-
Die Erfindung bezieht sich auf ein
Reinigungsverfahren eines Anthozyane enthaltenden Extrakts aus roten
Früchten.
Sie betrifft auch den durch das Verfahren gewonnenen Extrakt sowie
seine Verwendung.
-
In der weiteren Beschreibung und
in den Patentansprüchen
werden mit «roten
Früchten» insbesondere
die Holunderbeeren (Sambucus nigra), die schwarzen Johannisbeeren
(Ribes nigrum), die roten Johannisbeeren (Ribes rubrum), die Brombeeren
(Morus nigra), die Trauben (Vitis vinifera) und im engeren Sinne
die Heidelbeeren (Vaccinium myrtillus und andere Arten der Gattung
Vaccinium) bezeichnet, ohne dass damit eine Einschränkung verbunden
wäre.
-
Allgemein bezeichnet man mit "Anthozyanen"
ein Heterosid aus der Verbindung eines anthozyanen Aglykons mit
einer oder mehreren Monosaccharidgruppen. Die Anthozyane gibt es
in Form von Monomeren, aber auch als Diniere, Oligomere und Polymere,
je nach wachsendem Polymerisierungsgrad. Die Anthozyan-Anthozyan-Verbindung
erfolgt zwischen dem C4 des C-Kerns und dem C8 des A-Kerns.
-
Im vorliegenden Fall bezeichnen die
Anthozyane die monomeren Strukturen, deren Molekulargewicht zwischen
400 und 600 Dalton schwankt. Einige Dimerformen, deren Molekulargewicht
ca. 1000 Dalton erreichen kann, können ebenfalls präsent sein.
-
Die roten Früchte sind reich an Anthozyane
genannten Pigmenten, deren Wirkung auf die Feinzirkulation des Blutes
nachgewiesen wurde, insbesondere als Vitamin P-Faktor, Antioxidans, Wirkstoff
gegen Thrombozytenaggregation und gegen freie Radikale. Diese Eigenschaften
fanden Anerkennung für
die Behandlung von Störungen
des Retinakreislaufs, bei der Behandlung von funktionellen Störungen der
Kapillarfragilität
und der gefäßbedingten
Sehstörungen.
Sie werden auch von dem Pharmaunternehmen LEURQUIN MEDIOLANUM in
pharmazeutischen Spezialitäten,
die unter den Markennamen DIFRAREL® 100
und DIFRAREL® E
vertrieben werden, für
die Behandlung der Nachtblindheit und der Kurzsichtigkeit genutzt.
-
Für
die Extraktion von Anthozyanen aus Pflanzen oder Pflanzenteilen
wurden mehrere Verfahren vorgeschlagen.
-
Das Patent FR-A-2 299 385 beschreibt
ein Verfahren für
die Extraktion von Anthozyanen aus Traubentrester mit der eigentlichen
Extraktionsstufe und der anschließenden Konzentration des gewonnenen
Extrakts.
-
Nach diesem Verfahren besteht die
Extraktionsstufe aus einer Behandlung des Tresters mit einer sauren
wässrigen
Extraktionslösung
(pH = 2) unter Zusatz von erwärmtem
SO2 (zwischen 40 und 55°C). Die dabei entstehende klare
Lösung
enthält
Anthozyane, aber auch Säuren,
Salze, Polyphenole und Proteine; sie wird anschließend konzentriert.
Dazu wird sie auf ein Harz geladen. Das Harz wird dann mit einer
Elutionslösung, die
wahlweise ein Keton, ein Amid oder eine wässrige Lösung aus einem Alkali- oder
Erdalkalihydroxid enthält, eluiert.
Die Anthozyane werden schließlich
vom erzielten Eluat getrennt.
-
Aus den beschriebenen Beispielen,
insbesondere aus Beispiel 1, geht hervor, dass man aus einem Extrakt
mit 120 mg Anthozyane pro Liter nach der Verharzung einen Extrakt
mit 800 mg Anthozyanen pro Liter erhält, d. h. einen 6,6 mal höher konzentrierten
Extrakt.
-
Aber auch wenn das eingesetzte Verfahren
die Anthozyankonzentration im Extrakt deutlich erhöht, sagt
die Konzentration nichts über
eine Reinigung der Anthozyane aus.
-
Außerdem und vor allem führt die
anfängliche
Extraktion der Anthozyane durch ein mit SO2 versetztes Lösungsmittel
zu einer Fixierung der Anthozyane am Harz in veränderter Form und demzufolge
zu einer möglichen
Beeinträchtigung
der physikalischchemischen Eigenschaften des Anthozyans und damit
seiner Aktivität.
-
In jüngerer Zeit wurde in der EP-A-412
300 ein Verfahren für
die Extraktion mit anschließender
Reinigung von Anthozyanen aus Heidelbeeren vorgeschlagen.
-
Bei der eigentlichen Extraktion werden
gefrorene Produkte mit einer wässrigen
Methanollösung
in Kontakt gebracht, wobei jeder Extraktionsschritt vier Stunden
dauert.
-
Das gewonnene Extrakt wird dann gereinigt.
Dazu wird es zunächst
im Vakuum konzentriert, und das erzielte Konzentrat wird dann mit
Natriumbisulfit versetzt. Es entsteht dann eine Bindung zwischen
den Anthozyanen und den Bisulfitionen. Nach dreistündigem Rühren und
Neutralisierung durch Zugabe einer Natriumhydroxidlösung wird
das erhaltene Extrakt auf eine Säule
eines nicht ionogenen Polymerharzes geladen; dann wird die Säule mit
gereinigtem Wasser eluiert. Das Eluat wird dann durch konzentrierte
Salzsäure
(HCl) auf pH = 1 gesäuert.
Um das SO2 zu beseitigen, wird Stickstoff
durch die gewonnene Lösung
geblasen, um den Anthozyane-Bisulfit-Komplex zu trennen. Diese Trennung
führt zur
Freisetzung von Schwefeldioxid. Die wässrige Lösung wird dann mit Hilfe von
Butanol extrahiert. Die Butanollösung
wird mit 14 Volumenanteilen Ethylacetat versetzt. Nach einer Nacht
Ruhe wird das Präzipitat
bei 40°C
getrocknet.
-
Wie zuvor erfordert dieses Verfahren
auch hier den Einsatz von Bisulfitionen, die zur Bildung eines Anthozyan-Bisulfit-Komplexes
führen,
durch den die physikalisch-chemischen Eigenschaften der gesuchten
Anthozyane beeinträchtigt
werden können.
-
Außerdem führt der Rückgriff auf Stickstoff für die Regeneration
der Anthozyane zur Freisetzung von Schwefeldioxid, das Umweltprobleme
hervorrufen und aufwendige Abfallbehandlungen erfordern kann.
-
Zu betonen ist auch die Vielzahl
der verwendeten Lösungsmittel
(Methanol, Butanol, Ethylacetat) und die aufwendigen chemischen
Behandlungen bei diesem Extraktionsverfahren: Einsatz von SO2, NaOH, Säuerung auf pH = 1 durch konzentriertes
HCl und Gebrauch von Stickstoff.
-
Aus der FR 2641983 ist ein Verfahren
für die
Extraktion von farbgebenden Stoffen bekannt, im engeren Sinne ein
Extraktionsverfahren der Anthozyane von Fruchtbeeren (Heidelbeeren,
schwarze Johannisbeeren oder Preiselbeeren), die insbesondere den
Einsatz eines superkritischen, schwach polaren Lösungsmittels erfordern, das
später
destilliert wird. Der Extraktionsrest wird mit den üblichen
physikalischen Mitteln gereinigt, insbesondere durch Chromatographie
auf einer Polyamidsäule
bei anschließender
Elution mit Hydrochlormethanol.
-
Die derart gewonnenen Anthozyane,
insbesondere diejenigen der Heidelbeere, sind Arzneimittelwirkstoffe.
-
Ausgehend von diesem Stand der Technik
betrifft die Erfindung ein Verfahren für die Reinigung eines Extrakts
aus Anthozyane enthaltenden roten Früchten, das geeignet ist, die
folgenden Probleme zu lösen:
-
- – Verzicht
auf den Einsatz von Additiven des Typs SO2,
von denen die Struktur und die physikalisch-chemischen Eigenschaften
der extrahierten Anthozyane verändert
werden können;
- – Vermeidung
jeglicher Freisetzung von Schadstoffen und insbesondere von Schwefeldioxid;
- – Steigerung
der Anthozyankonzentration des gewonnenen gereinigten Extrakts;
- – Durchführung einer
Reinigung ohne strukturelle Änderung
der Anthozyane;
- – Maximale
Reduzierung der im gereinigten Extrakt enthaltenen Restlösungsmittelmenge;
- – Gewinnung
eines Extrakts, in dem die Restlösungsmittel
eindeutig identifiziert sind, wobei deren geringe Menge die ICH- Vorgaben (International
Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration
of Pharmaceuticals for Human Use) erfüllt.
-
Um dies zu erreichen, ist der Gegenstand
der Erfindung ein Verfahren zur Reinigung eines Anthozyane enthaltenden
Extrakts aus roten Früchten,
wobei:
-
- – der
besagte Extrakt einer wässrigen
Lösung
zugesetzt wird;
- – anschließend der
wässrige
Extrakt bis auf eine homogene Temperatur unter 15°C abgekühlt wird;
- – nach
dem Filtern des wässrigen
Extrakts das gewonnene Permeat entnommen und auf ein zu Riesenmolekülen vernetztes
Polymerharz geladen wird;
- – das
Harz anschließend
mit entmineralisiertem Wasser gespült wird;
- – das
erzielte Harz dann mit einer alkoholischen Elutionslösung herausgelöst wird;
- – das
gewonnene Eluat konzentriert und dann getrocknet wird.
-
Auf diese Art und Weise, unter Verzicht
auf Lösungsmittel
mit SO2-Zusatz, führt das unter "sanften" Bedingungen
durchgeführte
Reinigungsverfahren der Erfindung zu keinerlei Änderung der nativen physikalisch-chemischen
Eigenschaften, d. h. zu keiner Denaturierung der extrahierten Anthozyane.
Dieses Merkmal kann durch die Überdeckung
der chromatographischen HPLC-Profile in Abhängigkeit von der Rückhaltezeit des
Extrakts einerseits und der roten Ausgangsfrucht andererseits bestätigt werden.
-
Außerdem ist festzustellen, dass
die Kombination der einzelnen Verfahrensschritte, insbesondere die Kühlstufe
mit anschließender
Filtration und Aufharzung, auf ganz und gar überraschende Weise dazu führt, dass
der extrahierte Anthozyantiter im letztlichen Trockenextrakt beträchtlich
zunimmt. Bei einer Temperatur des wässrigen Extrakts von mehr als
15°C kommt
es nicht zu einer ausreichenden Reinigung der Anthozyane.
-
In einer ersten Ausführungsform
der Erfindung erfolgt das Reinigungsverfahren an einem alkoholischen
Extrakt aus roten Früchten,
der in folgenden Schritten gewonnen wird:
-
- – man
trennt zunächst
das Fruchtfleisch von den ganzen roten Früchten;
- – man
bringt dann das Fruchtfleisch in Kontakt mit einer alkoholischen
Extraktionslösung;
- – man
trennt die Festphase von der Flüssigphase;
- – man
lässt abschließend den
Hauptanteil des in der Flüssigphase
enthaltenen Restalkohols im Vakuum verdampfen, um ein alkoholisches
Konzentrat zu erzielen.
-
Vorteilhafterweise stammt das bei
der alkoholischen Extraktion eingesetzte Lösungsmittel aus der Gruppe,
zu der Methanol, Ethanol, Butanol, Aceton gehören.
-
In der Praxis erfolgt die alkoholische
Extraktion bei Raumtemperatur in mindestens zwei aufeinanderfolgenden
Schritten von jeweils 20 Minuten. Das Lösungsmittel wird dann verdampft.
Außerdem
kann die Extraktion der Anthozyane nicht allein aus dem Fruchtfleisch,
sondern aus ganzen Früchten
vorgesehen werden.
-
Die Trennung der festen Phase und
der Flüssigphase
kann zudem durch beliebige bekannte Mittel, insbesondere durch Zentrifugieren,
erfolgen.
-
Nach einer zweiten Ausführungsform
der Erfindung erfolgt das Reinigungsverfahren aus Extrakten von
im Handel erhältlichen
roten Früchten
oder aus dem Extrakt von vorgereinigten Anthozyanen, die jeweils in
flüssiger
Form oder als Pulver vorliegen. In diesem Fall kann der Fruchtextrakt
oder der vorgereinigte Extrakt vor dem Reinigungsschritt wahlweise
mit Alkohol, insbesondere Methanol, oder mit Wasser versetzt werden.
-
In dem erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren
erfolgt das Abkühlen
des Rotfruchtextrakts vorteilhafterweise, bis die Temperatur des
Extrakts homogen ist und weniger als 10°C - vorzugsweise weniger als 5°C - beträgt, wobei
diese Temperatur mindestens zwölf
Stunden lang aufrechterhalten wird.
-
Die Filtration des wässrigen
Extrakts kann ihrerseits mit einem Zellulosefilter, einem rostfreien
Metalldrahtgewebe mit einer Trennschwelle zwischen 0 und 100 Mikrometer
oder Gleichwertigem erfolgen.
-
Wie bereits, gesagt, wird das Permeat
aus der Filtrationsstufe dann auf ein adsorbierendes, zu Riesenmolekülen vernetztes
Harz geladen.
-
Um den Titer und die Anthozyankonzentration
im Endextrakt noch weiter zu steigern, ist die alkoholische Lösung, mit
der die Anthozyane aus dem Harz eluiert werden, vorzugsweise eine
wässrige
Ethanollösung,
wobei die Ethanolkonzentration zwischen 10 und 90%, vorteilhafterweise
bei 40%, liegt.
-
Das gewonnene Eluat wird unter auf
ca. 30°C
kontrollierter Temperatur konzentriert und dann durch Gefriertrocknen
oder auch durch Zerstäubung
getrocknet, um ein Pulver zu erhalten.
-
Im Übrigen ist festzustellen, dass
das erhaltene Pulver eine sehr geringe Restmenge an alkoholischem
Lösungsmittel
enthält,
weniger als 3000 ppm bei Methanol (wenn die Reinigung ausgehend
von einem Methanolextrakt erfolgt) und weniger als 2000 ppm bei
Ethanol. Diese Lösungsmittelreste
werden durch GC identifiziert und sind die einzigen, die im Endpulver
enthalten sind.
-
Die Erfindung bezieht sich auch auf
den Extrakt, der durch das vorstehend beschriebene Reinigungsverfahren
gewonnen werden kann.
-
Außerdem kann der Extrakt aufgrund
seines hohen Originalanthozyantiters und seines geringen Gehalts
an Lösungsmittelresten
für kosmetische,
pharmazeutische und diätetische
Verbindungen verwendet werden. Er kann auch in nutrazeutischen Verbindingen,
für funktionelle
Nahrungsmittel, angereicherte Nahrungsmittel und Nahrungsmittelzusätze genutzt
werden.
-
Die Erfindung und die davon abzuleitenden
Vorteile sind besser aus den nachfolgenden Ausführungsbeispielen mit den beigefügten Zeichnungen
zu ersehen. Es zeigen:
-
- – die 1 ist ein Vergleich eines
HPLC-Chromatogramms
des nach Beispiel 1 gewonnenen Endextrakts mit demjenigen
der Frucht und demjenigen des ursprünglichen Fruchtfleischs;
- – die 2 ist ein identischer Vergleich
ausgehend von dem nach Beispiel 2 gewonnenen Extrakt.
-
Die beiden folgenden Beispiele beziehen
sich auf die Extraktion von Anthozyanen aus Heidelbeerfruchtfleisch.
-
Beispiel 1
-
1/ Trennung des Fruchtfleischs
-
Auf beliebige bekannte Weise werden
125 Kilo Heidelbeeren aus Litauen ausgepresst. Nach dem Auspressen
wird das Fruchtfleisch (52,24 Kilo) vom Saft (71,48 Kilo)
getrennt.
-
2/ Extraktion
-
Man unternimmt dann nacheinander
zwei Extraktionen aus 35 Kilo Heidelbeerfruchtfleisch mit jeweils 210
Liter Methanol (d. h. 1 Volumenanteil Fruchtfleisch auf 6 Volumenanteile
Extraktionslösung)
während zwanzig
Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Extraktion wird das Fruchtfleisch
ausgepresst, um den Methanolanteil zurückzugewinnen. Das Methanol
wird dann im Vakuum verdampft, wobei die Temperatur des Extrakts
dann 22°C
beträgt.
-
3/ Reinigung
-
Man versetzt dann das Konzentrat
mit 70 Litern entmineralisiertem Wasser (d. h. 1 Volumenanteil
-
Fruchtfleisch für 2 Volumenanteile entmineralisiertes
Wasser).
-
Der derart gewonnene Flüssigextrakt
wird dann eine Nacht lang bei einer Temperatur unter 15°C gelagert.
-
Die Lösung wird dann auf einem rostfreien
Metalldrahtgewebe (50 Mikrometer) gefiltert.
-
Dann wird ein zu Riesenmolekülen vernetztes
Harz, z. B. das von ROHM & HAAS
vertriebene Harz XAD761, mit dem flüssigen Extrakt geladen. In
der Praxis werden 25 Liter Harz verwendet.
-
Wenn das Harz geladen ist, wird es
mit 105 Litern entmineralisiertem Wasser ausgespült (d. h. 1 Volumenanteil Fruchtfleisch
für 3 Volumenanteile
entmineralisiertes Wasser).
-
Das Harz wird dann mit 200 Liter
Ethanol 40 eluiert.
-
Das Eluat wird dann im Vakuum konzentriert,
worauf die Temperatur des Extrakts zwischen 26 und 31°C liegt.
-
Um ein Pulver zu erhalten, wird das
Eluat dann zerstäubt.
-
Der Anthozyangehalt des Endextrakts
beträgt
50.46 % des Endgewichts, d. h. 53.50% Gewichtsanteil Trockenmasse.
-
Diese Ergebnisse werden im Verhältnis zum
Cyanidinchlorid, dem betreffenden Standard für die HPLC-Analyse (Artikelnr.
0909S, Lieferant: Extrasynthese), ausgedrückt.
-
Die Lösungsmittelrestmenge im Endextrakt
beträgt:
-
- – 0
ppm bei Butanol,
- – weniger
als 3000 ppm bei Methanol,
- – weniger
als 2000 ppm bei Ethanol.
-
Auf der 1 sind die Ergebnisse eines HPLC-Chromatogramms des
Endextrakts (1) gegenüber demjenigen
der ursprünglichen
Frucht (2) und des Fruchtfleischs (3) dargestellt.
-
Wie dieses Chromatogramm zeigt, ist
das Profil der extrahierten Anthozyane identisch mit demjenigen der
im Fruchtfleischs bzw. in der ursprünglichen Frucht vorhandenen
nativen Anthozyane, was vermuten lässt, dass die physikalisch-chemischen
Eigenschaften der Anthozyane bei dem Extraktions- und Reinigungsverfahren
nicht beeinträchtigt
werden.
-
Man kann daher annehmen, dass das
gewonnene Extrakt, dessen Anthozyanzusammensetzung mit derjenigen
der Originalfrucht identisch ist, alle anerkannten Qualitäten der
Frucht bewahrt.
-
Beispiel 2
-
Vorgehen wie im Beispiel 1, diesmal
mit einer zweiten, aus Polen stammenden Heidelbeercharge.
-
Festzustellen ist, dass die erzielte
Anthozyankonzentration 49,1% Gewichtsanteile des Endextrakts, d.
h. 52,01% Gewichtsanteile Trockenmasse, ausmacht.
-
Die Lösungsmittelrestmenge beträgt:
-
- – 0
ppm bei Butanol,
- – weniger
als 3000 ppm bei Methanol,
- – weniger
als 2000 ppm bei Ethanol.
-
Wie zuvor, zeigt die 2 das HPLC-Chromatogramm des Fruchtfleischs, der
Frucht und des gewonnenen Extrakts.
-
Es ist gleichfalls festzustellen,
dass das Profil der im Extrakt (4) enthaltenen Anthozyane
demjenigen der Anthozyane im Fruchtfleisch (5) und in der
Frucht (6) entspricht.
-
Vergleichsbeispiel 3
-
In diesem Beispiel wurden verschiedene
Merkmale von handelsüblichen
Heidelbeerextrakten, nämlich:
-
- – ein
von der Firma INDENA unter dem Namen ANTHOCYANOSIDE vertriebener
Heidelbeerextrakt
- – und
ein zweiter Heidelbeerextrakt, der von der Firma VINYALS unter dem
Namen BILBERRY DRY EXTRACT (25% Anthozyane) vertrieben
wird,
-
mit einem nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellten Exrakt verglichen.
-
Beurteilte Kriterien:
-
- – die
durch HPLC berechnete Anthozyankonzentration gegenüber einem
Cyanidinchlorid-Standard;
- – die
Lösungsmittelrestmenge
im Endextrakt.
-
Die Ergebnisse sind in der folgenden
Tabelle zusammengefasst.
-
Wie die Tabelle zeigt, erhält man mit
dem erfindungsgemäß gewonnen
Extrakt im Vergleich mit den handelsüblichen Extrakten eine sehr
hohe Anthozyankonzentration.
-
Festzuhalten ist auch eine sehr geringe
Restmenge an organischem Lösungsmittel.
-
Letztlich: während in den Spezifikationen
der INDENA- und VINYALS-Extrakte keine Aussagen zum chromatographischen
Profil gemacht werden, ist festzustellen, dass das Chromatographieprofil
des erfindungsgemäßen Extrakts
mit demjenigen der Originalfrucht deckungsgleich ist.
-
Die Vorteile der Erfindung im Hinblick
auf die Wiedergabe der nativen Fruchtanthozyane im Extrakt gehen
aus der Beschreibung deutlich hervor.
-
Hinzuweisen ist insbesondere auf
den Gebrauch herkömmlicher
Extraktionslösungsmittel,
die im Laufe des Verfahrens kontinuierlich eliminiert werden, so
dass im gewonnen Extrakt nur noch Spuren von Restlösungsmitteln
vorliegen.
-
Ebenso erfordert das Verfahren keine
Zusatzmittel des Typs SO2 zu den Extraktionslösungsmitteln oder
den Einsatz von chemischen Verbindungen, deren Beseitigung sehr
schwierig ist und eine Reihe von Umweltproblemen aufwirft.
-
Ansonsten ist festzuhalten, dass
die Anthozyane während
des Verfahrens nicht denaturiert werden und die Zusammensetzung
der Originalfrucht bewahren, wodurch das gesamte Wirkspektrum erhalten
bleibt.
-
Zu unterstreichen ist schließlich die
Anthozyankonzentration des gewonnenen Extrakts, die bei 50% Trockenmassegewicht
liegt.