DE60002081T2

DE60002081T2 - Ein komplex enthaltend lignan, phenolische und aliphatische stoffe isoliert von flax und verfahren zur herstellung

Info

Publication number: DE60002081T2
Application number: DE60002081T
Authority: DE
Inventors: David Paton; D. Westcott
Original assignee: Agriculture and Agri Food Canada AAFC
Current assignee: Agriculture and Agri Food Canada AAFC
Priority date: 1999-06-21
Filing date: 2000-06-20
Publication date: 2003-10-30
Anticipated expiration: 2020-06-21
Also published as: DE60002081D1; ATE236915T1; CA2375297C; EP1192167A1; WO2000078771A1; EP1192167B1; DK1192167T3; AU5666400A; US6264853B1; PT1192167E; AU762912B2; ES2191631T3; CA2375297A1

Description

Technisches Gebiet

Diese Erfindung betrifft ein neues Verfahren zum Reinigen eines Komplexes enthaltend Lignan, phenolische und aliphatische Substanzen aus Flachssamen oder Flachssamenmehl und den neuen so erhaltenen Komplex.

Stand der Technik

Zum gegenwärtigen Zeitpunkt wird Flachssamen vorwiegend aufgrund seines Ölgehalts angebaut, hauptsächlich zur Verwendung als ein industrielles Öl. Flachssamen wird auch zunehmend als eine Quelle für Speiseöl zur Verwendung in Gesundheitszusätzen und Margarine verwendet. Konventioneller Flachssamen ist in seinem Triglyceridöl reich an ungesättigten Fettsäuren und ist somit einer oxidative Polymerisation ausgesetzt.
Die Hauptkomponenten von Flachssamen, welche von kommerzieller Bedeutung sind, sind Öl und Mehlkuchen. Das Öl wird industriell bei der Herstellung von Linoleum und in einigen Farben und Lacken verwendet. Das Mehl, das zurückbleibt, nachdem das Öl im Wesentlichen entfernt worden ist, wird als ein Bestandteil in Tierfutter verwendet. Es sind auch Berichte erhältlich, die eine Polysaccharidfraktion und mögliche Verwendungen beschreiben. Diese schließen die Verwendung von Flachssamenschleim als ein Abführmittel ein. Kürzlich haben Westcott und Muir (US-Patent 5,705,618) ein Verfahren zur Extraktion, Isolierung und Reinigung einer Chemikalie beschrieben, die zu der Lignanklasse von Verbindungen gehört, welche in Flachssamen enthalten ist. Lignane sind natürlich vorkommende Substanzen, die durch Dimerisation von Cinnamoylalkoholen gebildet werden. Das in Flachssamen hauptsächlich gefundene Lignan ist Secoisolariciresinol- Diglucosid, herein nachfolgend als SDG bezeichnet.
Der erste Bericht, dass SDG in Flachssamen vorkommt, war von Bakke und Klostermann, "A New Diglucoside from Flaxseed", Proceedings of the N. Dakota Academy of Science 10: 18-22 (1956). Es wurden zu diesem Zeitpunkt keine physiologischen Wirkungen für diese Substanz berichtet. Diese Autoren isolierten SDG in einem mehrstufigen Verfahren, einschließend eine Extraktion des entfetteten Samens mit Ethanol-Dioxan und Aufkonzentrierung des Extraktes zu einem Sirup. Der resultierende Sirup wurde in Petrolether gegossen, was die Abtrennung einer schweren braunen plastischen Masse verursachte, welches nachfolgend in wässrigem Ethanol gelöst wurde. Diese alkoholische Lösung wurde dann auf pH 3,0 angesäuert und in Eiswasser gegossen. Das Präzipitat, welches sich bildete, koagulierte, setzte sich ab und wurde gesammelt und unter reduziertem Druck getrocknet. Das Präzipitat wurde mal als "braunes polymeres Pulver" und mal als eine "braune, amorphe, gummiartige Substanz" beschrieben. Das Präzipitat wurde mit Natrium oder Bariummethoxid in Methanol behandelt und das freigesetzte SDG wurde nach einer chromatographischen Reinigung isoliert.
Beträchtliches Interesse an SDG entwickelte sich nach Berichten über eine physiologische Wirkung entweder von ganzem Flachssamen oder gereinigtem SDG. Es wurde vor annähernd 30 Jahren demonstriert, dass, wenn Flachssamen als Teil der menschlichen Nahrung aufgenommen wurde, im Urin erhöhte Spiegel der sogenannten Säugetierlignane, Enterolacton und Enterodiol, gefunden wurden. Es wurde später berichtet, dass Flachssamen sehr reich an Vorläufern dieser Säugetierlignane ist. In der Tat produzierten Flachssamen oder deren entfettetes Mehl 75-mal mehr Säugetierlignane als die nächste Quelle, ein Seegras, und über 100-mal mehr als üblichere Nahrungsmittel. Es wurden weiterhin von Stitch et al., "Excretion, isolation and structure of a new phenolic constituent in female urine", Nature 287: 738- 740 (1980) beobachtet, dass die Menge an Säugetierlignanen in der Lutealphase des reproduktiven Zyklus am größten war. Außerdem berichteten Aldercreutz et al., "Excretion of the lignans enterolactone and enterodiol and of equol in omnivorous and vegetarian postmenopausal women and in women with breast cancer", Lancet 1295-1299 (1982), dass die Säugetierlignanspiegel im Urin von Frauen mit Brustkrebs geringer waren als bei gesunden Frauen.
Innerhalb der letzten 10 Jahre haben zahlreiche Forscher von physiologischen Wirkungen entweder von Flachssamen oder SDG berichtet. Thompson, "Anticarcinogenic effect of a mammalian lignan precursor from flaxseed", Proc. 55th Flax Institute of U. S. A., Fargo, ND, 46-50 (1994) hat die Wirkungen von Flachssamen auf die Einleitung und auf fördernde Stadien der Brusttumorgenese beschrieben. Zusätzliche Berichte über die Wirkung von SDG und Flachsöl auf die Brusttumorgenese sind publiziert worden. Andere Berichte von Thompson haben die Wirkungen von Flachssamen oder SDG auf Darmkrebs ausführlich beschrieben. Im US-Patent 5,827,256 hat auch Clark über den Nutzen von SDG bei Patienten, die an Lupus nephritis leiden, berichtet. Im US-Patent 5,846,944 hat Prasad kürzlich die Wirkungen von SDG bei der Reduktion der Entwicklung von hypercholesterinämischer Arteriosklerose in Tiermodellversuchen beschrieben. Weiterhin hat Prasad auch beschrieben, dass SDG vorteilhafte Wirkungen bei Diabetes mellitus besitzt. Sowohl Thompson als auch Prasad haben gesondert berichtet, dass SDG antioxidative Eigenschaften besitzt.
Eine zweite Klasse von Verbindungen, von denen berichtet wird, dass sie in Flachssamen vorliegen, kann im Allgemeinen als phenolische Säuren bezeichnet werden. Insbesondere p-Kumarsäureglycosid (4-Glucosyl- Zimtsäure), Kaffeesäureglycosid (3-Hydroxy-4-glycosyl-Zimtsäure) sind Bestandteile des Komplexes aus Flachssamen, enthaltend SDG, über die berichtet wird. Es ist bekannt, dass phenolische Säuren dieser Verbindungsklasse und deren Derivate eine in vitro-Aktivität als Antioxidantien besitzen. Weiterhin besitzen Verbindungen dieser Art bekannte physiologische Wirkungen, verwandt mit der Tyrosinkinaseinhibition. Überraschenderweise haben Westcott und Muir (US-Patent 5,705,618) gefunden, dass auch ein drittes Phenolsäureglycosid vorhanden ist, nämlich Ferulasäureglycosid (3- Methoxy-4-glucosyl-Zimtsäure). Flachssamen enthält eine zusätzliche Verbindung, Hydroxymethylglutarsäure (HMGA). Es wurde von Siddiqi und Beg (US-Patent 3,629,449) gefunden, dass HMGA, das aus anderen Quellen als Flachs isoliert wurde, hypocholesterinämische Eigenschaften besitzt.
Während ganzer Flachssamen oder sein gemahlenes Gegenstück in die menschliche Ernährung eingebracht werden kann, kann die Menge einer solchen Aufnahme durch eine Regulation beschränkt sein. Sogar wenn sie nicht durch eine Regulation beschränkt ist, würde der hohe Ölgehalt und der Polysaccharidschleimgehalt zu einer übermäßigen Kalorienaufnahme bzw. einer gesteigerten Darmentleerung beitragen. Weiterhin ist es bekannt, dass Flachssamen cyanidhaltige Verbindungen, bekannt als cyanogene Glycoside, enthält, wobei die in Flachssamen gefundenen Liminarin, Linustatin und Neolinustatin sind. Wenn sie im Übermaß über einen langen Zeitraum konsumiert werden, können diese Verbindungen Kropfprobleme und Schädigungen anderer menschlicher Organe ergeben.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die wertvollen Bestandteile von Flachs ohne die unerwünschten Bestandteile, einschließlich cyanogener Glucoside, zu isolieren.

Offenbarung der Erfindung

Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein wässriger, aliphatisch alkoholischer Extrakt aus kommerziellem Flachs erhalten, z. B. aus Flachssamen oder Flachsmehl. Dieser wässrige Extrakt wird ultrafiltriert, wobei niedermolekulare Spezies mit dem Filtrat verbleiben und Spezies mit höherem Molekulargewicht zurückgehalten werden. Es wurde gefunden, dass es durch eine richtige Auswahl des Filtrationsmediums möglich ist, einen Komplex umfassend Secoisolariciresinol-Diglucosid (SDG), Zimtsäureglucoside und Hydroxymethylglutarsäure (HMGA) in einer im Wesentlichen reinen Form zu erhalten. Die Spezies mit geringem Molekulargewicht, die im Filtrat verbleiben, schließen Aminosäuren, kleine Peptide, Zucker und Salze ebenso wie die cyanogenen Glucoside ein, wobei alle davon aus dem Stoffwechselpool des anfänglichen Flachssamens zurückbleiben.
Die Ultrafiltration wird bevorzugt für einen Größenausschluss von 30 000 Dalton oder größer durchgeführt, z. B. 30 000 bis 100 000 Dalton. Im Allgemeinen liegt er im Bereich von 30 000 bis 50 000 Dalton.
Es kann eine Vielzahl von Ultrafiltern verwendet werden, einschließlich Filter in Form flacher Scheiben, spiralig gewickelt, unterstützte Röhren oder Hohlfasermembranen oder andere Anordnungen. Solche Filter sind normalerweise aus synthetischen Polymeren, Zellulose oder Keramik gefertigt. Ein zur Verwendung in der Erfindung bevorzugter Ultrafilter ist eine Membran, durch die der wässrige Extrakt fließt, z. B. eine regenerierte Zellulosemembran. Besonders gute Ergebnisse werden erhalten, wenn die Membran in Form einer spiralig gewundenen Membran vorliegt. Ultrafiltrationsverfahren sind z. B. in den US-Patenten 4,963,356 und 4,716,120 beschrieben.
Es ist auch möglich, eine Säule zu verwenden, enthaltend einen festen Träger, einer Art, der gewöhnlich entweder als Größenausschluss- oder Gelpermeationsharze bezeichnet wird, wie etwa Sephadex® LH-20. Solche Harze erlauben selektiv eine schnellere Passage von Substanzen mit größerem Molekulargewicht im Vorzug vor denjenigen Substanzen, die ein niedrigeres Molekulargewicht besitzen. Somit hält das Gel die Salze, cyanogene Glucoside, Aminosäuren, kleine Peptide und dergleichen zurück, während der Komplex mit einer größeren Dimension hindurchgehen kann.
Es ist in einigen Fällen vorteilhaft, eine Kombination einer Ultrafiltrationsmembran und eines Größenausschlussharzes zu verwenden. Somit kann zuerst der wässrige alkoholische Extrakt einmal oder mehrere Male durch eine Membran geleitet werden, um einen wesentlichen Anteil der niedermolekularen Substanzen zu entfernen. Dann wird der Extrakt mit einem reduzierten Gehalt an niedermolekularen Substanzen durch eine Säule geleitet, die ein Größenausschlussharz enthält, um den Rest der niedermolekularen Substanzen zu entfernen und den Komplex zu sammeln, der im Wesentlichen frei von den niedermolekularen Substanzen ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die im Wesentlichen reine Form des Komplexes, umfassend SDG, Zimtsäureglucoside und HMGA ein neues Material, welches wie es ist oder in Form eines flüssigen Konzentrats oder eines Pulvers verwendet werden kann.
Das Retentat, enthaltend den neuen Komplex, erhalten durch die Ultrafiltration, wird bevorzugt durch bekannte Mittel aufkonzentriert, wie etwa Verdampfen unter vermindertem Druck, um den Gehalt an Alkohol zu verringern, und der Komplex wird als ein flüssiges Konzentrat gewonnen. Es ist auch möglich, das Konzentrat durch bekannte Mittel, wie etwa Sprühtrocknen, Trommeltrocknung, Gefriertrocknung usw. als ein trockenes Pulver zu gewinnen. Das trockene Endprodukt enthält normalerweise weniger als 5% Feuchtigkeit und besitzt das Erscheinungsbild eines blassweißlichen Feststoffs. Das Pulver enthält normalerweise bis zu 50% SDG, bis zu 25% Zimtsäureglucoside insgesamt und bis zu 10% HMGA, mit weniger als 1% Stickstoff.
Der für die anfängliche Extraktion verwendete aliphatische Alkohol kann ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol usw. Bevorzugt wird die Extraktion unter Verwendung von Ethanol durchgeführt, und sie kann bequem bei Raumtemperatur durchgeführt werden, obwohl die Extraktionstemperatur nicht kritisch ist.
Durch Isolieren des Komplexes dieser Erfindung in im Wesentlichen reiner Form lediglich unter der Verwendung der wässrigen aliphatischen alkoholischen Extraktion und Ultrafiltration, wird jede Kontamination oder andere Beschädigung des Komplexes vermieden. Z. B. wurde im Verfahren des US-Patents 5,705,618 der alkoholische Extrakt weiter einer basenkatalysierten Hydrolyse unterzogen, um die Lignane freizusetzen. Diese zerstört den Komplex, so dass die Trennung eines reinen Komplexes nicht länger möglich ist.
Die Produkte dieser Erfindung sind insbesondere wertvoll als Nutrazeutika und können z. B. in Form von Tabletten oder Kapseln zur humanen Gebrauch verwendet werden. Das Produkt der Erfindung kann auch in formulierte Lebensmittel als Funktionsnahrung eingebracht werden. Eine weitere Anwendung des Produkts wäre die Verwendung bei der Tierpflege oder Tierernährung. Man nimmt an, dass der Komplex die gut dokumentierten Vorteile seiner in ganzen Flachssamen, der Quelle des Komplexes gefundenen Bestandteile überträgt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

In den Zeichnungen, welche die Erfindung veranschaulichen:
Fig. 1A ist ein Chromatogramm eines nicht verarbeiteten ethanolischen Extraktes aus Flachssamenmehl, das einen ultravioletten Nachweis bei 280 nm zeigt;
Fig. 1B ist ein Chromatogramm eines nicht verarbeiteten ethanolischen Extraktes aus Flachssamenmehl, das einen Verdampfungslichtstreuungsnachweis zeigt;
Fig. 2A ist ein Chromatogramm, das einen ultravioletten Nachweis bei 280 nm des Permeats eines ethanolischen Extraktes von Flachssamenmehl nach der Bearbeitung mit einem 30 000 NMCO-Filter zeigt;
Fig. 2B ist ein Chromatogramm, das einen Verdampfungslichtstreuungsnachweis des Permeats von einem ethanolischen Extrakt von Flachssamenmehl nach einer Bearbeitung mit einem 30 000 NMCO-Filter zeigt;
Fig. 2C ist ein Chromatogramm, das einen ultravioletten Nachweis bei 280 nm des Retentats eines ethanolischen Extraktes aus Flachssamenmehl nach einer Bearbeitung mit einem 30 000 NMCO-Filter zeigt;
Fig. 2D ist ein Chromatogramm, das einen Verdampfungslichtstreuungsnachweis des Retentats von einem ethanolischen Flachssamenmehlextrakt nach einer Bearbeitung mit einem 30 000 NMCO-Filter zeigt;
Fig. 3A ist ein Chromatogramm, das einen ultravioletten Nachweis bei 280 nm des Permeats aus einem ethanolischen Extrakt von Flachssamenmehl nach der Bearbeitung mit einem 100 000 NMCO-Filter zeigt;
Fig. 3B ist ein Chromatogramm, das einen Verdampfungslichtstreuungsnachweis des Permeats von einem ethanolischen Extrakt von Flachssamenmehl nach einer Bearbeitung mit einem 100 000 NMCO-Filter zeigt;
Fig. 3C ist ein Chromatogramm, das einen ultravioletten Nachweis bei 280 nm des Retentats von einem ethanolischen Extrakt von Flachssamenmehl nach der Bearbeitung mit einem 100 000 NMCO-Filter zeigt;
Fig. 3D ist ein Chromatogramm, das einen Verdampfungslichtstreuungsnachweis des Retentats von einem ethanolischen Extrakt von Flachssamenmehl nach einer Bearbeitung mit einem 100 000 NMCO-Filter zeigt;
Fig. 4A ist ein Chromatogramm, das einen ultravioletten Nachweis bei 280 nm der Fraktion zeigt, die einen Komplex mit hohem Molekulargewicht aus einem wässrigen ethanolischen Extrakt von Flachssamen nach einer Trennung mittels Gelpermeationsharz zeigt;
Fig. 4B ist ein Chromatogramm, das einen Lichtstreuungsnachweis der Fraktion zeigt, die einen Komplex mit hohem Molekulargewicht enthält aus einem wässrigen ethanolischen Extrakt von Flachssamen nach der Trennung mittels Gelpermeationsharz;
Fig. 4C ist ein Chromatogramm, das einen ultravioletten Nachweis bei 280 nm der niedermolekularen Koextrakte aus einem wässrigen ethanolischen Extrakt von Flachssamen nach einer Trennung mittels Gelpermeationsharz zeigt; und
Fig. 4D ist ein Chromatogramm, das einen Verdampfungslichtstreuungsnachweis der niedermolekularen Koextrakte aus einem wässrigen ethanolischen Extrakt von Flachssamen nach einer Trennung mittels Gelpermeationsharz zeigt.

Beste Ausführungsarten der Erfindung

Beispiel 1

6 kg Flachssamenmehl wurden mit insgesamt 60 l 70%-igem (Vol/Vol) wässrigem Ethanol bei 20ºC extrahiert, wobei für insgesamt 8 h gerührt wurde. Der Extrakt wurde von der Masse der feuchten zurückbleibenden Mehlfeststoffe mittels Filtration entfernt. Ein Anteil des Extrakts wurde dann durch eine regenerierte Zelluloseultrafiltrationsmembran (Amicon Corp.) gepumpt, die einem nominellen Molekulargewichtsgrößenausschluss (NMCO) von 30 000 Dalton und mehr besaß, um den Komplex zurückzuhalten, während die niedermolekularen Spezies, wie etwa Zucker, Aminosäuren, kleine Peptide, Salze, cyanogene Glycoside und dergleichen eliminiert wurden.
In diesem Test wurden zwei verschiedene kommerzielle Proben von Flachssamenmehl (Flachssamenmehle "A" und "B") verwendet. Das kommerzielle Flachssamenmehl "A" enthielt 22,6 mg/g Mehl SDG, 11,4 mg/g Mehl 4-Glucosylcumarinsäure (GCA) und 5,0 mg/g Mehl Glucosylferulasäure (GFA). Nachdem der Extrakt aus Mehl "A" durch die 30 000 NMCO-Membran geleitet wurde, wurde gefunden, dass die nach der Entfernung aller Lösungsmittel in der Retentatfraktion zurückbleibenden Feststoffe 370 mg/g Feststoffe SDG, 160 mg/g Feststoffe GCA (gemessen als Methylester), 50 mg/g Feststoffe GFA (gemessen als Methylester) und 96 mg/g Feststoffe HMGA (gemessen als sein Dimethylester) enthielt.
Der Extrakt aus kommerziellem Flachssamenmehl "B" enthielt nach ähnlicher Behandlung 340 mg/g Feststoffe SDG, 95 mg/g Feststoffe GCA (gemessen als Methylester), 45 mg/g Feststoffe GFA (gemessen als Methylester) und 96 mg/g Feststoffe HMGA (gemessen als sein Dimethylester). Für beide der obigen Flachssamenmehlproben betrug die Zunahme der Konzentration der gewünschten Produkte in den Feststoffen im Vergleich zum Ausgangsmehl etwa das Zwanzigfache.

Beispiel 2

6 g von kommerziellem Flachsmehl wurden wie in Beispiel 1 beschrieben extrahiert. Der Extrakt wurde durch einen Apparat zirkuliert, der eine spiralig gewundene Membran (Amicon Corp.) mit einer Ausschlussgrenze von 30 000 Dalton und mehr enthielt, um den SDG-enthaltenden Komplex zurückzuhalten, während die niedermolekularen Spezies wie etwa Zucker, Aminosäuren, kleine Peptide, Salze, cyanogene Glycoside und dergleichen eliminiert wurden. Die Zirkulation wurde fortgesetzt, bis das Retentat auf etwa 30 l verringert war, woraufhin das Retentat mit frischem wässrigem Alkohol auf das Originalvolumen von 60 l verdünnt wurde. Eine weitere Zirkulation wurde bis zu dem Punkt fortgeführt, wo das Retentat erneut auf etwa 30 l verringert war. Das Retentat wurde erneut auf das Originalvolumen von etwa 60 l verdünnt. Die Zirkulation wurde fortgesetzt, bis das Volumen auf etwa 30 l reduziert war. Es wurde darauf Rücksicht genommen, dass das Volumen nicht bis zu einem Punkt reduziert wurde, wo die Feststoffe im Retentat auftauchten, und was die Membran verstopfen kann. Das Retentat wurde weiterhin durch Verdampfen unter verringertem Druck aufkonzentriert, um den Gehalt an Alkohol zu verringern, und das Konzentrat wurde als ein flüssiges Konzentrat gewonnen.
Ein Teil des Retentats wurde auch in Pulverform getrocknet. Es besaß das Erscheinungsbild eines blassweißlichen Feststoffes.

Beispiel 3

Das aus Beispiel 2 erhaltene flüssige Konzentrat wurde durch ein Größenausschlussharz (Sephadex® LH-20) geleitet. Die Gelmatrix wurde mit frischem Lösungsmittel gewaschen, nur ausreichend, um den Komplex zu eluieren und die Retention der verbleibenden und restlichen unerwünschten Bestandteile zu maximieren. Der eluierte Komplex wurde dann durch Verdampfung aufkonzentriert.

Beispiel 4

Um die Variabilität in der Konzentration von sekundären Pflanzenmetaboliten in Abhängigkeit von der Umwelt, dem Wachstumsstandort und dem Kultivar zu zeigen, wurden eine Reihe von Tests mit Kultivaren aus verschiedenen Quellen durchgeführt. Sie wurden auf den Gehalt an SDG, 4-Glucosylkumarsäure (GCA) und 4-Glucosylferulasäure (GFA) analysiert. Sowohl GCA als auch GFA wurden durch Flüssigchromatographie als deren Methylester bestimmt. Eine Zusammenfassung der durchschnittlichen SDG-, GCA- und GFA-Konzentration in entfettetem Flachssamenmehl wird in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1

Beispiel 5

Es wurden weitere chromatographische Analysen mit verschiedenen alkoholischen Extrakten von Flachssamenmehl durchgeführt. Der erste war ein alkoholischer Extrakt, wie in Beispiel 1 erhalten, ohne weitere Bearbeitung. Der zweite war das Permeat und Retentat aus dem Leiten des alkoholischen Extrakts durch eine 30 000 NMCO-Membran. Der dritte war das Permeat und Retentat aus dem Leiten des alkoholischen Extrakts durch eine 100 000 NMCO-Membran.
Die Proben wurden unter Verwendung eines ersten Tests, umfassend einen ultravioletten Nachweis und eines zweiten Tests, umfassend einen Verdampfungslichtstreuungsnachweis (ELSD, "Evaporative Light Scattering Detection") getestet. Der ultraviolette Nachweis ist für Verbindungen geeignet, die eine wesentliche Lichtabsorption im Wellenlängenbereich von 200 bis 400 nm besitzen, einschließlich den Komplex der Erfindung. Der ELSD ist für den Nachweis von Verbindungen wie etwa Zucker, Salze, aliphatische cyanogenen Glycoside usw. geeignet, welche eine geringe Absorption im normalen gemessenen UV-Bereich besitzen.
Fig. 1A zeigt den Ultraviolett-Nachweis des nicht bearbeiteten Extrakts. Er besitzt einen wesentlichen Peak bei etwa 21 min, welches der Komplex ist, der SDG, die Zimtsäurederivate und die Glutarsäurederivate enthält. Fig. 1B ist der Verdampfungslichtstreuungsnachweis desselben Extrakts. Ein wesentlicher Peak wird bei etwa 2 min gesehen, zu einem Zeitpunkt, wo man erwarten würde, dass Zucker und Salze kommen, da sie nicht an der Umkehrphasen-Chromatographiesäule zurückgehalten werden. Die Säule wurde mit wässrigem Acetonitril eluiert, mit einer Spur von Trifluoressigsäure, wobei der Prozentgehalt von Acetonitril mit der Zeit anstieg. Der Komplex ist sichtbar als eine schwache Abweichung von der Basislinie.
Fig. 2A ist der UV-Nachweis (280 nm) des Permeats von der 30 000 NMCO ("normaler Molekulargewichtsausschluss")-Membran. Er enthält einige UV-absorbierende Materialien, aber diese tauchen zu einem leicht früheren Elutionszeitpunkt auf. Fig. 2B ist der ELSD-Nachweis, der einen starken frühen Peak zeigt, anzeigend, dass die niedermolekularen Substanzen durch die Membran durchgingen, und keine Peaks bei 21 min für den Komplex. Fig. 2C ist das UV des zurückgehaltenen Materials und zeigt eine intensive UV- Absorption. Fig. 2D zeigt, dass es im Wesentlichen keine niedermolekularen Substanzen gibt und zeigt erneut einen kleinen Peak bei 21 min für den Komplex.
Fig. 3A ist das Permeat von einer 100 000 NMCO-Membran. Es zeigt, dass es eine wesentliche UV-Absorption gibt, anzeigend die Passage des Komplexes durch die Membran. Fig. 3B zeigt erneut ein starkes Signal für die niedermolekularen Substanzen im Permeat. Die Anwesenheit des Komplexes kann bei einer genauen Untersuchung erkannt werden. Somit ist die 100 000 NMCO-Membran beim Zurückhalten des Komplexes nicht wirksam. Fig. 3C ist die UV-Spur des Retentats und zeigt die Anwesenheit des Komplexes, während Fig. 3D zeigt, dass keine niedermolekularen Materialien im Retentat vorhanden sind.
Dies zeigt, dass der Komplex an einer 30 000 NMCO-Membran wirksam zurückgehalten wird, aber an einer 100 000 NMCO-Membran nicht wirksam zurückgehalten wird. Da die Rate der Filtration sich normalerweise mit geringeren NMCO-Membranen verlangsamt, ist es bevorzugt, den größtmöglichen Ausschluss zu verwenden, welcher nicht in einem wesentlichen Verlust der hochmolekularen Substanzen resultiert.

Beispiel 6

6 kg eines kommerziellen Flachsmehls wurden wie in Beispiel 1 beschrieben extrahiert. Ein Anteil des Extrakts wurde über ein Bett einer Gelpermeationsträgermatrix des Typs Sephadex® LH-20 geleitet. Die niedermolekularen Bestandteile wurden im Wesentlichen in den Poren der Matrix als Koextrakte zurückgehalten, während der größere SDG-enthaltende Komplex durchgelangen konnte. Die Gelmatrix wurde mit frischem Lösungsmittel gewaschen, ausreichend, um nur den Komplex zu eluieren und die Retention der unerwünschten Bestandteile (Koextrakte) zu maximieren.
Die Fraktionen, die den hochmolekularen Komplex enthalten und die niedermolekularen Koextrakte aus dem wässrigen alkoholischen Extrakt wurden chromatographischen Analysen unterzogen und die Ergebnisse sind in den Fig. 4A-4D gezeigt.
Fig. 4A ist das Material, das nicht von dem Gelpermeationsharz zurückgehalten wurde. Es zeigt eine intensive UV-Absorption bei 21 min, was die Anwesenheit des hochmolekularen Komplexes anzeigt. Fig. 4B ist der ELSD-Nachweis für das nicht zurückgehaltene Material, was zeigt, dass es im Wesentlichen keine niedermolekularen Substanzen gibt, und einen kleinen Peak bei 21 min für den Komplex zeigt. Fig. 4C ist das UV für das Material, das vom Harz zurückgehalten wurde und zeigt geringe UV-Absorptionsmaterialien. Fig. 4D zeigt einen starken frühen Peak, der anzeigt, dass die niedermolekularen Koextrakte von dem Harz zurückgehalten wurden.
Um eine Analyse auf SDG-Gehalt durchzuführen, wurden die Produkte in den obigen Beispielen zuerst hydrolysiert und wie von Westcott und Muir, US-Patent 5,705,618, beschrieben bearbeitet. Cyanogene Glycoside wurden zunächst durch Behandlung der cyanogenen Glycoside mit Beta-Glucuronidase und Nachweisen des freien Cyanidions mit einem Microquant Cyanid-Testkit (Merck) analysiert. Stickstoff wurde durch das Kjeldahl-Verfahren bestimmt. HMGA wurde unter Verwendung einer Gaschromatographie-Massenspektrometrie bestimmt.

Industrielle Anwendbarkeit

Der von Flachssamen stammende Komplex dieser Erfindung besitzt eine industrielle Anwendbarkeit im Bereich der Nutrazeutika. Er kann in Form von Tabletten oder Kapseln zum menschlichen Verbrauch verwendet werden und kann auch in formulierte Nahrungsmittel als eine Funktionsnahrung eingebracht werden.

Claims

1. Verfahren zum Gewinnen eines im Wesentlichen reinen, von Flachs stammenden Komplexes, wobei der Komplex Secoisolariciresinol-Diglucosid, Zimtsäure-Glycoside und Hydroxymethylglutarsäure enthält, welches umfasst: Gewinnen eines wässrigen, aliphatisch alkoholischen Extrakts aus Flachssamen oder Flachssamenmehl und Ultrafiltrieren dieses wässrigen Extrakts, wobei niedermolekulare Spezies mit einem Filtrat verbleiben und Spezies mit höheren Molekulargewicht, umfassend den abgetrennten Komplex, zurückgehalten werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Ultrafiltration für einen Größenausschluss von etwa 30 000 Dalton oder größer durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin der Größenausschluss im Bereich von etwa 30 000 bis 100 000 Dalton liegt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin die Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran durchgeführt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, worin das den Komplex enthaltende Retentat aus der Ultrafiltration aufkonzentriert wird, um ein flüssiges Konzentrat zu bilden.

6. Verfähren nach einem der Ansprüche 1-4, worin das den Komplex enthaltende Retentat aus der Ultrafiltration getrocknet wird, um ein trockenes Pulver zu bilden.

7. Verfahren nach Anspruch 5, worin das Retentat weiter fraktioniert wird unter Verwendung einer Säule, die einen festen Träger aus Größenausschluss- oder Gelpermeations-Harzen enthält.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die Fraktion aus den Größenausschluss- oder Gelpermeations-Harzen, die den Komplex enthält, aufkonzentriert wird, um ein flüssiges Konzentrat zu bilden.

9. Verfahren nach Anspruch 7, worin die Fraktion aus den Größenausschluss- oder Gelpermeations-Harzen, die den Komplex enthält, getrocknet wird, um ein trockenes Pulver zu bilden.

10. Verfahren zum Gewinnen eines im Wesentlichen reinen, von Flachs stammenden Komplexes, wobei der Komplex Secoisolariciresinol-Diglucosid, Zimtsäure-Glycoside und Hydroxymethylglutarsäure enthält, welches umfasst: Gewinnen eines wässrigen, aliphatisch alkoholischen Extrakts aus Flachssamen oder Flachssamenmehl und Fraktionieren dieses wässrigen, Extrakts auf einer Säule, enthaltend einen festen Träger aus Größenausschluss- oder Gelpermeations-Harzen, wobei eine höhermolekulare Spezies von Spezies mit geringem Molekulargewicht getrennt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin die Fraktion aus der Fraktionierung, die den Komplex enthält, aufkonzentriert wird, um ein flüssiges Konzentrat zu bilden.

12. Verfahren nach Anspruch 10, worin die Fraktion aus der Fraktionierung, die den Komplex enthält, getrocknet wird, um ein trockenes Pulver zu bilden.

13. Im Wesentlichen reiner Komplex, der aus Flachssamen stammt und der Secoisolariciresinol-Diglucosid, Zimtsäure-Glycoside und Hydroxymethylglutarsäure enthält, wobei der Komplex ein Molekulargewicht von mindestens 30 000 besitzt.

14. Komplex nach Anspruch 13 mit einem Molekulargewicht im Bereich von 30 000 bis 100 000.

15. Komplex nach Anspruch 13 in Form eines flüssigen Konzentrats.

16. Komplex nach Anspruch 13 in Form eines trockenen Pulvers.