DE60204137T2

DE60204137T2 - Langwirkende fusionspeptid-inhibitoren für hiv-infektion

Info

Publication number: DE60204137T2
Application number: DE60204137T
Authority: DE
Inventors: John Erickson; P. Dominique BRIDON; Martin Robitaille; A. Grant KRAFFT; Dong Xie; Elena Afonina; Jun Liang; Sandra De Meyer
Original assignee: ConjuChem Inc
Current assignee: Conjuchem Biotechnologies Inc Montreal Quebec; Erickson John Frederick Md Us
Priority date: 2001-05-31
Filing date: 2002-05-31
Publication date: 2006-01-26
Anticipated expiration: 2022-06-01
Also published as: ATE295370T1; JP2005500274A; JP2008308506A; US7741453B2; ATE345353T1; DE60216151T2; HK1071379A1; CA2448891A1; EP1390399B1; ES2242860T3; DK1479691T3; DE60204137D1; WO2002096935A2; WO2002096935A3; AU2002302277A1; US20110166061A1; US20050065075A1; DE60216151D1; JP4463545B2; PT1479691E

Description

Bereich der Erfindung
Diese Erfindung betrifft C34-Peptidderivate, welche Inhibitoren von viralen Infektionen sind und/oder antifusogene Eigenschaften zeigen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung C34-Derivate, welche Wirkung gegen humanes Immunmangel-Virus (HIV), respiratorisches Synzytiumvirus (RSV), humanes Parainfluenzavirus (HPV), Masernvirus (MeV) und Affen-Immunmangelvirus (SIV) mit langer Wirkungszeit für die Behandlung der jeweiligen viralen Infektionen zeigen.
Hintergrund der Erfindung
Das Vorkommen von Membranfusion ist auch in eine Vielfalt von Krankheitszuständen verwickelt, einschließlich beispielsweise dem Eintreten von umhüllten Viren in Zellen, während sie in normalen zellbiologischen Prozessen gang und gäbe sind. Es ist bekannt, dass Peptide Vorkommnisse, welche mit Membranfusion verbunden sind, inhibieren oder sonst wie unterbrechen, einschließlich beispielsweise die retrovirale Übertragung in nicht-infizierte Zellen inhibieren.
HIV ist ein Mitglied der Lentivirus-Familie von Retroviren und es existieren zwei vorherrschende HIV-Typen, HIV-1 und HIV-2, wovon jeweils verschiedene Stämme identifiziert worden sind. HIV zielt auf CD-4+-Zellen und ein viraler Eintritt hängt von der Bindung des HIV-Proteins gp120 an das CD4-Glycoprotein und einen chemokinen Rezeptor auf der Zelloberfläche ab. Es ist bekannt, dass C34 antivirale Aktivität gegen HIV zeigt, einschließlich der Inhibierung von CD-4+-Zellinfektion durch freien Virus und/oder Inhibierung HIV-induzierter Synzytium bildung zwischen infizierten und nicht-infizierten CD-4+-Zellen. Es wird angenommen, dass die Inhibierung durch Bindung von C34 an die erste Heptad-Repeat-Region in gp41 verursacht wird und so die ersten und zweiten Heptad-Repeat-Regionen von der Bildung der fusigenen Haarnadelstruktur abhält.
Es ist bekannt, dass C34 antifusogene Wirkung besitzt, d.h. es die Fähigkeit besitzt, das Maß an Membranfusionsvorkommen zwischen zwei oder mehr Einheiten, zum Beispiel Virus-Zelle oder Zelle-Zelle relativ zum Maß der in Abwesenheit des Peptids vorkommenden Membranfusion zu inhibieren oder zu reduzieren. Insbesondere lehrt die WO 00/06599 die Verwendung von C34, um gp41 zu inaktivieren und so den Eintritt von HIV-1 in Zellen zu verhindern oder zu reduzieren.
Auch beschreibt die WO 99/59615 Verstärkungspeptidsequenzen, welche ursprünglich von verschiedenen retroviralen (gp41) Hullen-Proteinsequenzen abgeleitet sind, welche die pharmakokinetischen Eigenschaften eines jeglichen Kernpolypeptids, an welche sie gebunden sind, steigern. Die WO 99/59615 bezieht sich ferner auf Verfahren zur Steigerung der pharmakokinetischen Eigenschaften eines jeglichen Kernpolypeptids durch Bindung der Verstärkerpeptidsequenzen an das Kernpolypeptid.
Während viele der antiviralen oder antifusogenen Peptide, die im Stand der Technik beschrieben, sind starke antivirale und/oder antifusogene Aktivität zeigen, leidet C34, wie alle solchen Peptide, an der kurzen Halbwertslebenszeit in vivo, hauptsächlich infolge von raschem Serum-Clearance und Peptidase- und Protease Aktivität. Dies wiederum vermindert stark die wirksame antivirale Aktivität.
Es besteht daher ein Bedarf für ein Verfahren zur Verlängerung der Halbwertslebenszeit von Peptiden, wie C34, in vivo, ohne im Wesentlichen die antifusogene Aktivität negativ zu beeinflussen.
Zusammenfassung der Erfindung
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung werden nun C34-Peptidderivate zur Verfügung gestellt, welche im Vergleich mit den entsprechenden nicht-modifizierten C34-Peptidsequenzen eine verlängerte Halbwertslebenszeit aufweisen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verbindungen der unten dargestellten Formeln I–VI, welche mit Thiolgruppen an Blutkomponenten sowohl in vivo als auch ex vivo unter Bildung einer stabilen kovalenten Bindung reagieren können.
Bevorzugte Blutkomponenten beinhalten Proteine, wie Immunoglobuline, umfassend IgG und IgM, Serumalbumin, Ferritin, Steroidbindende Proteine, Transferrin, Thyroxin-bindendes Protein, α-2-Makroglobulin etc., wobei Serumalbumin und IgG bevorzugter sind und Serumalbumin am bevorzugtesten ist.
Unter einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine pharmazeu tische Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, welche Derivate der Formeln I–VI in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst. Eine solche Zusammensetzung ist zur Inhibierung der Aktivität von HIV, RSV, HPV, MeV oder SIV nützlich.
Nach einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer Verbindung der Formeln I–VI, allein oder in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, zur Herstellung eines Medikamentes zur Inhibierung der Aktivität von HIV, RSV, HPV, MeV oder SIV zur Verfügung gestellt, worin die Verbindung der vorliegenden Erfindung vorzugsweise kovalent an eine Blutkomponente gebunden ist, am bevorzugtesten, worin die Verbindung der vorliegenden Erfindung in vivo kovalent an eine Blutkomponente gebunden ist.
Unter einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Konjugat zur Verfügung gestellt, das die Verbindungen der Formeln I–VI kovalent gebunden an eine Blutkomponente umfasst.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung erfüllt diese und weitere Bedürfnisse und ist auf C34-Peptidderivate der Formeln I–VI mit antiviraler Aktivität und/oder antifusogener Aktivität gerichtet. Diese C34-Peptivderivate liefern eine erhöhte Stabilität in vivo und eine verminderte Suszeptibilität gegenüber Peptidase- oder Protease-Abbau. Im Ergebnis minimieren die Verbindungen der Formeln I–VI das Erfordernis häufigerer oder sogar kontinuierlicher Verabreichung der Peptide. Die vorliegenden C34-Derivate können beispielsweise als Prophylaxemittel gegen und/oder Behandlungsmittel bei Infektionen durch eine Anzahl von Viren, einschließlich dem humanen Immunmangelvirus (HIV), dem humanen respiratorischen Synzytiumvirus (RSV), dem humanen Prainfluenzavirus (HPV), Masernvirus (MeV) und Affenimmunmangelvirus (SIV), verwendet werden.
Die an der nativen C34-Peptidsequenz durchgeführte Modifikation erlaubt es, mit verfügbaren Thiolgruppen an Blutkomponenten unter Ausbildung stabiler kovalenter Bindungen zu reagieren. Bei einer Ausführungsform der Erfindung umfasst die Blutkomponente ein Blutprotein, einschließlich eines mobilen Blutproteins, wie Albumin, welches am bevorzugtesten ist.
Die Verbindungen der Formeln I–VI inhibieren virale Infektion von Zellen durch beispielsweise Inhibieren von Zell-Zell-Fusion oder freier Virusinfektion. Der Pfad der Infektion kann eine Membranfusion beinhalten, wie sie im Falle von eingehüllten oder eingekapselten Viren auftritt, oder einige andere Fusionsvorkommen, welche virale und zelluläre Strukturen beinhalten.
Die Blutkomponenten, an welche die vorliegenden antiviralen C34-Derivate kovalent binden, können entweder fixiert oder mobil sein. Fixierte Blutkomponenten sind nicht-mobile Blutkomponenten und umfassen Gewebe, Membranrezeptoren, interstitielle Proteine, Fibrinproteine, Collagene, Blutplättchen, Endothelzellen, Epithelzellen und deren verbundenes Membran oder membranartige Rezeptoren, somatische Körperzellen, skelettartige und Weichmuskelzellen, neuronale Komponenten, Osteocyten und Osteoklasten und alle Körpergewebe, insbesondere solche, welche mit den zirkulatorischen und lymphatischen Systemen verbunden sind. Mobile Blutkomponenten sind Blutkomponenten, welche für keinen längeren Zeitraum, welcher im Allgemeinen 5 Minuten oder üblicher 1 Minute nicht überschreitet, einen festen Sitz aufweisen. Diese Blutkomponenten sind nicht Membranassoziiert und sind im Blut über einen längeren Zeitraum in einer Minimalkonzentration von wenigstens 0,1 μg/ml vorhanden. Mobile Blutkomponenten umfassen Serumalbumin, Transferrin, Ferritin und Immunoglobuline, wie IgM und IgG. Die Halbwertlebenszeit von mobilen Blutkoponenten beträgt wenigstens etwa 12 Stunden.
Während des Syntheseprozesses der vorliegenden C34-Derivate können Schutzgruppen erforderlich sein. Diese Schutzgruppen sind im Bereich der Peptidsynthese herkömmlich und können allgemein als chemische Einheiten beschrieben werden, welche dazu in der Lage sind, das Peptidderivat vor der Reaktion mit anderen funktionellen Gruppen zu schützen. Es sind verschiedene Schutzgruppen im Handel erhältlich und Beispiele davon können in der US 5,493,007 gefunden werden, welche unter Bezugnahme darauf hier enthalten ist. Typische Beispiele geeigneter Schutzgruppen umfassen Acetyl, Fluorenylmethyloxicarbonyl (FMOC), t-Butyloxicarbonyl (BOC), Benzyloxicarbonyl (CBZ), etc. Darüber hinaus liefert Tabelle 1 sowohl die aus drei Buchstaben und auch die aus einem Buchstaben bestehenden Abkürzungen für Aminosäuren.
Tabelle 1
Die vorliegenden C34-Derivate können in vivo verabreicht werden, so dass eine Konjugation mit Blutkomponenten in vivo auftritt, oder sie können zunächst mit Blutkomponenten in vitro konjugiert werden und das resultierende konjugierte Derivat in vivo verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung zieht ihren Vorteil aus den Eigenschaften von existierenden antiviralen und antifusogenen Peptiden. Die Viren, welche durch die Peptide inhibiert werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, alle Stämme von Viren, welche beispielsweise in den Tabellen V–VII und IX–XIV der US 6,013,263 und US 6,017,536 aufgezeichnet sind. Diese Viren beinhalten beispielsweise humane Retroviren, umfassend HIV-1, HIV-2, und humane T-Lymphocytenviren (HTLV-1 und HTLV-II) und nicht-humane Retroviren, umfassend Rinder-Leukosevirus, Katzen-Sarcomvirus, Katzen-Leukämievirus, Affenimmunmangelvirus (SIV), Affen-Sarcomvirus, Affen-Leukämie und progressiven Schafpneumonievirus. Nicht-retrovirale Viren können ebenfalls durch die vorliegenden C34-Derivate inhibiert werden, einschließlich humanes respiratorisches Synzytiumvirus (RSV), Kaninchen-Staupevirus, Newcastle-Diseasvirus, humanes Parainfluenzavirus (HPIV), Influenzaviren, Masernviren (MeV), Epstein-Barr-Viren, Hepatitis-B-Viren, und Affenmasern-Pfizer-Viren. Nicht-eingehüllte Viren können ebenfalls durch die vorliegenden C34-Derivate inhibiert werden, und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Picornaviren, wie Polioviren, Hepatitis-A-Viren, Enteroviren, Echoviren, Coxsacki-Viren, Papovaviren, wie Papillomviren, Parvoviren, Adenoviren und Reoviren.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die C34-Peptidsequenz in einer Weise zu modifizieren, dass diesem Peptid eine verbesserte Bioverfügbarkeit, verlängerte Halbwertslebensdauer und bessere Verteilung durch selektive Konjugation des Peptides auf einem Proteinträger zu Eigen wird, ohne im Wesentlichen die antiviralen Eigenschaften des Peptides zu modifizieren. Der Träger der Wahl wäre im Rahmen der vorliegenden Erfindung Albumin, das durch sein freies Thiol konjugiert ist (ohne Beschränkung).
Die vorliegenden C34-Derivate sind so gestaltet, dass sie spezifisch mit Thiolgruppen an mobilen Blutproteinen reagieren. Eine solche Reaktion wird durch kovalente Bindung des mit einer Maleimidbindung an eine Thiolgruppe an einem mobilen Blutprotein, wie Serumalbumin oder IgG, modifizierten Peptid durchgeführt ist.
Da Thiolgruppen in vivo weniger häufig auftreten als beispielsweise Aminogruppen, werden die Maleimid-modifizierten C34-Peptide der vorliegenden Erfindung sich an weniger Proteine kovalent binden. Beispielsweise liegt in Albumin (dem häufigsten Blutprotein) nur eine einzige Thiolgruppe vor. Demzufolge wird ein C34-Maleimid-Albumin-Konjugat in etwa ein 1:1-Molverhältnis von C34-Peptid zu Albumin aufweisen. Zusätzlich zu Albumin weisen IgG-Moleküle (Klasse II) ebenfalls freie Thiole auf. Da IgG-Moleküle und Serumalbumin die Hauptmenge der löslichen Proteine im Blut ausmachen, bestimmen sie auch die Hauptmenge der Thiolgruppen im Blut, welche zur kovalenten Bindung an C34-Peptidderivat zur Verfügung stehen.
Darüber hinaus führt, sogar unter freies Thiol enthaltenden Blutproteinen, einschließlich IgGs, eine spezifische Markierung mit einem Maleimid zur bevorzugten Bildung eines C34-Maleimid-Albuminkonjugats, infolge der unitären Eigenschaften von Albumin selbst. Die einzige freie Thiolgruppe von Albumin, welche unter den Spezien hoch konserviert ist, ist am Aminosäurerest 34 (Cys³⁴) angeordnet. Es wurde kürzlich gezeigt, dass das Cys³⁴ von Albumin eine erhöhte Reaktivität relativ zu freien Thiolen an anderen freies Thiol enthaltenden Proteinen aufweist. Das ist teilweise eine Folge des sehr niedrigen pK- Wertes von 5,5 für Cys³⁴ von Albumin. Das ist viel niedriger als die typischen pK-Werte für Cysteinreste im Allgemeinen, welche typischerweise um etwa 8 liegen. Infolge dieses niedrigen pK-Wertes liegt unter normalen physiologischen Bedingungen Cys³⁴ von Albumin hauptsächlich in ionisierter Form vor, was seine Reaktivität dramatisch erhöht. Zusätzlich zu dem niedrigen pK-Wert von Cys³⁴, ist ein weiterer Faktor, welcher die Reaktivität von Cys³⁴ beschleunigt, seine Stellung, welche eine hydrophobe Tasche nahe der Oberfläche einer Schleife der Region V von Albumin ist. Diese Stellung macht Cys³⁴ für Liganden aller Art sehr verfügbar und ist ein wesentlicher Faktor für die biologische Rolle von Cys³⁴ als Falle für freie Radikale und Fänger von freiem Thiol. Diese Eigenschaften machen Cys³⁴ hochreaktiv mit Maleimid-C34 und die Reaktionsgeschwindigkeitsbeschleunigung kann sogar das 1000-fache der Geschwindigkeiten der Reaktion von Maleimid-C34 mit anderen freies Thiol enthaltenden Proteinen betragen.
Ein weiterer Vorteil von C34-Maleimid-Albumin-Konjugaten ist die Reproduzierbarkeit, welche mit der 1:1-Ladung von C34 an Albumin, insbesondere an Cys³⁴, verbunden ist. Andere Techniken, wie Glutaraldehyd, DCC, EDC und weitere chemische Aktivierungen von zum Beispiel freien Aminen weisen diese Selektivität nicht auf. Beispielsweise enthält Albumin 52 Lysinreste, wovon 25 bis 30 an der Oberfläche von Albumin angeordnet sind und daher zur Konjugation zur Verfügung stehen. Die Aktivierung dieser Lysinreste oder alternativ dazu die Modifizierung von C34, um mit diesen Lysinresten zu kuppeln, resultiert in einer heterogenen Population von Konjugaten. Sogar wenn 1:1-Molverhältnisse von C34 zu Albumin verwendet werden, wird die Ausbeute aus zahlreichen Konjugatprodukten bestehen, wovon einige 0, 1, 2 oder mehr C34 pro Albumin enthalten und jedes davon an jedem oder mehreren der 25 bis 30 verfügbaren Lysinstellen C34 zufällig gekuppelt aufweist. Aufgrund der zahlreichen möglichen Kombinationen wird die Charakterisierung der genauen Zusammensetzung und Natur einer jeden Konjugatcharge schwierig und die Reproduzierbarkeit von Charge zu Charge ist alles andere als möglich, was solche Konjugate als Therapeutikum weniger wünschenswert macht. Während es scheinen mag, dass die Konjugation durch Lysinreste von Albumin wenigstens den Vorteil aufweist, dass mehr therapeutisch wirksames Mittel pro Albuminmolekül geliefert wird, haben Studien darüber hinaus gezeigt, dass ein 1:1-Verhältnis von therapeutischem Mittel zu Albumin bevorzugt ist. In einem Artikel von Stehle et al., "The Loading Rate Determines Tumor Targeting properties of Methotrexate-Albumin Conjugates in Rats", Anti-Cancer Drugs, Band 8, Seiten 677–685 (1988), der hier vollständig eingebracht ist, berichten die Autoren, dass ein 1:1-Verhältnis des Antikrebsmittels Methotrexat an Albumin, konjugiert über Glutaraldehyd, die am vielversprechendsten Ergebnisse lieferten. Diese Konjugate wurden bevorzugt von Tumorzellen aufgenommen, wohingegen Konjugate, welche 5:1 bis 20:1 Methotrexatmoleküle trugen, abgewandelte HPLC-Profile aufwiesen und rasch durch die Leber in vivo aufgenommen wurden. Es wird postuliert, dass bei diesen höheren Verhältnissen Konformationsänderungen an Albumin seine Wirksamkeit als Therapeutikumträger verringern.
Durch kontrollierte Verabreichung der vorliegenden C34-Derivate in vivo, kann man die spezifische Markierung von Albumin und IgG in vivo kontrollieren. Bei typischen Verabreichungen werden 80 bis 90% der verabreichten C34-Derivate Albumin und weniger als 5% IgG markieren. Eine Spurenmarkierung von freien Thiolen, wie Glutathion, wird ebenfalls auftreten. Eine solche spezifische Markierung wird zur in vivo-Verwendung bevorzugt, da sie eine genaue Berechnung der geschätzten Halbwertslebenszeit von C34 erlaubt.
Zusätzlich zu der kontrollierten spezifischen in vivo-Markierung können die vorliegenden C34-Derivate eine spezifische Markierung von Serumalbumin und IgG ex vivo liefern. Eine solche ex vivo-Markierung beinhaltet die Zugabe der C34-Derivate zu Blut, Serum oder physiologischer Kochsalzlösung, welche Serumalbumin und/oder IgG enthält. Sobald eine Konjugation ex vivo mit dem C34-Derivat stattgefunden hat, kann das Blut, das Serum oder die physiologische Kochsalzlösung dem Blut des Patienten zur in vivo Behandlung zurückgeführt oder lyophilisiert werden.
Die vorliegenden C34-Derivate können durch Standardverfahren der Festphasenpeptidchemie, die jedem Fachmann mit durchschnittlichen Kenntnissen auf dem Gebiet bekannt sind, synthetisiert werden. Beispielsweise kann das Peptid durch Techniken der Festphasenchemie synthetisiert werden, indem den Verfahrensschritten gefolgt wird, welche von Steward et al. in Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Ausgabe, Pierce Chemical Company, Rockford, III., (1984) beschrieben sind, unter Verwendung einer Rainin PTI Symphony-Syntheseapparatur. Gleichermaßen können Peptidfragmente synthetisiert und nachfolgend zur Ausbildung der C34-Peptidsequenz kombiniert oder verbunden werden (Segmentkondensation).
Zur Festphasenpeptidsynthese kann eine Zusammenfassung der vielen Techniken bei Stewart et al. "Solid Phase Peptide Synthesis", W. H. Freemann Co. (San Francisco), 1963 und Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, 1973, 2, 46 gefunden werden. Zur klassischen Synthese in Lösung wird beispielsweise auf Schroder et al. in "The Peptides", Band 1, Academic Press (New York) verwiesen. Im Allgemeinen umfasst ein solches Verfahren die aufeinander folgende Zugabe einer oder mehrerer Aminosäuren oder in geeigneter Weise geschützter Aminosäuren zu einer wachsenden Peptidkette an einem Polymer. Normalerweise ist entweder die Amino- oder Carboxlygruppe der ersten Aminosäure durch eine geeignete Schutzgruppe geschützt. Die geschützte und/oder derivatisierte Aminosäure wird dann entweder an einen inerten Feststoffträger gebunden oder in Lösung durch Zugabe der nächsten Aminosäure in der Sequenz mit der Komplimentären (Amino- oder Carboxyl-)Gruppe, die in geeigneter Weise geschützt ist und unter Bedingungen, welche zur Bildung der Amidbindung geeignet sind, verwendet. Die Schutzgruppe wird dann von diesem neu zugegebenen Aminosäurerest entfernt und die nächste Aminosäure (in geeigneter Weise geschützt) wird zugegeben und so fort.
Nachdem alle gewünschten Aminosäuren in der richtigen Reihenfolge verbunden worden sind, wird jede verbliebene Schutzgruppe (und jeder Feststoffträger) nacheinander oder gleichzeitig abgespalten, um das Endpeptid zu ergeben. Durch einfache Abwandlung dieser allgemeinen Prozedur ist es möglich, gleichzeitig mehr als eine Aminosäure einer wachsenden Kette zuzugeben, beispielsweise durch Kuppeln (unter Bedingungen, welche chirale Zentren nicht racemisieren) eines geschützten Tripeptids mit einem geeignet geschützten Dipeptid, um nach dem Abspalten der Schutzgruppen ein Pentapeptid zu ergeben.
Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der vorliegenden C34-Derivate beinhaltet Festphasenpeptidsynthese, wobei die Aminosäure am α-N-terminalen Ende durch eine säure- oder basenempfindliche Gruppe geschützt ist. Die Schutzgruppen sollten die Eigenschaften aufweisen, dass sie unter den Bedingungen der Peptidbindungsbildung stabil sind, während sie ohne Zerstörung der wachsenden Peptidkette oder Razemisierung irgendwelcher darin enthaltener chiralen Zentren rasch entfernbar sind. Beispiele von N-Schutzgruppen und Carboxi-Schutzgruppen sind in Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", (John Wiley & Sons, New York, Seiten 152–186 (1981)), offenbart, auf welche hier unter Bezugnahme einbezogen wird. Beispiele von N-Schutzgruppen umfassen, ohne Beschränkung, Niederalkanoylgruppen, wie Formyl, Acetyl ("Ac"), Propionyl, Pivaloyl, t-Butylacetyl und dergleichen; weitere Acylgruppen beinhalten 2-Chloracetyl, 2-Bromacetyl, Trifluoracetyl, Trichloracytyl, Phthalyl, o-Nitrophenoxiacetyl, -Chlorbutyryl, Benzoyl, 4-Chlorbenzoyl, 4-Brombenzoyl, 4-Nitrobenzoyl und dergleichen; Sulfonylgruppen, wie Benzolsulfonyl, p-Toluolsulfonyl, o-Nitrophenylsulfonyl, 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl (pmc) und dergleichen; Carbamat bildende Gruppen, wie t-Amyloxicarbonyl, Benzyloxicarbonyl, p-Chlorbenzyloxicarbonyl, p-Methoxi-benzyloxicarbonyl, p-Nitrobenzyloxicarbonyl, 2-Nitrobenzloxicarbonyl, p-Brom benzyloxicarbonyl, 3,4-Dimenthoxibenzyloxicarbonyl, 3,5-Dimethoxibenzyloxicarbonyl, 2,4-Dimethoxibenzyloxicarbonyl, 4-Ethoxibenzyloxicarbonyl, 2-Nitro-4,5-dimethoxi-benzyloxicarbonyl, 3,4,5-Trimethoxibenzyloxicarbonyl, 1-(p-Biphenyl)-1-methylethoxicarbonyl, α,α-Dimethyl-3,5-dimethoxibenzyloxicarbonyl, Benzhydryloxicarbonyl, t-Butyloxicarbonyl (boc), Diisopropylmethoxicarbonyl, Isopropyloxicarbonyl, Ethoxicarbonyl, Methoxicarbonyl, Allyloxicarbonyl, 2,2,2-Trichlorethoxicarbonyl, Phenoxicarbonyl, 4-Nitrophenoxicarbonyl, Fluorenyl-9-methoxicarbonyl, Isobornyloxicarbonyl, Cyclopentyloxicarbonyl, Adamantyloxicarbonyl, Cyclohexyloxicarbonyl, Phenylthiocarbonyl und dergleichen; Arylalkylgruppen, wie Benzyl, Biphenylisopropyloxicarbonyl, Triphenylmethyl, Benzyloximethyl, 9-Fluorenylmethyloxicarbonyl (Fmoc) und dergleichen und Silylgruppen, wie Trimethylsilyl und dergleichen. Bevorzugte α-N-Schutzgruppen sind o-Nitrophenylsulfenyl; 9-Fluorenylmethyloxicarbonyl; t-Butyloxicarbonyl (boc), Isobornyloxicarbonyl; 3,5-Dimethoxibenzyloxicarbonyl; t-Amyloxicarbonyl; 2-Cyan-t-butyloxicarbonyl und dergleichen, wobei 9-Fluorenylmethyloxicarbonyl (Fmoc) bevorzugter ist, während bevorzugte Seitenketten-N-Schutzgruppen 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl (pmc), Nitro, p-Toluolsulfonyl, 4-Methoxibenzolsulfonyl, Cbz, Boc umfassen und Adamantyloxicarbonyl für Seitenkettenaminogruppen, wie Lysin und Arginin; Benzyl, o-Brombenzyloxicarbonyl, 2,6-Dichlorbenzyl, Isopropyl, t-Butyl (t-Bu), Cyclohexyl, Cyclopentyl und Acetyl (Ac) für Tyrosin; t-Butyl, Benzyl und Tetrahydropyranyl für Serin; Trityl, Benzyl, Cbz, p-Toluolsulfonyl und 2,4-Dinitrophenyl für Histidin; Formyl für Tryptophan; Benzyl und t-Butyl für Aspartinsäure und Glutaminsäre; und Triphenylmethyl (Trityl) für Cystein.
Eine Carboxyl-Schutzgruppe bezieht sich herkömmlicherweise auf eine Carbonsäureester- oder amidschutzgruppe. Solche Carboxyl-Schutzgruppen sind dem Fachmann bekannt, da sie beim Schutz von Carboxylgruppen im Penizillin- und Cephalosporinbereich extensiv verwendet wurden, wie in der US-3,840,556 und US- 3,719,667 beschrieben ist, deren Offenbarung unter Bezugnahme darauf hier enthalten ist. Representative Carboxyl-Schutzgruppen umfassen, ohne Beschränkung, C₁-C₈-Niederalkyl; Arylalkyl, wie Phenethyl oder Benzyl und substituierte Derivate davon, wie Alkoxibenzyl- oder Nitrobenzylgruppen; Arylalkenyl, wie Phenylethenyl; Aryl und substituierte Derivate davon, wie 5-Indanyl; Dialkylaminoalkyl, wie Dimethylaminoethyl; Alkanoyloxialkylgruppen, wie Acetoximethyl, Butyryloximethyl, Valeryloximethyl, Isobutyryloximethyl, Isovaleryloximethyl, 1-(Propionyloxi)-1-ethyl, 1-(Pivaloyloxyl)-1-ethyl, 1-Methyl-1-(propionyloxi)-1-etyl, Pivaloyloximethyl, Propionyloximethyl; Cycloalkanoyloxialkylgruppen, wie Cyclopropylcarbonyloximethyl, Cyclobutylcarbonyloximethyl, Cyclopentylcarbonyloximethyl, Cyclohexylcarbonyloximethyl; Aroyloxialkyl, wie Benzoyloximethyl, Benzoyloxiethyl; Arylalkylcarbonyloxialkyl, wie Benzylcarbonyloximethyl, 2-Benzylcarbonyl-oxiethyl; Alkoxicarbonylalkyl oder Cycloalkyloxicarbonyl-alkyl, wie Methoxicarbonylmethyl, Cyclohexyloxicarbonylmethyl, 1-Methoxicarbonyl-1-ethyl; Alkoxicarbonyloxialkyl oder Cycloalkyloxicarbonyloxialkyl, wie Methoxicarbonyloximethyl, t-Butyloxicarbonyloximethyl, 1-Ethoxicarbonyloxi-1-ethyl, 1-Cyclohexyloxicarbonyloxi-1-ethyl; Aryloxicarbonyloxialkyl, wie 2-(Phenoxicarbonyloxi)ethyl, 2-(5-Indanyloxicarbonyloxi)ethyl; Alkoxialkylcarbonyloxialkyl, wie 2-(1-Methoxi-2-methylpropan-2-oyloxi)-ethyl; Arylalkyloxicarbonyloxialkyl, wie 2-(Benzyloxicarbonyloxi)ethyl; Arylalkenyloxicarbonyloxialkyl, wie 2-(3-Phenylpropen-2-yloxicarbonyloxi)ethyl; Alkoxicarbonylaminoalkyl, wie t-Butyloxicarbonylaminomethyl; Alkylaminocarbonylaminoalkyl, wie Methylaminocarbonylaminomethyl; Alkanoylaminoalkyl, wie Acetylaminomethyl; heterozyklisches Carbonyloxialkyl, wie 4-Methylpiperazinylcarbonyloximethyl; Dialkylaminocarbonylalkyl, wie Dimethylaminocarbonylmethyl, Diethylaminocarbonylmethyl; (5-(Niederalkyl)-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl)alkyl, wie (5-t-Butyl-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl)methyl; und (5-Phenyl-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl)alkyl, wie (5-Phenyl-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl)methyl. Representative Amidcarboxi-Schutzgruppen umfassen, ohne Beschränkung, Aminocarbonyl- und Niede ralkylaminocarbonylgruppen. Unter den oben genannten Carboxyl-Schutzgruppen werden Niederalkyl, Cycloalkyl oder Arylalkylester, beispielsweise Methylester, Ethylester, Propylester, Isopropylester, Butylester, sec-Butylester, Isobutylester, Amylester, Isoamylester, Octylester, Cyclohexylester, Phenylethylester und dergleichen oder ein Alkanoyloxialkyl, Cycloalkanoyloxialkyl, Aroyloxialkyl oder ein Arylalkylcarbonyloxialkylester bevorzugt. Bevorzugte Amidcarboxyl-Schutzgruppen sind Niederalkylaminocarbonylgruppen.
Bei dem Festphasenpeptidsyntheseverfahren ist eine Aminosäure mit dem α-C-terminalen Ende an einen geeigneten Feststoffträger oder ein solches Harz gebunden. Geeignete Feststoffträger, welche für die obige Synthese nützlich sind, sind jene Materialien, welche gegenüber den Reagenzien und Reaktionsbedingungen der stufenweisen Kondensation-Entschützen-Reaktionen inert sowie unlöslich in dem verwendeten Medium sind. Der bevorzugte Feststoffträger zur Synthese von α-C-terminalen Carboxylpeptiden ist 4-Hydroximethylphenoxiacetyl-4'-methylbenzylhydrylamin-Harz (HMP-Harz). Der bevorzugte Feststoffträger für ein α-C-terminales Amidpeptid ist ein mit Fmoc geschütztes Ramage-Harz, hergestellt und verkauft durch Bachem Inc., Californien.
Am Ende der Festphasensynthese wird das Peptid vom Harz entfernt und entschützt, entweder in aufeinander folgenden Schritten oder in einem einzigen Arbeitsgang. Entfernen des Peptides und Entschützen kann in herkömmlicher Weise in einem einzigen Arbeitsgang durch Behandeln des an das Harz gebundenen Polypeptids mit einem Spaltreagenz, umfassend Thioanisol, Triisopropylsilan, Phenol und Trifluoressigsäure, durchgeführt werden. In Fällen, in denen das α-C-terminale Ende des Peptids ein Alkylamid ist, wird das Harz durch Aminolyse mit einem Alkylamin abgespalten. Alternativ kann das Peptid durch Umesterung, zum Beispiel mit Methanol, gefolgt durch Aminolyse oder durch direkte Umamidierung entfernt werden. Das geschützte Peptid kann an diesem Punkt gereinigt oder direkt in die nächste Stufe eingeführt werden. Die Entfernung der Seitenket tenschutzgruppen wird unter Verwendung der oben beschriebenen Spaltmischung durchgeführt. Das vollständig entschützte Peptid kann durch eine Sequenz von Chromatographiestufen unter Anwendung jeglicher oder aller der folgenden Typen gereinigt werden: Ionenaustausch an einem schwach basischen Harz (Acetatform); hydrophobe Adsorptionschromatographie an nicht derivatisiertem Polystyrol-Divinylbenzol (wie Amberlite XAD^TM); Silicagel-Adsorptionschromatographie; Ionenaustauschchromatographie an Carboximethylcellulose; Verteilungschromatographie, zum Beispiel an Sephadex G-25^TM, LH-20^TM oder Gegenstromverteilung, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), insbesondere Umkehrphasen-HPLC an Octyl- oder Phenyl/Hexylsilylsiliciumdioxid-Verbundphasen-Säulenpackung. Jeder Fachmann auf dem Gebiet wird dazu in der Lage sein, leicht zu bestimmen, welche die bevorzugten Chromatographieschritte oder Sequenzen sind, welche erforderlich sind, um eine akzeptierbare Reinigung des C34-Peptids zu erhalten.
Molekulargewichte dieser Peptide werden unter Verwendung Elektrosprüh-Massenspektroskopie bestimmt.
Die vorliegenden C34-Derivate können allein oder in Kombination verwendet werden, um ihre therapeutische Wirkung zu optimieren. Sie können in einem physiologisch annehmbaren Medium verabreicht werden, zum Beispiel in entionisiertem Wasser, mit Phosphat gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS), physiologische Kochsalzlösung, wässrigem Ethanol oder einem anderen Alkohol, Plasma, proteinhaltigen Lösungen, Mannitol, wässriger Glucose, Alkohol, Pflanzenöl oder dergleichen. Weitere Additive, welche enthalten sein können, umfassen Puffer, wobei die Medien im Allgemeinen auf einen pH-Wert im Bereich von etwa 5 bis 10 gepuffert werden, wobei der Puffer im Allgemeinen eine Konzentration in einem Bereich von 50 bis 250 mM liegen wird, Salz, wobei die Konzentration an Salz im Allgemeinen im Bereich von 5 bis 500 mM liegen wird, physiologisch akzeptierbare Stabilisatoren und dergleichen. Die Zusammensetzungen können zur vorteilhaften Lagerung und zum Transport ly ophilisiert werden.
Die C34-Derivate können parenteral verabreicht werden, wie intravaskulär (IV), intraarteriell (IA), intramuskulär (IM), subkutan (SC) oder dergleichen. Die Verabreichung kann in geeigneten Situationen auch durch Transfusion erfolgen. In einigen Fällen, wo die Reaktion der funktionellen Gruppe relativ langsam ist, kann die Verabreichung oral, nasal, rektal, transdermal oder mit Hilfe eines Aerosols erfolgen, wo die Natur des Konjugates die Überführung in das vaskuläre System erlaubt. Üblicherweise wird eine einzige Injektion angewendet, obwohl mehr als eine Injektion, falls erforderlich, verwendet werden kann. Das Peptidderivat kann durch alle vorteilhaften Vorrichtungen verabreicht werden, einschließlich Spritzen, Trokar, Katheter oder dergleichen. Die besondere Weise der Verabreichung wird abhängig von der zu verabreichenden Menge, ob eine Einmalgabe oder eine kontinuierliche Verabreichung, oder dergleichen vorgenommen wird, variieren. Vorzugsweise erfolgt die Verabreichung intravaskulär, wobei die Einführungsstelle für die vorliegende Erfindung nicht kritisch ist, jedoch bevorzugt eine Stelle ist, wo ein rascher Blutfluss vorliegt, zum Beispiel intravenös die periphere oder zentrale Vene. Es können andere Wege Anwendung finden, bei denen die Verabreichung mit einer Technik zur langsamen Freigabe oder einer Schutzmatrix verbunden ist. Es ist Absicht, dass das C34-Derivat wirksam im Blut verteilt wird, so dass es mit den Blutkomponenten reagieren kann. Die Konzentration des Konjugates wird in einem weiten Bereich variieren, im Allgemeinen von etwa 1 pg/ml bis 50 mg/ml. Die intravaskuläre Gesamtverabreichung wird im Allgemeinen im Bereich von etwa 0,1 mg/ml bis etwa 10 mg/ml oder üblicher etwa 1 mg/ml bis etwa 5 mg/ml liegen.
Durch die Bindung an langlebige Komponenten des Bluts, wie Immunoglobulin, Serumalbumin, rote Blutzellen und Blutplättchen, stellen sich eine Anzahl von Vorteilen ein. Die Aktivität der C34-Derivate wird um Tage bis Wochen verlängert. Es erfordert nur eine einmalige Verabreichung während dieses Zeitraums. Es kann eine größere Spezifizität erreicht werden, da die aktive Verbindung hauptsächlich an große Moleküle gebunden werden wird, wodurch es weniger wahrscheinlich wird, intrazellulär aufgenommen zu werden, um dann mit anderen physiologischen Prozessen zu interferieren.
Die Bildung der kovalenten Bindung zwischen dem Blutbestandteil kann in vivo oder ex vivo auftreten. Zur kovalenten ex vivo Bindungsbildung wird das C34-Derivat Blutserum oder einer physiologischen Kochsalzlösung, welche gereinigte Blutkomponenten enthält, wie humanes Serumalbumin oder IgG, zugegeben, um eine kovalente Bindungsbildung zwischen dem Derivat und der Blutkomponente zu erlauben. Nach einem bevorzugten Prinzip wird das C34-Derivat mit humanem Serumalbumin in physiologischer Kochsalzlösung umgesetzt. Nach Bildung des Konjugats kann das letztere dem Probanden verabreicht oder lyophilisiert werden.
Das Blut des Säugetierwirts kann auf die Aktivität des C34-Peptids und/oder die Anwesenheit von C34-Derivaten überwacht werden. Durch Entnahme einer Blutprobe vom Wirt zu verschiedenen Zeiten, kann man bestimmen, ob das C34-Peptid an die langlebigen Blutkomponenten in ausreichendem Maße für eine therapeutische Wirkung gebunden werden und danach der Spiegel von C34 im Blut. Erforderlichenfalls kann auch bestimmt werden, an welche der Blutkomponenten C34 kovalent gebunden ist. Eine Untersuchung bzw. Aufzeichnung kann auch unter Verwendung von Assays der C34-Aktivität, HPLC-MS oder auf C34 gerichtete Antikörper stattfinden.
Die folgenden Beispiele sind zur Veranschaulichung bevorzugter Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung angegeben und sollen in keiner Weise den Umfang davon beschränken.
Die vorliegenden C34-Derivate können an Patienten gemäß den unten beschriebenen Verfahren und weiteren im Stand der Tech nik bekannten Methoden verabreicht werden. Wirksame therapeutische Dosen der vorliegenden C34-Derivate können durch dem Fachmann gut bekannte Prozeduren bestimmt werden und alle Anbelange über potenzielle Toxizität von C34 berücksichtigen.
Das vorliegende C34-Derivat kann auch prophylaktisch an vorher nicht infizierte Individuen verabreicht werden. Das kann in Fällen vorteilhaft sein, in denen ein Individuum einem hohen Risiko unterliegt, einem Virus ausgesetzt (worden) zu sein, wie das Auftreten kann, wenn ein Individuum mit einem infizierten Individuum in Kontakt war und ein hohes Risiko der viralen Übertragung vorliegt. Das kann insbesondere dann vorteilhaft sein, wenn es eine bekannte Heilung bzw. Behandlung für den Virus, wie dem HIV-Virus, gibt. Als ein Beispiel wäre eine prophylaktische Verabreichung des C34-Derivats in Situationen vorteilhaft, in denen eine Pflegepersonalperson mit dem Blut eines HIV-infizierten Individuums in Kontakt gebracht war oder in anderen Situationen, in denen ein Individuum, das in hochrisikoreichen Aktivitäten involviert ist, welche dieses Individuum potentiell mit dem HIV-Virus in Kontakt bringen.
Die vollständig beschriebene Erfindung kann des Weiteren unter Bezugnahme auf die folgenden nicht beschreibenden Beispiele berücksichtigt und verstanden werden.
Allgemeines
Wenn nichts anderes angegeben ist, wurde die Synthese eines jeden C34-Derivates unter Verwendung einer automatisierten Festphasenverfahren an einer Symphony-Peptidsynthesevorrichtung unter händischer Einwirkung während der Generierung des Derivates durchgeführt werden. Die Synthese wurde an einem Fmoc-geschützten Ramage Amidlinker-Harz unter Verwendung von Fmoc-geschützten Aminosäuren durchgeführt. Die Kupplung wurde unter Verwendung von O-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyl-uroniumhexafluorphosphat (HBTU) als Aktivator in N,N-Dimethylformamid-(DMF)-Lösung und Diisopropylethylamin (DIEA) als Base erreicht. Die Fmoc-Schutzgruppe wurde unter Verwendung von 20% Piperidin/DMF entfernt. Erforderlichenfalls wurde eine Boc-geschützte Aminosäure am N-terminalen Ende verwendet, um das N_α-terminale Ende zu erzeugen, nachdem das Peptid vom Harz abgespalten ist. Alle während der Synthese verwendeten Aminosäuren besitzen die L-Stereochemie. Reaktionsbehälter aus Glas wurden während der Synthese verwendet.
Beispiel 1
Verbindung der Formel I
Schritt 1: Das Beispiel beschreibt die Festphasenpeptidsynthese der Verbindung in einem 100 μmol-Maßstab. Die folgenden geschützten Aminosäuren wurden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH. Sie wurden in N,N-Dimethylformamid (DMF) aufgelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wurde unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) während 20 Minuten (Schritt 1) erreicht. Die Aminogruppe der endständigen Aminosäure wurde unter Verwendung von Essigsäure acetyliert, welche unter Verwendung von O-Benzotriazol-1-yl,N,N,N',N'-tetramethyl-uroniumhexafluorphosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert war.
Schritt 2: Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wur de händisch durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. von Pd(PPh₃)₄, aufgelöst in 5 ml C₆H₆CHCl₃ (1:1) : 2,5% NMM (v:v) : 5% AcOH (v:v) während 2 Stunden (Schritt 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% AcOH in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen.
Schritt 3: Die Synthese wurde dann für die Zugabe von Fmoc-AEEA-OH und der 3-Maleimidpropionsäure (Schritt 3) reautomatisiert. Zwischen jeder Kupplung wurde das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol (iPrOH) gewaschen.
Schritt 4: Das Peptid wurde von dem Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% Triisopropylsilan (TIPS)/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und danach durch trockeneiskaltes Et₂O ausgefällt (Schritt 4).
Beispiel 2
Verbindung der Formel II
Schritt 1: Das Beispiel beschreibt die Festphasenpeptidsynthese der Verbindung in einem 100 μmol-Maßstab. Die folgenden geschützten Aminosäuren wurden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH. Sie wurden in N,N-Dimethylformamid (DMF) aufgelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wurde unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) während 20 Minuten (Schritt 1) erreicht. Die Aminogruppe der endständigen Aminosäure wurde unter Verwendung von Essigsäure acetyliert, welche unter Verwendung von O-Benzotriazol-1-yl,N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert war.
Schritt 2: Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wurde händisch durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. von Pd(PPh₃)₄, aufgelöst in 5 ml C₆H₆CHCl₃ (1:1) : 2,5% NMM (v:v) : 5% AcOH (v:v) während 2 Stunden (Schritt 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% AcOH in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen.
Schritt 3: Die Synthese wurde dann für die Zugabe von Fmoc-AEEA-OH und der 3-Maleimidpropionsäure (Schritt 3) reautomatisiert. Zwischen jeder Kupplung wurde das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol (iPrOH) gewaschen.
Schritt 4: Das Peptid wurde von dem Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und danach durch trockeneiskaltes Et₂O ausgefällt (Schritt 4).
Beispiel 3
Verbindung der Formel III
Schritt 1: Das Beispiel beschreibt die Festphasenpeptidsynthese der Verbindung in einem 100 μmol-Maßstab. Die folgenden geschützten Aminosäuren wurden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc- Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH. Sie wurden in N,N-Dimethylformamid (DMF) aufgelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wurde unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) während 20 Minuten (Schritt 1) erreicht. Die Aminogruppe der endständigen Aminosäure wurde unter Verwendung von Essigsäure acetyliert, welche unter Verwendung von O-Benzotriazol-1-yl,N,N,N',N'-tetramethyl-uroniumhexafluorphosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert war.
Schritt 2: Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wurde händisch durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. von Pd(PPh₃)₄, aufgelöst in 5 ml C₆H₆CHCl₃ (1:1) : 2,5% NMM (v:v) : 5% AcOH (v:v) während 2 Stunden (Schritt 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% AcOH in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen.
Schritt 3: Die Synthese wurde dann für die Zugabe von Fmoc-AEEA-OH und der 3-Maleimidpropionsäure (Schritt 3) reautomatisiert. Zwischen jeder Kupplung wurde das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol (iPrOH) gewaschen.
Schritt 4: Das Peptid wurde von dem Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und danach durch trockeneiskaltes Et₂O ausgefällt (Schritt 4).
Beispiel 4
Verbindung der Formel IV
Schritt 1: Das Beispiel beschreibt die Festphasenpeptidsynthese der Verbindung in einem 100 μmol-Maßstab. Die folgenden geschützten Aminosäuren wurden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH. Sie wurden in N,N-Dimethylformamid (DMF) aufgelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wurde unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) während 20 Minuten (Schritt 1) erreicht. Die Aminogruppe der endständigen Aminosäure wurde unter Verwendung von Essigsäure acetyliert, welche unter Verwendung von O-Benzotriazol-1-yl,N,N,N',N'-tetramethyl-uroniumhexafluorphosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert war.
Schritt 2: Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wurde händisch durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. von Pd(PPh3)4, aufgelöst in 5 ml C₆H₆CHCl₃ (1:1) : 2,5% NMM (v:v) : 5% AcOH (v:v) während 2 Stunden (Schritt 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% AcOH in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen.
Schritt 3: Die Synthese wurde dann für die Zugabe von Fmoc- AEEA-OH und der 3-Maleimidpropionsäure (Schritt 3) reautomatisiert. Zwischen jeder Kupplung wurde das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol (iPrOH) gewaschen.
Schritt 4: Das Peptid wurde von dem Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und danach durch trockeneiskaltes Et₂O ausgefällt (Schritt 4).
Beispiel 5
Verbindung der Formel V
Schritt 1: Das Beispiel beschreibt die Festphasenpeptidsynthese der Verbindung in einem 100 μmol-Maßstab. Die folgenden geschützten Aminosäuren wurden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH. Sie wurden in N,N-Dimethylformamid (DMF) aufgelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU) und Diisopropylehtylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe wurde unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) während 20 Minuten (Schritt 1) erreicht. Die Aminogruppe der endständigen Aminosäure wurde unter Verwendung von Essigsäure acetyliert, welche unter Verwendung von O-Benzotriazol-1-yl,N,N,N',N'-tetramethyl-uroniumhexafluorphosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert war.
Schritt 2: Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wurde händisch durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. von Pd(PPh3)4, aufgelöst in 5 ml C₆H₆CHCl₃ (1:1) : 2,5% NMM (v:v) : 5% AcOH (v:v) während 2 Stunden (Schritt 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃ (6 × 5 ml), 20% AcOH in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen.
Schritt 3: Die Synthese wurde dann für die Zugabe der 3-Maleimidpropionsäure (Schritt 3) re-automatisiert. Zwischen jeder Kupplung wurde das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol (iPrOH) gewaschen.
Schritt 4: Das Peptid wurde von dem Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und danach durch trockeneiskaltes Et₂O ausgefällt (Schritt 4).
Beispiel 6
Verbindung der Formel VI
Schritt 1: Das Beispiel beschreibt die Festphasenpeptidsynthese der Verbindung in einem 100 μmol-Maßstab. Die folgenden geschützten Aminosäuren wurden nacheinander dem Harz zugegeben: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH. Sie wurden in N,N-Dimethylformamid (DMF) aufgelöst und gemäß der Sequenz unter Verwendung von O-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert. Die Entfernung der Fmoc- Schutzgruppe wurde unter Verwendung einer Lösung von 20% (V/V) Piperidin in N,N-Dimethylformamid (DMF) während 20 Minuten (Schritt 1) erreicht. Die Aminogruppe der endständigen Aminosäure wurde unter Verwendung von Essigsäure acetyliert, welche unter Verwendung von O-Benzotriazol-1-yl,N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU) und Diisopropylethylamin (DIEA) aktiviert war.
Schritt 2: Das selektive Entschützen der Lys(Aloc)-Gruppe wurde händisch durchgeführt und durch Behandlung des Harzes mit einer Lösung von 3 Äqu. von Pd(PPh3)4, aufgelöst in 5 ml C₆H₆CHCl₃ (1:1) : 2,5% NMM (v:v) : 5% AcOH (v:v) während 2 Stunden (Schritt 2) erreicht. Das Harz wird dann mit CHCl₃(6 × 5 ml), 20% AcOH in DCM (6 × 5 ml), DCM (6 × 5 ml) und DMF (6 × 5 ml) gewaschen.
Schritt 3: Die Synthese wurde dann für die Zugabe von Fmoc-AEEA-OH und der 3-Maleimidpropionsäure (Schritt 3) reautomatisiert. Zwischen jeder Kupplung wurde das Harz dreimal mit N,N-Dimethylformamid (DMF) und dreimal mit Isopropanol (iPrOH) gewaschen.
Schritt 4: Das Peptid wurde von dem Harz unter Verwendung von 85% TFA/5% TIS/5% Thioanisol und 5% Phenol abgespalten und danach durch trockeneiskaltes Et₂O ausgefällt (Schritt 4).
Zelluläre Anti-HIV-Untersuchung (MTT-Untersuchung)
Die antivirale Aktivität wurde wie in "Journal of Virological Methods", 1988, 20, 309–321 beschrieben, bestimmt. Kurz gesagt wurden verschiedene Konzentrationen der Testverbindung in jede Quelle einer Flachboden-Mikrotiterplatte eingebracht. Nachfolgend wurden HIV-Stämme (HIV-1 IIIB) und MT-4-Zellen auf eine Endkonzentration von 200 CCID₅₀/Quelle bzw. 30.000 Zellen/Quelle zugegeben. Um die Toxizität der Testverbindung zu bestimmen, wurden scheininfizierte Zellkulturen, welche einen identischen Konzentrationsbereich der Verbindung enthielten, parallel mit den HIV-infizierten Zellkulturen inkubiert. Nach 5 Tagen Inkubation (37 °C, 5% CO₂) wurde die Lebensfähigkeit der Zellen durch das Tetrazoliumcolorimetrie-MTT-Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse beider Untersuchungen sind in Tabelle 2 unten gezeigt.
Tabelle 2

Claims

Eine Verbindung der Formeln I–VI
Pharmazeutische Zusammensetzung, aufweisend eine Verbindung nach Anspruch 1 in Kombination mit einem pharmazeutisch verwendbaren Trägermittel.
Zusammensetzung nach Anspruch 2 zum Inhibieren der Aktivität von HIV, RSV, HPV, MeV oder SIV.
Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 1, alleine oder in Kombination mit einem pharmazeutisch verwendbaren Trägermittel, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Inhibition der Aktivität von HIV, RSV, HPV, MeV oder SIV.
Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Inhibition der Aktivität von HIV, RSV, HPV, MeV oder SIV, wobei die Verbindung kovalent an einen Blutbestandteil gebunden ist.
Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Inhibition der Aktivität von HIV, RSV, HPV, MeV oder SIV, wobei die Verbindung in vivo mit einem Blutbestandteil kovalent verbindbar ist.
Konjugat, aufweisend eine Verbindung gemäß Anspruch 1, kovalent an einen Blutbestandteil gebunden.