DE60000665T3

DE60000665T3 - Lang wirkende peptidinhibitoren der virusfusion mit körperzellen bei viralen infektionen

Info

Publication number: DE60000665T3
Application number: DE60000665T
Authority: DE
Inventors: Dominique P. Outremont Bridon; Robert S. Dufresne; Nissab Dorval Boudjellab; Martin Montreal Robitaille; Peter G. Milner
Original assignee: ConjuChem Biotechnologies Inc
Current assignee: CONJUCHEM BIOTECHNOLOGIES INC., MONTREAL, QUEBEC,
Priority date: 1999-05-17
Filing date: 2000-05-17
Publication date: 2009-10-29
Anticipated expiration: 2020-05-18
Also published as: ATE226593T1; ATE443714T1; ES2185595T5; US7608271B2; JP2009167208A; DK1264840T3; US7582301B1; EP1179012B1; ES2185595T3; US20080176794A1; DE60000665T2; JP2002544287A; JP4216480B2; ES2334106T3; EP1264840B1; HK1053128A1; AU5027100A; DE60000665D1; WO2000069902A1; EP1179012B9

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von modifizierten Peptiden, welche Inhibitoren von viraler Aktivität bzw. Wirkung sind und antifusogene Eigenschaften zeigen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von modifizierten Peptid-Inhibitoren gegen das humane Immundefizienz-Virus (HIV), das humane Atmungssyncytial-Virus (RSV), das humane Parainfluenza-Virus (HPV), das Masern-Virus (MeV) und das Affen-Immundefizienz-Virus (SIV) mit langer Wirkungsdauer für die Behandlung der jeweiligen viralen Infektionen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Membranfusionsvorkommen, obwohl sie in normalen zellbiologischen Prozessen herkömmlich sind, sind auch in eine Vielfalt von Krankheitszuständen verwickelt, einschließlich beispielsweise das Eintreten von eingehüllten Viren in Zellen. Es sind Peptide bekannt, welche mit Membranfusion verbundene Vorkommnisse inhibieren oder anders unterbrechen, einschließlich beispielsweise die Inhibierung retroviraler Übertragung auf uninfizierte Zellen. Als ein Beispiel sind die synthetischen Peptide DP-107 und DP-178, abgeleitet aus separaten Bereichen innerhalb des humanen Immundefizienz-Virus Typ 1 (”HIV-1”)-Transmembran-(”TM”)-Glycoproteins gp41, potente Inhibitoren gegen HIV-1-Infektion und eine HIV-induzierte Zell-Zell-Fusion.
Lambert et al., ”Peptides from Conserved Regions of Paramyxovirus Fusion (F) Proteins are Potent Inhibitors of Viral Fusion”, Proc. Natl. Acad. Science USA, 5. März 1996, Bd. 93 (5), Seiten 2186–2191, offenbart, dass die synthetischen Peptide DP-107 und DP-178 (T-20), abgeleitet aus separaten Bereichen innerhalb des humanen Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1)-Transmembran-(TM)-Proteins gp41, potente Inhibitoren gegen HIV-1-Infektion und -Fusion sind. Unter Verwendung einer computergestützten Untersuchungsstrategie (computergestützte Antivirus-Untersuchungstechnologie (C. A. S. T.), basierend auf der vorhergesagten Sekundärstruktur von DP-107 und DP-178 (T-20), identifizierten Lambert et al. konservierte Heptad-Wiederholungsbereiche, welche analog zu den DP-107- und DP-178-Bereichen von HIV-1 gp41 innerhalb der Glycoproteine anderer fusogener Viren sind. Antivirale Peptide, abgeleitet von drei repräsentativen Paramyxoviren, Atmungssyncytial-Virus (RSV), humanes Parainfluenza-Virus-Typ 3 (HPIV-3) und Masern-Virus (MV) blockierten homologe, Virus-vermittelte Syncytia-Bildung und zeigten EC₅₀-Werte im Bereich von 0,015–0,250 μM. Darüber hinaus sind diese Peptide auf das Ursprungsvirus hoch selektiv.
Die US-PSen 6,013,263 , 6,017,536 und 6,020,459 , welche hier vollständig eingebracht sind, offenbaren ebenfalls, dass das 36-Aminosäuren-Peptid DP178, entsprechend den Aminosäuren 638 bis 673 von gp41 aus dem HIV-1-Isolat LAI (HIV-1_LAI), und das 38-Aminosäuren-Peptid DP107, entsprechend den Aminosäuren 558–595 von gp41 aus HIV-1_LAI, beide eine potente Anti-HIV-1-Wirkung zeigen.
Während viele antivirale oder antifusogene Peptide, die im Stand der Technik beschrieben sind, eine potente antivirale und/oder antifusogene Wirkung zeigen, leiden diese Peptide an einer kurzen in vivo Plasma-Halbwertszeit, hauptsächlich infolge rascher Serum-Clearance und Peptidase- und Protease-Aktivität. Das wiederum reduziert stark die wirksame antivirale Aktivität der Peptide. Es besteht daher ein Bedürfnis für ein Verfahren zur Verlängerung der Halbwertszeit existierender antiviraler und antifusogener Peptide und zur Bereitstellung einer längeren Wirkungsdauer dieser Peptide in vivo.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung erfüllt diese und weitere Bedürfnisse und ist auf die Verwendung modifizierter Peptide mit antiviraler Aktivität und antifusogener Aktivität gerichtet. Diese modifizierten Peptide liefern eine erhöhte Stabilität in vivo und eine verminderte Anfälligkeit auf Peptidase- oder Protease-Abbau. Diese modifizierten Peptide minimieren dadurch zum Beispiel die Notwendigkeit für häufigere oder sogar kontinuierliche Verabreichung der Peptide. Die Produkte verschiedener Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, beispielsweise als Prophylaxe gegen und/oder Behandlung von Infektionen einer Anzahl von Viren, einschließlich des Human-Immundefizienz-Virus (HIV), des humanen Atmungssyncytial-Virus (RSV), des humanen Parainfluenza-Virus (HPV), des Masern-Virus (MeV) und des Affen-Immundefizienz-Virus (SIV). Eine Modifizierung anderer Peptide, welche in viraler Transfektion involviert sind (z. B., Hepatitis, Epstein Barr und weitere verwandte Viren), liegt ebenfalls innerhalb im Umfang der Erfindung.
Die vorliegende Erfindung betrifft chemisch wirksame Modifikationen von Peptiden, welche antivirale und antifusogene Wirkung zeigen, so dass die modifizierten Peptide mit verfügbaren Funktionalitäten an Blutkomponenten unter Ausbildung stabiler kovalenter Bindungen reagieren. Die reaktive Gruppe ist ein Maleimid, das mit einer Thiolgruppe an einem mobilen Blutprotein, Albumin, reagieren kann. Dementsprechend liefert die Erfindung die Verwendung eines modifizierten antiviralen und antifusogenen Peptids zur Herstellung eines Medikamentes zur Vorbeugung und/oder Behandlung viraler Injektionen, wobei das modifizierte Peptid umfasst: ein Peptid, das antivirale und antifusogene Aktivität zeigt und eine Maleimidgruppe, welche mit einer Thiolgruppe an Serumalbumin unter Ausbildung einer stabilen kovalenten Bindung reagiert, wobei die Maleimidgruppe mit dem Peptid entweder ohne Verwendung einer Kopplungsgruppe oder über eine Kopplungsgruppe verbunden wird, welche (2-Amino)ethoxyessigsäure (AEA) oder [2-(2-Amino)ethoxy]ethoxyessigsäure (AEEA) ist, wobei das modifizierte Peptid in vivo ein antifusogenes Peptid-Maleimid-Albumin-Konjugat bildet.
Insbesondere betrifft die Erfindung solche chemisch reaktiven Modifikationen von DP107- und DP178-Peptiden und Analogen davon einschließlich Peptiden, bestehend aus Aminosäuresequenzen von anderen (nicht-HIV) Viren, welche dem gp41-Bereich von HIV entsprechen, von dem DP107 und DP178 abgeleitet sind und welche eine antivirale oder antifusogene Wirkung zeigen. Ganz besonders zeigen diese Peptide antivirale Wirkung gegen, unter anderem, humanes Immuninsuffizienz-Virus, humanes Immuninsuffizienz-Virus, humanes Atmungssyncytial-Virus (RSV), humanes Parainfluenza-Virus (HPV), Masern-Virus (MeV) und Affen-Immuninsuffizienz-Virus (SIV). Die Erfindung betrifft auch die Verwendung solcher chemisch reaktiven Modifikationen der Peptide der Sequenzen SEQ ID NR 1 bis SEQ ID NR 86. Insbesondere Peptide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NR. 1 bis SEQ ID NR. 9, SEQ ID NR. 10 bis SEQ ID NR. 30, SEQ ID NR. 31 bis SEQ ID NR. 62, SEQ ID NR. 63 bis SEQ ID NR. 73 oder SEQ ID NR. 74 bis SEQ ID NR. 86.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Zusammensetzungen zur Herstellung eines Medikamentes zur Prävention und/oder Behandlung viraler Infektion, wobei die Zusammensetzung das Peptid, das antivirale Aktivität zeigt, modifiziert mit einer wie beschriebenen reaktiven Gruppe, umfasst. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung solcher Zusammensetzungen zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von AIDS, humanem Atmungssyncytial-Virus (RSV), humanem Parainfluenza-Virus (HPV), Masern-Virus (MeV) und Affen-Immundefizienz-Virus (SIV).
KURZE BESCHREIBUNG DER TABELLEN
Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die Tabellen besser verstanden werden, worin:
Tabelle 1 die herkömmlich vorkommenden Aminosäuren zusammen mit ihren Abkürzungen aus einem und aus drei Buchstaben und übliche Schutzgruppen auflistet.
Tabelle 2 Carboxyschnitte von DP178 zeigt.
Tabelle 3 Aminoschnitte von DP178 zeigt.
Tabelle 4 Carboxyschnitte DP107 zeigt.
Tabelle 5 Aminoschnitte von DP107 zeigt.
Tabelle 6 Carboxyschnitte des Analogon von HIV-2_NIHZ-DP178 zeigt.
Tabelle 7 Aminoschnitte des Analogon von HIV-2_NIHZ-DP178 zeigt.
Tabelle 8 Carboxyschnitte des RSV F2-Bereichs des Analogon von DP107 zeigt.
Tabelle 9 Aminoschnitte des RSV F2-Bereichs des DP107-Analogon zeigt.
Tabelle 10 Carboxyschnitte des RSV F1-Bereichs des DP178-Analogon zeigt.
Tabelle 11 Aminoschnitte des RSV F1-Bereichs des DP178-Analogon zeigt.
Tabelle 12 Carboxyschnitte des HPV3 F1-Bereichs des DP178-Analogon zeigt.
Tabelle 13 Aminoschnitte des HPV3 F1-Bereichs des DP178-Analogon zeigt.
Tabelle 14 Carboxyschnitte des HPV3 F1-Bereichs des DP107-Analogon zeigt.
Tabelle 15 Aminoschnitte des PV3 F1-Bereichs des DP107-Analogon zeigt.
Tabelle 16 repräsentative Anti-RSV-Peptide zeigt.
Tabelle 17 repräsentative Anti-HPV3-Peptide zeigt.
Tabelle 18 repräsentative Anti-SIV-Peptide zeigt.
Tabelle 19 repräsentative Anti-MeV-Peptide zeigt.
KURZE BESCHREIBUNG DER SEQUENZLISTEN
Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die Sequenzlisten bes ser verstanden werden, worin:
SEQ ID NR 1 die Peptidsequenz von DP178 zeigt.
SEQ ID NR 2 die Peptidsequenz von DP107 zeigt.
SEQ ID NR 3–9 Peptidsequenzen von bestimmten DP178-Analoga zeigt.
SEQ ID NR 10–30 die Peptidsequenzen von RSV F1-Bereich und F2-Bereich, entsprechend DP178 und DP107, und repräsentative Anti-RSV-Peptide zeigen.
SEQ ID NR 31–62 die Peptidsequenzen von HPIV3 F1-Bereich, entsprechend DP178 und DP107, und repräsentative Anti-HPIV3-Peptide zeigen.
SEQ ID NR 63–73 Peptidsequenzen von SIV, entsprechend DP178, und repräsentative Anti-SIV-Peptide zeigen, und
SEQ ID NR 74–78 Peptidsequenzen von MeV, entsprechend DP178, und repräsentative Anti-MeV-Peptide zeigen.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Um ein vollständiges Verständnis der Erfindung sicherzustellen, werden die folgenden Definitionen angegeben:
Antivirale Peptide: Wie hier verwendet, sollen sich antivirale Peptide auf Peptide beziehen, welche eine virale Infektion von Zellen inhibieren, durch beispielsweise Inhibierung von Zell-Zell-Fusion oder freier Virusinfektion. Der Weg der Infektion kann eine Membranfusion beinhalten, wie sie im Falle von eingehüllten Viren auftritt oder irgendein anderes Fusionsvorkommnis, das virale und zelluläre Strukturen involviert. Peptide, welche virale Infektion durch einen bestimmten Virus inhibieren, können unter Bezugnahme auf diesen bestimmten Virus bezeichnet werden, zum Beispiel Anti-HIV-Peptid, Anti-RSV-Peptid, etc.
Antifusogene Peptide: Antifusogene Peptide sind Peptide, welche eine Fähigkeit zeigen, das Level der Membranfusionsvorkommnisse zwischen zwei oder mehr Einheiten zu inhibieren oder zu reduzieren, zum Beispiel Virus-Zelle oder Zelle-Zelle, relativ zu dem Level der Membranfusion, welche in Abwesenheit des Peptides auftritt.
HIV- und Anti-HIV-Peptide: Das humane Immundefizienz-Virus (HIV), das für das erworbene Immundefizienz-Syndrom (AIDS) verantwortlich ist, ist ein Mitglied der Lentivirusfamilie von Retroviren. Es gibt zwei vorherrschende Typen von HIV, HIV-1 und HIV-2 mit verschiedenen Stämmen, welche jeweils identifiziert worden sind. HIV zielt CD-4+-Zellen an und ein viraler Eintritt hängt von der Bindung des HIV-Proteins gp41 an CD-4+-Zelloberflächenrezeptoren ab. Anti-HIV-Peptide beziehen sich auf Peptide, welche antivirale Wirkung gegen HIV zeigen, einschließlich einer Inhibierung von CD-4+-Zellinfektion durch freie Viren und/oder Inhibierung von HIV-induzierter Syncytia-Bildung zwischen infizierten und nicht-infizierten CD-4+-Zellen.
SIV- und Anti-SIV-Peptide: (Simian)Affen-Immundefizienz-Viren (SIV) sind Lentiviren, welche Krankheiten, die ähnlich zum erworbenen Immundefizienz-Syndrom (AIDS) sind, in anfälligen Affen verursachen. Anti-SIV-Peptide sind Peptide, welche eine antivirale Aktivität gegen SIV zeigen, einschließlich der Inhibierung der Zellinfektion durch den SIV-Virus und eine Syncytia-Bildung zwischen infizierten und nicht-infizierten Zellen.
RSV- und Anti-RSV-Peptide: (Respiratory) Atmungssyncytial-Virus (RSV) ist ein respiratorisches Pathogen, das insbesondere gefährlich bei Säuglingen und Kleinkindern ist, wo sie Bronchiolitis (Entzündung der kleinen Luftwege) und Lungenentzündung hervorrufen können. RSV sind ”negativ-sense”, einsträngige RNA-Viren und Mitglieder der Paramyxoviridae-Familie von Viren. Der Infektionsweg von RSV verläuft typischerweise durch die Schleimhautmembranen durch den Atmungstrakt, das heißt Nase, Hals, Luftröhre und Bronchien und Bronchiolen. Anti-RSV-Peptide sind Peptide, welche eine antivirale Wirkung gegen RSV zeigen, einschließlich einer Inhibierung der Schleimhaut-Zellinfektion durch freies RSV-Virus und Syncytia-Bildung zwischen infizierten und nicht-infizierten Zellen.
HPV- und Anti-HPV-Peptide: Humanes Parainfluenza-Virus (HPIV oder HPV) ist, wie RSV, eine weitere leitende Ursache für Atmungswegeerkrankungen und, wie RSV-Viren, sind sie negativ-sense, einsträngige RNA-Viren, welche Mitglieder der Paramyxoviridae-Familie von Viren sind. Es gibt vier anerkannte Serotypen von HPIV,- HPIV-1, HPIV-2, HPIV-3 und HPIV-4-. HPIV-1 ist die wesentliche Ursache von Kinder-Krupp und sowohl HPIV-1 als auch HPIV-2 verursachen Erkrankungen der oberen und unteren Atmungswege. HPIV-3 ist häufiger mit Bronchiolitis und Lungenentzündung verbunden. Anti-HPV-Peptide sind Peptide, welche eine antivirale Aktivität gegen HPV zeigen, einschließlich einer Inhibierung der Infektion durch freie HPV-Viren und einer Syncytia-Bildung zwischen infizierten und nicht-infizierten Zellen.
MeV- und Anti-MeV-Peptide: Das Masern-Virus (VM oder MeV) ist ein eingehüllter, negativer, einsträngiger RNA-Virus aus der Paramyxoviridae-Familie von Viren. Wie RSV und HPV verursacht MeV Atemwegserkrankung und erzeugt auch eine Immunsuppression, welche für zusätzliche, opportune Infektionen verantwortlich ist. In einigen Fällen kann MeV eine Infektion des Gehirns etablieren, was zu ernsthaften neurologischen Komplikationen führt. Anti-MeV-Peptide sind Peptide, welche eine antivirale Wirkung gegen MeV zeigen, einschließlich der Inhibierung durch Infektion durch freie MeV-Viren und Syncytia-Bildung zwischen infizierten und nicht-infizierten Zellen.
DP-178 und DP178-Analoga: Wenn nicht anders erläutert oder sich aus dem Zusammenhang ergebend, bedeutet DP-178 das 36-Aminosäuren-DP-178-Peptid, entsprechend Aminosäureresten 638–673 des gp41-Glycoproteins des HIV-1-Isolates LAI (HIV_LAI) mit der folgenden Sequenz:
YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NR 1)
sowie Schnitte, Deletionen und/oder Insertionen davon. Schnitte des DP178-Peptids können Peptide von zwischen 3–36 Aminosäuren umfassen. Deletionen bestehen aus der Entfernung eines oder mehrerer Aminosäurereste aus dem DP178-Peptid und können die Entfernung eines einzigen fortlaufenden Abschnittes der Peptidsequenz oder mehrfache Bereiche umfassen. Insertionen bzw. Einfügungen können einzelne Aminosäurereste oder Stränge von Resten umfassen und können am Carboxyl- oder Aminoende des DP178-Peptids oder an einer Stelle innerhalb des Peptides durchgeführt werden.
DP178-Peptidanaloga sind Peptide, deren Aminosäuresequenzen aus Aminosäuresequenzen von Peptidbereichen von Viren zusammengesetzt sind, die verschieden von HIV-1_LAI sind, welche dem gp41-Bereich, aus welchem DP178 abgeleitet ist, entsprechen sowie aus einem Schnitt, einer Deletion oder Insertion davon. Solche anderen Viren können umfassen, sind aber nicht beschränkt auf andere HIV-Isolate, wie HIV-2_NIHZ, Atmungssyncytial-Virus (RSV), humanes Parainfluenza-Virus (HPV), Affen-Immundefizienz-Virus (SIV) und Masern-Virus (MeV). DP178-Analoga beziehen sich auch auf solche Peptidsequenzen, welche durch ALLMOTI5-, 107 × 178 × 4- und PLZIP-Suchmotive, wie sie in den US-PSen 6,013,263 , 6,017,536 und 6,020,459 beschrieben und hier eingebracht sind, identifiziert und erkannt werden, welche eine strukturelle und/oder Aminosäuren-Ähnlichkeit zu DP178 aufweisen. DP178-Analoga beziehen sich des Weiteren auf Peptide, welche als ”DP178-ähnlich” beschrieben sind, wie dieser Begriff in den US-PSen 6,013,263 , 6,017,536 und 6,020,459 definiert worden ist.
DP-107 und DP107-Analoga: Wenn nicht anders ausdrücklich oder im Zusammenhang angezeigt wird, bedeutet DP-107 das 38-Aminosäuren-DP-107-Peptid entsprechend Aminosäureresten 558–595 des gp41-Proteins vom HIV-1-Isolat LAI (HIV_LAI) mit folgender Sequenz:
NNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQ (SEQ ID NR 2)
sowie Schnitte, Deletionen und/oder Insertionen davon. Schnitte des DP107-Peptids können Peptide zwischen 3–38 Aminosäuren umfassen. Deletionen bestehen aus der Entfernung eines oder mehrerer Aminosäureresten aus dem DP107-Peptid und können die Entfernung eines einzelnen fortlaufenden Abschnitts der Peptidsequenz oder eines mehrfachen Bereichs entsprechen. Insertionen können einzelne Aminosäurereste oder Stränge von Resten umfassen und können am Carboxyl- oder Aminoende des DP107-Peptides oder einer Stelle innerhalb des Peptides erzeugt werden.
DP107-Peptidanaloga sind Peptide, deren Aminosäuresequenzen aus Aminosäuresequenzen von Peptidbereichen von Viren zusammengesetzt sind, welche verschieden von HIV-1_LAI sind, welche der gp41-Region entsprechen, von der DP107 abgeleitet wurde, sowie Schnitte, Deletionen und/oder Insertionen davon. Solche anderen Viren können umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf weitere HIV-Isolate, wie HIV-2_NIHZ-Atmungssyncytial-Virus (RSV), humanen Parainfluenza-Virus (HPV), Affen-Immundefizienz-Virus (SIV) und Masernvirus (MeV). DP107-Analoga beziehen sich auch auf jene Peptidsequenzen, welche durch ALLMOTI5-, 107 × 178 × 4- und PLZIP Suchmotive, beschrieben in den US-PSen 6,013,263 , 6,017,536 und 6,020,459 identifiziert und erkannt worden sind, mit strukturellen und/oder Aminosäuremotiven, die ähnlich zu DP107 sind. DP107-Analoga beziehen sich des Weiteren auf Peptide, welche als ”DP107-ähnlich” beschrieben sind, wie dieser Begriff in den US-PSen 6,013,263 , 6,017,536 und 6,020,459 definiert ist.
Reaktive Gruppen: Reaktive Gruppen sind chemische Gruppen, welche eine kovalente Bindung ausbilden können. Solche reaktive Gruppen sind an DP-107 oder DP-178-Peptide oder Analoga davon oder andere antivirale oder antifusogene Peptide von Interesse gekoppelt oder gebunden. Reaktive Gruppen werden im Allgemeinen in einem wässrigen Umfeld stabil sein, und werden Maleimid sein, wodurch sie zur Ausbildung einer kovalenten Bindung mit einer Funktionalität, die eine Thiolgruppe ist, an der Targetstelle von mobilen Blutkomponenten fähig sind.
Funktionalitäten: Funktionalitäten sind Gruppen an Blutkomponenten, an welche reaktive Gruppen an modifizierten, antiviralen Peptiden unter Ausbildung von kovalenten Bindungen reagieren. Funktionalitäten beinhalten Thiolgruppen zur Bindung an Maleimide.
Blutkomponenten: Blutkomponenten sind mobil. Mobile Blutkomponenten sind Blutkomponenten, welche keine festgelegte Stelle über jeglichen längeren Zeitraum aufweisen, im Allgemeinen nicht mehr als 5, üblicher nicht eine Minute überschreitend. Diese Blutkomponenten sind nicht membranverbunden und sind im Blut für längere Zeiten und in einer Minimalkonzentration von wenigstens 0,1 μg/ml vorhanden. Die mobile Blutkomponente ist Serumalbumin. Die Halbwertszeit von mobilen Blutkomponenten beträgt wenigstens 12 Stunden.

Schutzgruppen: Schutzgruppen sind chemische Einheiten, welche dazu verwendet werden, Peptidderivate von eigener Umsetzung zu schützen. Verschiedene Schutzgruppen sind hier und in der US-PS 5,493,007 offenbart, welche unter Bezugnahme darauf hier einverleibt ist. Solche Schutzgruppen umfassen Acetyl-, Fluorenylmethyloxycarbonyl(Fmoc)-, t-Butyloxycarbonyl(Boc)-, Benzyloxycarbonyl(CBZ)-Gruppen und dergleichen. Die speziellen geschützten Aminosäuren sind in Tabelle 1 dargestellt.

TABELLE 1
Natürliche Aminosäuren und ihre Abkürzungen
Name	3-Buchstaben-Abkürzung	1-Buchstaben-Abkürzung	Modifizierte Aminosäuren
Alanin	Ala	A	Fmoc-Ala-OH
Arginin	Arg	R	Fmoc-Arg(Pbf)-OH
Asparagin	Asn	N	Fmoc-Asn(Trt)-OH
Asparginsäure	Asp	D	Asp(tBu)-OH
Cystein	Cys	C	Fmoc--Cys(Trt)
Glutaminsäure	Glu	E	Fmoc-Glu(tBu)-OH
Glutamin	Gln	Q	Fmoc-Gln(Trt)-OH
Glycin	Gly	G	Fmoc-Gly-OH
Histidin	His	H	Fmoc-His(Trt)-OH
Isoleucin	Ile	I	Fmoc-Ile-OH
Leucin	Leu	L	Fmoc-Leu-OH
Lysin	Lys	Z	Boc-Lys(Aloc)-OH
Lysin	Lys	X	Fmoc-Lys(Aloc)-OH
Lysin	Lys	K	Fmoc-Lys(Mtt)-OH
Methionin	Met	M	Fmoc-Met-OH
Phenylalanin	Phe	F	Fmoc-Phe-OH
Prolin	Pro	P	Fmoc-Pro-OH
Serin	Ser	S	Fmoc-Ser(tBu)-OH
Threonin	Thr	T	Fmoc-Thr(tBu)-OH
Tryptophan	Trp	W	Fmoc-Trp(Boc)-OH
Tyrosin	Tyr	Y	Boc-Tyr(tBu)-OH
Valin	Val	V	Fmoc-Val-OH

Linkergruppen: Linker(Abstands-)gruppen sind chemische Einheiten, welche reaktive Einheiten mit antiviralen und antifusogenen Peptiden verbinden. Linkergruppen können die Polyethoxyaminosäuren AEA ((2-Amino)ethoxyessigsäure) oder vorzugsweise eine Linkergruppe AEEA ([2-(2-Amino)ethoxy)]ethoxyessigsäure) sein.
Empfindliche funktionelle Gruppen: Eine empfindliche funktionelle Gruppe ist eine Gruppe von Atomen, welche eine potentielle Reaktionsstelle auf einem antiviralen und antifusogenen Peptid darstellt. Falls vorhanden, kann eine empfindliche funktionelle Gruppe als Bindungspunkt für die Bindungsreaktivgruppen-Modifizierung ausgewählt sein. Empfindliche funktionelle Grup pen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Carboxyl-, Amine-, Thiol- und Hydroxylgruppen.
Modifizierte Peptide: Ein modifiziertes Peptid ist ein antivirales und antifusogenes Peptid, welches durch Anbindung einer reaktiven Gruppe modifiziert worden ist. Die reaktive Gruppe kann an das Peptids entweder durch eine Bindungs- bzw. Linkergruppe oder wahlweise ohne eine Linkergruppe angebunden sein. Es wird auch in Betracht gezogen, dass eine oder mehrere Aminosäuren an das Peptid angebunden sind, um die Anbindung der reaktiven Einheit zu erleichtern. Modifizierte Peptide können in vivo verabreicht werden, so dass eine Konjugation mit Blutkomponenten in vivo auftritt oder sie können zuerst mit den Blutkomponenten in vitro konjugiert werden und das resultierende konjugierte Peptid (wie unten definiert) wird in vivo verabreicht.
Konjugierte Peptide: Ein konjugiertes Peptid ist ein modifiziertes Peptid, das mit einer Blutkomponente über eine kovalente Bindung, welche zwischen der reaktiven Gruppe des modifizierten Peptides und den Funktionalitäten der Blutkomponenten, mit oder ohne eine Linkergruppe, ausgebildet worden ist. Wie bei dieser Anmeldung verwendet wurde, kann der Begriff ”konjugiertes Peptid” spezifischer gemacht werden, um auf besondere konjugierte Peptide hinzuweisen, beispielsweise ”konjugiertes DP178” oder ”konjugiertes DP107”.
In Anbetracht dieser Definitionen zieht die vorliegende Erfindung Nutzen aus den Eigenschaften existierender antiviraler und antifusogener Peptide. Die Viren, welche durch die Peptide inhibiert werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf alle Stämme von Viren, welche beispielsweise in den US-PSen 6,013,263 , 6,017,536 und 6,020,459 in den Tabellen V–VII und IX–XIV aufgelistet sind. Diese Viren umfassen beispielsweise humane Retroviren, umfassend HIV-1, HIV-2, und humane T-Lymphocyten-Viren (HTLV-I und HTLV-II), und nicht-humane Retroviren, umfassend Rinderleukose-Virus, felines Sarcoma-Virus, felinen Leukämie-Virus, Affen-Immundefizienz-Virus (SIV), Affen-Sarcoma-Virus, Affen-Leukämie und das fortschreitenden Lungenentzündungsvirus vom Schaf. Nicht-retrovirale Viren können ebenfalls durch die Peptide der vorliegenden Erfindung inhibiert werden, einschließlich des humanen Atmungssyncytial-Virus (RSV), Kaninchen-Distempervirus, Newcastle-Disease-Virus, des humanen Parainfluenza-Virus (HPIV), Influenza-Viren, Masern-Viren (MeV), Epstein-Barr-Viren, Hepatitis-B-Viren und Affen-Mason-Pfizer-Viren. Nicht-eingehüllte Viren können ebenfalls durch die Peptide der vorliegenden Erfindung inhibiert werden und umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Picornaviren, wie Polioviren, Hepatitis-A-Virus, Enteroviren, Echoviren, Coxsackie-Viren, Papovaviren, wie Papilloma-Virus, Parvoviren, Adenoviren und Reoviren.
Als ein Beispiel wurde der Wirkungsmechanismus von HIV-Fusionspeptiden beschrieben, wie in dem Abschnitt ”Hintergrund der Erfindung” dieser Anmeldung diskutiert, und antivirale und antifusogene Eigenschaften dieser Peptide wurden gut nachgewiesen. Ein synthetisches Peptid, das der Carboxyl-ständigen Ectobereich-Sequenz entspricht (beispielsweise Aminosäurereste 643–678 von HIV-1-Klasse B des LAI-Stamms oder Reste 638–673 vom gleichen Stamm sowie Reste 558–595) zeigte eine Virus-vermittelte Zell-Zell-Fusion vollständig bei niedriger Konzentration. Das Fusionspeptid kompetitiert mit dem Leucin-Zipperbereich des nativen viralen gp41, was in der Störung bzw. Interferenz der Fusion/Infektion des Virus in die Zelle resultiert.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein ausgewähltes antivirales und antifusogenes Peptid mit der DAC (Drug Activity Complex)-Technologie zu modifizieren, um diesem Peptid eine verbesserte Bioverfügbarkeit, verlängerte Halbwertszeit und bessere Verteilung durch selektive Konjugation des Peptids mit einem Proteinträger zu verleihen, jedoch ohne die antiviralen Eigenschaften des Peptides zu modifizieren. Der Träger der Wahl für diese Erfindung wäre Albumin, das über sein freies Thiol durch ein antivirales und antifusogenes mit einer Maleimid-Einheit modifiziertes Peptid konjugiert ist.
Verschiedene Peptidsequenzen sind in der Literatur als hochpotent für die Prävention von HIV-1-Fusion/Infektion beschrieben worden. Beispielsweise bindet das Peptid DP178 an eine Konformation von gp41, welche relevant für die Fusion ist. Daher werden bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung DP178 und DP178-ähnliche Peptide modifiziert.
Gleichermaßen umfassen weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung Modifikationen von DP107 und von DP107-ähnlichem Peptid zur Verwendung gegen HIV, sowie Peptide, die zu DP107 und DP178 analog sind, welche in RSV, HPV, MeV und SIV-Viren gefunden werden.
1. DP178 und DP107
A. DP178-Peptide
Das DP178-Peptid entspricht Aminosäureresten 638 bis 673 des Transmembran-Proteins gp41 aus dem HIV-1_LAI-Isolat und weist die 36 Aminosäuren umfassende Sequenz auf (gelesen vom Aminozum Carboxylende):
NH₂-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-COOH (SEQ ID NR 1)
Zusätzlich zu dem 36-mer voller Länge von DP178 umfassen die Peptide der vorliegenden Erfindungen Schnitte bzw. Trunkationen des DP178-Peptids, umfassend Peptide von zwischen 3 und 36 Aminosäureresten (d. h. Peptiden, welche in der Größe zwischen einem Tripeptid und einem 36-mer-Polypeptid reichen). Diese geschnittenen Peptide sind in den Tabellen 2 und 3 gezeigt.
Darüber hinaus liegen Aminosäuresubstitutionen des DP178-Peptids ebenfalls im Umfang der Erfindung. HIV-1- und HIV-2-Hüllenproteine sind strukturell verschieden, es besteht jedoch eine auffallende Aminosäurekonservierung innerhalb den DP178 entsprechenden Regionen von HIV-1 und HIV-2. Die Aminosäurekonservierung ist von einer periodischen Natur, was einige Konserverierung der Struktur und/oder Funktion annehmen lässt. Daher würde eine mögliche Klasse von Aminosäuresubstitutionen jene Aminosäureänderungen umfassen, von denen angenommen wird, dass sie die Struktur der DP178-Peptide der Erfindung stabilisieren. Unter Verwendung der DP178- und DP178-Analogsequenzen, welche hier beschrieben sind, kann ein Fachmann rasch DP178-Konsensussequenzen kombinieren bzw. übersetzen und aus diesen konservierte Aminosäurereste bestimmen, welche bevorzugte Aminosäuresubstitutionen darstellen würden.
Die Aminosäuresubstitutionen können konservierter oder nicht-konservierter Natur sein. Konservierte Aminosäuresubstitutionen bestehen im Ersatz einer oder mehrerer Aminosäuren der DP178-Peptidsequenz mit Aminosäuren ähnlicher Ladungs-, Größen- und/oder Hydrophobie-Eigenschaften, wie beispielsweise eine Glutaminsäure (E)- in Asparginsäure (D)-Aminosäuresubstitution. Nicht-konservierte bzw. nicht-konservierende Substitutionen bestehen im Ersatz einer oder mehrerer Aminosäuren der DP178-Peptidsequenz mit Aminosäuren, welche ungleiche Ladungs-, Größen- und/oder Hydrophobie-Eigenschaften besitzen, wie beispielsweise die Substitution einer Glutaminsäure (E) durch Valin (V).
Aminosäureinsertionen von DP178 können aus einzelnen Aminosäureresten oder Zügen von Resten bestehen. Die Insertionen bzw. Einfügungen können am Carboxyl- oder Aminoende der trunkierten DP178 oder DP178-Peptide durchgeführt werden sowie an einer Stelle innerhalb des Peptides.
Solche Insertionen werden im Allgemeinen 2 bis 15 Aminosäuren in der Länge aufweisen. Es wird in Betracht gezogen, dass Insertionen, welche entweder am Carboxyl- oder Aminoende des Peptides von Interesse durchgeführt werden, einen breiteren Größenbereich darstellen können, wobei etwa 2 bis etwa 50 Amino säuren bevorzugt werden. Eine oder mehrere solcher Insertionen können in DP178- oder DP178-Schnitte eingeführt werden, solange solche Insertionen in Peptiden resultieren, welche noch durch die 107 × 178 × 4-, ALLMOTI5- oder PLZIP-Suchmotive, welche oben beschrieben sind, erkannt werden können.
Bevorzugte amino- oder carboxylendständige Insertionen sind Peptide, die von etwa 2 bis etwa 50 Aminosäuren in der Länge reichen, entsprechend den gp41-Proteinbereichen, entweder amino- oder carboxylständig zu der tatsächlichen DP178 gp41-Aminosäuresequenz. Demzufolge würde eine bevorzugte aminoendständige oder carboxylendständige Aminosäureinsertion gp41-Aminosäuresequenzen enthalten, welche unmittelbar aminoendständig oder carboxylendständig zu dem DP178-Bereich des gp41-Proteins gefunden werden.
Deletionen von DP178- oder DP178-Schnitten liegen auch im Umfang der vorliegenden Erfindung. Solche Deletionen bestehen in der Entfernung einer oder mehrerer Aminosäuren aus der DP178- oder DP178-ähnlichen Peptidsequenz, wobei die untere Grenzlänge der resultierenden Peptidsequenz 4 bis 6 Aminosäuren beträgt.
Solche Deletionen können eine einzelne nahe oder größer als ein diskreter Abschnitt der Peptidsequenze beinhalten. Eine oder mehrere solcher Deletionen können in die DP178- oder DP178-Schnitte eingeführt werden, solange die Deletionen in Peptiden resultieren, welche noch durch die 107 × 178 × 4-, ALLMOTI5- oder PLZIP-Suchmotive, wie sie oben beschrieben sind, erkannt werden können.
B. DP107-Peptide
DP107 ist ein 38 Aminosäuren umfassendes Peptid, das eine potente antivirale Aktivität zeigt und den Resten 558 bis 595 des HIV-1_LAI-Isolat-Transmembran(TM)-gp41-Glycoproteins entspricht, wie es hier gezeigt ist:
NH₂-NNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQ-COOH (SEQ ID NR 2)
Zusätzlich zu dem DP107 38-mer voller Länge beinhalten die DP107-Peptidschnitte des DP107-Peptids, umfassend Peptide von zwischen 3 und 38 Aminosäureresten (d. h. Peptiden, welche in der Größe von einem Tripeptid bis zu einem 38-mer-Polypeptid reichen). Diese Peptide sind in den Tabelle 4 und 5 unten gezeigt.
Zusätzlich liegen Aminosäuresubstitutionen des DP178-Peptids ebenfalls im Umfang der Erfindung. Wie bei DP178 liegt eine auffallende Aminosäurekonservierung in den DP107 entsprechenden Bereichen von HIV-1 und HIV-2 vor, wieder von periodischer Natur, was eine Konservierung der Struktur und/oder Funktion nahelegt. Daher umfasst eine mögliche Klasse von Aminosäuresubstitutionen jene Aminosäureänderungen, von denen angenommen wird, dass sie die Struktur der DP107-Peptide der vorliegenden Erfindung stabilisieren. Unter Verwendung der DP107- und DP107-Analog-Sequenzen, welche hier beschrieben sind, kann der Fachmann rasch DP107-Konsenssequenzen kombinieren bzw. übersetzen und aus diesen konservierte Aminosäurereste bestimmen, welche bevorzugte Aminosäuresubstitutionen darstellen würden.
Die Aminosäuresubstitutionen können von einer konservierten bzw. konservierenden oder nicht-konservierten bzw. nicht-konservierenden Natur sein. Konservierte Aminosäuresubstitutionen bestehen im Ersatz einer oder mehrerer Aminosäuren der DP107-Peptidsequenz mit Aminosäuren ähnlicher Ladungs-, Größen- und/oder Hydrophobie-Eigenschaften, wie beispielsweise eine Aminosäuresubstitution von Glutaminsäure (E) durch Asparginsäu re (D). Nicht-konservierende Substitutionen bestehen im Ersatz einer oder mehrerer Aminosäuren der DP107-Peptidsequenz mit Aminosäuren, welche ungleiche Ladungs-, Größen- und/oder Hydrophobie-Eigenschaften besitzen, beispielsweise die Substitution einer Glutaminsäure (E) durch Valin (V).
Aminosäureinsertionen können aus einzelnen Aminosäureresten oder Zügen von Resten bestehen. Die Insertionen können am Carboxyl- oder Aminoende des DP107- oder DP107-geschnittenen Peptides durchgeführt werden, sowie an einer Position im Innern des Peptids.
Solche Insertionen werden im Allgemeinen von 2 bis 15 Aminosäuren in der Länge reichen. Es wird in Betracht gezogen, dass die Insertionen, welche entweder am Carboxyl- oder Aminoende des Peptides von Interesse durchgeführt werden, in einem breiteren Größenbereich liegen, wobei etwa 2 bis etwa 50 Aminosäuren bevorzugt werden. Eine oder mehrere solcher Insertionen können in DP107 oder DP107-Schnitte eingeführt werden, solange solche Insertionen in Peptiden resultieren, welche noch durch die 107 × 178 × 4-, ALLMOTI5- oder PLZIP-Suchmotive, die oben beschrieben sind, erkannt werden.
Bevorzugte amino- oder carboxylendständige Insertionen sind Peptide, welche von etwa 2 bis etwa 50 Aminosäureresten in der Länge reichen, entsprechend gp41-Proteinbereichen, entweder amino- oder carboxylständig zur tatsächlichen DP107-gp41-Aminosäuresequenz. Demzufolge würde eine bevorzugte aminoendständige oder carboxylendständige Aminosäureinsertion gp41-Aminosäuresequenzen enthalten, welche unmittelbar amino- oder carboxylständig zum DP107-Bereich des gp41-Proteins gefunden werden.
Deletionen von DP107 oder DP107-Schnitten liegen ebenfalls im Umfang der vorliegenden Erfindung. Solche Deletionen bestehen in der Entfernung einer oder mehrerer Aminosäuren aus der DP107- oder DP107-ähnlichen Peptidsequenz, wobei die untere Grenzlänge der resultierenden Peptidsequenz 4 bis 6 Aminosäuren beträgt.
Solche Deletionen können einen einzelnen engen oder größeren als einen diskreten Abschnitt der Peptidsequenzen beinhalten. Eine oder mehrere solche Deletionen können in DP107 oder DP107-Schnitte eingeführt werden, solange solche Deletionen in Peptiden resultieren, welche noch durch die 107 × 178 × 4-, ALLMOTI5- oder PLZIP-Suchmotive erkannt werden.
DP107 und DP107-Schnitte sind vollständiger in der US-PS 5,656,480 beschrieben, welche hier vollständig unter Bezugnahme darauf inverleibt ist.
2. DP107- und DP178-Analoga
Peptide, welche Analogen von DP178-, DP178-Schnitt-, DP107- und DP107-Schnitt-Sequenzen der vorliegenden Erfindung entsprechen, welche oben beschrieben sind, können in weiteren Viren gefunden werden, einschließlich beispielsweise nicht-HIV-1-Hüllviren, nicht-Hüllviren und anderen nicht-viralen Organismen.
Solche DP178- und DP107-Analoga können beispielsweise Peptidsequenzen entsprechen, welche in Transmembran(”TM”)-Proteinen von Hüllviren vorliegen und können Peptidsequenzen entsprechen, welche in nicht-eingehüllten und nicht-viralen Organismen vorliegen. Solche Peptide können eine antifusogene, antivirale und insbesondere antivirale Aktivität zeigen, welche spezifisch für den Virus ist, in welchem ihre native Sequenzen gefunden werden, oder können eine Fähigkeit zeigen, intrazelluläre Prozesse, welche gewundene, Windungspeptidstrukturen beinhalten, modulieren.
A. DP178-Analoga
DP178-Analoga sind Peptide, deren Aminosäuresequenzen aus den Aminosäuresequenzen von Peptidbereichen von beispielsweise an deren (d. h. anderen als HIV-1) Viren bestehen, umfassen, welche dem gp41-Peptidbereich entsprechen, aus dem DP178 abgeleitet wurde. Solche Viren können weitere HIV-1-Isolate und HIV-2-Isolate beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt.
DP178-Analoga, abgeleitet aus dem entsprechenden gp41-Peptidbereich von anderen (d. h. nicht-HIV-1LAI) HIV-1-Isolaten, können beispielsweise Peptidsequenzen beinhalten, welche unten gezeigt sind.
Die Peptide von SEQ ID NR 3, SEQ ID NR 4 und SEQ ID NR 5 sind aus HIV-1_SF2, HIV-1_RF bzw. HIV-1_MN abgeleitet. Weitere DP178-Analoga umfassen jene, welche aus HIV-2 abgeleitet sind, einschließlich der Peptide von SEQ ID NR 6 und SEQ ID NR 7, welche aus HIV-2_ROD bzw. HIV-2_NIHZ abgeleitet sind. Noch weitere nützliche Analoga umfassen die Peptide der SEQ ID NR 8 und SEQ ID NR 9, welche eine antivirale Aktivität zeigen.
Bei der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt, dass die DP178-Analoga Peptide repräsentieren, deren Aminosäuresequenzen dem DP178-Bereich des gp41-Proteins entsprechen, es wird auch in Betracht gezogen, dass die hier offenbarten Peptide des Weiteren Aminosäuresequenzen umfassen, welche von etwa 2 bis etwa 50 Aminosäureresten in der Länge beinhalten, entsprechend gp41-Proteinbereichen entweder in Amino- oder Carboxylendstellung zu der tatsächlichen DP178-Aminosäuresequenz.
Die Tabellen 6 und 7 zeigen mögliche Schnitte bzw. Trunkationen des HIV-2_NIHZ-DP178-Analogs, das Peptide von zwischen 3 bis 36 Aminosäureresten umfassen kann (d. h. Peptiden, welche in der Größe von einem Tripeptid bis zu einem 36-mer-Polypeptid reichen). Peptidsequenzen in diesen Tabellen sind vom Aminoende (links) zum Carboxylende (rechts) aufgelistet.
B. Zusätzliche DP178-Analoga und DP107-Analoga
DP178- und DP107-Analoga werden beispielsweise unter Verwendung einer oder mehrerer der 107 × 178 × 4-, ALLMOTI5- oder PLZIP-computergestützten Suchstrategien, welche oben beschrieben sind, erkannt oder identifiziert. Die Suchstrategie identifiziert zusätzliche Peptidregionen, von denen angenommen wird, dass sie strukturelle und/oder Aminosäuresequenzmerkmale aufweisen, welche ähnlich zu jenen von DP107 und/oder DP178 sind.
Die Suchstrategien sind vollständig in dem Beispiel beschrieben, das in Abschnitt 9 der US-PSen 6,013,263 , 6,017,536 und 6,020,459 dargestellt ist. Während diese Suchstrategie teilweise auf einem primären Aminosäuremotiv, abgeleitet aus DP107 und DP178, basiert, ist sie nicht nur auf der Suche nach Primäraminosäuresequenzhomologen basiert, da solche Proteinsequenzhomologen innerhalb aber nicht zwischen Gruppen von Viren existieren. Beispielsweise ist die Primäraminosäuresequenzhomologie innerhalb des TM-Proteins von verschiedenen Stämmen von HIV-1 oder innerhalb des TM-Proteins von verschiedenen Isolaten des Affen-Immundefizienz-Virus (SIV) verschieden.
Die computergestützte Suchstrategie, welche in den US-PSen 6,013,263 , 6,017,536 und 6,020,459 beschrieben ist, identifizierte erfolgreich Bereiche von Proteinen, welche ähnlich zu DP107 oder DP178 sind. Diese Suchstrategie wurde zur Verwendung mit einer handelsüblich verfügbaren Sequenzdatenbank, vorzugsweise PC/Gen, entworfen.
In den US-PSen 6,013,263 , 6,017,536 und 6,020,459 wurden eine Reihe von Suchmotiven, die 107 × 178 × 4-, ALLMOTI5- und PLZIP-Motive, entworfen und entwickelt, um in der Stringenz von genau bis breit zu reichen, wobei 107 × 178 × 4 bevorzugt wird. Die durch solche Suchmotive identifizierten Sequenzen, solche, die in den Tabellen V–XIV der US-PSen 6,013,263 , 6,017,536 und 6,020,459 aufgelistet sind und in dieser Anmeldung unter Bezugnahme einverleibt sind, zeigen potentiell antifusogene Eigenschaften, wie antivirale Aktivität, können zusätzlich zur Identifizierung von antifusogenen, wie antiviralen, Verbindungen nützlich sein.
3. Weitere antivirale Peptide
A. Anti-RSV-Peptide
Anti-RSV-Peptide beinhalten DP178 und/oder DP107-Analoga, welche aus entsprechenden Peptidsequenzen in RSV identifiziert wurden, und für welche festgestellt wurde, dass sie eine Virusinfektion durch RSV inhibieren. Solche Peptide von Interesse beinhalten die Peptide der Tabelle 16 und Peptide von SEQ ID NR 10 bis SEQ ID NR 30. Von besonderem Interesse sind die folgenden Peptide:
Das Peptid SEQ ID NR 10 ist aus dem F2-Bereich von RSV abgeleitet und wurde in den US-PSen 6,103,236 und 6,020,459 unter Verwendung der Suchmotive identifiziert, welche als entsprechend zu DP107- und DP178-Peptiden (d. h. ”DP107/178-ähnlich”) beschrieben sind. Die Peptide SEQ ID NR 14 bis SEQ ID NR 16 weisen jeweils Aminosäuresequenzen auf, welche in dem Peptid SEQ ID NR 10 enthalten sind und jedes zeigt Anti-RSV-Wirkung, insbesondere eine Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen RSV-infizierten und nicht-infizierten Hep-2-Zellen in Konzentrationen von weniger als 50 μg/ml.
Das Peptid SEQ ID NR 11 ist aus dem F1-Bereich von RSV abgeleitet und wurde in den US-PSen 6,103,236 und 6,020,459 unter Verwendung von Suchmotiven identifiziert, welche als entsprechend zu DP107 (d. h. ”DP107-ähnlich”) beschrieben sind. Das Peptid SEQ ID NR 29 enthält Aminosäuresequenzen, welche in dem Peptid SEQ ID NR 10 enthalten sind und zeigt ebenfalls Anti-RSV- Aktivität, insbesondere eine Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen RSV-infizierten und nicht-infizierten Hep-2-Zellen in Konzentrationen von weniger als 50 μg/ml.
B. Anti-HPIV-Peptide
Anti-HPIV-Peptide beinhalten DP178- und/oder DP107-Analoga, welche aus entsprechenden Peptidsequenzen in HPIV identifiziert wurden und für welche des Weiteren gezeigt wurde, dass sie eine Virusinfektion durch HIPV inhibieren. Solche Peptide von Interesse beinhalten die Peptide der Tabelle 17 und die Sequenzen SEQ ID NR 31 bis SEQ ID NR 62. Von besonderem Interesse sind die folgenden Peptide:
Das Peptid SEQ ID NR 31 ist aus dem F1-Bereich von HPIV-3 abgeleitet und wurde in den US-PSen 6,103,236 und 6,020,459 unter Verwendung der Suchmotive identifiziert, welche als entsprechend zu DP107 (d. h. ”DP107-ähnlich”) beschrieben sind. Die Peptide SEQ ID NR 52 und SEQ ID NR 58 besitzen alle Aminosäuresequenzen, welche in dem Peptid SEQ ID NR 30 enthalten sind, und jedes zeigt Anti-HPIV-3-Aktivität, insbesondere eine Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen HPIV-3-infizierten Hep2-Zellen und nicht-infizierten CV-1W-Zellen in Konzentrationen von weniger als 1 μg/ml.
Das Peptid SEQ ID NR 32 ist ebenfalls aus dem F1-Bereich von HPIV-3 abgeleitet und wurde in den US-PSen 6,103,236 und 6,020,459 unter Verwendung der Suchmotive identifiziert, welche als entsprechend zu DP178 (d. h. ”DP178-ähnlich”) beschrieben sind. Die Peptide SEQ ID NR 35 und SEQ ID NR 38 bis SEQ ID NR 42 besitzen jeweils Aminosäuresequenzen, welche in dem Peptid SEQ ID NR 32 enthalten sind und jedes zeigte auch Anti-HPIV-3-Aktivität, insbesondere eine Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen HPIV-3-infizierten Hep2-Zellen und nicht-infizierten CV-1W-Zellen in Konzentrationen von weniger als 1 μg/ml.
C. Anti-MeV-Peptide
Anti-MeV-Peptide sind DP178- und/oder DP107-Analoga, welche aus entsprechenden Peptidsequenzen in Masernviren (MeV) identifiziert wurden, und für welche des Weiteren festgestellt wurde, dass sie eine Virusinfektion durch Masernviren inhibieren. Solche Peptide von besonderem Interesse beinhalten die Peptide von Tabelle 19 und Peptide der Sequenzen SEQ ID NR 74 bis SEQ ID NR 86. Von besonderem Interesse sind die unten aufgelisteten Peptide.
Aus Masernviren abgeleitete Sequenzen wurden in den US-PSen 6,103,236 und 6,020,459 unter Verwendung der Suchmotive identifiziert, welche als entsprechend zu DP178 (d. h. ”DP178-ähnlich”) beschrieben sind. Die Peptide SEQ ID NR 77, SEQ ID NR 79, SEQ ID NR 81 und SEQ ID NR 83 besitzen jedes so identifizierte Aminosäuresequenzen und zeigen auch Anti-MeV-Aktivität, insbesondere eine Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen MeV-infizierten Hep2 und nicht-infizierten Vero-Zellen in Konzentrationen von weniger als 1 μg/ml.
D. Anti-SIV-Peptide
Anti-SIV-Peptide sind DP178- und/oder DP107-Analoga, welche aus entsprechenden Peptidsequenzen in SIV identifiziert wurden, und welche des Weiteren zeigten, dass sie eine Virusinfektion durch SIV inhibieren. Solche Peptide von Interesse beinhalten die Peptide der Tabelle 18 und Peptide der Sequenzen SEQ ID NR 63 bis SEQ ID NR 73. Von besonderem Interesse sind die folgenden Peptide:
Aus SIV-Transmembranfusionsprotein abgeleitete Sequenzen wurden in den US-PSen 6,103,236 und 6,020,459 unter Verwendung der Suchmotive identifiziert, welche als entsprechend zu DP178 (d. h. ”DP178-ähnlich”) beschrieben sind. Die Peptide der Sequenzen SEQ ID NR 64 bis SEQ ID NR 73 besitzen jeweils so identifizierte Aminosäuresequenzen und jedes zeigt potente Anti-SIV-Aktivität als Rohpeptide.
4. Modifikation von antiviralen und antifusogenen Peptiden
Die Erfindung zieht eine Modifizierung von Peptiden in Betracht, welche antivirale und antifusogene Aktivität zeigen, einschließlich solcher Modifikationen von DP-107 und DP-178 und Analogen davon. Solche modifizierten Peptide können mit verfügbaren reaktiven Funktionalitäten an Blutkomponenten über kovalente Bindungen reagieren. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung solcher modifizierter Peptide. Das Verfahren zur Ver wendung der modifizierten Peptide beinhaltet die Verlängerung der wirksamen therapeutischen Lebenszeit der konjugierten antiviralen Peptidderivate im Vergleich zur Verabreichung der nicht-konjugierten Peptide. Die modifizierten Peptide sind von einer Art, welche als DAC (Drug Affinity Complex) bezeichnet wird, welche das antivirale Peptidmolekül und eine Bindungsgruppe zusammen mit einer chemisch reaktiven Gruppe umfasst, die fähig zur Reaktion mit einer reaktiven Funktionalität eines mobilen Blutproteins ist. Durch Reaktion bzw. Umsetzung mit der Blutkomponente oder dem Protein kann das modifizierte Peptid, oder DAC, über das Blut an geeignete Stellen oder Rezeptoren geliefert werden.
Die Funktionalität am Protein wird eine Thiolgruppe sein und die reaktive Gruppe wird eine Maleimid enthaltende Gruppe sein, wie γ-Maleimidbutyralamid (GMBA) oder Maleimidpropionsäure (MPA). Die Erfindung liefert daher die Verwendung eines DAC, worind die Maleimidgruppe über eine Kopplungsgruppe an das Peptid gebunden ist.
Primäre Amine sind die hauptsächlichen Ziele bzw. Targets für NHS-Ester. Zugängliche α-Aminogruppen am N-terminalen Ende von Proteinen reagieren mit NHS-Estern. Jedoch können α-Aminogruppen an einem Protein für die NHS-Kopplung nicht erwünscht oder verfügbar sein. Während fünf Aminosäuren Stickstoff in ihren Seitenketten besitzen, reagiert nur das ε-Amin von Lysin deutlich mit NHS-Estern. Wenn die NHS-Ester-Konjugationsreaktion mit primären Aminen unter Freisetzung von N-Hydroxysuccinimid, wie unten im Schema verdeutlicht, reagiert, wird eine Amidbindung ausgebildet.
Die funktionelle Gruppe an diesem Protein wird eine Thiolgruppe sein und die chemisch reaktive Gruppe wird eine Maleimid enthaltende Gruppe, wie MPA oder GMBA (γ-Maleimidbutyralamid) sein. Die Maleimidgruppe ist äußerst selektiv für Sulfhydrylgruppen an Peptiden, wenn der pH-Wert des Reaktionsgemisches zwischen 6,5 und 7,4 gehalten wird. Bei einem pH-Wert von 7,0 ist die Umsetzungsgeschwindigkeit von Maleimidgruppen mit Sulfhydrylen 1000-fach schneller als mit Aminen. Zwischen der Maleimidgruppe und dem Sulfhydryl wird eine stabile Thioetherbindung ausgebildet, welche unter physiologischen Bedingungen nicht gespalten werden kann, wie in dem nachfolgenden Schema dargestellt ist.
A. Spezifische Kennzeichnung
Die verwendeten modifizierten Peptide der vorliegenden Erfindung sind so gestaltet, dass sie mit Thiolgruppen an mobilen Blutproteinen spezifisch reagieren. Eine solche Umsetzung wird durch kovalente Bindung des Peptides aufgebaut, das mit einem Maleimidlinker (zum Beispiel hergestellt aus GMBS, MPA oder anderen Maleimiden) an eine Thiolgruppe an einem mobilen Blutprotein, Serum Albumin, modifiziert ist.
Unter bestimmten Umständen bietet eine spezifische Markierung bzw. Kennzeichnung (im Folgenden Markierung) mit Maleimid verschiedene Vorteile im Gegensatz zu nicht-spezifischer Markierung von mobilen Proteinen mit Gruppen, wie NHS oder Sulf-NHS. Thiolgruppen sind in vivo weniger häufig als Aminogruppen. Daher werden die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Maleimid-modifizierten Peptide, das heißt die Maleimidpeptide, mit weniger Proteinen kovalent binden. Beispielsweise existiert in Albumin (dem häufigsten Blutprotein) nur eine einzige Thiolgruppe. Daher werden Peptid-Maleimid-Albumin-Konjugate dazu neigen, etwa ein 1:1-Molverhältnis von Peptid zu Albumin zu umfassen. Zusätzlich zu Albumin weisen IgG-Moleküle (Klasse II) ebenfalls freie Thiolgruppen auf. Da IgG-Moleküle und Serumalbumin die Hauptmenge des löslichen Proteins im Blut ausmachen, machen sie auch die Hauptmenge der freien Thiolgruppen im Blut aus, welche verfügbar sind, um kovalent an Maleimidmodifizierte Peptide zu binden.
Des Weiteren führt sogar unter freie Thiolgruppen enthaltenden Blutproteinen, einschließlich IgGs, eine spezifische Markierung mit Maleimiden zur bevorzugten Bildung von Peptid-Maleimid-Albumin-Konjugaten, infolge der einzigartigen Eigenschaften von Albumin selbst. Die einzelne freie Thiolgruppe von Albumin, hochkonserviert unter Spezien, ist am Aminosäurerest 34 (Cys³⁴) lokalisiert. Es wurde kürzlich gezeigt, dass das Cys³⁴ von Albumin eine erhöhte Reaktivität relativ zu freien Thiolen an anderen freies Thiol enthaltenden Proteinen besitzt. Das ist teilweise eine Folge des sehr niedrigen pK-Wertes von 5,5 des Cys³⁴ von Albumin. Dieser ist viel niedriger als typische pK-Werte für Cysteinreste im Allgemeinen, welche typischerweise etwa 8 betragen. Infolge dieses niedrigen pK-Wertes liegt unter normalen physiologischen Bedingungen Cys³⁴ von Albumin hauptsächlich in ionisierter Form vor, was seine Reaktivität dramatisch erhöht. Zusätzlich zu dem niedrigen pK-Wert von Cys³⁴ ist ein weiterer Faktor, welcher die Reaktivität von Cys³⁴ erhöht, seine Stellung bzw. Position, die eine Spalte nahe der Oberfläche einer Schleife der Region V von Albumin ist. Diese Position macht Cys³⁴ für Liganden aller Art sehr verfügbar und ist ein wesentlicher Faktor in der biologischen Rolle von Cys³⁴ als Falle für freie Radikale und Fänger von freiem Thiol. Diese Eigenschaften machen Cys³⁴ hochreaktiv mit Maleimid-Peptiden und die Umsetzungsgeschwindigkeitserhöhung kann das 1000-fache relativ zur Umsetzungsgeschwindigkeit von Maleimidpeptiden mit anderen freies Thiol enthaltenden Proteinen betragen.
Ein weiterer Vorteil von Peptid-Maleimid-Albumin-Konjugaten ist die Reproduzierbarkeit, welche mit der 1:1-Ladung von Peptid zu Albumin spezifisch an Cys³⁴ verbunden ist. Anderen Techniken, wie Glutaraldehyd, DCC, EDC und weitere chemische Aktivierungen von, beispielsweise freien Aminen, mangelt es an dieser Selektivität. Beispielsweise enthält Albumin 52 Lysinreste, wovon 25 bis 30 auf der Oberfläche von Albumin lokalisiert sind und daher zur Konjugation verfügbar sind. Eine Aktivierung dieser Lysinreste oder alternativ dazu eine Modifizierung von Peptiden, um mit diesen Lysinresten zu koppeln, resultiert in einer heterogenen Population von Konjugaten. Sogar wenn 1:1-Molverhältnisse von Peptid zu Albumin verwendet werden, wird die Ausbeute aus vielfachen Konjugatprodukten bestehen, wovon einige 0, 1, 2 oder mehr Peptide pro Albumin enthalten und jedes Peptide aufweist, welche an einem oder mehreren der 25 bis 30 verfügbaren Lysin-Stellen regellos gekoppelt sind. Bei den zahlreichen möglichen Kombinationen wird eine Charakterisierung der genauen Zusammensetzung und Natur jeder Konjugat-Partie bzw. -Charge schwierig und eine Partie-zu-Partie-Reproduzierbarkeit ist völlig unmöglich, was solche Konjugate weniger erwünscht als Therapeutikum macht. Während es scheinen mag, dass eine Konjugation durch Lysinreste von Albumin wenigstens den Vorteil aufweist, mehr Wirkstoff pro Albuminmolekül zu liefern, haben Studien darüber hinaus gezeigt, dass ein 1:1-Verhältnis von Therapeutikum zu Albumin bevorzugt ist. In einem Artikel von Stehle et al., ”The Loading Rate Determines Tumor Targeting properties of Methotrexate-Albumin Conjugates in Rats”, Anti-Cancer Drugs, Bd. 8, S. 677–685 (1988), welcher hier vollständig einverleibt ist, berichten die Autoren, dass ein 1:1-Verhältnis von Antikrebs-Methotrexat zu Albumin, konju giert über Glutaraldehyd, die meistversprechenden Resultate ergab. Diese Konjugate wurden vorzugsweise durch Tumorzellen aufgenommen, wohingegen Konjugate mit 5:1 bis 20:1 Methotrexat-Molekülen geänderte HPLC-Profile aufwiesen und in vivo rasch durch die Leber aufgenommen wurden. Es wurde postuliert, dass bei diesen höheren Verhältnissen konformative Änderungen am Albumin seine Wirksamkeit als Arzneimittelträger verringern.
Durch kontrollierte Verabreichung von Maleimid-Peptiden in vivo kann man die spezifische Markierung von Albumin und IgG in vivo kontrollieren. In typischen Verabreichungen werden 80 bis 90% der verabreichten Maleimid-Peptide Albumin markieren bzw. indizieren und weniger als 5% IgG. Eine Spurenindizierung bzw. -markierung von freien Thiolen, wie Glutathion, wird ebenfalls auftreten. Eine solche spezifische Indizierung wird für in vivo Verwendung bevorzugt, da sie eine genaue Berechnung der geschätzten Halbwertszeit des verabreichten Mittels erlaubt.
Zusätzlich zur Lieferung einer kontrollierten, spezifischen in vivo Indizierung können Maleimid-Peptide eine spezifische Indizierung von Serumalbumin und IgG ex vivo liefern. Eine solche ex vivo Indizierung beinhaltet die Beimengung von Maleimid-Peptiden zu Blut, Serum oder Salzlösung, welche Serumalbumin und/oder IgG enthält. Sobald eine Konjugation ex vivo mit den Maleimid-Peptiden aufgetreten ist, kann das Blut, das Serum oder die Salzlösung dem Patientenblut zur in vivo Behandlung erneut verabreicht werden.
Im Gegensatz zu NHS-Peptiden sind Maleimid-Peptide im Allgemeinen in Gegenwart wässriger Lösungen und in Gegenwart freier Amine sehr stabil. Da Maleimid-Peptide nur mit freien Thiolen reagieren werden, sind Schutzgruppen im Allgemeinen nicht erforderlich, um zu verhindern, dass die Maleimid-Peptide mit sich selbst reagieren. Darüber hinaus erlaubt die erhöhte Stabilität des modifizierten Peptids die Verwendung weiterer Reinigungsschritte, wie HPLC, um hochgereinigte Produkte herzustellen, welche für eine in vivo Anwendung geeignet sind.
Letztendlich liefert die erhöhte chemische Stabilität ein Produkt mit einer längeren Lagerbeständigkeit.
5. Synthese von modifizierten antiviralen und antifusogenen Peptiden
A. Peptidsynthese
Antivirale und antifusogene Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung können durch Standardverfahren der Festphasen-Peptidchemie, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden. Beispielsweise können Peptide durch Festphasen-Chemietechniken gemäß den Verfahren synthetisiert werden, die von Steward und Young (Steward, J. M. und Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Aufl., Pierce Chemical Company, Rockford, Ill. (1984) unter Verwendung eines Applied Biosystem Synthesizers beschrieben sind. Gleichermaßen können mehrteilige Peptidfragmente synthetisiert werden und dann miteinander unter Ausbildung großer Peptide verbunden werden. Diese synthetischen Peptide können auch unter Aminosäuresubstitutionen an spezifischen Stellen durchgeführt werden.
Für Festphasen-Peptidsynthesen kann eine Zusammenfassung vieler Techniken in J. M. Stewart und J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co. (San Francisco), 1963 und J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, Bd. 2, S. 46, Academic Press (New York), 1973 gefunden werden. Für klassische Lösungssynthesen wird auf G. Schroder und K. Lupke, The Peptides, Bd. 1, Academic Press (New York) hingewiesen. Im Allgemeinen umfassen diese Verfahren die aufeinander folgende Zugabe einer oder mehrerer Aminosäuren oder geeignet geschützter Aminosäuren zu einer wachsenden Peptidkette. Normalerweise ist entweder die Amino- oder Carboxylgruppe der ersten Aminosäure durch eine geeignete Schutzgruppe geschützt. Die geschützte oder derivatisierte Aminosäure wird dann an einen inerten Feststoffträger angebunden oder in Lösung unter Zugabe der nächsten Aminosäure in der Sequenz verwendet, welche die komplementäre (Amino- oder Carboxyl)-Gruppe aufweist, welche geeignet geschützt ist und unter Bedingungen, welche zur Ausbildung der Amidbindung geeignet sind. Die Schutzgruppe wird dann von diesem neu zugegebenen Aminosäurerest entfernt und die nächste Aminosäure (geeignet geschützt) wird zugegeben und so weiter.
Nachdem alle gewünschten Aminosäuren in der richtigen Sequenz (Reihenfolge) verbunden sind, werden jegliche verbliebenen Schutzgruppen (und jeglicher Feststoffträger) aufeinander folgend oder gleichzeitig entfernt, um das Endpolypeptid zu liefern. Durch einfache Modifikation dieses allgemeinen Verfahrens ist es möglich, mehr als eine Aminosäure gleichzeitig zu einer wachsenden Kette zuzugeben, beispielsweise indem (unter Bedingungen, welche chirale Zentren nicht racemisieren) ein geschütztes Tripeptid mit einem geeignet geschützten Dipeptid gekuppelt wird, um nach dem Entfernen der Schutzgruppe(n) ein Pentapeptid zu bilden.
Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst eine Festphasen-Peptidsynthese, worin die Aminosäure α-N-endständig durch eine Säure- oder Basen-empfindliche Gruppe geschützt ist. Solche Schutzgruppen sollten die Eigenschaften aufweisen, unter den Bedingungen der Peptidbindungsbildung stabil zu sein, wohingegen sie rasch, ohne Zerstörung der wachsenden Peptidkette oder ohne Racemisierung eines jeden der chiralen Zentren, die darin enthalten sind, entfernbar sind. Geeignete Schutzgruppen sind 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), t-Butyloxycarbonyl (Boc), Benzyloxycarbonyl (Cbz), Biphenylisopropyloxycarbonyl, t-Amyloxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, α-α-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, o-Nitrophenylsulfenyl, 2-Cyano-t-butyloxycarbonyl, und dergleichen. Die 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-Schutzgruppe (Fmoc) wird für die Synthese der Peptide der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt. Weitere bevorzugte Seitenkettenschutzgruppen sind für Seitenkettenaminogruppen, wie Lysin und Arginin, 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl (pro), Nitro, p-Toluolsulfonyl, 4-Methoxybenzolsulfonyl, Cbz, Boc und Adamantyloxycarbonyl; für Tyrosin Ben zyl, o-Brombenzyloxycarbonyl, 2,6-Dichlorbenzyl, Isopropyl, t-Butyl (t-Bu), Cyclohexyl, Cyclophenyl und Acetyl (Ac); für Serin t-Butyl, Benzyl und Tetrahydropyranyl; für Histidin Trityl, Benzyl, Cbz, p-Toluolsulfonyl und 2,4-Dinitrophenyl; für Tryptophan Formyl; für Aspartinsäure und Glutaminsäure Benzyl und t-Butyl und für Cystein Triphenylmethyl (trityl).
Bei der Festphasen-Peptidsynthese wird die α-C-terminale Aminosäure an einen geeigneten Feststoffträger oder ein Harz gebunden. Geeignete Feststoffträger, welche für die obige Synthese verwendet werden, sind jene Materialien, welche den Reagenzien und Reaktionsbedingungen der stufenweisen Kondensation/Entschützen-Reaktionen gegenüber inert sowie unlöslich im verwendeten Medium sind. Der bevorzugte Feststoffträger zur Synthese eines α-C-terminalen Carboxy-Peptides ist 4-Hydroxymethylphenoxymethyl-Copoly(Styrol-1%-Divinylbenzol). Der bevorzugte Feststoffträger für α-C-terminale Amidpeptide ist 4-(2'‚4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)phenoxyacetamidoethyl-Harz, erhältlich von Applied Biosystems (Foster City, Calif.). Die α-C-terminale Aminosäure wird an das Harz mittels N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), N,N'-Diisopropylcarbodiimid (DIC) oder O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) mit oder ohne 4-Dimethylaminopyridin (DMAP), 1-Hydroxybenztriazol (HOBT), Benztriazol-1-yloxy-tris(dimethylamino)phosphonium-hexafluorophosphat (BOP) oder Bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)phosphinchlorid (BOPCl)-unterstützten Gruppen während von etwa 1 bis etwa 24 Stunden bei einer Temperatur von zwischen 10°C und 50°C in einem Lösungsmittel, wie Dichlormethan oder DMF, angebunden.
Ist der Feststoffträger 4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)phenoxyacetamidethyl-Harz, wird die Fmoc-Gruppe mit einem sekundären Amin abgespalten, vorzugsweise Piperidin, bevor, wie oben beschrieben, mit der α-C-terminalen Aminosäure gekuppelt wird. Das bevorzugte Verfahren zur Kupplung mit dem entschützten 4-(2'‚4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)phenoxyacetamidethyl-Harz ist O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetra methyluroniumhexafluorophosphat (HBTU, 1 Äqu.) und 1-Hydroxybenztriazol (HOBT, 1 Äqu.) in DMF. Die Kupplung nachfolgender geschützter Aminosäuren kann in einem automatischen Polypeptid-Synthesizer, wie im Stand der Technik bekannt ist, durchgeführt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die α-N-terminalen Aminosäuren der wachsenden Peptidkette mit Fmoc geschützt. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe von der α-N-terminalen Seite des wachsenden Peptids wird durch Behandeln mit einem sekundären Amin, vorzugsweise Piperidin, erreicht. Jede geschützte Aminosäure wird dann in einen etwa dreifach molaren Überschuss eingeführt und die Kupplung wird vorzugsweise in DMF durchgeführt. Das Kupplungsmittel ist normalerweise O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU, 1 Äqu.) und 1-Hydroxybenztriazol (HOBT, 1 Äqu.).
Am Ende der Festphasensynthese wird das Peptid vom Harz entfernt und entschützt, entweder in einem aufeinander folgenden oder einem einzigen Verfahren. Die Entfernung des Polypeptids und das Entschützen kann in einem einzigen Schritt durch Behandeln des Harz-gebundenen Polypeptids mit einem Spaltreagens erreicht werden, umfassend Thioanisol, Wasser, Ethandithiol und Trifluoressigsäure. In Fällen, in denen das α-C-terminale Ende des Polypeptids ein Alkylamid ist, wird das Harz durch Aminolyse mit einem Alkylamin abgespalten. Alternativ dazu kann das Peptid durch Umesterung, z. B. mit Methanol, und nachfolgender Aminolyse oder durch direkte Transamidierung entfernt werden. Das geschützte Peptid kann an diesem Punkt gereinigt werden oder direkt in die nächste Stufe eingesetzt werden. Die Entfernung der Seitenketten-Schutzgruppen wird unter Verwendung des oben beschriebenen Spaltcocktails erreicht. Das vollständig entschützte Peptid wird durch eine Sequenz von Chromatographiestufen gereinigt, welche einige oder alle der folgenden Typen verwendet: Innenaustausch an einem schwach basischen Harz (Acetatform); hydrophobe Adsorptionschromatographie an nicht-derivatisiertem Polystyrol-Divinylbenzol (beispielsweise Amberlit XAD); Silicagel-Adsorptionschromatographie; Ionenaustauschchromatographie an Carboxymethylcellulose; Vertei lungs-chromatographie, z. B. an Sephadex G-25, LH-20 oder Gegenstromchromatographie; Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), insbesondere Umkehrphasen-HPLC an Octyl- oder Octadecylsilyl-Silica-Bindungsphasen-Säulenpackung.
Molekulargewichte dieser ITPs werden unter Verwendung von FAB-Massenspektroskopie bestimmt.
(1) N-terminale Schutzgruppen
Wie oben diskutiert worden ist, bezieht sich der Begriff ”N-Schutzgruppe” auf jene Gruppen, welche das α-N-terminale Ende einer Aminosäure oder eines Peptids schützen sollen oder anders die Aminogruppe einer Aminosäure oder eines Peptids gegen unerwünschte Reaktionen während des Syntheseverfahrens schützen soll. Üblicherweise verwendete N-Schutzgruppen sind in Greene, ”Protective Groups In Organic Synthesis” (John Wiley & Sons, New York (1981)) offenbart, was hier unter Bezugnahme darauf einverleibt ist. Darüber hinaus können Schutzgruppen als Pro-Arzneimittel verwendet werden, welche in vivo rasch gespalten werden, beispielsweise durch enzymatische Hydrolyse, um den biologisch wirksamen Grundstoff freizusetzen. α-N-Schutzgruppen umfassen Niederalkanoylgruppen, wie Formyl, Acetyl (”Ac”), Propionyl, Pivaloyl, t-Butylacetyl und dergleichen; weitere Acylgruppen beinhalten 2-Chloracetyl, 2-Bromacetyl, Trifluoracetyl, Trichloracetyl, Phthalyl, o-Nitrophenoxyacetyl, -Chlorbutyryl, Benzoyl, 4-Chlorbenzoyl, 4-Brombenzoyl, 4-Nitrobenzoyl und dergleichen; Sulfonylgruppen, wie Benzolsulfonyl, p-Toluolsulfonyl und dergleichen; Carbamat bildende Gruppen, wie Benzyloxycarbonyl, p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, 2-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl, 3,4-Dimethoxybenzyloxycarbonyl, 3,5-Dimethoxybenzyloxycarbonyl, 2,4-Dimethoxybenzyloxycarbonyl, 4-Ethoxybenzyloxycarbonyl, 2-Nitro-4,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, 3,4,5-Trimethoxybenzyloxycarbonyl, 1-(p-Biphenylyl)-1-methylethoxycarbonyl, α,α-Dimethyl-3,5-Dimethoxybenzyloxycarbonyl, Benzhydryloxycarbonyl, t-Butyloxy carbonyl (Boc), Diisopropylmethoxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Methoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl, 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl, Phenoxycarbonyl, 4-Nitrophenoxycarbonyl, Fluorenyl-9-methoxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, Cyclohexyloxycarbonyl, Phenylthiocarbonyl und dergleichen; Arylalkylgruppen, wie Benzyl, Triphenylmethyl, Benzyloxymethyl, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) und dergleichen, und Silylgruppen, wie Trimethylsilyl und dergleichen.
(2) Carboxyl-Schutzgruppen
Wie oben diskutiert worden ist, bezieht sich der Begriff ”Carboxyl-Schutzgruppe” auf eine Carbonsäure-schützende Ester- oder Amidgruppe, welche verwendet wird, um die Carbonsäure-Funktionalität zu blockieren oder zu schützen, während die Umsetzungen, welche andere Funktionsstellen der Verbindung involvieren, durchgeführt werden. Carboxyl-Schutzgruppen sind in Greene, ”Protective Groups in Organic Synthesis”, S. 152–186 (1981) offenbart, was hier unter Bezugnahme darauf einverleibt ist. Darüber hinaus kann eine Carboxyl-Schutzgruppe als Pro-Arzneimittel verwendet werden, wobei die Carboxyl-Schutzgruppe in vivo rasch abgespalten werden kann, beispielsweise durch enzymatische Hydrolyse, um den biologisch wirksamen Grundstoff freizusetzen. Solche Carboxyl-Schutzgruppen sind dem Fachmann gut bekannt und wurden zum Schutz von Carboxylgruppen im Penicillin- und Cephalosporin-Bereich extensiv benutzt, wie in den US-PSen 3,840,556 und 3,719,667 beschrieben ist, deren Offenbarung hier unter Bezugnahme darauf einverleibt ist. Repräsentative Carboxyl-Schutzgruppen sind C₁-C₈-Niederalkylgruppen (z. B. Methyl, Ethyl oder t-Butyl und dergleichen); Arylalkylgruppen, wie Phenethyl oder Benzyl und substituierte Derivate davon, wie Alkoxybenzyl oder Nitrobenzylgruppen und dergleichen; Arylalkenylgruppen, wie Phenylethenyl und dergleichen; Arylgruppen und substituierte Derivate davon, wie 5-Indanyl und dergleichen; Dialkylaminoalkylgruppen, wie Dimethylaminoethyl und dergleichen; Alkanoyloxyalkylgruppen, wie Acetoxymethyl, Butyryloxymethyl, Valeryloxymethyl, Isobutyryloxymethyl, Isovaleryloxy methyl, 1-(Propionyloxy)-1-ethyl, 1-(Pivaloyloxyl)-1-ethyl, 1-Methyl-1-(propionyloxy)-1-ethyl, Pivaloyloxymethyl, Propionyloxymethyl und dergleichen; Cycloalkanoyloxyalkylgruppen, wie Cyclopropylcarbonyloxymethyl, Cyclobutylcarbonyloxymethyl, Cyclopentylcarbonyloxymethyl, Cyclohexylcarbonyloxymethyl und dergleichen; Aroyloxyalkylgruppen, wie Benzoyloxymethyl, Benzoyloxyethyl und dergleichen; Arylalkylcarbonyloxyalkylgruppen, wie Benzylcarbonyloxymethyl, 2-Benzylcarbonyloxyethyl und dergleichen; Alkoxycarbonylalkyl- oder Cycloalkyloxycarbonylalkylgruppen, wie Methoxycarbonylmethyl, Cyclohexyloxycarbonylmethyl, 1-Methoxycarbonyl-1-ethyl und dergleichen; Alkoxycarbonyloxyalkyl- oder Cycloalkyloxycarbonyloxyalkylgruppen, wie Methoxycarbonyloxymethyl, t-Butyloxycarbonyloxymethyl, 1-Ethoxycarbonyloxy-1-ethyl, 1-Cyclohexyloxycarbonyloxy-1-ethyl und dergleichen; Aryloxycarbonyloxyalkylgruppen, wie 2-(Phenoxycarbonyloxy)ethyl, 2-(5-Indanyloxycarbonyloxy)ethyl und dergleichen; Alkoxyalkylcarbonyloxyalkylgruppen, wie 2-(1-Methoxy-2-methylpropan-2-oyloxy)ethyl und dergleichen; Arylalkyloxycarbonyloxyalkylgruppen, wie 2-(Benzyloxycarbonyloxy)ethyl und dergleichen; Arylalkenyloxycarbonyloxyalkylgruppen, wie 2-(3-Phenylpropen-2-yloxycarbonyloxy)ethyl und dergleichen; Alkoxycarbonylaminoalkylgruppen, wie t-Butyloxycarbonylaminomethyl und dergleichen; Alkylaminocarbonylaminoalkylgruppen, wie Methylaminocarbonylaminomethyl und dergleichen; Alkanoylaminoalkylgruppen, wie Acetylaminomethyl und dergleichen; heterocyclische Carbonyloxyalkylgruppen, wie 4-Methylpiperazinylcarbonyloxymethyl und dergleichen; Dialkylaminocarbonylalkylgruppen, wie Dimethylaminocarbonylmethyl, Diethylaminocarbonylmethyl und dergleichen; (5-(Niederalkyl)-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl)alkylgruppen, wie (5-t-Butyl-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl)methyl und dergleichen und (5-Phenyl-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl)alkylgruppen, wie (5-Phenyl-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl)methyl und dergleichen.
Repräsentative Amid-Carboxyl-Schutzgruppen sind Aminocarbonyl- und Niederalkylaminocarbonylgruppen.
Bevorzugte Carboxyl-geschützte Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen, worin die geschützte Carboxylgruppe ein Niederalkyl-, Cycloalkyl- oder Arylalkylester ist, beispielsweise Methylester, Ethylester, Propylester, Isopropylester, Butylester, sec-Butylester, Isobutylester, Amylester, Isoamylester, Octylester, Cyclohexylester, Phenylethylester und dergleichen oder ein Alkanoyloxyalkyl-, Cycloalkanoyloxyalkyl-, Aroyloxyalkyl- oder ein Arylalkylcarbonyloxyalkylester. Bevorzugte Amid-Carboxyl-Schutzgruppen sind Niederalkyl-Alkylaminocarbonylgruppen. Beispielsweise kann Asparginsäure am α-C-terminalen Ende durch eine säurelabile Gruppe (z. B. t-Butyl) geschützt werden und am β-C-terminalen Ende durch eine hydrierungslabile Gruppe (z. b. Benzyl) und dann während der Synthese selektiv entschützt werden.
B. Peptidmodifikation
Die Art und Weise zur Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten modifizierten Peptide wird in weitem Rahmen variieren, abhängig von der Natur der verschiedenen Elemente, welche das Peptid umfassen. Das synthetische Verfahren wird dahingehend ausgewählt werden, dass es einfach ist, hohe Ausbeuten liefert und ein hochgereinigtes stabiles Produkt ermöglicht. Normalerweise wird die chemisch reaktive Gruppe in der letzten Stufe der Synthese erzeugt werden, beispielsweise mit einer Carboxylgruppe die Veresterung, unter Ausbildung eines aktiven Esters. Spezielle Verfahren zur Erzeugung der modifizierten Peptide der vorliegenden Erfindung werden unten beschrieben werden.
Insbesondere wird das ausgewählte Peptid zunächst auf antivirale Aktivität untersucht und dann mit der Linker- bzw. Bindungsgruppe entweder nur am N-terminalen oder C-terminalen Ende oder innerhalb des Peptides modifiziert. Dann wird die antivirale Aktivität dieser modifizierten Peptid-Linkergruppe untersucht. Ist die antivirale Aktivität nicht dramatisch reduziert (d. h. um weniger als das 10-fache reduziert), wird die Stabilität der modifizierten Peptid-Linkergruppe durch ihre in vivo-Lebenszeit gemessen. Ist die Stabilität nicht auf ein gewünschtes Maß verbessert, wird das Peptid an einer alternativen Stelle modifiziert und das Verfahren wird wiederholt, bis ein gewünschtes Maß an antiviraler Aktivität und Stabilität erreicht ist.
Insbesondere wird jedes Peptid, das zur Modifikation mit einem Linker und einer reaktiven Wirkungsgruppe ausgewählt wird, gemäß den folgenden Kriterien modifiziert: Ist eine endständige Carboxylgruppe am Peptid verfügbar, welche nicht kritisch für die Retention antiviraler Aktivität ist, und ist keine weitere empfindliche funktionelle Gruppe am Peptid vorhanden, dann wird die Carbonsäure als Anbindungspunkt für die Linker-reaktive Gruppenmodifikation ausgewählt. Ist die endständige Carboxylgruppe in eine antivirale Aktivität verwickelt oder sind keine Carbonsäuregruppen vorhanden, dann wird jede andere empfindliche funktionelle Gruppe, welche nicht kritisch für die Retention antiviraler Aktivität ist, als Anbindungspunkt für die Modifikation der Linker-reaktiven Einheit ausgewählt. Sind verschiedene empfindliche funktionelle Gruppen am Peptid verfügbar, wird eine Kombination von Schutzgruppen in der Art und Weise verwendet werden, dass nach Zugabe der Linker/Reaktiv-Einheit und nach Entschützen aller geschützten empfindlichen funktionellen Gruppen eine Retention von antiviraler Aktivität erhalten wird. Ist keine empfindliche funktionelle Gruppe am Peptid verfügbar oder ist ein einfacherer Modifikationsweg erwünscht, werden es synthetische Bemühungen erlauben, eine Modifikation des ursprünglichen Peptids in der Weise zu ermöglichen, dass eine Retention antiviraler Aktivität aufrechterhalten bleibt. In diesem Fall wird die Modifikation am gegenüber liegenden Ende des Peptides auftreten.
Ein Maleimid-Derivat kann ebenfalls aus einem Peptid synthetisiert werden, das eine freie Aminogruppe und eine freie Carbonsäure enthält. Um ein Maleimid-Derivat aus einem Aminoderivatisierten Molekül zu erzeugen, kann man N[γ-Maleimidbutyryloxy]succinimidester (GMBS) und Triethylamin in DMF ver wenden. Der Succinimidester wird mit der freien Aminogruppe reagieren und das Maleimid-Derivat wird aus dem Reaktionsgemisch durch Kristallisieren oder durch Chromatographie an Silica oder durch HPLC gereinigt.
Letztendlich kann ein Maleimid-Derivat aus einem Peptid synthetisiert werden, das mehrere weitere empfindliche funktionelle Gruppen und keine freie Carbonsäure enthält. Enthält das ausgewählte Molekül keine Carbonsäure, kann eine Reihe bifunktioneller Vernetzungsreagenzien verwendet werden, um das Molekül in ein reaktives NHS-Derivat umzuwandeln. Beispielsweise kann Maleimidpropionsäure (MPA) an das freie Amin gekuppelt werden, um ein Maleimid-Derivat durch Umsetzung des freien Amins mit der Carboxylgruppe von MPA unter Verwendung von HBTU/HOBt/DIEA-Aktivierung in DMF zu erzeugen.
Erforderlichenfalls können viele weitere kommerziell verfügbare heterobifunktionelle Vernetzungsmittel alternativ dazu verwendet werden. Eine große Anzahl bifunktioneller Verbindungen sind zur Anbindung an Einheiten verfügbar. Beispielhafte Reagenzien umfassen: Azidobenzoylhydrazid, N-[4-(p-Azidosalicylamino)butyl]-3'-[2'-pyridyldithio)propionamid), Bis-sulfosuccinimidylsuberat, Dimethyladipimidat, Disuccinimidyltartrat, N-γ-Maleirnidbutyryloxysuccinimidester, N-Hydroxysulfosuccinimidyl-4-azidobenzoat, N-Succinimidyl-[4-azidophenyl]-1,3'-dithiopropionat, N-Succinimidyl-[4-iodacetyl]aminobenzoat, Glutaraldehyd und Succinimidyl-4-[N-maleimidmethyl]cyclohexan-1-carboxylat.
6. Verwendungen von modifizierten antiviralen Peptiden
Modifizierte antivirale Peptide der Erfindung können als therapeutisches Mittel zur Behandlung von Patienten verwendet werden, welche an Virusinfektionen leiden, und können den Patienten gemäß unten beschriebenen Verfahren und weiteren im Stand der Technik bekannten Verfahren verabreicht werden. Wirksame therapeutische Dosen der modifizierten Peptide werden durch dem Fachmann gut bekannte Verfahren bestimmt werden und es werden auch Belange hinsichtlich potentieller Toxizität des Peptides in Betracht ziehen.
Die modifizierten Peptide können auch prophylaktisch an nicht-infizierte Individuen verabreicht werden. Das kann vorteilhaft in den Fällen sein, in denen ein Individuum einem hohen Risiko unterworfen war, einem Virus ausgesetzt zu sein, wie es auftreten kann, wenn ein Individuum in Kontakt mit einem infizierten Individuum war, bei dem ein hohes Risiko der Virusübertragung besteht. Das kann insbesondere von Vorteil in solchen Fällen sein, wo eine Heilung des Virusbefalls bekannt ist, wie durch den HIV-Virus. Beispielsweise würde eine prophylaktische Verabreichung eines modifizierten Anti-HIV-Peptides in einer Situation vorteilhaft sein, in welcher eine gesunde Pflegeperson dem Blut eines HIV-infizierten Individuums ausgesetzt wurde oder in Situationen, in denen ein Individuum, das in Hochrisiko-Aktivitäten verwickelt ist, welche dieses Individuum potentiell dem HIV-Virus aussetzen.
7. Verabreichung modifizierter antiviraler und antifusogener Peptide
Im Allgemeinen werden die modifizierten Peptide in einem physiologisch annehmbaren Medium verabreicht werden, zum Beispiel entionisiertem Wasser, Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), Salzlösung, wässrigem Ethanol oder anderem Alkohol, Plasma, Eiweißlösungen, Mannitol, wässrige Glucose, Alkohol, Pflanzenöl oder dergleichen. Weitere Additive, welche enthalten sein können, umfassen Puffer, wobei die Medien im Allgemeinen auf einen pH-Wert im Bereich von etwa 5 bis 10 gepuffert werden, und der Puffer im Allgemeinen in Konzentrationsbereichen von etwa 50 bis 250 mM Salz vorliegt, wobei die Konzentration von Salz im Allgemeinen von etwa 5 bis 500 mM reichen wird, physiologisch annehmbare Stabilisatoren und dergleichen. Die Zusammensetzungen können für eine geeignete Lagerung und einen geeigneten Transport lyophilisiert werden.
Die in Rede stehenden modifizierten Peptide werden hauptsächlich parenteral verabreicht werden, wie intravenös (IV), intraarteriell (IA), intramuskulär (IM), subkutan (SC) oder dergleichen. Die Verabreichung kann unter geeigneten Situationen durch eine Transfusion erfolgen. In einigen Fällen, in denen eine Reaktion der funktionellen Gruppe relativ langsam ist, kann die Verabreichung oral, nasal, rektal, transdermal oder als Aerosol erfolgen, wenn die Natur des Konjugats die Übertragung in das Gefäßsystem gestattet. Gewöhnlich wird eine einzelne Injektion verwendet werden, obwohl mehr als eine Injektion gegebenenfalls verwendet werden kann. Die modifizierten Peptide können durch alle geeigneten Mittel, einschließlich Spritze, Trokar, Katheter, oder dergleichen verabreicht werden.
Die besondere Art und Weise der Verabreichung wird abhängig von der zu verabreichenden Menge variieren, entweder als einzelner Bolus oder als kontinuierliche Verabreichung, oder dergleichen. Vorzugsweise wird die Verabreichung intravaskulär erfolgen, wobei die Stelle der Einführung für die Erfindung nicht kritisch ist, vorzugsweise an einer Stelle, wo ein rascher Blutstrom vorliegt, zum Beispiel intravenös, in die Peripher- oder Zentralvene. Weitere Wege können Verwendung finden, wo die Verabreichung mit langsamen Freisetzungstechniken oder einer Schutzmatrix verbunden ist. Es ist die Absicht, dass das modifizierte Peptid im Blut wirksam verteilt wird, um in der Lage zu sein, mit den Blutkomponenten zu reagieren. Die Konzentration des Konjugates wird in weitem Bereich variieren, im Allgemeinen von etwa 1 pg/ml bis 50 mg/ml reichen. Die Gesamtverabreichung wird intravaskulär im Allgemeinen im Bereich von etwa 0,1 mg/ml bis etwa 10 mg/ml, gewöhnlicher etwa 1 mg/ml bis etwa 5 mg/ml liegen.
Durch Bindung an langlebige Komponenten des Blutes, Serumalbumin, wird sich eine Anzahl von Vorteilen ergeben. Die Wirksamkeit des Peptides ist für Tage bis Wochen verlängert. Nur eine Verabreichung muss während dieser Zeitdauer erfolgen. Es kann eine größere Spezifität erreicht werden, da die wirksame Verbindung hauptsächlich an große Moleküle gebunden werden wird, wobei es weniger wahrscheinlich ist, intrazellulär aufgenommen zu werden, um mit anderen physiologischen Prozessen zu interferieren.
8. Überwachung der Anwesenheit modifizierter Peptide
Das Blut des Säugetierwirts kann auf die Anwesenheit der modifizierten Peptidverbindung ein- oder mehrmals überwacht werden. Durch Abnahme eines Teils oder einer Probe des Blutes des Wirtes kann man bestimmen, ob das Peptid an die langlebigen Blutkomponenten in ausreichender Menge gebunden worden ist, um therapeutisch wirksam zu sein, und danach die Menge der Peptidverbindung im Blut. Falls erforderlich kann man bestimmen, an welche der Blutkomponenten das Peptid gebunden ist. Das ist besonders wichtig, wenn nicht-spezifische modifizierte Peptide verwendet werden. Für spezifische Maleimid-modifizierte Peptide ist es viel einfacher, die Halbwertszeit von Serumalbumin und IgG zu berechnen.
A. Immunoassays
Es werden Verfahren zur Bestimmung der Konzentration der antiviralen Peptide und/oder Analoga oder ihrer Derivate und Konjugate in biologischen Proben (wie Blut), unter Verwendung von Antikörpern, welche für die Peptide, Peptidanaloga und ihre Derivate und Konjugate spezifisch sind und die Verwendung solcher Antikörper zur Behandlung von Toxizität, welche potentiell mit solchen Peptiden, Analoga und/oder ihren Derivaten oder Konjugaten verbunden ist, beschrieben. Das ist vorteilhaft, weil die erhöhte Stabilität und Lebensdauer der Peptide in vivo im Patienten zu neuen Problemen während der Behandlung führen könnte, einschließlich einer erhöhten Wahrscheinlichkeit für Toxizität.
Die Verwendung von Anti-Wirkstoffantikörpern, entweder monoklonale oder polyklonale, mit einer Spezifität für ein besonderes Peptid, Peptidanalog oder Derivat davon, kann die Übertragung solcher Probleme unterstützen. Der Antikörper kann von einem mit dem besonderen Peptid, Analog oder Derivat davon oder mit einem immunogenen Fragment des Mittels oder einem synthetisierten Immunogen, entsprechend einer antigenen Determinante des Mittels immunisierten Wirt erzeugt oder abgeleitet werden. Bevorzugte Antikörper werden eine hohe Spezifität und Affinität für native, modifizierte und konjugierte Formen des Peptids, Peptidanalogs oder Derivats besitzen. Solche Antikörper können auch mit Enzymen, Fluorochromen oder Radiomarkern indiziert sein.
Für modifizierte Peptide spezifische Antikörper können unter Verwendung gereinigter Peptide für die Induzierung Peptidspezifischer Antikörper erzeugt werden. Durch Induzierung von Antikörpern wird nicht nur die Stimulierung einer Immunantwort durch Injektion in Tiere beabsichtigt, sondern analoge Schritte in der Herstellung synthetischer Antikörper oder anderer spezifischer Bindungsmoleküle, wie das Screenen von rekombinanten Immunoglobulin-Bibliotheken. Sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren erzeugt werden.
Die Antipeptidantikörper können zur Behandlung von Toxizität verwendet werden, die durch Verabreichung des modifizierten Peptids, Analogs oder Derivats davon induziert wird, und können ex vivo oder in vivo verwendet werden. Ex vivo Verfahren würden eine Immundialysebehandlung auf Toxizität umfassen, unter Verwendung von Antiwirkstoffantikörpern, die an Feststoffträger gebunden sind. In vivo Verfahren umfassen eine Verabreichung von Antiwirkstoffantikörpern in Mengen, welche wirksam sind, um eine Nullstellung (Clearance) von Antikörper-Wirkstoff-Komplexen zu induzieren.
Die Antikörper können zur Entfernung der modifizierten Peptide, Analoga oder Derivate davon und Konjugaten davon aus dem Blut eines Patienten ex vivo durch Kontaktieren des Blutes mit den Antikörpern unter sterilen Bedingungen entfernt werden. Beispielsweise können die Antikörper an einer Säulenmatrix gebunden oder anders immobilisiert werden und das Patientenblut kann dem Patienten abgenommen werden und über die Matrix laufengelassen werden. Das modifizierte Peptid, Peptidanaloga, Derivate und Konjugate werden an die Antikörper binden und das Blut, das eine niedrige Konzentration an Peptid, Analog, Derivat oder Konjugat enthält, kann in den Blutkreislauf des Patienten zurückgeführt werden. Die Menge an entfernter Peptidverbindung kann durch Einstellung des Druckes und der Fließrate kontrolliert bzw. gesteuert werden.
Eine empfohlene bzw. vorzuziehende Entfernung von Peptiden, Analoga, Derivaten und Konjugaten aus der Plasmakomponente eines Patientenblutes kann beispielsweise durch Verwendung einer halbdurchlässigen Membran bewirkt werden oder durch zunächst Abtrennen der Plasmakomponente von der Zellkomponente auf im Stand der Technik bekanntem Wege, um die Plasmakomponente über eine Matrix zu leiten, welche Anti-Wirkstoffantikörper enthält. Alternativ dazu kann die bevorzugte Entfernung von Peptidkonjugierten Blutzellen, einschließlich roten Blutzellen, durch Sammeln und Konzentrieren der Blutzellen im Patientenblut und Kontaktieren dieser Zellen mit Anti-Wirkstoffantikörpern bewirkt werden bis zum Ausschluss der Serumkomponente des Blutes des Patienten.
Die Antiwirkstoffantikörper können in vivo, parenteral, an einen Patienten verabreicht werden, der das Peptid, Analoga, Derivate oder Konjugate zur Behandlung erhalten hat. Die Antikörper werden an Peptidverbindungen und -konjugate binden. Sobald die Bindung stattgefunden hat, wird die Peptidaktivität behindert, wenn nicht vollständig blockiert, wodurch die biologisch wirksame Konzentration der Peptidverbindung im Patientenblutstrom reduziert wird und schädliche Nebenwirkungen minimiert werden. Darüber hinaus wird der gebundene Antikörper-Peptid-Komplex die Clearance der Peptidverbindungen und -konjugate aus dem Patientenblutstrom erleichtern.
Während die vorliegende Erfindung vollständig beschrieben wurde, kann sie weiter aufgewertet und unter Bezugnahme auf die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele verstanden werden.
BEISPIEL 1
Herstellung eines modifizierten DP178 – Synthese von YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFK(MPA)-NH₂
In diesem Beispiel wird DP178 (SEQ ID NR 1) gemäß dem folgenden Syntheseschema synthetisiert und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie in den US-PSen 6,013,236 und 6,020,459 berichtet wurde, ist DP 178 ein potenter Inhibitor von HIV-1 und inhibiert sowohl Zell-induzierte Syncytia-Bildung zwischen HIV-1 infizierten und nicht-infizierten Zellen und eine Infektion nicht-infizierter Zellen durch zellfreien HIV-1-Virus.
Eine Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids wird in einem 100 μmol-Maßstab unter Verwendung einer manuellen Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers und von Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die folgenden geschützten Aminosäuren werden nacheinander dem Harz zugefügt: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH; Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-His(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropyl ethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten (Stufe 1) erreicht. Am Ende der Synthese wird das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe manuell durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh₃)₄, aufgelöst in 5 ml CHCl₃:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden (Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% HOAc in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen. Die Synthese wird dann für die Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten, mit trockeneiskaltem Et₂O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H₂O (A) und 0,045% TFA in CH₃CN (B)) über 180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254 nm, um das gewünschte modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, bestimmt durch RP-HPLC, zu ergeben.
BEISPIEL 2
Herstellung eines modifizierten DP107 – Synthese von NNLLRAIEAQQHLLQLTVWQIKQLQARILAVERYLKDQK(MPA)-NH₂
In diesem Beispiel wird DP107 (SEQ ID NR 2) gemäß dem folgenden Syntheseschema synthetisiert und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie in den US-PSen 6,013,236 und 6,020,459 berichtet wurde, zeigt DP107 eine potente antivirale Aktivität gegen HIV.
Die Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids in einem 100 μmol-Maßstab wird unter Verwendung einer manuellen Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers und von Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die folgenden geschützten Aminosäuren werden nacheinander dem Harz zugefügt: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-His(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten (Stufe 1) erreicht. Am Ende der Synthese wird die selektive Entschützung der Lys(Aloc)-Gruppe manuell durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh₃)₄, gelöst in 5 ml CHCl₃:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden (Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% HOAc in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe von 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und danach mit trockeneiskaltem Et₂O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H₂O (A) und 0,045% TFA in CH₃CN (B)) über 180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254 nm, um das gewünschte modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu erhalten.
BEISPIEL 3
Herstellung eines modifizierten Anti-RSV-Peptids (C-terminal)
In diesem Beispiel wird
VITIELSNIKENKCNGAKVKLIKQELDKYKNAV (SEQ ID NR 16) gemäß dem un ten dargestellten Syntheseschema modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie in den US-PSen 6,013,236 und 6,020,459 berichtet wurde, inhibiert die native Sequenz (SEQ ID NR) virale Infektionen von Atmungssyncytial-Virus (RSV), einschließlich einer Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen RSV-infizierten und nicht-infizierten Hep-2-Zellen.
Die Festphasen-Peptidsynthese in einem 100 μmol-Maßstab wird unter Verwendung einer manuellen Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers und von Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die folgenden geschützten Aminosäuren werden nacheinander dem Harz zugefügt: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Val-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten (Stufe 1) erreicht. Die selektive Entschützung der Lys(Aloc)-Gruppe wird manuell durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh₃)₄, gelöst in 5 ml CHCl₃:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden (Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% HOAc in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen. Die Synthese wird zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und danach mit trockeneiskaltem Et₂O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H₂O (A) und 0,045% TFA in CH₃CN (B)) über 180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254 nm, um das gewünschte modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu erhalten.
BEISPIEL 4
Herstellung eines modifizierten Anti-RSV-Peptids (T-N-terminal)
In diesem Beispiel wurde das Peptid VITIELSNIKENKCNGAKVKLIKQELDKYKNAV (SEQ ID NR 17), das dem Peptid der SEQ ID NR 16 entspricht, in dem jedoch ein Cystein(C)-gegen den Methionin(M)-Rest substituiert wurde, gemäß dem unten dargestellten Syntheseschema hergestellt und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie in den US-PSen 6,013,236 und 6,020,459 berichtet wurde, inhibiert die native Sequenz (SEQ ID NR 16) eine virale Infektion von Atmungssyncytial-Virus (RSV), einschließlich einer Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen RSV-infizierten und nicht-infizierten Hep-2-Zellen.
Die Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids in einem 100 μmol-Maßstab wird unter Verwendung einer manuellen Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers und von Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die folgenden geschützten Aminosäuren werden nacheinander dem Harz zugefügt: Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Val-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten (Stufe 1) erreicht. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und danach mit trockeneiskaltem Et₂O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H₂O (A) und 0,045% TFA in CH₃CN (B)) über 180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254 nm gereinigt, um das gewünschte modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu erhalten.
BEISPIEL 5
Herstellung eines modifizierten Anti-RSV-Peptids
Bei diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 14 gemäß dem un ten angegebenen Syntheseschema synthetisiert und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie in den US-PSen 6,013,236 und 6,020,459 berichtet wird, inhibiert SEQ ID NR 14 eine virale Infektion von Atmungssyncytial-Virus (RSV), einschließlich einer Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen RSV-infizierten und nicht-infizierten Hep-2-Zellen.
Die Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids in einem 100 μmol-Maßstab wird unter Verwendung einer manuellen Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rink-Amid MBHA durchgeführt. Die folgenden geschützten Aminosäuren werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten (Stufe 1) erreicht. Die selektive Entschützung der Lys(Aloc)-Gruppe wird manuell durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh₃)₄, gelöst in 5 ml CHCl₃:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden (Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% HOAc in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen.
Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und nachfolgend durch trockeneiskaltes Et₂O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H₂O (A) und 0,045% TFA in CH₃CN (B)) über 180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei 214 und 254 nm, um das gewünschte modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu erhalten.
BEISPIEL 6 (T-143)
Herstellung eines modifizierten Anti-RSV-Peptids
In diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 15 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie in den US-PSen 6,013,236 und 6,020,459 berichtet ist, inhibiert SEQ ID NR 15 eine virale Infektion von Atmungssyncytial-Virus (RSV), einschließlich einer Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen RSV-infizierten und nicht-infizierten Hep-2-Zellen.
Die Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptidanalogs in einem 100 μmol-Maßstab wird unter Verwendung einer manuellen Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die folgenden geschützten Aminosäuren werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten (Stufe 1) erreicht. Die selektive Entschützung der Lys(Aloc)-Gruppe wird manuell durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh₃)₄, gelöst in 5 ml CHCl₃:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden (Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% HOAc in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen.
Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und nachfolgend durch trockeneiskaltes Et₂O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H₂O (A) und 0,045% TFA in CH₃CN (B)) über 180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254 nm, um das gewünschte modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu ergeben.
BEISPIEL 7
Herstellung eines modifizierten Anti-RSV-Peptids (C-terminal)
In diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 17, das SEQ ID NR 16 entspricht, worin ein Cystein (C) gegen Methionin (M) substituiert ist, gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie in den US-PSen 6,013,236 und 6,020,459 berichtet ist, inhibiert die native Sequenz SEQ ID NR 16 die virale Infektion von Atmungssyncytial-Virus (RSV), einschließlich einer Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen RSV-infizierten und nicht-infizierten Hep-2-Zellen.
Die Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids in einem 100 μmol-Maßstab wird unter Verwendung einer manuellen Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die folgenden geschützten Aminosäuren werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Val-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten (Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird manuell durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh₃)₄, gelöst in 5 ml CHCl₃:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden (Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% HOAc in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und danach durch trockeneiskaltes Et₂O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin)-präparativen, binären HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H₂O (A) und 0,045% TFA in CH₃CN (B)) über 180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254 nm, um das gewünschte modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu ergeben.
BEISPIEL 8
Herstellung eines modifizierten Anti-RSV-Peptids
In diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 29 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie in den US-PSen 6,013,236 und 6,020,459 berichtet ist, inhibiert SEQ ID NR 29 die virale Infektion von Atmungssyncytial-Virus (RSV), einschließlich einer Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen RSV-infizierten und nicht-infizierten Hep-2-Zellen.
Die Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids in einem 100 μmol-Maßstab wird unter Verwendung einer manuellen Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die folgenden geschützten Aminosäuren werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten (Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird manuell durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh₃)₄, gelöst in 5 ml CHCl₃:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden (Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% HOAc in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten, danach durch trockeneiskaltes Et₂O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H₂O (A) und 0,045% TFA in CH₃CN (B)) über 180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254 nm, um das gewünschte modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu ergeben.
BEISPIEL 9 (T-173)
Herstellung eines modifizierten Anti-HPIV-Peptids
In diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 52 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie in den US-PSen 6,013,236 und 6,020,459 berichtet ist, inhibiert SEQ ID NR 52 die virale Infektion von humanem Parainfluenza-Virus 3 (HPIV3), einschließlich einer Inhibierung der Fusion und Syncy tia-Bildung zwischen HPIV3-infizierten Hep2-Zellen und nicht-infizierten CV-1W-Zellen.
Die Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids in einem 100 μmol-Maßstab wird unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die folgenden geschützten Aminosäuren werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten (Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird manuell durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh₃)₄, gelöst in 5 ml CHCl₃:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden (Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% HOAc in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes Et₂O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems gerei nigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H₂O (A) und 0,045% TFA in CH₃CN (B)) über 180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254 nm, um das gewünschte modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu ergeben.
BEISPIEL 10
Herstellung eines modifizierten Anti-HPIV-Peptids
In diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 58 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie in den US-PSen 6,013,236 und 6,020,459 berichtet ist, inhibiert SEQ ID NR 58 virale Infektion von humanem Parainfluenza-Virus 3 (HPIV3), einschließlich einer Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen HPIV3-infizierten Hep2-Zellen und nicht-infizierten CV-1W-Zellen.
Die Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids in einem 100 μmol-Maßstab wird unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die folgenden geschützten Aminosäuren werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten (Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird manuell durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh₃)₄, gelöst in 5 ml CHCl₃:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden (Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% HOAc in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes Et₂O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H₂O (A) und 0,045% TFA in CH₃CN (B)) über 180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254 nm, um das gewünschte modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu ergeben.
BEISPIEL 11
Herstellung eines modifizierten Anti-HPIV-Peptids
In diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 35 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie in den US-PSen 6,013,236 und 6,020,459 berichtet ist, inhibiert SEQ ID NR 35 virale Infektion von humanem Parainfluenza-Virus 3 (HPIV3), einschließlich einer Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen HPIV3-infizierten Hep2-Zellen und nicht-infizierten CV-1W-Zellen.
Die Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids in einem 100 μmol-Maßstab wird unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die folgenden geschützten Aminosäuren werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten (Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird manuell durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh₃)₄, gelöst in 5 ml CHCl₃:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden (Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% HOAc in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes Et₂O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H₂O (A) und 0,045% TFA in CH₃CN (B)) über 180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254 nm, um das gewünschte modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu ergeben.
BEISPIEL 12
Herstellung eines modifizierten Anti-HPIV-Peptids
In diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 38 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie in den US-PSen 6,013,236 und 6,020,459 berichtet ist, inhibiert SEQ ID NR 38 virale Infektion von humanem Parainfluenza-Virus 3 (HPIV3), einschließlich einer Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen HPIV3-infizierten Hep2-Zellen und nicht-infizierten CV-1W-Zellen.
Die Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptidanalogs in einem 100 μmol-Maßstab wird unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die folgenden geschützten Aminosäuren werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Boc-Lys(Aloc)-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten (Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird manuell durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh₃)₄, gelöst in 5 ml CHCl₃:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden (Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% HOAc in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes Et₂O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H₂O (A) und 0,045% TFA in CH₃CN (B)) über 180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254 nm, um das gewünschte modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu ergeben.
BEISPIEL 13
Herstellung eines modifizierten Anti-HPIV-Peptids
In diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 39 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie in den US-PSen 6,013,236 und 6,020,459 berichtet ist, inhibiert SEQ ID NR 39 virale Infektion von humanem Parainfluenza-Virus 3 (HPIV3), einschließlich der Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen HPIV3-infizierten Hep2-Zellen und nicht-infizierten CV-1W-Zellen.
Die Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids in einem 100 μmol-Maßstab wird unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die folgenden geschützten Aminosäuren werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten (Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird manuell durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh₃)₄, gelöst in 5 ml CHCl₃:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden (Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% HOAc in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten, dann durch trockeneiskaltes Et₂O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H₂O (A) und 0,045% TFA in CH₃CN (B)) über 180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254 nm, um das gewünschte modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu ergeben.
BEISPIEL 14
Herstellung eines modifizierten Anti-HPIV-Peptids
In diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 40 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie in den US-PSen 6,013,236 und 6,020,459 berichtet ist, inhibiert SEQ ID NR 40 virale Infektion von humanem Parainfluenza-Virus 3 (HPIV3), einschließlich der Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen HPIV3-infizierten Hep2-Zellen und nicht-infizierten CV-1W-Zellen.
Die Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids in einem 100 μmol-Maßstab wird unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die folgenden geschützten Aminosäuren werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten (Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird manuell durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh₃)₄, gelöst in 5 ml CHCl₃:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden (Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% HOAc in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes Et₂O (Stufe 4) ausge fällt. Das Produkt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H₂O (A) und 0,045% TFA in CH₃CN (B)) über 180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254 nm, um das gewünschte modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu ergeben.
BEISPIEL 15
Herstellung eines modifizierten Anti-HPIV-Peptids
In diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 41 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie in den US-PSen 6,013,236 und 6,020,459 berichtet ist, inhibiert SEQ ID NR 41 virale Infektion von humanem Parainfluenza-Virus 3 (HPIV3), einschließlich der Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen HPIV3-infizierten Hep2-Zellen und nicht-infizierten CV-1W-Zellen.
Die Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids in einem 100 μmol-Maßstab wird unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die folgenden geschützten Aminosäuren werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Trp(BOC)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Lys(Aloc)-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten (Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird manuell durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh₃)₄, gelöst in 5 ml CHCl₃:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden (Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% HOAc in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes Et₂O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H₂O (A) und 0,045% TFA in CH₃CN (B)) über 180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254 nm, um das gewünschte modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu ergeben.
BEISPIEL 16
Herstellung eines modifizierten Anti-HPIV-Peptids
In diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 42 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie die US-PSen 6,013,236 und 6,020,459 berichten, inhibiert SEQ ID NR 42 virale Infektion von humanem Parainfluenza-Virus 3 (HPIV3), einschließlich der Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen HPIV3-infizierten Hep2-Zellen und nicht-infizierten CV-1W-Zellen.
Die Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids in einem 100 μmol-Maßstab wird unter Verwendung manueller Festpha sen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die folgenden geschützten Aminosäuren werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-His(Boc)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten (Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird manuell durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh₃)₄, gelöst in 5 ml CHCl₃:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden (Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% HOAc in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes Et₂O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems gereinigt: Gradienten-eluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H₂O (A) und 0,045% TFA in CH₃CN (B)) über 180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254 nm, um das gewünschte modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu ergeben.
BEISPIEL 17
Herstellung eines modifizierten Anti-MeV-Peptids
In diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 77 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie die US-PSen 6,013,236 und 6,020,459 berichten, inhibiert SEQ ID NR 77 virale Infektion von Masernviren (MeV), einschließlich der Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen MeV- infizierten und nicht-infizierten Vero-Zellen.
Die Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids in einem 100 μmol-Maßstab wird unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die folgenden geschützten Aminosäuren werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-His(Boc)-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten (Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird manuell durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh₃)₄, gelöst in 5 ml CHCl₃:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden (Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% HOAc in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes Et₂O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H₂O (A) und 0,045% TFA in CH₃CN (B)) über 180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254 nm, um das gewünschte modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu ergeben.
BEISPIEL 18
Herstellung eines modifizierten Anti-MeV-Peptids
In diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 79 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie die US-PSen 6,013,236 und 6,020,459 berichten, inhibiert SEQ ID NR 79 virale Infektion von Masernvirus (MeV), einschließlich der Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen MeV-infizierten und nicht-infizierten Vero-Zellen.
Die Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids in einem 100 μmol-Maßstab wird unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die folgenden geschützten Aminosäuren werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten (Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird manuell durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh₃)₄, gelöst in 5 ml CHCl₃:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden (Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% HOAc in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes Et₂O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binä ren HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H₂O (A) und 0,045% TFA in CH₃CN (B)) über 180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254 nm, um das gewünschte modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu ergeben.
BEISPIEL 19
Herstellung eines modifizierten Anti-MeV-Peptids
In diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 81 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie die US-PSen 6,013,236 und 6,020,459 berichten, inhibiert SEQ ID NR 79 virale Infektion von Masernviren (MeV), einschließlich der Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen MeV-infizierten und nicht-infizierten Vero-Zellen.
Die Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids in einem 100 μmol-Maßstab wird unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die folgenden geschützten Aminosäuren werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Leu-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten (Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird manuell durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh₃)₄, gelöst in 5 ml CHCl₃:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden (Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% HOAc in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes Et₂O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H₂O (A) und 0,045% TFA in CH₃CN (B)) über 180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254 nm, um das gewünschte modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu ergeben.
BEISPIEL 20
Herstellung eines modifizierten Anti-MeV-Peptids
In diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 84 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie die US-PSen 6,013,236 und 6,020,459 berichten, inhibiert SEQ ID NR 84 virale Infektion von Masernvirus (MeV), einschließlich der Inhibierung der Fusion und Syncytia-Bildung zwischen MeV-infizierten und nicht-infizierten Vero-Zellen.
Die Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids wird in einem 100 μmol-Maßstab unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die folgenden geschützten Aminosäuren werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Pro-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten (Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird manuell durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh₃)₄, gelöst in 5 ml CHCl₃:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden (Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% HOAc in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3- Maleimidpropionsäure (Stufe 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes Et₂O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H₂O (A) und 0,045% TFA in CH₃CN (B)) über 180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254 nm, um das gewünschte modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu ergeben.
BEISPIEL 21
Herstellung eines modifizierten Anti-SIV-Peptids
In diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 64 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie die US-PSen 6,013,236 und 6,020,459 berichten, zeigt SEQ ID NR 64 eine potente antivirale Aktivität als rohes Peptid gegen Simian(Affen)-Immundefizienz-Virus (SIV).
Die Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids wird in einem 100 μmol-Maßstab unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die folgenden geschützten Aminosäuren werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten (Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird manuell durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh₃)₄, gelöst in 5 ml CHCl₃:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden (Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% HOAc in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes Et₂O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H₂O (A) und 0,045% TFA in CH₃CN (B)) über 180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254 nm, um das gewünschte modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu ergeben.
BEISPIEL 22
Herstellung eines modifizierten Anti-SIV-Peptids
In diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 65 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie die US-PSen 6,013,236 und 6,020,459 berichten, zeigt SEQ ID NR 65 eine potente antivirale Aktivität als rohes Peptid gegen Affen-Immundefizienz-Virus (SIV).
Die Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids wird in einem 100 μmol-Maßstab unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die folgenden geschützten Aminosäuren werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten (Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird manuell durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh₃)₄, gelöst in 5 ml CHCl₃:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden (Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% HOAc in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes Et₂O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H₂O (A) und 0,045% TFA in CH₃CN (B)) über 180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254 nm, um das gewünschte modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu ergeben.
BEISPIEL 23
Herstellung eines modifizierten Anti-SIV-Peptids
In diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 66 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie die US-PSen 6,013,236 und 6,020,459 berichten, zeigt SEQ ID NR 66 eine potente antivirale Aktivität als rohes Peptid gegen Affen-Immundefizienz-Virus (SIV).
Die Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids wird in einem 100 μmol-Maßstab unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die folgenden geschützten Aminosäuren werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Aloc)-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten (Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird manuell durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh₃)₄, gelöst in 5 ml CHCl₃:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden (Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% HOAc in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes Et₂O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H₂O (A) und 0,045% TFA in CH₃CN (B)) über 180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254 nm, um das gewünschte modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu ergeben.
BEISPIEL 24
Herstellung eines modifizierten Anti-SIV-Peptids
In diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 67 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie die US-PSen 6,013,236 und 6,020,459 berichten, zeigt SEQ ID NR 67 eine potente antivirale Aktivität als rohes Peptid gegen Affen-Immundefizienz-Virus (SIV).
Die Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids wird in einem 100 μmol-Maßstab unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die folgenden geschützten Aminosäuren werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten (Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird manuell durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh₃)₄, gelöst in 5 ml CHCl₃:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden (Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% HOAc in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes Et₂O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H₂O (A) und 0,045% TFA in CH₃CN (B)) über 180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254 nm, um das gewünschte modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu ergeben.
BEISPIEL 25
Herstellung eines modifizierten Anti-SIV-Peptids
In diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 68 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie die US-PSen 6,013,236 und 6,020,459 berichten, zeigt SEQ ID NR 68 eine potente antivirale Aktivität als rohes Peptid gegen Affen-Immundefizienz-Virus (SIV).
Die Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids wird in einem 100 μmol-Maßstab unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die folgenden geschützten Aminosäuren werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Boc-Lys(Aloc)-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten (Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird manuell durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh₃)₄, gelöst in 5 ml CHCl₃:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden (Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% HOAc in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes Et₂O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H₂O (A) und 0,045% TFA in CH₃CN (B)) über 180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254 nm, um das gewünschte modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu ergeben.
BEISPIEL 26
Herstellung eines modifizierten Anti-SIV-Peptids
In diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 69 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie die US-PSen 6,013,236 und 6,020,459 berichten, zeigt SEQ ID NR 69 eine potente antivirale Aktivität als rohes Peptid gegen Affen-Immundefizienz-Virus (SIV).
Die Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids wird in einem 100 μmol-Maßstab unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die folgenden geschützten Aminosäuren werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benztriazo1-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten (Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird manuell durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh₃)₄, gelöst in 5 ml CHCl₃:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden (Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% HOAc in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes Et₂O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H₂O (A) und 0,045% TFA in CH₃CN (B)) über 180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254 nm, um das gewünschte modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu ergeben.
BEISPIEL 27
Herstellung eines modifizierten Anti-SIV-Peptids
In diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 70 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie die US-PSen 6,013,236 und 6,020,459 berichten, zeigt SEQ ID NR 70 eine potente antivirale Aktivität als rohes Peptid gegen Affen-Immundefizienz-Virus (SIV).
Die Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids wird in einem 100 μmol-Maßstab unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die folgenden geschützten Aminosäuren werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Boc-Lys(Aloc)-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten (Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird manuell durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh₃)₄, gelöst in 5 ml CHCl₃:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden (Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% HOAc in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes Et₂O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H₂O (A) und 0,045% TFA in CH₃CN (B)) über 180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254 nm, um das gewünschte modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu ergeben.
BEISPIEL 28
Herstellung eines modifizierten Anti-SIV-Peptids
In diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 71 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie die US-PSen 6,013,236 und 6,020,459 berichten, zeigt SEQ ID NR 71 eine potente antivirale Aktivität als rohes Peptid gegen Affen-Immundefizienz-Virus (SIV).
Die Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids wird in einem 100 μmol-Maßstab unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die folgenden geschützten Aminosäuren werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten (Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird manuell durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh₃)₄, gelöst in 5 ml CHCl₃:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden (Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% HOAc in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes Et₂O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H₂O (A) und 0,045% TFA in CH₃CN (B)) über 180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254 nm, um das gewünschte modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu ergeben.
BEISPIEL 29
Herstellung eines modifizierten Anti-SIV-Peptids
In diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 72 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie die US-PSen 6,013,236 und 6,020,459 berichten, zeigt SEQ ID NR 72 eine potente antivirale Aktivität als rohes Peptid gegen Affen-Immundefizienz-Virus (SIV).
Die Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids wird in einem 100 μmol-Maßstab unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die folgenden geschützten Aminosäuren werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten (Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird manuell durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh₃)₄, gelöst in 5 ml CHCl₃:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden (Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% HOAc in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85 TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes Et₂O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H₂O (A) und 0,045% TFA in CH₃CN (B)) über 180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254 nm, um das gewünschte modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu ergeben.
BEISPIEL 30
Herstellung eines modifizierten Anti-SIV-Peptids
In diesem Beispiel wird das Peptid SEQ ID NR 73 gemäß dem unten angegebenen Syntheseschema synthetisiert und modifiziert, um einen Linker und eine Maleimidgruppe zu enthalten. Wie die US-PSen 6,013,236 und 6,020,459 berichten, zeigt SEQ ID NR 73 eine potente antivirale Aktivität als rohes Peptid gegen Affen-Immundefizienz-Virus (SIV).
Die Festphasen-Peptidsynthese des modifizierten Peptids wird in einem 100 μmol-Maßstab unter Verwendung manueller Festphasen-Synthese, eines Symphony Peptide Synthesizers und Fmoc-geschütztem Rinkamid-MBHA durchgeführt. Die folgenden geschützten Aminosäuren werden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Phe-OH. Sie werden in N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benztriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wird unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 20 Minuten (Stufe 1) erreicht. Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wird manuell durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. Pd(PPh₃)₄, gelöst in 5 ml CHCl₃:NMM:HOAc (18:1:0,5), für 2 Stunden (Stufe 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% HOAc in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen. Die Synthese wird dann zur Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Stufe 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wird das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol gewaschen. Das Peptid wird vom Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und dann durch trockeneiskaltes Et₂O (Stufe 4) ausgefällt. Das Produkt wird durch präparative Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung eines Varian(Rainin) präparativen, binären HPLC-Systems gereinigt: Gradienteneluierung von 30–55% B (0,045% TFA in H₂O (A) und 0,045% TFA in CH₃CN (B)) über 180 Minuten bei 9,5 ml/min unter Verwendung einer Phenomenex Luna-Säule (10 μ Phenyl-Hexyl, 21 mm × 25 cm) und eines UV-Detektors (Varian Dynamax UVD II) bei λ214 und 254 nm, um das gewünschte modifizierte Peptid (d. h. DAC) in einer Reinheit von > 95%, wie durch RP-HPLC bestimmt, zu ergeben.
Während bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben worden und beispielhaft angegeben worden sind, wird ein Fachmann auf dem Gebiet in Betracht ziehen, dass die Erfindung nicht auf die spezifischen Ausführungsformen beschränkt sein sollen, sondern sie wird durch die nachfolgenden Ansprüche definiert. TABELLE 2
Es wurde der Aminosäure-Code mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE 3
Es wurde der Aminosäure-Code mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE 4
Es wurde der Aminosäure-Code mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE 5
Es wurde der Aminosäure-Code mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE 6
Es wurde der Aminosäure-Code mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE 7
Es wurde der Aminosäure-Code mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE 8
Es wurde der Aminosäure-Code mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE 9
Es wurde der Aminosäure-Code mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE 10
Es wurde der Aminosäure-Code mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE 11
Es wurde der Aminosäure-Code mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE 12
Es wurde der Aminosäure-Code mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE 13
Es wurde der Aminosäure-Code mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE 14
Es wurde der Aminosäure-Code mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE 15
Es wurde der Aminosäure-Code mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE 16
Es wurde der Aminosäure-Code mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE 17
Es wurde der Aminosäure-Code mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE 18
Es wurde der Aminosäure-Code mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet. TABELLE 19
Es wurde der Aminosäure-Code mit einem Buchstaben aus Tabelle 1 verwendet.

Claims

Verwendung eines modifizierten antiviralen und antifusogenen Peptides bei der Herstellung eines Medikamentes zur Prävention und/oder Behandlung einer viralen Infektion, wobei das modifizierte Peptid umfasst: ein Peptid, das eine antivirale und antifusogene Wirkung zeigt, und eine Maleimidgruppe, die mit einer Thiolgruppe am Serumalbumin unter Bildung einer stabilen kovalenten Bindung reaktiv ist, wobei die Maleimidgruppe entweder ohne Verwendung einer Verknüpfungsgruppe oder über eine Verknüpfungsgruppe, welche (2-Amino)-ethoxyessigsäure (AEA) oder [2-(2-Amino)-ethoxy]-ethoxyessigsäure (AEEA) ist, an das Peptid gekoppelt ist, wobei das modifizierte Peptid in vivo ein antifusogenes Peptid-Maleimid-Albumin-Konjugat bildet.
Verwendung wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Peptid DP178 oder DP107 oder Analoge hiervon ist.
Verwendung wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Peptid eine antivirale und antifusogene Wirkung gegen das humane Immundefizienz-Virus (HIV) aufweist.
Verwendung wie in Anspruch 3 beansprucht, wobei das Peptid aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus der SEQ ID NR. 1 bis SEQ ID NR. 9.
Verwendung wie in Anspruch 3 beansprucht, wobei das Peptid DP178 oder DP107 ist.
Verwendung wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Peptid eine antivirale und antifusogene Wirkung gegen das humane Respiratory Syncytial Virus (RSV) zeigt.
Verwendung wie in Anspruch 6 beansprucht, wobei das Peptid aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus der SEQ ID NR. 10 bis SEQ ID NR. 30.
Verwendung wie in Anspruch 6 beansprucht, wobei das Peptid aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus der SEQ ID NR. 14 bis SEQ ID NR. 17 und SEQ ID NR. 29.
Verwendung wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Peptid eine antivirale und antifusogene Wirkung gegen das humane Parainfluenza-Virus (HPIV) zeigt.
Verwendung wie in Anspruch 9 beansprucht, wobei das Peptid aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus der SEQ ID NR. 31 bis SEQ ID NR. 62.
Verwendung wie in Anspruch 9 beansprucht, wobei das Peptid aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus der SEQ ID NR. 35, SEQ ID NR. 38 bis SEQ ID NR. 42, SEQ ID NR. 52 und SEQ ID NR. 58.
Verwendung wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Peptid eine antivirale und antifusogene Wirkung gegen das Masernvirus (MeV) zeigt.
Verwendung wie in Anspruch 12 beansprucht, wobei das Peptid aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus der SEQ ID NR. 74 bis SEQ ID NR. 86.
Verwendung wie in Anspruch 12 beansprucht, wobei das Peptid aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus der SEQ ID NR. 77, SEQ ID NR. 79, SEQ ID NR. 81 und SEQ ID NR. 84.
Verwendung wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei das Peptid eine antivirale und antifusogene Wirkung gegen das Simian-Immundefizienz-Virus (SIV) zeigt.
Verwendung wie in Anspruch 15 beansprucht, wobei das Peptid aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus der SEQ ID NR. 63 bis SEQ ID NR. 73.
Verwendung einer Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikamentes zur Prävention und/oder Behandlung des erworbenen Immundefekt-Syndroms (AIDS), wobei die Zusammensetzung ein Peptid umfasst, das eine antivirale und antifusogene Wirkung gegen das humane Immundefizienz-Virus (HIV) zeigt, das mit einer Maleimidgruppe, die mit einer Thiolgruppe am Serumalbumin unter Bildung einer stabilen kovalenten Bindung reaktiv ist, modifiziert ist, wobei die Maleimidgruppe an das Peptid entweder ohne Verwendung einer Verknüpfungsgruppe oder über eine Verknüpfungsgruppe, welche (2-Amino)-ethoxyessigsäure (AEA) oder [2-(2-Amino)-ethoxy]-ethoxyessigsäure (AEEA) ist, gebunden ist, wobei das modifizierte Peptid in vivo ein antifusogenes Peptid-Maleimid-Albumin-Konjugat bildet.
Verwendung wie in Anspruch 17 beansprucht, wobei das Peptid DP178 oder DP107 oder Analoge davon ist.
Verwendung einer Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikamentes zur Prävention und/oder Behandlung der humanen Respiratory Syncytial Virus(RSV)-Infektion, wobei die Zusammensetzung ein Peptid umfasst, das eine antivirale und antifusogene Wirkung gegen RSV zeigt, das mit einer Maleimidgruppe, die mit einer Thiolgruppe am Serumalbumin unter Bildung einer stabilen kovalenten Bindung reaktiv ist, modifiziert ist, wobei die Maleimidgruppe an das Peptid entweder ohne Verwendung einer Verknüpfungsgruppe oder über eine Verknüpfungsgruppe, welche (2-Amino)- ethoxyessigsäure (AEA) oder [2-2-Amino)-ethoxy]-ethoxyessigsäure (AEEA) ist, gebunden ist, wobei das modifizierte Peptid in vivo ein antifusogenes Peptid-Maleimid-Albumin-Konjugat bildet.
Verwendung wie in Anspruch 19 beansprucht, wobei das Peptid aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus der SEQ ID NR. 14 bis SEQ ID NR. 17 und SEQ ID NR. 29.
Verwendung einer Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikamentes zur Prävention und/oder Behandlung der humanen Parainfluenza-Virus(HPIV)-Infektion, wobei die Zusammensetzung ein Peptid umfasst, das eine antivirale und antifusogene Wirkung gegen humane Parainfluenza (HPIV) aufweist, das mit einer Maleimidgruppe, die mit einer Thiolgruppe am Serumalbumin unter Bildung einer stabilen kovalenten Bindung reaktiv ist, modifiziert ist, wobei die Maleimidgruppe an das Peptid entweder ohne Verwendung einer Verknüpfungsgruppe oder über eine Verknüpfungsgruppe, welche (2-Amino)-ethoxyessigsäure (AEA) oder [2-(2-Amino)-ethoxy]-ethoxyessigsäure (AEEA) ist, gebunden ist, wobei das modifizierte Peptid in vivo ein antifusogenes Peptid-Maleimid-Albumin-Konjugat bildet.
Verwendung wie in Anspruch 21 beansprucht, wobei das Peptid aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus der SEQ ID NR. 35, SEQ ID NR. 38 bis SEQ ID NR. 42, SEQ ID NR. 52 und SEQ ID NR. 58.
Verwendung einer Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikamentes zur Prävention und/oder Behandlung der Masern-Virus (MeV)-Infektion, wobei die Zusammensetzung ein Peptid umfasst, das eine antivirale und antifusogene Wirkung gegen Masern-Virus (MeV) aufweist, das mit einer Maleimidgruppe, die mit einer Thiolgruppe am Serumalbumin unter Bildung einer stabilen kovalenten Bindung reaktiv ist, modifiziert ist, wobei die Maleimidgruppe an das Peptid entweder ohne Verwendung einer Verknüpfungsgruppe oder über eine Verknüpfungsgruppe, welche (2-Amino)- ethoxyessigsäure (AEA) oder [2-(2-Amino)-ethoxy]-ethoxyessigsäure (AEEA) ist, gebunden ist, wobei das modifizierte Peptid in vivo ein antifusogenes Peptid-Maleimid-Albumin-Konjugat bildet.
Verwendung wie in Anspruch 23 beansprucht, wobei das Peptid aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus der SEQ ID NR. 77, SEQ ID NR. 79, SEQ ID NR. 81 und SEQ ID NR. 84.
Verwendung wie in einem der vorstehenden Ansprüche beansprucht, wobei die Maleimidgruppe über eine Verknüpfungsgruppe an das Peptid gekoppelt ist.