernde Aktivität aufweist. Das ACE weist ebenfalls eine Fähigkeit auf, Bradykinin, welches den Blutdruck erniedrigt, zu zersetzen und zu inaktivieren. Daher bewirkt ACE einerseits eine Erhöhung des Blutdrucks durch Erzeugen von Angiotensin II, während es andererseits Bradykinin zersetzt, was den Blutdruck erhöht.
Dementsprechend könnte sich, wenn das Angiotensin-umwandelnde Enzym gehemmt wird, der hohe Blutdruck erniedrigen und viele Arzneimittel, welche einen Hemmstoff für Angiotensin-umwandelnde Enzyme enthalten, könnten entwickelt und gegen Bluthochdruck verwendet werden. Kürzlich wurde festgestellt, daß bestimmte Peptide verwendbar sind, da sie niedrig in der Toxizität und sehr sichere Bluthochdruckgegenmittel sind, und es wurde von natürlichen und synthetischen Peptiden als mögliche Arzneimittel gegen Bluthochdruck berichtet ( JP-A-3 120 225 ). Es ist ebenso bekannt, daß Peptide, die Ile-Pro-Pro (hierin später als IPP bezeichnet) oder Val-Pro-Pro (hierin später als VPP bezeichnet) enthalten, aufgrund ihrer Basispeptidstruktur ACE-hemmende Eigenschaften aufweisen, und daß diese Peptide in großen Mengen durch Kultivierung von bestimmten Milchsäurebakterien oder Milchsäurebakterien und Hefe ( JP-B-2 782 142 und JP-B-2 782 153 ) hergestellt werden können. Arzneimittel oder Nahrungsmittel, die aus diesen Peptiden bestehen, werden vorgeschlagen, sehr sicher zu sein und in kleinen Mengen zum Erniedrigen von Bluthochdruck in Form von oraler Verabreichung anwendbar zu sein, wenn die kultivierte Flüssigkeit durch Reinigung und Trennung behandelt worden ist.
Es kann möglich sein, die Fermentationsflüssigkeit, die gemäß den in den vorstehenden Patenten beschriebenen Verfahren erhalten wird, als ACE hemmendes Arznei- oder Lebensmittel, die ACE-hemmende Peptide enthalten (hierin später als ACEI-Peptide bezeichnet), zu verwenden. Sie kann jedoch eine schlechte Schmackhaftigkeit bei der oralen Aufnahme aufweisen und ist nicht ohne weitere Reinigungsprozesse zum Trinken geeignet, weil sie Milchsäure und, bis zu einem gewissen Ausmaß, einige andere Substanzen enthält.
Dementsprechend ist es wünschenswert, andere Substanzen als die ACEI-Peptide aus der Flüssigkeit zu entfernen. Arznei- oder Lebensmittel in einer trockenen Form, welche die Peptide in einer konzentrierteren Form als die Flüssigkeit einschließen, sind vorteilhafter. Proteine und ACEI-Peptide mit IPP oder VPP als deren Basispeptidstruktur, welche durch Kultivierung von Milchsäurebakterien oder Milchsäurebakterien und Hefe hergestellt werden, werden teilweise hydrolysiert, um IPP und VPP in dem kultivierten Nährmedium zu bilden.
Offenbarung der Erfindung
Die Fermentationsflüssigkeit wird Behandlungen für die Fest-Flüssig-Trennung, einschließlich Zentrifugation und Filtration, unterworfen, um Molke als Überstand zu erhalten, welche den Hauptteil der ACEI-Peptide enthält. Die Säuren und andere Verunreinigungen in der Molke können durch Unterwerfen der Molke einer oder einer Kombination von den folgenden Behandlungen, welche Elektrodialyse, eine Behandlung mit Ionenaustauschharzen, Hohlfasermembrandialyse, reverse Osmosebehandlung und hydrophobe Säulenchromatographie einschließen, entfernt werden. Die gereinigte Molke wird in Trockenmasse überführt, welche ACEI-Peptide enthält.
Elektrodialyse wird allgemein als eine der vorteilhaftesten Techniken betrachtet, um Molke zu reinigen; die allgemein bekannte Dialyse hat jedoch die Nachteile, daß sie einen langen Zeitraum für die Dialyse wegen der langsamen Ionenbewegung aufgrund der Polarisierung oder "fouling" benötigt. Ein anderer Nachteil der Elektrodialyse ist die geringe Effizienz bei der Wiedergewinnung der Endprodukt-ACEI-Peptide, da Proteine und andere Verbindungen mit großen Molekülgrößen, die in der Molke gelöst sind, die Permeabilität für Säuren, Wasser und andere Ionen durch die Ionenaustauschmembran verringern können. Andererseits weisen ACEI-Peptide, wie IPP und VPP, kleine Molekülgrößen auf, welche die Membran leicht durchdringen können.
Es ist festgestellt worden, daß, wenn eine Anionenaustauschmembran mit einem Permeabilitäts-Diffusionskoeffizienten in einem Bereich von 3,0 bis 9,0 × 10^–6 cm/Sekunde, besonders bevorzugt in dem Bereich von 5,0 bis 7,0 × 10^–6 cm/Sekunde, für die Reinigung und Konzentrierung der Molke verwendet wird, welche aus Milchsäure-Fermentationsflüssigkeit durch Trennung erhalten wird und ACEI-Peptide enthält, die Milchsäure und andere Ionen gleichmäßig entfernt werden und die ACE-Peptide in einer sehr hohen Ausbeute in einem sehr kurzen Behandlungszeitraum entfernt werden können; ungeachtet dessen, wird die Membran als "loose-type membrane" bezeichnet und weist eher große Löcher auf, welche geladene Substanzen mit großen Molekulargewichten leicht durchdringen.
Gemäß Anspruch 1 wird ein Verfahren zum Reinigen und Konzentrieren von Molke, welche aus Milchsäure-Fermentationsflüssigkeit abgetrennt wird, die ACEI-Peptide enthält, bereitgestellt, welches einen Elektrodialyseschritt umfaßt, welcher eine Anionenaustauschmembran mit einem Permeabilitäts-Diffusionskoeffizienten in einem Bereich von 3,0 bis 9,0 × 10^–6 cm/Sekunde verwendet. Ein besonders bevorzugter Bereich ist 5,0 bis 7,0 × 10^–6 cm/Sekunde bei der Dialyse.
Es ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung, ein wirksames Elektrodialyseverfahren bereitzustellen, um Milchsäure und andere Ionen als ACEI-Peptide aus der Molke zu entfernen.
Es ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Reinigung von Molke durch Elektrodialyse bereitzustellen, um Milchsäure und andere Ionen als ACEI-Peptide in einem kürzeren Zeitraum zu entfernen.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung
Die Milchsäurefermentationsflüssigkeit, die ACEI-Peptide enthält, kann durch Kultivierung von Milchsäurebakterien oder Milchsäurebakterien und Hefe gemäß der Beschreibung in JP-B-2,782,142 und JP-B-2,782,153 erhalten werden. Die Molke kann aus der Fermentationsflüssigkeit als Überstand durch Fest-Flüssig-Trennung, einschließlich Zentrifugation, Filtration und Dekantierung der Flüssigkeit, erhalten werden. Die so erhaltene Molke enthält große Mengen ACEI-Peptide, wie auch Säuren, andere Ionen und Proteine und wird für die Reinigung der Elektrodialyse unterworfen. Falls gewünscht, können die Lösungen bis zu einem gewissen Grad vor dem Unterwerfen der Dialyse unter verringertem Druck konzentriert werden.
Bei dem Verfahren der Molkeaufreinigung durch Elektrodialyse gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Anionenaustauschmembran mit einem Permeabilitäts-Diffusionskoeffizienten in einem Bereich von 3,0 bis 9,0 × 10^–6 cm/Sekunde, und besonders bevorzugt in dem Bereich von 5,0 bis 7,0 × 10^–6 cm/Sekunde, verwendet. Der Diffusionskoeffizient wird durch das folgende Verfahren bestimmt: 0,5 normale Natriumchloridlösung – Membran – 3 normale Natriumchloridlösung werden in einem Gefäß gerührt, Konzentrationsunterschiede der Natriumchloridlösung werden gemessen und der Diffusionskoeffizient der verwendeten Membran wurde durch die Formel bestimmt: Diffusionskoeffizient (cm/Sekunde) = übertragene Menge von Natriumchlorid (mol/Sekunde) × Fläche der Membran (cm2) × ΔC (mol/cc).
Eine Kationen-permeable Ionenaustauschermembran, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, braucht keine Beschränkungen aufzuweisen, und geeignete Membranen schließen solche ein, welche einen Permeabilitäts-Diffusionskoeffizienten in dem Bereich von 3,0 bis 5,0 × 10^–6 cm/Sekunde aufweisen, und solche in dem Bereich von 4,0 × 6,0 × 10^–6 cm/Sekunde, und andere Membranen, die ähnliche Ergebnisse ergeben, können verwendet werden.
Es gibt keine weiteren Arbeitsbedingungen, die der herkömmlichen Elektrodialyse hinzuzufügen sind. Insbesondere können gemäß der vorliegenden Erfindung allgemein bekannte Elektrodialyseeinheiten verwendet werden und der an die Elektroden angelegte Strom wird kontrolliert, um die Stromausbeute zu maximieren. Der Leitfähigkeitsgrad der Molke zu der Stromdichte kann der allgemein verwendete sein, und die Dialyse wird bei Umgebungstemperaturen von bis etwa 50°C für 3 bis 10 Stunden durchgeführt. Während der Dialyse werden Säuren einschließlich Milchsäuren und andere geladene Substanzen aus der Molke in ein Diffusat entfernt, während die ACEI-Peptide in einem Dialysat zurückbleiben. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Dialyse in einem viel kürzeren Zeitraum mit einer höheren Ausbeute des ACEI-Hemmstoffs abgeschlossen, als wenn eine Anionenaustauschermembran mit einem Diffusionskoeffizienten außerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Für medizinische Anwendungen kann die gereinigte Molkelösung durch herkömmliche Trockenverfahren getrocknet werden.
Beispiel 1
112 kg Milchsäurefermentationsflüssigkeit wurden gemäß JP-B-2,782,153 hergestellt und die Flüssigkeit wurde einer Zentrifugation bei 10.000 Upm für 5 Minuten unterworfen. Der Überstand (Molkelösung) enthielt 2,1 mg/100 g IPP und 3,9 mg/100 g VPP.
In der vorliegenden Erfindung sind die ACEI-Aktivitäten von IPP das 1,7-fache von VPP, und dementsprechend werden die ACEI-Peptidmengen als kombinierte Mengen von IPP und VPP, die nach der folgenden Formel berechnet werden, definiert: Menge der ACEI-Peptide (als VPP-Menge) = Menge von IPP (mg/100 g) × 1,7 + Menge von VPP (mg/100 g).
Der oben erhaltene Überstand wird unter Vakuum in einem Verdampfer des Langplattentyps, "Super-Long Plate Evaporator RET-100", hergestellt durch Hisaka Co., Ltd., Japan, auf ein Gesamtvolumen von einem Siebtel (1/7) destilliert und konzentrierte Molke wird erhalten. Sie weist die Eigenschaften eines pH-Werts von 3,0 auf und enthält 37,67% (w/w) Saccharide, 62,2% Wasser, 13,8% Säure und 52,4 mg/100 g ACEI-Peptide. 3 kg der konzentrierten Molkelösung wurden einer Elektrodialyse unter Verwendung einer Einheit des Dialysators Typs TS-2-10, hergestellt durch Tokuyama Co., Ltd., Japan, unterworfen. Die Einheit wurde aus 10 Paaren einer Anionenaustauschermembran "Neosepta AMX" mit einem Permeabilitäts-Diffusionskoeffizienten von 6,0 × 10^–6 cm/Sekunde und mit einer effektiven Oberfläche von 2 dm² pro Membranblatt, hergestellt durch Tokuyama Co., Ltd., Japan, und einer Kationaustauschermembran "Neosepta CMX" mit einem Permeabilitäts-Ddiffusionskoeffizienten von 5,0 × 10^–6 cm/Sekunde und mit einer effektiven Oberfläche von 2 dm² pro Membranblatt, hergestellt durch Tokuyama Co., Ltd., Japan, zusammengebaut. Die an das Gefäß angelegte Spannung betrug 14,2 Volt, und der Anfangsstrom war 2,94 A, der Endstrom war 1,41 A. Der angelegte Gesamtstrom war 15,5 AH bei 15 bis 30°C für 620 Minuten. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
Beispiel 2
Experimente, ähnlich zu Beispiel 1, wurden unter Verwendung von Anionenaustauschermembranen mit verschiedenen Diffusionskoeffizienten, wie in Tab. 2 gezeigt, wiederholt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tab. 2 gezeigt. Tabelle 2
Die Ergebnisse zeigen, daß, wenn eine Anionenaustauschmembran mit einem Permeabilitätsdiffusionskoeffizienten in dem Bereich von 3,0 bis 9,0 × 10^–6 cm/Sekunde und, besonders bevorzugt, in dem Bereich von 5,0 × 7,0 × 10^–6 cm/Sekunde verwendet wird, Säuren einschließlich Milchsäure, andere Ionen und Wasser wirksam in einem kürzeren Zeitraum entfernt werden, während die ACEI-Aktivitäten in dem konzentrierten Dialysat in hohen Ausbeuten zurückbleiben.

Claims

Verfahren zum Reinigen und Konzentrieren von Molke, welche aus Milchsäure-Fermentationsflüssigkeit abgetrennt wird, um hemmende Peptide für Angiotensin-umwandelnde Enzyme für medizinische Anwendungen zu konzentrieren, welches das Behandeln der Milchsäure-Fermentationsflüssigkeit in einer Fest-Flüssig-Trennung, um Molke als einen Überstand zu erhalten, und das Unterwerfen des so erhaltenen Überstandes einer Elektrodialyse umfasst, gekennzeichnet durch die Verwendung einer Anionenaustauschmembran mit einem Permeabilität-Diffusionskoeffizienten in dem Bereich von 3,0 bis 9,0 × 10^–6 cm/s, wobei der Diffusionskoeffizient der Anionenaustauschmembran bestimmt wird durch: a) das Aufrechterhalten einer ersten 0,5 normalen Natriumchloridlösung auf einer Seite der Anionenaustauschmembran in einem Gefäß, und das Aufrechterhalten einer zweiten 3,0 normalen Natriumchloridlösung auf der anderen Seite der Membran in dem Gefäß, b) das Rühren der ersten und zweiten Natriumchloridlösungen, c) das Messen der Konzentrationsunterschiede der zwei Natriumchloridlösungen und d) das Bestimmen des Diffusionskoeffizienten durch Anwenden der Formel: Diffusionskoeffizient (cm/s) = übertragene Menge des Natriumchlorids (mol/s) × Membranfläche (cm2) × ΔC (mol/s) und das Trocknen der so erhaltenen gereinigten Molkelösung.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Anionenaustauschmembran einen Permeabilität-Diffusionskoeffizienten in dem Bereich von 5,0 bis 7,0 × 10^–6 cm/s aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei vor der Dialyse die Molke unter verringertem Druck teilweise konzentriert wird.