PT1479691E - Inibidores de péptido de fusão de longa duração para a infecção por hiv - Google Patents
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Description
ΕΡ 1 479 691 /PT
DESCRIÇÃO "Inibidores de péptido de fusão de longa duração para a infecção por HIV"
CAMPO DO INVENTO 0 presente invento refere-se a derivados de péptido C34 que são inibidores de infecção virai e/ou exibem propriedades antifusogénicas. Em particular, este invento refere-se a derivados de C34 possuindo actividade de inibição contra vírus de imunodeficiência humana (HIV), vírus sincicial respiratório (RSV), vírus parainfluenza humano (HPV), vírus do sarampo (MeV) e vírus de imunodef iciência de símio (SIV), com longa duração de acção, para o tratamento das infecções virais respectivas.
ANTECEDENTES DO INVENTO
Os eventos de fusão de membrana, embora comuns em processos biológicos de células normais, estão também envolvidos numa variedade de estados de doença, incluindo, por exemplo na entrada de vírus com invólucro no interior das células. São conhecidos péptidos que inibem ou de outro modo interrompem os eventos associados à fusão de membrana, incluindo, por exemplo, inibição da transmissão retroviral a células não infectadas. 0 HIV é um membro da família lentivírus dos retrovírus, e existem dois tipos predominantes de HIV, HIV-1 e H1V-2, tendo sido identificadas várias estirpes de cada um deles. 0 HIV dirige-se às células CD4+, e a entrada virai depende da ligação da proteína do HIV gpl20 à glicoproteína CD4 e a um receptor de quimioquina sobre a superfície da célula. É conhecido que o C34 exibe actividade antiviral contra o HIV, incluindo inibição da infecção de células CD-4+ por vírus livre e/ou inibição da formação de sincícios induzida por HIV entre células CD4+ infectadas e não infectadas. Crê-se que a inibição ocorre por ligação de C34 à primeira região de repetição de septeto ("heptad repeat") na gp41 e impedindo assim a primeira e segunda repetições de septeto de formatarem a estrutura em gancho fusogénico. É conhecido que o C34 possui actividade antifusogénica, i.e., possui a capacidade para inibir ou reduzir o nível de 2 ΕΡ 1 479 691 /PT eventos de fusão de membrana entre duas ou mais entidades, e.g., vírus-célula ou célula-célula, em relação ao nível de fusão de membrana que ocorre na ausência do péptido. Mais especificamente, a WO 00/06599 ensina a utilização de C34 para inactivar a gp41 e assim prevenir ou reduzir a entrada de HIV-1 no interior das células.
Também WO 99/59615 descreve sequências peptídicas potenciadoras ("enhancer") originalmente derivadas de várias sequências de proteína (gp41) de invólucro retroviral que melhoram as propriedades farmacocinéticas de qualquer polipéptido de núcleo ao qual estas estão ligadas. WO 99/59615 refere-se ainda a métodos para melhorar as propriedades farmacocinéticos de qualquer polipéptido nuclear através de ligação das sequências peptídicas potenciadoras ao polipéptido nuclear.
Embora muitos dos péptidos antivirais ou antifusogénicos descritos na especialidade exibam uma potente actividade antiviral e/ou ant if usogénica, o 034, tal como todos estes péptidos, enferma de uma semivida curta in vivo, principalmente devido à depuração rápida a partir do soro e à actividade de peptidase e protease. Por sua vez, isto reduz grandemente a sua actividade antiviral efectiva.
Existe deste modo uma necessidade de um método para prolongamento da semivida de péptidos, tais como o C34, in vivo sem afectar substancialmente a actividade antifusogénica.
SUMÁRIO DO INVENTO
De acordo com o presente invento, são agora proporcionados derivados de péptido C34 possuindo uma semivida in vivo prolongada quando comparada com a da sequência do péptido C34 não modificada correspondente. Mais especificamente, o presente invento refere-se a compostos de Fórmulas I e II a seguir ilustradas, que são susceptíveis de reagirem com grupos tiol num componente do sangue, quer in vivo quer ex vivo, para formar uma ligação covalente estável.
3 ΕΡ 1 479 691 /PT SEQID. NO. 1
íD SEQ 1D. NO. 1 o o NH-WMEWDRBNNVTSUHSLiEESQNQQEKMgQELl-CONH-í Π
Os componentes do sangue preferidos compreendem proteínas tais como imunoglobulinas, incluindo IgG e IgM, albumina sérica, ferritina, proteínas de ligação a esteróides, transf errina, proteína de ligação a tiroxina, ot-2-macroglobulina etc., sendo a albumina sérica e a IgG mais preferidas, e sendo a albumina sérica a mais preferida.
Noutro aspecto do invento, é proporcionada uma composição farmacêutica compreendendo os derivados de Fórmulas I e II em combinação com um transportador farmaceuticamente aceitável. Uma tal composição é útil para inibição da actividade de HIV, RSV, HPV, MeV ou SIV.
Numa concretização adicional do presente invento, é proporcionado um método para inibição da actividade de HIV, RSV, HPV, MeV ou SIV. 0 método compreende administrar a um sujeito, preferivelmente um mamífero, uma quantidade eficaz dos compostos de Fórmulas I e II ou de um seu conjugado, sozinho ou em combinação com um transportador farmacêutico. é de do
Num aspecto adicional do presente invento, proporcionado um conjugado compreendendo os compostos Fórmulas I e II ligados covalentemente a um componente sangue.
Num aspecto adicional do presente invento, é proporcionado um método para prolongamento da semivida in vivo do péptido C34 num sujeito, o método compreendendo ligar covalentemente os compostos de Fórmulas I e II a um componente do sangue. 4
ΕΡ 1 479 691 /PT
DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO 0 presente invento vai ao encontro destas e doutras necessidades e é dirigido a derivados de péptidos C34 de Fórmulas I e II possuindo actividade antiviral e/ou actividade antifusogénica. Estes derivados de péptidos C34 proporcionam uma estabilidade acrescida in vivo e uma susceptibilidade reduzida à degradação por peptidase ou protease. Como resultado, os compostos de Fórmulas I e II minimizam a necessidade de administração dos péptidos mais frequente, ou mesmo continua. Os presentes derivados de C34 podem ser utilizados, e.g., como profilácticos contra e/ou para tratamento de infecção por vários virus, incluindo virus de imunodeficiência humana (HIV), virus sincicial respiratório humano (RSV), virus parainfluenza humano (HPV), virus do sarampo (MeV) e virus da imunodeficiência de simio (SIV). A modificação efectuada à sequência do péptido C34 nativo permite que este reaja com grupos tiol disponíveis em componentes do sangue para formar ligações covalentes estáveis. Numa concretização do invento, o componente do sangue compreende uma proteína do sangue, incluindo uma proteína móvel do sangue tal como albumina, que é muito preferida.
Os compostos de Fórmulas I e II inibem a infecção virai de células, por exemplo, por inibição da fusão célula-célula ou da infecção por vírus livre. A via de infecção pode envolver fusão de membrana, como ocorre no caso de vírus com invólucro ou encapsulados, ou qualquer outro evento de fusão envolvendo estruturas virais e celulares.
Os componentes do sangue aos quais os presentes derivados de C34 antivirais se ligam covalentemente podem ser quer fixos quer móveis. Componentes do sangue fixos são componentes do sangue não móveis e incluem tecidos, receptores de membrana, proteínas intersticiais, proteínas de fibrina, colagénios, plaquetas, células endoteliais, células epiteliais e seus receptores associados a membrana e membranosos, células somáticas do corpo, células de músculo esquelético e liso, componentes neuronais, osteócitos e osteoclastos, e todos os tecidos corporais especialmente aqueles associados aos sistemas circulatório e linfático Os componentes móveis do sangue são componentes do sangue que não têm um sítio fixo durante um qualquer período de tempo prolongado, geralmente 5 ΕΡ 1 479 691 /PT não excedendo 5 minutos, e mais usualmente um minuto. Estes componentes do sangue não estão associados a membranas e estão presentes no sangue, por períodos de tempo prolongados, numa concentração mínima de pelo menos 0,1 pg/ml. Componentes móveis do sangue incluem albumina sérica, transferrina, ferritina e imunoglobulinas, tais como IgM e IgG. A semivida de componentes móveis do sangue é de pelo menos cerca de 12 horas.
Durante o processo de síntese do presente derivado de C34 podem ser requeridos grupos protectores. Estes grupos protectores são convencionais no campo da síntese de péptidos, e podem ser geralmente descritos como porções químicas capazes de protegerem o derivado peptídico da reacção com outros grupos funcionais. Estão disponíveis comercialmente vários grupos protectores, e seus exemplos podem ser encontrados na US 5 493 007 que é aqui incorporada por referência. Exemplos típicos de grupos protectores adequados incluem acetilo, fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC), t-butiloxicarbonilo (BOC), benziloxicarbonilo (CBZ), etc. Para além disso, a Tabela 1 proporciona ambas as abreviaturas de aminoácidos de três letras e de uma letra. 6
ΕΡ 1 479 691 /PT TABELA 1
AMINOÁCIDOS NATURAIS E SUAS ABREVIATURAS Nome Abreviatura de 3 letras Abreviatura de 1 letra Alanina Ala A Arginina Arg R Asparagina Asn N Ácido aspártico Asp D Cisteína Cys C Ácido glutâmico Glu E Glutamina Gin Q Glicina Gly G Histidina His H Isoleucina Ile I Leucina Leu L Lisina Lys K Metionina Met M Fenilalanina Phe F Prolina Pro P Serina Ser S Treonina Thr T Triptofano Trp W Tirosina Tyr Y Valina Vai V
Os presentes derivados de C34 podem ser administrados in vivo tal que a conjugação com componentes do sangue ocorre in vivo, ou podem ser primeiro conjugados com componentes do sangue in vitro e o derivado conjugado resultante administrado in vivo. 0 presente invento tira partido das propriedades de péptidos antivirais e antifusogénicos existentes. Os virus que podem ser inibidos pelos péptidos incluem, mas não estão limitados a todas as estirpes de vírus listadas, e.g., nas US 6 013 263 e US 6 017 536 nas suas Tabelas V-VII e IX-XIV. Estes vírus incluem, e.g., retrovírus humano, incluindo HIV-1, HIV-2 e vírus de linfócitos T humano (HTLV-I e HTLV-II], e retrovírus não humanos, incluindo vírus de leucose bovina, vírus de sarcoma felino, vírus da leucemia felina, vírus da imunodeficiência de símio (SIV), vírus do sarcoma de símio, vírus da leucemia de símio e vírus da pneumonia progressiva de 7 ΕΡ 1 479 691 /PT ovino. Vírus não retrovirais podem também ser inibidos pelos presentes derivados de C34, incluindo vírus sincicial respiratório humano (RSV), vírus da esgana canina, vírus da Doença de Newcastle, vírus parainfluenza humano (HPIV), vírus influenza, vírus do sarampo (MeV), vírus de Epstein-Barr, vírus da hepatite B e vírus de Mason-Pfizer de símio. Vírus sem invólucro podem também ser inibidos pelos presentes derivados de C34, e incluem, mas não estão limitados a, picornavírus tais como poliovírus, vírus de hepatite A, enterovírus, ecovírus, vírus "coxsackie", papovavírus tais como papilomavírus, parvovírus, adenovírus e reovírus. 0 cerne do presente invento consiste em modificar a sequência do péptido C34 para conferir a este péptido biodisponibilidade melhorada, semivida prolongada e melhor distribuição, através da conjugação selectiva do péptido sobre um transportador de proteína sem modificar substancialmente as propriedades antivirais do péptido. 0 transportador escolhido para este invento (mas não limitado a este) seria albumina conjugada através do seu tiol livre.
Os presentes derivados de C34 são desenhados para reagir especificamente com grupos tiol em proteínas móveis do sangue. Esta reacção é estabelecida por ligação covalente do péptido modificado com uma ligação maleimida a um grupo tiol numa proteína móvel do sangue tal como albumina sérica ou IgG.
Sendo os grupos tiol menos abundantes in vivo do que, por exemplo, os grupos amino, o péptido C34 modificado com maleimida do presente invento ligar-se-á covalentemente a menos proteínas. Por exemplo, na albumina (a proteína mais abundante no sangue) existe apenas um único grupo tiol. Assim, um conjugado de C34-maleimida-albumina tenderá a compreender uma proporção molar de péptido C34 para albumina de aproximadamente 1:1. Para além da albumina, as moléculas de IgG (classe II) possuem também grupos tiol livres. Uma vez que as moléculas de IgG e a albumina do soro constituem a maior parte da proteína solúvel no sangue, estas proporcionam também a maioria dos grupos tiol livres no sangue que estão disponíveis para se ligarem covalentemente ao derivado peptídico C34.
Adicionalmente, mesmo entre proteínas do sangue contendo tiol livre, incluindo IgG, a marcação específica com uma maleimida conduz à formação preferencial de um conjugado C34- 8 ΕΡ 1 479 691 /PT maleimida-albumina devido às características únicas da própria albumina. O grupo tiol livre único de albumina, altamente conservado entre espécies, está localizado no resíduo aminoácido 34 (Cys34) . Tem sido demonstrado recentemente que a Cys34 de albumina tem reactividade aumentada em relação a tióis livres noutras proteínas contendo tiol livre. Isto é devido em parte ao muito baixo valor de pK de 5,5 para a Cys34 de albumina. Este é muito inferior aos valores de pK típicos para resíduos cisteína em geral, que são tipicamente cerca de 8. Devido a este pK baixo, sob condições fisiológicas normais, a Cys de albumina esta predominantemente na forma ionizada, o que aumenta dramaticamente a sua reactividade. Para além do valor de pK baixo de Cys34, outro factor que melhora a reactividade de Cys34 é a sua localização, que está numa bolsa hidrófoba próxima da superfície de uma laçada da região V de albumina. Esta localização torna a Cys34 muito disponível a ligandos de todos os tipos, e é um factor importante no papel biológico da Cys34 como armadilha de radicais livres e extintora de tióis livres. Estas propriedades tornam a Cys34 altamente reactiva com maleimida-C34, e a aceleração da velocidade de reacção pode ser tão elevada quanto 1000 vezes em relação a velocidades de reacção de maleimida-C34 com outras proteínas contendo tiol livre.
Outra vantagem dos conjugados C34-maleimida-albumina é a reprodutibilidade associada com o carregamento 1:1 de C34 para albumina especificamente na Cys34. Outras técnicas, tais como activação com glutaraldeído, DCC, EDC e outras activações químicas, e.g., de aminas livres, não possuem esta selectividade. Por exemplo, a albumina contém 52 resíduos lisina, 25-30 dos quais estão localizados à superfície da albumina e deste modo acessíveis para conjugação. A activação destes resíduos lisina, ou alternativamente a modificação de C34 para se acoplar através destes resíduos lisina, resulta numa população heterogénea de conjugados. Mesmo se se utilizarem proporções molares 1:1 de C34 para albumina, o rendimento consistirá de múltiplos produtos de conjugação, alguns contendo 0, 1, 2 ou mais C34 por albumina, e cada um possuindo C34 acoplados aleatoriamente a qualquer um ou mais dos 25-30 sítios lisina disponíveis. Considerando as numerosas combinações possíveis, torna-se difícil a caracterização da composição exacta e da natureza de cada lote de conjugado, e a reprodutibilidade de lote para lote é de todo impossível, tornando estes conjugados menos desejáveis como um agente terapêutico. Adicionalmente, embora parecesse que a conjugação 9 ΕΡ 1 479 691 /PT através de resíduos lisina de albumina teria pelo menos a vantagem de entregar mais agente terapêutico por molécula de albumina, estudos têm mostrado que é preferida uma proporção 1:1 de agente terapêutico para albumina. Num artigo por Stehle, et al., "The Loading Rate Determines Tumor Targeting Properties of Metotrexate-Albumin Conjugates in Rats," Anti-Cancer Drugs, Vol. 8, pp. 677-685 (1988), aqui incorporado na sua totalidade, os autores noticiam que uma proporção 1:1 do metotrexato anticanceroso para albumina conjugada via glutaraldeído deu os resultados mais promissores. Estes conjugados foram preferencialmente incorporados por células de tumor, enquanto que conjugados portadores de 5:1 a 20:1 moléculas de metotrexato tiveram perfis de HPLC alterados e foram incorporados rapidamente pelo fígado in vivo. É postulado que, para estas proporções mais elevadas, as alterações de conformação na albumina diminuem a sua eficácia como transportador terapêutico.
Através da administração controlada dos presentes derivados de C34 in vivo, pode-se controlar a marcação específica de albumina e de IgG in vivo. Em administrações típicas, 80-90% dos derivados de C34 administrados marcarão a albumina e menos de 5% marcarão a IgG. Ocorrerá também a marcação vestigiária de tióis livres tais como na glutationa. Esta marcação específica é preferida para utilização in vivo uma vez que permite um cálculo exacto da semivida estimada de C34.
Para além de proporcionar marcação in vivo específica controlada, os presentes derivados de C34 podem proporcionar marcação específica de albumina sérica e de IgG ex vivo. Esta marcação ex vivo envolve a adição dos derivados de C34 a sangue, soro ou solução salina contendo albumina sérica e/ou IgG. Após ter ocorrido a conjugação ex vivo com o derivado de C34, o sangue, soro ou solução salina podem ser readministrados ao sangue do paciente para tratamento in vivo, ou liofilizados.
Os presentes derivados de C34 podem ser sintetizados por métodos padrão da química dos péptidos em fase sólida, bem conhecidos de uma pessoa competente na matéria. Por exemplo, o péptido pode ser sintetizado por técnicas de química em fase sólida seguindo os procedimentos descritos por Steward et al. em Solid Phase Peptid Synthesis, 2.a Ed., Pierce Chemical Company, Rockford, IL., (1984), utilizando um sintetizador 10
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Rainin PTI Symphony. Similarmente, fragmentos de péptidos podem ser sintetizados e subsequentemente combinados ou ligados em conjunto para formar a sequência do péptido C34 (condensação de segmentos).
Para a síntese de péptidos em fase sólida, um resumo das muitas técnicas pode ser encontrado em Stewart et al. em "Solid Phase Peptid Synthesis", W.H. Freeman Co. (San Francisco), 1963 e em Meienhofer, Hormonal Proteins and
Peptids, 19 73, 2_ 46. Para a síntese clássica em solução, ver por exemplo Schroder et al. em " The Peptids11, volume 1, Academic Press (New York). Em geral, este método compreende a adição sequencial de um ou mais aminoácidos ou aminoácidos adequadamente protegidos a uma cadeia peptídica em crescimento sobre um polímero. Normalmente, qualquer dos grupos amino ou carboxilo do primeiro aminoácido está protegido por um grupo protector adequado. O aminoácido protegido e/ou derivatizado é depois, ou ligado a um suporte sólido inerte, ou utilizado em solução, adicionando o aminoácido seguinte na sequência, com o grupo complementar (amino ou carboxilo) adequadamente protegido e sob condições adequadas para formar a ligação amida. Remove-se depois o grupo protector deste resíduo aminoácido recentemente acrescentado e adiciona-se o aminoácido seguinte (adequadamente protegido), e assim sucessivamente.
Após todos os aminoácidos desejados terem sido ligados na sequência adequada, quaisquer grupos protectores restantes (e qualquer suporte sólido) são clivados sequencialmente ou simultaneamente para proporcionar o péptido final. Por simples modificação deste procedimento geral, é possível adicionar mais do que um aminoácido de uma só vez a uma cadeia em crescimento, por exemplo, por acoplamento (sob condições que não racemizem centros quirais) de um tripéptido protegido com um dipéptido apropriadamente protegido para formar, após desprotecção, um pentapéptido.
Um método particularmente preferido para preparar os presentes derivados de C34 envolve síntese de péptidos em fase sólida, onde o aminoácido α-Ν-terminal é protegido por um grupo sensível a ácido ou base. Estes grupos protectores deverão ter as propriedades de serem estáveis nas condições de formação da ligação peptídica, sendo ao mesmo tempo prontamente removíveis sem destruição da cadeia peptídica em crescimento ou racemização de qualquer dos centros quirais aí 11 ΕΡ 1 479 691 /PT contidos. Exemplos de grupos protectores de N e de grupos protectores de carboxi são revelados em Greene, "Protective Groups In Organic Synthesis," (John Wiley & Sons, New York pp. 152-186 (1981)), que é aqui incorporado por referência. Exemplos de grupos protectores de N compreendem, sem limitação, grupos alcanoilo inferior tais como formilo, acetilo ("Ac"), propionilo, pivaloílo, t-butilacetilo e outros; outros grupos acilo incluem 2-cloroacetilo, 2-bromoacetilo, trifluoroacetilo, tricloroacetilo, ftalilo, o-nitrofenoxiacetilo, -clorobutirilo, benzoilo, 4-cloro-benzoilo, 4-bromobenzoilo, 4-nitrobenzoílo e outros; grupos sulfonilo tais como benzenossulfonilo, p-toluenossulfonilo, o-nitrofenilsulfonilo, 2,2,5,7,8-pentametilcromano-6-sulfonilo (pmc), e outros; grupos formadores de carbamato tais como t-amiloxicarbonilo, benziloxicarbonilo, p-clorobenziloxicar-bonilo, p-metoxibenziloxicarbonilo, p-nitrobenziloxi-carbonilo, 2-nitrobenziloxicarbonilo, p-bromobenziloxicar-bonilo, 3,4-dimetoxibenziloxicarbonilo, 3,5-dimetoxibenziloxi-carbonilo, 2,4-dimetoxibenziloxicarbonilo, 4-etoxibenziloxi-carbonilo, 2-nitro-4,5-dimetoxibenziloxicarbonilo, 3,4,5-trimetoxibenziloxicarbonilo, 1-(p-bifenilil)-1-metiletoxicar-bonilo, a,a-dimetil-3,5-dimetoxibenziloxicarbonilo, benzi-driloxicarbonilo, t-butiloxicarbonilo (boc), di-isopropil-metoxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, etoxicarbonilo, metoxicarbonilo, aliloxicarbonilo, 2,2,2-tricloroetoxi-carbonilo, fenoxicarbonilo, 4-nitrofenoxicarbonilo, fluorenil-9-metoxicarbonilo, isoborniloxicarbonilo, ciclopentiloxi-carbonilo, adamantiloxicarbonilo, ciclo-hexiloxicarbonilo, feniltiocarbonilo e outros; grupos arilalquilo tais como benzilo, bifenilisopropiloxicarbonilo, trifenilmetilo, benziloximetilo, 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) e outros, e grupos sililo tais como trimetilsililo e outros. Os grupos protectores de α-N preferidos são o-nitrofenilsulfenilo; 9-fluorenilmetiloxicarbonilo; t-butiloxicarbonilo (boc), isoborniloxicarbonilo; 3,5-dimetoxibenziloxicarbonilo; t-amiloxicarbonilo; 2-ciano-t-butiloxicarbonilo, e outros, sendo mais preferido o 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), enquanto grupos protectores de N de cadeia lateral preferidos compreendem 2,2,5,7,8-pentametilcromano-6-sulfonilo (pmc), nitro, p-toluenossulfonilo, 4-metoxibenzenossulfonilo, Cbz, Boc, e adamantiloxicarbonilo para grupos amino de cadeia lateral tais como lisina e arginina; benzilo, o-bromobenziloxicarbonilo, 2,6-diclorobenzilo, isopropilo, t-butilo (t-Bu), ciclo-hexilo, ciclopentilo e acetilo (Ac) para tirosina; t-butilo, benzilo e tetra-hidropiranilo para 12 ΕΡ 1 479 691 /PT serina; tritilo, benzilo, Cbz, p-toluenossulfonilo e 2,4-dinitrofenilo para histidina; formilo para triptofano; benzilo e t-butilo para ácido aspártico e ácido glutâmico; e trifenilmetilo (tritilo) para cisteina.
Um grupo protector de carboxi refere-se convencionalmente a um grupo éster ou amida protector de ácido carboxilico. Tais grupos protectores de carboxi são bem conhecidos dos peritos na especialidade, tendo sido extensivamente utilizados na protecção de grupos carboxilo nos campos da penicilina e da cef alosporina conforme descrito em na US 3 840 556 e na US 3 719 667, cujas revelações são aqui incorporadas por referência. Grupos protectores de carboxi representativos compreendem, sem limitação, alquilo inferior Ci-Cs; arilalquilo tal como fenetilo ou benzilo e seus derivados substituídos tais como grupos alcoxibenzilo ou nitrobenzilo; arilalcenilo tal como feniletenilo; arilo e seus derivados substituídos tais como 5-indanilo; dialquilaminoalquilo tal como dimetilaminoetilo; grupos alcanoíloxialquilo tais como acetoximetilo, butiriloximetilo, valeriloximetilo, isobuti-riloximetilo, isovaleriloximetilo, 1-(propioniloxi)-1-etilo, l-(pivaloíloxi)-1-etilo, 1-meti1-1-(propioniloxi)-1-etilo, pivaloíloximetilo, propioniloximetilo; grupos cicloalcanoíl-oxialquilo tais como ciclopropilcarboniloximetilo, ciclobutilcarboniloximetilo, ciclopentilcarboniloximetilo, ciclo-hexilcarboniloximetilo; aroíloxialquilo tais como benzoíloximetilo, benzoíloxietilo; arilalquilcarboniloxi-alquilo tal como benzilcarboniloximetilo, 2-benzilcarboniloxi-etilo; alcoxicarbonilalquilo ou cicloalquiloxicarbonilalquilo tais como metoxicarbonilmetilo, ciclo-hexiloxicarbonilmetilo, 1- metoxicarbonil-l-etilo; alcoxicarboniloxialquilo ou cicloalquiloxicarboniloxialquilo tais como metoxicarboniloxi-metilo, t-butiloxicarboniloximetilo, 1-etoxicarboniloxi-l-etilo, 1-ciclo-hexiloxicarboniloxi-l-etilo; ariloxicarbo-niloxialquilo tal como 2-(fenoxicarboniloxi)etilo, 2-(5-indaniloxicarboniloxi)etilo; alcoxialquilcarboniloxialquilo tal como 2-(l-metoxi-2-metilpropan-2-oíloxi)etilo; aril-alquiloxicarboniloxialquilo tal como 2-(benziloxi-carboniloxi)etilo; arilalceniloxicarboniloxialquilo tal como 2- (3-fenilpropen-2-iloxicarboniloxi)etilo; alcoxicarbonilami-noalquilo tal como t-butiloxicarbonilaminometilo; alquil-aminocarbonilaminoalquilo tal como metilaminocarbonilamino-metilo; alcanoílaminoalquilo tal como acetilaminometilo; carboniloxialquilo heterocíclico tal como 4-metilpiperazinil-carboniloximetilo; dialquilaminocarbonilalquilo tal como 13 ΕΡ 1 479 691 /PT dimetilaminocarbonilmetilo, dietilaminocarbonilmetilo; (5-(alquilo inferior)-2-oxo-l,3-dioxolen-4-il)alquilo tal como (5-t-butil-2-oxo-l,3-dioxolen-4-il)metilo; e (5-fenil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)alquilo tal como (5-fenil-2-oxo-l,3-dioxolen-4-il)metilo. Grupos amida protectores de carboxi representativos compreendem, sem limitação, grupos aminocarbonilo e (alquilo inferior)aminocarbonilo. Dos grupos protectores de carboxi anteriores, preferem-se ésteres de alquilo inferior, cicloalquilo ou arilalquilo, por exemplo, éster de metilo, éster de etilo, éster de propilo, éster de isopropilo, éster de butilo, éster de sec-butilo, éster de isobutilo, éster de amilo, éster de isoamilo, éster de octilo, éster de ciclo-hexilo, éster de feniletilo e outros, ou um éster de alcanoíloxialquilo, cicloalcanoíloxialquilo, aroíloxialquilo, arilalilcarboniloxialquilo. Grupos amida protectores de carboxi preferidos são grupos (alquilo inferior)aminocarbonilo.
No método de síntese de péptidos em fase sólida, o aminoácido α-C-terminal é ligado a uma resina ou suporte sólido adequado. Suportes sólidos adequados úteis para a síntese anterior são aqueles materiais que são inertes para os reagentes e condições reaccionais das reacções de condensação-desprotecção por passos, sendo também insolúveis nos meios utilizados. 0 suporte sólido preferido para síntese de péptidos de carboxi α-C-terminal é a resina de 4-hidroximetilfenoxiacetil-4'-metilbenzidrilamina (resina HMP) . 0 suporte sólido preferido para péptidos de amida a-C-terminal é uma resina Ramage protegida com Fmoc, fabricada e comercializada pela Bachem Inc., Califórnia.
No final da síntese em fase sólida, o péptido é removido da resina e desprotegido, quer em operações sucessivas quer numa única operação. A remoção do péptido e a desprotecção podem ser realizadas convencionalmente numa única operação por tratamento do polipéptido ligado a resina com um reagente de clivagem compreendendo tioanisole, tri-isopropilsilano, fenol e ácido trifluoroacético. Em casos onde o terminal α-C do péptido é uma alquilamida, a resina é clivada por aminólise com uma alquilamina. Alternativamente, o péptido pode ser removido por trans-esterificação, e.g. com metanol, seguida por aminólise ou por trans-amidação directa. 0 péptido protegido pode ser purificado nesta altura ou levado directamente para o passo seguinte. A remoção dos grupos protectores de cadeia lateral é realizada utilizando a mistura 14 ΕΡ 1 479 691 /PT de clivagem anteriormente descrita. O péptido totalmente desprotegido pode ser purificado por uma sequência de passos cromatográficos utilizando qualquer um ou a totalidade dos passos seguintes: permuta iónica sobre uma resina fracamente básica (forma de acetato); cromatografia de adsorção hidrófoba sobre poliestireno-divinilbenzeno não derivatizado (tal como Amberlite XAD™) ; cromatografia de adsorção em sílica gel; cromatografia de permuta iónica sobre carboximetilcelulose; cromatografia de partição, e.g. sobre Sephadex G-25™, LH-20™ ou de distribuição em contracorrente; cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), especialmente HPLC de fase reversa sobre um enchimento de coluna de fase ligada octil- ou fenil/hexilsilil-sílica. Um vulgar perito na especialidade será capaz de determinar facilmente quais seriam as sequências ou passos cromatográficos preferidos requeridos para obter uma purificação aceitável do péptido C34.
Os pesos moleculares destes péptidos são determinados utilizando espectroscopia de massa de electropulverização.
Os presentes derivados de C34 podem ser utilizados sozinhos ou em combinação para optimizar os seus efeitos terapêuticos. Podem ser administrados num meio fisiologicamente aceitável, e.g. água desionizada, solução salina tamponada com fosfato (PBS), solução salina, etanol aquoso ou outro álcool, plasma, soluções proteicas, manitol, glucose aquosa, álcool, óleo vegetal, ou outro. Outros aditivos que podem ser incluídos incluem tampões, onde os meios estão geralmente tamponados a um pH na gama de cerca de 5 a 10, onde o tampão estará geralmente numa gama de concentrações de cerca de 50 a 250 mM, sal, onde a concentração de sal estará geralmente na gama de cerca de 5 a 500 mM, estabilizantes fisiologicamente aceitáveis, e outros. As composições podem ser liofilizadas para armazenamento conveniente e transporte.
Os derivados de C34 podem ser administrados parentericamente, tais como intravascularmente (IV), intra-arterialmente (IA), intramuscularmente (IM), subcutaneamente (SC), ou outros. Em situações apropriadas, a administração pode ser por transfusão. Nalguns casos, quando a reacção do grupo funcional é relativamente lenta, a administração pode ser oral, nasal, rectal, transdérmica ou por aerossol, onde a natureza do conjugado permite a transferência para o sistema vascular. Usualmente, será utilizada uma única injecção ainda 15
ΕΡ 1 479 691 /PT que se possa utilizar mais do que uma injecção, se desejado. 0 péptido derivado pode ser administrado por quaisquer meios convenientes, incluindo seringa, trocarte, cateter, ou outros. 0 modo particular de administração variará dependendo da quantidade a ser administrada, seja esta um bolus único ou administração continua, ou outras. Preferivelmente, a administração será intravascularmente, onde o sitio de introdução não é critico para este invento, preferivelmente num sitio onde existe um fluxo rápido de sangue, e.g., intravenosamente, numa veia periférica ou central. Podem ser utilizadas outras vias nas quais a administração está associada a uma técnica de libertação retardada ou a uma matriz de protecção. A intenção é que o derivado de C34 seja eficazmente distribuído no sangue, de modo a este ser capaz de reagir com os componentes do sangue. A concentração do conjugado variará amplamente, estando geralmente na gama de cerca de 1 pg/ml a 50 mg/ml. A quantidade total administrada intravascularmente estará geralmente na gama de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 10 mg/ml, mais usualmente cerca de 1 mg/ml a cerca de 5 mg/ml.
Por ligação a componentes do sangue de vida longa, tais como imunoglobulina, albumina sérica, glóbulos vermelhos e plaquetas, resultam várias vantagens. A actividade dos derivados de C34 é prolongada durante dias a semanas. Apenas é necessário proporcionar uma administração durante este período de tempo. Pode-se conseguir uma maior especificidade, uma vez que o composto activo será ligado principalmente a moléculas grandes, onde é menos provável que seja incorporado intracelularmente para interferir com outros processos fisiológicos. A formação da ligação covalente com o componente do sangue pode ocorrer in vivo ou ex vivo. Para formação da ligação covalente ex vivo, o derivado de C34 é adicionado a soro de sangue ou a uma solução salina contendo componentes do sangue purificados, tais como albumina sérica humana ou IgG, para permitir a formação da ligação covalente entre o derivado e o componente do sangue. Num formato preferido, faz-se reagir o derivado de C34 com albumina sérica humana em solução salina. Após formação do conjugado, este pode ser administrado ao sujeito ou liofilizado. O sangue do hospedeiro mamífero pode ser monitorizado quanto à actividade do péptido C34 e/ou à presença dos 16 ΕΡ 1 479 691 /PT derivados de C34. Colhendo uma amostra de sangue a partir do hospedeiro em diferentes instantes, pode-se determinar se o péptido C34 ficou ou não ligado aos componentes do sangue de vida longa, numa guantidade suficiente para ser terapeuticamente activo e, depois, o nível de C34 no sangue. Se desejado, pode-se também determinar a guais dos componentes do sangue o C34 se liga covalentemente. A monitorização pode também ser realizada por utilização de ensaios da actividade de C34, HPLC-MS ou anticorpos dirigidos a C34.
Os exemplos seguintes são apresentados para ilustrar concretizações preferidas do invento e não deverão ser de modo algum entendidos como limitantes do seu âmbito.
Os presentes derivados de C34 podem ser administrados a pacientes de acordo com os métodos a seguir descritos e com outros métodos conhecidos na especialidade. Dosagens terapêuticas eficazes dos presentes derivados de C34 podem ser determinadas através de procedimentos bem conhecidos na especialidade e terão em consideração guaisguer preocupações sobre a potencial toxicidade de C34. 0 presente derivado de C34 pode também ser administrado profilacticamente a indivíduos previamente não infectados. Isto pode ser vantajoso em casos onde um indivíduo foi submetido a um risco elevado de exposição a um vírus, como pode ocorrer guando um indivíduo esteve em contacto com um indivíduo infectado onde existe um risco elevado de transmissão virai. Isto pode ser especialmente vantajoso quando não existe cura conhecida para o vírus, tal como o vírus HIV. Como exemplo, a administração profiláctica de um derivado de C34 seria vantajosa numa situação em que um trabalhador de cuidados de saúde foi exposto a sangue de um indivíduo infectado com HIV, ou noutras situações de um indivíduo envolvido em actividades de alto risco que expõem potencialmente esse indivíduo ao vírus HIV.
Tendo o invento sido descrito na sua totalidade pode ser adicionalmente apreciado e compreendido com referência aos exemplos não limitantes seguintes.
GERAL A nao ser onde afirmado em contrário, a síntese de cada derivado de C34 foi realizada utilizando um procedimento em 17 ΕΡ 1 479 691 /PT fase sólida automático num sintetizador de péptidos Symphony, com intervenção manual durante a geração do derivado. A síntese foi realizada sobre uma resina de ligante amida Ramage protegida com Fmoc, utilizando aminoácidos protegidos com Fmoc. 0 acoplamento foi conseguido por utilização de hexafluorofosfato de O-benzotriazol-l-il-N,N,N',N'-tetrametilurónio (HBTU) como activador em solução de N,N-dimetilformamida (DMF) e di-isopropiletilamina (DIEA) como base. 0 grupo protector Fmoc foi removido utilizando 20% de piperidina/DMF. Quando necessário, utilizou-se um aminoácido protegido com Boc no terminal N de modo a gerar o terminal Na livre após o péptido ser clivado da resina. Todos os aminoácidos utilizados durante a síntese possuem a estereoquímica L. Durante a síntese utilizaram-se vasos reaccionais de vidro.
Exemplo 1 Composto A
Passo 1: O exemplo descreve a síntese de péptidos em fase sólida do composto a uma escala de 100 pmol. À resina adicionaram-se sequencialmente os aminoácidos protegidos seguintes: Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-
Gln(Trt)-OH, Ser(tBu)-OH, Gin(Trt)-OH, Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Tyr(tBu)-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-
Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-
Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-
Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-
Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH. Dissolveram-se estes em N,N-dimetilformamida (DMF) e, de acordo com a sequência, activaram-se com O-benzotriazol-l-il-N,N,N',N'-tetrametilurónio (HBTU) e di-isopropiletilamina (DIEA). A remoção do grupo protector Fmoc foi conseguida utilizando uma solução de 20% (v/v) de piperidina em N,N- dimetilformamida (DMF) durante 20 minutos (passo 1). O grupo amino do aminoácido final foi acetilado utilizando ácido acético activado com hexafluorofosfato de O-benzotriazol-l-il-N,N,N,N'-tetrametilurónio (HBTU) e di-isopropiletilamina (DIEA).
Passo 2: Continuou-se a síntese para a adição do ácido 3-maleimidopropiónico (Passo 2) . Entre cada acoplamento, a 18 ΕΡ 1 479 691 /PT resina foi lavada 3 vezes com N,N-dimetilformamida (DMF) e 3 vezes com isopropanol (iPrOH).
Passo 3: 0 péptido foi clivado a partir da resina utilizando 85% de TFA/5% de TIS/5% de tioanisole e 5% de fenol, seguindo-se precipitação com Et20 arrefecido em gelo (Passo 3).
Exemplo 2 Composto B
Passo 1: 0 exemplo descreve a síntese de péptidos em fase sólida do composto a uma escala de 100 pmol. À resina adicionaram-se sequencialmente os aminoácidos protegidos seguintes: Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-
Gln(Trt)-OH, Ser(tBu)-OH, Gin(Trt)-OH, Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Tyr(tBu)-OH,
Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-
Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-
Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-
Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-
Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH. Dissolveram-se estes em N,N-dimetilformamida (DMF) e, de acordo com a sequência, activaram-se utilizando hexafluorofosfato de O-benzotriazol-l-il-N,N,N',N'- tetrametilurónio (HBTU) e di-isopropiletilamina (DIEA). A remoção do grupo protector Fmoc foi conseguida utilizando uma solução de 20% (v/v) de piperidina em N,N-dimetilformamida (DMF) durante 20 minutos (passo 1). O grupo amino do aminoácido final foi acetilado utilizando ácido acético activado com hexafluorofosfato de O-benzotriazol-l-il- N,N,N,N'-tetrametilurónio (HBTU) e di-isopropiletilamina (DIEA).
Passo 2: Continuou-se a síntese para a adição do FMOC-AEEA-OH do ácido 3-maleimidopropiónico (Passo 2) . Entre cada acoplamento, a resina foi lavada 3 vezes com N,N-dimetilformamida (DMF) e 3 vezes com isopropanol (iPrOH).
Passo 3: O péptido foi clivado a partir da resina utilizando 85% de TFA/5% de TIS/5% de tioanisole e 5% de 19 ΕΡ 1 479 691 /PT fenol, seguindo-se precipitação com Et20 arrefecido em gelo (Passo 3).
Ensaio celular anti-HIV (ensaio MTT) A actividade antiviral foi determinada conforme descrito no Journal of Virological Methods, 1988, 2_0, 309-321.
Resumidamente, colocaram-se várias concentrações do composto de teste em cada poço de uma placa de microtitulação de fundo plano. Subsequentemente, adicionaram-se a estirpe de HIV (HIV-1 IIIB) e células MT-4 até uma concentração final de 200 CCID50/poço e 30000 células/poço, respectivamente. De modo a determinar a toxicidade do composto de teste, incubaram-se culturas de células infectadas em falso, contendo uma gama idêntica de concentrações de composto, em paralelo com as culturas de células infectadas com HIV. Após 5 dias de incubação (37°C, 5% de CO2) , a viabilidade das células foi determinada pelo método colorimétrico de tetrazólio MTT. Na Tabela 2 a seguir apresentam-se os resultados de ambos os ensaios.
Tabela 2
Composto Comentário Ensaio antiviral IC50 (μΜ) A extinto 0,3171 conjugado com HSA 0,6602 B extinto 0,0015 conjugado com HSA 0,0175 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> ConjuChem Inc.
<120> INIBIDORES DE PÉPTIDO DE FUSÃO DE LONGA DURAÇÃO PARA A INFECÇÃO POR HIV <130> 53124 <140> EP 04015696.0 <141> 2004-07-03 <160> 1 <170> Patentln versão 3.1 20
ΕΡ 1 479 691 /PT <210 > 1 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <221 > PÉPTIDO <222> (1)..(34) <400> 1
Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu lie Asn Asn Tyr Thr Ser Leu lie His 1 5 10 15
Ser Leu lie Glu Glu Ser Gin Asn Gin Gin Glu Lys Asn Glu Gin Glu 20 25 30
Leu Leu
Lisboa,
Claims (6)
- ΕΡ 1 479 691 /PT 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Composto de Fórmulas I-IIHN-WMEWDREINNYTSUHSUEESQNQGEKNEQELL-CONt·^ -- SEG !D. NO. ............................. ^........... 1^M£WPReNNYTStSHSUEESQNQQEKNEQat?CQNHSEomloi 2 ΪΙ
- 2. Composição farmacêutica compreendendo um composto de acordo com a reivindicação 1 em combinação com um transportador farmaceuticamente aceitável.
- 3. Composição de acordo com a reivindicação 2 para inibição da actividade de HIV, RSV, HPV, MeV ou SIV.
- 4. Utilização de um composto de acordo com a reivindicação 1, sozinho ou em combinação com um transportador farmaceuticamente aceitável, para a fabricação de um medicamento para a inibição da actividade de HIV, RSV, HPV, MeV ou SIV.
- 5. Utilização de um composto de acordo com a reivindicação 4, para a fabricação de um medicamento para a inibição da actividade de HIV, RSV, HPV, MeV ou SIV, o referido composto estando ligado covalentemente a um componente do sangue.
- 6. Utilização de um composto de acordo com a reivindicação 4, para a fabricação de um medicamento para a inibição da actividade de HIV, RSV, HPV, MeV ou SIV, o ΕΡ 1 479 691 /PT 2/2 referido composto sendo capaz de se ligar covalentemente a um componente do sangue in vivo. 1. Conjugado compreendendo um composto de acordo com a reivindicação 1, ligado covalentemente a um componente do sangue. Lisboa,
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