ES2558680T3 - Inhibidores derivados de péptidos de fusión contra la infección del VIH - Google Patents
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Abstract
Un péptido aislado seleccionado entre un péptido FB005 que comprende la secuencia de SEC ID Nº 1, un péptido FB006 que comprende la secuencia de SEC ID Nº 2, y un péptido FB066 que comprende la secuencia de SEC ID Nº 7.
Description
Tabla 4-Aminoácidos hidrófilos
- Aminoácido
- Abreviatura
- Arginina
- Arg
- Lisina
- Lys
- Ácido aspártico
- Asp
- Ácido glutámico
- Asn
- Glutamina
- Gln
- Histidina
- His
- Serina
- Ser
- Treonina
- Thr
- Glicina
- Gly
Tabla 5-Aminoácidos hidrófobos
- Aminoácido
- Abreviatura
- Alanina
- Ala
- isoleucina
- Ile
- Leucina
- Leu
- Metionina
- Met
- Fenilalanina
- Phe
- Triptófano
- Trp
- Valina
- Val
- Tirosina
- Tyr
Tabla 6-Aminoácidos con alta tendencia helicoidal1
- Aminoácido
- Preferencia α-helicoidal
- Ácido glutámico
- 1,59
- Alanina
- 1,41
- Leucina
- 1,34
- Metionina
- 1,30
- Glutamina
- 1,27
- Lisina
- 1,23
- Arginina
- 1,21
- Fenilalanina
- 1,16
- Isoleucina
- 1,09
- Histidina
- 1,05
- Triptófano
- 1,02
- Ácido aspártico
- 0,99
- Valina
- 0,90
- Treonina
- 0,76
- Asparagina
- 0,76
- Tirosina
- 0,74
- Cisteína
- 0,66
- Serina
- 0,57
- Glicina
- 0,43
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
(continuación)
- Aminoácido
- Preferencia α-helicoidal
- Prolina
- 0,34
- 1Fuente: T.E Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties (2ª ed.), W.H. Freeman y Co., 1993.
En términos generales, los péptidos de la invención son análogos C-34 que comprenden cinco heptavalentes de una hélice alfa de un complejo proteico super-hélice, los análogos preferentes que presentan grupos de acoplamiento a maleimida y los residuos más polares que la secuencia parental se sustituyeron en el residuo 2 de 7 del primer heptavalente, en el residuo 6 de 7 del segundo heptavalente, en el residuo 3 de 7 del tercer heptavalente y/o en el residuo 7 de 7 del cuarto heptavalente. En otra realización de la invención, los péptidos de la invención abarcan estos péptidos previamente mencionados, pero además incluyen 10 residuos adicionales de gp41 introducidos en el extremo N-terminal del péptido C-34.
El péptido FB006 se basa en el péptido C34 con el segundo y decimoséptimo residuos mutados en glutamato, y el decimotercer residuo mutado en lisina. Las posiciones de mutación se seleccionaron en base a la estructura cristalina del complejo N36/C34. El criterio de selección es que estos residuos no se implican en la unión a las hélices N36. Las mutaciones en el glutamato y la lisina tienen por objetivo mejorar la solubilidad y la tendencia helicoidal, que es la tendencia para formar una hélice en solución acuosa. Debido a que se considera que la conformación activa de C34 es helicoidal como en la estructura cristalina N36/C34, el aumento de la tendencia helicoidal, debería mejorar por consiguiente la actividad biológica. Los péptidos FB005, FB006, FB066, FB005M, FB005CM, FB006M, y FB007M también contienen estas sustituciones.
Los péptidos variantes de gp41 abarcan las secuencias peptídicas enumeradas en las tablas 1, 2 y 3, y en la Figura 1, así como sus formas modificadas y derivatizadas. El péptido FB005 se basa en el péptido FB006, aunque tiene 10 restos de aminoácidos adicionales situados en el extremo N-terminal en relación con otros péptidos variantes de gp41.
El péptido FB066 se basa en FB006. Se diferencia de FB006 en que alberga una única sustitución de aminoácidos, al cambiar la lisina en la posición 28 a un ácido glutámico. Este cambio deja al 13er resto de aminoácido como el único residuo de lisina para funcionar como el sitio de conjugación. Este cambio simplifica significativamente la síntesis de los análogos con modificaciones de maleimida.
La invención también proporciona derivados en base a FB005, FB006, y T-1249 (véase el documento WO 01/03723) que pueden conjugarse con seroalbúmina para convertirse en inhibidores de larga duración. Los péptidos FB005M y FB005CM se basan en la secuencia FB005; los péptidos FB006M y FB007M se basan en la secuencia FB006; y los péptidos FB010M y FB010KM se basan en la secuencia T-1249.
El procedimiento de selección del sitio de unión en el péptido que permite la unión al transportador de proteína sanguínea es también novedoso. Los inventores descubrieron que la unión del péptido variante de gp41 a la albúmina a través de un residuo de lisina interno del péptido produce un conjugado con una mayor eficacia en un enlace C-terminal. La CI50 para FB006, FB006M y FB007M es 1,4, 3,9 y 9,1 nM, respectivamente (el valor CI50 es la concentración del fármaco para lograr la inhibición viral al 50 %, y el valor CT50 es la concentración del fármaco para lograr una citotoxicidad al 50 %). FB006 es el péptido nativo, FB006M es un complejo peptídico modificado que alberga un enlace de maleimida en el 13er residuo, mientras que FB007M se une al extremo C-terminal. Cuando FB006M se une a la seroalbúmina, la cantidad requerida para el efecto antiviral aumenta 2,8 veces, mientras que uniéndose a la albúmina a través del enlace del extremo C-terminal de FB007M provoca que la CI50 aumente su valor en 6,5 veces. Aunque se anticipó unirse a una molécula transportadora para prolongar la ½vida del péptido, conceptualmente también se esperaba que la conjugación en la albúmina (una proteína de 66 kDa) bloqueara la actividad biológica de los péptidos proporcionando un impedimento estérico. Sin embargo, de manera inesperada, cuando los inventores prepararon los péptidos FB006M y los conjugaron en la albúmina, se descubrió que la actividad antiviral del complejo no se vio sensiblemente comprometida (solo aumentó 2,8 veces).
Los grupos de acoplamiento de la invención son grupos químicos que pueden formar un enlace covalente con una funcionalidad presente en un componente sanguíneo. Los grupos de acoplamiento son generalmente estables en un entorno acuoso. Las funcionalidades reactivas que se disponen en los componentes sanguíneos para el enlace covalente a los grupos de acoplamiento son principalmente grupos amino, grupos carboxilo y grupos tiol. En una realización de la invención, los grupos de acoplamiento incluyen dobles enlaces reactivos, grupos carboxi, fosforilo,
o acilo convenientes, ya sea como un éster o un anhídrido mezclado, o un imidato, de ese modo pueden formar un enlace covalente con funcionalidades tales como grupos amino, grupos hidroxi o grupos tiol en el sitio diana en proteínas móviles, en particular, en proteínas sanguíneas. Los grupos de acoplamiento de éster reactivos consisten en compuestos fenólicos, ésteres de tiol, ésteres alquílicos, o ésteres de fosfato. En una realización particularmente preferente de la invención, los grupos de acoplamiento consisten en grupos succinimidilo o maleimido.
El enfoque de la presente invención es modificar las secuencias peptídicas de gp41 para conferir una biodisponibilidad mejorada, una semivida prolongada y una mejor distribución (mediante la conjugación selectiva del
10
15
20
25
30
35
sincitial respiratorio humano (VSR), virus del moquillo canino, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la parainfluenza humana (VPIH), virus de la gripe, virus del sarampión, virus de Epstein-Barr, virus de la hepatitis B y virus Mason-Pfizer en simios. Los virus no envueltos también pueden inhibirse mediante los péptidos de la invención, incluyendo picornavirus tales como virus de la polio, virus de hepatitis A, enterovirus, ecovirus, virus Coxsackie, papovavirus tales como virus del papiloma, parvovirus, adenovirus y reovirus.
Síntesis peptídica
Los péptidos variantes de gp41 derivatizados se pueden sintetizar por procedimientos convencionales de la química de péptidos en fase sólida bien conocidos por uno cualquiera de los expertos en la materia. Por ejemplo, los péptidos pueden sintetizarse mediante las técnicas químicas en fase sólida siguiendo los procedimientos descritos en Steward y col. en Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª Ed., Pierce Chemical Company, Rockford, Ill., (1984), utilizando un sintetizador Rainin PTI Symphony. Alternativamente, los fragmentos peptídicos pueden sintetizarse y posteriormente combinarse o unirse entre sí para formar las secuencias peptídicas de gp41 en solución (condensación de segmentos, tal como se describe, por ejemplo, en la Patente Estadounidense n.º 6.281.331.
Para la síntesis de péptidos en fase sólida, se puede hallar un sumario de las numerosas técnicas en Stewart y col. en "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co. (San Francisco), 1963 y Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, 1973, 2 46. Para la síntesis clásica en solución, véase por ejemplo Schroder y col. en "The Peptides", volumen 1, Academic Press (Nueva York). En general, tales procedimientos comprenden la adición secuencial de uno o más aminoácidos o aminoácidos apropiadamente protegidos en una cadena peptídica en crecimiento en un polímero. Normalmente, el grupo amino o carboxilo del primer aminoácido se protege con un grupo protector adecuado. El aminoácido protegido y/o derivatizado se une entonces a un soporte sólido inerte o se utiliza en solución añadiendo el aminoácido siguiente a la secuencia que tiene el grupo complementario (amino o carboxilo) apropiadamente protegido y en las condiciones adecuadas para la formación del enlace de amida. Se elimina entonces el grupo protector de este resto de aminoácido recién añadido y se añade el siguiente aminoácido (adecuadamente protegido).
Después de que se hayan unido todos los aminoácidos deseados en la secuencia apropiada, cualquier grupo protector restante (y cualquier soporte sólido) se escinde secuencial o simultáneamente para proporcionar el péptido final. Mediante la simple modificación del presente procedimiento general, es posible añadir más de un aminoácido a la vez a una cadena en crecimiento, por ejemplo, por acoplamiento (en condiciones que no racemicen los centros quirales) de un tripéptido protegido con un dipéptido apropiadamente protegido para formar, después de la desprotección, un pentapéptido. Los grupos protectores pueden ser necesarios durante el procedimiento de síntesis del presente derivado peptídico. Estos grupos protectores son convencionales en el campo de la síntesis de péptidos, y generalmente pueden describirse como restos químicos capaces de proteger al derivado peptídico frente a reacciones con otros grupos funcionales. Se disponen comercialmente diversos grupos protectores, y ejemplos de los mismos pueden hallarse en la Patente Estadounidense n.º 5.493.007. Los ejemplos de grupos protectores típicos adecuados incluyen acetilo, fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC), t-butiloxicarbonilo (BOC), benciloxicarbonilo (CBZ). Además, la tabla 7 proporciona las abreviaturas tanto de tres letras como de una letra de los aminoácidos de origen natural.
Tabla 7: Aminoácidos de origen natural y sus abreviaturas
- Nombre
- Abreviatura de 3 letras Abreviatura de 1 letra
- Alanina
- Ala A
- Arginina
- Arg R
- Asparagina
- Asn N
- Ácido aspártico
- Asp D
- Cisteína
- Cys C
- Ácido glutámico
- Glu E
- Glutamina
- Gln Q
- Glicina
- Gly G
- Histidina
- His H
- Isoleucina
- Ile I
- Leucina
- Leu L
- Lisina
- Lys K
- Metionina
- Met M
- Fenilalanina
- Phe F
- Prolina
- Pro P
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
(continuación)
- Nombre
- Abreviatura de 3 letras Abreviatura de 1 letra
- Serina
- Ser S
- Treonina
- Thr T
- Triptófano
- Trp W
- Tirosina
- Tyr Y
- Valina
- Val V
Un procedimiento particularmente preferente de preparación de péptidos variantes de gp41 implica la síntesis de péptidos en fase sólida en la que el aminoácido α-N-terminal se protege con un ácido o grupo sensible de base. Tales grupos protectores deben tener la propiedad de ser estables a las condiciones de formación de enlace peptídico al mismo tiempo que han de eliminarse fácilmente sin destruir la cadena peptídica en crecimiento o racemización de cualquiera de los centros quirales contenidos en ellos. Los ejemplos de grupos protectores N y los grupos protectores de carboxi se desvelan en Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", (John Wiley & Sons, Nueva York págs. 152-186 (1981)). Los ejemplos de grupos protectores N comprenden grupos alcanoilo inferior tales como formilo, acetilo ("Ac"), propionilo, pivaloilo, t-butilacetilo y similares; otros grupos acilo incluyen 2cloroacetilo, 2-bromoacetilo, trifluoroacetilo, tricloroacetilo, ftalilo, o-nitrofenoxiacetilo, -clorobutirilo, benzoilo, 4clorobenzoilo, 4-bromobenzoilo, 4-nitrobenzoilo y similares; grupos sulfonilo tales como bencenosulfonilo, ptoluenosulfonilo, o-nitrofenilsulfonilo, y 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo (pmc); grupos que forman carbamato tales como t-amiloxicarbonilo, benciloxicarbonilo, p-clorobenciloxicarbonilo, p-metoxibenciloxicarbonilo, pnitrobenciloxicarbonilo, 2-nitrobenciloxicarbonilo, p-bromobenciloxicarbonilo, 3,4-dimetoxibenciloxicarbonilo, 3,5dimetoxibenciloxicarbonilo, 2,4-dimetoxibenciloxicarbonilo, 4-etoxibenciloxicarbonilo, 2-nitro-4,5dimetoxibenciloxicarbonilo, 3,4,5-trimetoxibenciloxicarbonilo, 1-(p-bifenilil)-1-metiletoxicarbonilo, α,α-dimetil-3,5dimetoxibenciloxicarbonilo, benzhidriloxicarbonilo, t-butiloxicarbonilo (boc), diisopropilmetoxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, etoxicarbonilo, metoxicarbonilo, aliloxicarbonilo (Aloc), 2,2,2,-tricloroetoxicarbonilo, fenoxicarbonilo, 4-nitrofenoxicarbonilo, fluorenil-9-metoxicarbonilo, isoborniloxicarbonilo, ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo, ciclohexiloxicarbonilo, feniltiocarbonilo y similares; grupos arilalquilo tales como bencilo, bifenilisopropiloxicarbonilo, trifenilmetilo, benciloximetilo, 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) y grupos sililo tales como trimetilsililo. Los grupos α-N protectores preferentes son grupos o-nitrofenilsulfenilo; 9-fluorenilmetiloxicarbonilo; tbutiloxicarbonilo (boc), isoborniloxicarbonilo; 3,5-dimetoxibenciloxicarbonilo; t-amiloxicarbonilo; 2-ciano-tbutiloxicarbonilo, siendo el 9-fluorenil-metiloxicarbonilo (Fmoc), aún más preferente, mientras que los grupos protectores N de cadena lateral comprenden 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo (pmc), nitro, p-toluenosulfonilo, 4-metoxibenceno-sulfonilo, Cbz, Boc y adamantiloxicarbonilo para los grupos amino de cadena lateral como en lisina y arginina; Aloc para lisina; bencilo, o-bromobenciloxicarbonilo, 2,6-diclorobencilo, isopropilo, t-butilo (t-Bu), ciclohexilo, ciclopentilo y acetilo (Ac) para tirosina; t-butilo, bencilo y tetrahidropiranilo para serina; tritilo, bencilo, Cbz, p-toluenosulfonilo y 2,4-dinitrofenilo para histidina; formilo para triptófano; bencilo y t-butilo para ácido aspártico y ácido glutámico; y trifenilmetilo (tritilo) para cisteína.
Un grupo protector carboxi se refiere convencionalmente a un éster protector de ácido carboxílico o grupo amida. Tales grupos protectores carboxi se conocen bien por los expertos en la materia, habiéndose utilizado ampliamente en la protección de grupos carboxilo en los campos de penicilina y cefalosporina como se describe en las Patentes Estadounidenses n.º 3.840.556 y 3.719.667.
Los grupos protectores carboxi representativos comprenden alquilo inferior C1-C8; arilalquilo tal como fenetilo o bencilo y sus derivados sustituidos tales como grupos alcoxibencilo o nitrobencilo; arilalquenilo tal como feniletenilo; arilo y sus derivados sustituidos tales como 5-indanilo; dialquilaminoalquilo tal como dimetilaminoetilo; grupos alcanoiloxialquilo tales como acetoximetilo, butiriloximetilo, valeriloximetilo, isobutiriloximetilo, isovaleriloximetilo, 1(propioniloxi)-1-etilo, 1-(pivaloiloxil)-1-etilo, 1-metil-1-(propioniloxi)-1-etilo, pivaloiloximetilo, propioniloximetilo; grupos cicloalcanoiloxialquilo tales como ciclopropilcarboniloximetilo, ciclobutilcarboniloximetilo, ciclopentilcarboniloximetilo, ciclohexilcarboniloxi-metilo; aroiloxialquilo tal como benzoiloximetilo, benzoiloxietilo; arilalquilcarboniloxialquilo tal como bencilcarboniloximetilo, 2-bencilcarboniloxietilo; alcoxicarbonilalquilo o cicloalquiloxicarbonilalquilo tal como metoxicarbonilmetilo, ciclohexiloxicarbonilmetilo, 1-metoxicarbonil-1-etilo; alcoxicarboniloxialquilo o cicloalquilxicarboniloxialquilo tal como metoxicarboniloximetilo, t-butiloxicarboniloximetilo, 1-etoxicarboniloxi-1-etilo, 1-ciclohexiloxicarboniloxi-1-etilo; ariloxi-carboniloxialquilo tal como 2-(fenoxicarboniloxi)etilo, 2-(5indaniloxicarboniloxi)-etilo; alcoxialquilocarboniloxialquilo tal como 2-(1-metoxi-2-metilpropan-2-oiloxi)-etilo; arilalquiloxicarboniloxialquilo tal como 2-(benciloxicarboniloxi)-etilo; arilalqueniloxicarboniloxialquilo tal como 2-(3fenilpropen-2-iloxicarboniloxi)etilo; alcoxicarbonilaminoalquilo tal como t-butiloxicarbonilaminometilo; alquilaminocarboniloaminoalquilo tal como metilaminocarbonilaminometilo; alcanoilaminoalquilo tal como acetilaminometilo; heterociclocarboniloxialquilo tal como 4-metilpiperazinilcarboniloximetilo; dialquilaminocarbonilalquilo tal como dimetilaminocarbonilmetilo, dietilaminocarbonilmetilo; (5-(alquilo inferior)-2-oxo1,3-dioxolen-4-il)alquilo tal como (5-t-butil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il) metilo; y (5-fenil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)alquilo tal como (5-fenil-2-oxo-1,3-dioxolen-4-il)metilo. Los grupos protectores carboxiamida representativos comprenden
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grupos aminocarbonilo y alquiloaminocarbonil inferiores. De los grupos protectores carboxi previos, se prefieren alquilo inferior, éster de cicloalquilo o arilalquilo, por ejemplo, éster metílico, éster etílico, éster propílico, éster isopropílico, éster butílico, éster sec-butílico, éster isobutílico, éster amílico, éster isoamílico, éster octílico, éster ciclohexílico, éster feniletílico o un éster alcanoiloxialquílico, cicloalcanoiloxialquílico, aroiloxialquílico o arilalquilcarboniloxialquílico. Los grupos protectores carboxiamida preferentes son los grupos alquilaminocarbonil inferiores.
En el procedimiento de síntesis en fase sólida de los péptidos, el aminoácido α-C-terminal se une a un soporte sólido
o resina adecuado. Los soportes sólidos adecuados útiles para la síntesis previa son aquellos materiales inertes a los reactivos y condiciones de reacción de las reacciones de condensación-desprotección escalonadas, así como insolubles en los medios utilizados. El soporte sólido preferente para la síntesis de péptidos carboxi α-C-terminal es la resina 4-hidroximetilfenoxiacetil-4'-metilbenzihidrilamina (resina HMP). El soporte sólido preferente para los péptidos amida α-C-terminal es una resina Ramage protegida por Fmoc, fabricada y vendida por Bachem Inc., California.
En síntesis preferentes, la unión a lisina se protege por Aloc. Después de que se haya completado la síntesis, el Aloc se escinde con Pd(Ph3)4 mientras que el péptido se encuentra aún en la resina, y permite el acoplamiento de la molécula enlazadora y el grupo maleimido. Específicamente, el enlazador es ácido [2-(2-amino)etoxi] acético, y el grupo maleimido es ácido 3'-maleimidopropiónico. Después de la modificación, los grupos Fmoc se eliminan y el péptido se escinde de la resina.
Al final de la síntesis en fase sólida, el péptido se separa de la resina y se desprotege, ya sea en operaciones sucesivas o en una única operación. La eliminación del péptido y la desprotección pueden llevarse a cabo convencionalmente en una única operación tratando el polipéptido unido a la resina con un reactivo de escisión que comprende tioanisol, triisopropilo silano, fenol y ácido trifluoroacético. En casos en los que el α-C-terminal del péptido es una alquilamida, la resina se escinde por aminolisis con una alquilamina. Alternativamente, el péptido puede eliminarse por transesterificación, por ejemplo con metanol, seguido de aminolisis o por transamidación directa. El péptido protegido puede purificarse en este punto o llevarse directamente a la siguiente etapa. La eliminación de los grupos protectores de cadena lateral se consigue utilizando la mezcla de escisión que se ha descrito previamente. El péptido completamente desprotegido se puede purificar mediante una secuencia de etapas cromatográficas empleando todos o cualquiera de los siguientes tipos: intercambio iónico en una resina ligeramente básica (forma de acetato); cromatografía de adsorción hidrófoba en poliestireno-divinilbenceno no derivatizado (tal como Amberlite XAD); cromatografía de adsorción de gel de sílice; cromatografía de intercambio iónico en carboximetilcelulosa; cromatografía de partición, por ejemplo en Sephadex G-25, LH-20 o distribución en contracorriente; cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), especialmente HPLC en fase inversa en relleno de columna de fase unida a octilo-o fenilo/hexilsililo-sílice. El experto en la materia puede determinar las etapas o secuencias cromatográficas preferentes requeridas para obtener una purificación aceptable de los péptidos variantes de gp41.
Alternativamente, los fragmentos peptídicos, incluyendo la adición del grupo maleimido pueden sintetizarse en fase sólida y el péptido derivatizado final se puede obtener por acoplamiento de solución de estos fragmentos.
Los pesos moleculares de estos péptidos pueden determinarse utilizando espectrometría de masas de tipo electrospray o espectrometría de masas MALDI-TOF.
Uso terapéutico de los péptidos modificados
Los péptidos variantes de gp41, incluyendo los compuestos enumerados en las tablas 1, 2 y 3, inhiben la infección viral de las células, por ejemplo, mediante la inhibición de la fusión célula-célula o la infección de virus libre. La ruta de infección puede implicar la fusión de membranas, como ocurre en el caso de los virus envueltos o encapsulados,
o algún otro evento de fusión que implica estructuras virales y celulares, tales como receptores celulares.
Los péptidos variantes de gp41 se pueden administrar in vivo de tal modo que la conjugación con componentes sanguíneos se produce in vivo, o pueden conjugarse en primer lugar con componentes sanguíneos ex vivo y el derivado conjugado resultante se administra in vivo. En otra realización de la invención, la plasmaféresis se utiliza para separar componentes sanguíneos deseados en la muestra sanguínea de un paciente, que luego se conjuga con los péptidos de la invención antes de administrarse de nuevo al paciente.
Los grupos tiol son menos abundantes in vivo que, por ejemplo, los grupos amino en las proteínas plasmáticas. El (los) péptido(s) variante(s) modificado(s) de gp41 con maleimida se unirá(n) covalentemente a unas pocas proteínas. Por ejemplo, en la albúmina (la proteína más abundante en la sangre) existe un grupo tiol. Por lo tanto, un conjugado de péptido-maleimida-albúmina de gp41 modificado tenderá a comprender aproximadamente una relación molar 1:1 del péptido de gp41 con respecto a la albúmina. Además de la albúmina, las moléculas de IgG (clase II) presentan también tioles libres. Dado que las moléculas de IgG y la seroalbúmina constituyen la mayoría de la proteína soluble en la sangre, constituyen también la mayoría de los grupos tiol libres disponibles en la sangre para unirse covalentemente a los péptidos variantes de gp41.
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Los péptidos variantes de gp41 pueden administrarse a los pacientes según los procedimientos descritos en el presente documento y otros procedimientos conocidos en la materia. Los pacientes para los que se contempla la terapia incluyen pacientes infectados con cualquiera de los virus mencionados en el presente documento, especialmente VIH-1 y VIH-2. Las dosis terapéuticas eficaces de los péptidos variantes de gp41 pueden determinarse mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia y estos tendrán en cuenta las preocupaciones relativas a la toxicidad potencial de estos péptidos de gp41.
Los péptidos variantes de gp41 también pueden administrarse profilácticamente a individuos previamente no infectados. Esta administración puede resultar ventajosa en aquellos casos en los que un individuo se ha sometido a un gran riesgo de exposición a un virus, como puede ocurrir cuando un paciente ha estado en contacto con un individuo infectado y hay un gran riesgo de transmisión viral. Esto puede resultar especialmente ventajoso puesto que no existe una cura conocida para el virus, como el virus VIH. A modo de ejemplo, la administración profiláctica de un péptido de gp41 sería ventajosa en una situación en la que un sanitario se ha expuesto a la sangre de un individuo infectado por VIH, o en otras situaciones en las que los pacientes involucrados en actividades de alto riesgo se exponen potencialmente al virus del VIH. Otras aplicaciones de los péptidos variantes de gp41 abarcan la administración de la misma a los individuos que albergan un virus, tal como VIH, con el fin de prevenir la transmisión del virus del individuo infectado a un individuo sin infectar. Estas aplicaciones también incluyen la prevención de la transmisión materno-infantil durante la lactancia u otros contactos diarios, o la transmisión que se produce a través de la actividad sexual.
En otra realización de la invención, los péptidos variantes de gp41, incluyendo los péptidos proporcionados en las tablas 1, 2 y 3, pueden coadministrarse con uno o más péptidos adicionales enumerados en las tablas 1, 2 y 3, Figura 1, T-20, T-1249, u otros tratamientos contra el VIH para prevenir la replicación del VIH (incluyendo VIH-1, VIH-2, o todos sus otros serotipos) y las partículas virales de VIS en el paciente.
Aplicación tópica
Los péptidos variantes de gp41, incluidos los proporcionados en las tablas 1, 2 y 3 se pueden utilizar solo o en forma de una composición que contiene o que consiste esencialmente en una concentración eficaz del péptido y un transportador farmacéuticamente aceptable. Una concentración eficaz puede determinarse observando si la infección por virus puede obstaculizarse después de la aplicación del(los) agente(s).
Las composiciones de la invención incluyen usos microbicidas tópicos, virostáticos o antifusogénicos para fines tanto in vitro como in vivo, especialmente para su uso intravaginal e intrarrectal. Para estos fines, el péptido modificado se puede formular en cualquier transportador apropiado, es decir, siempre que la actividad antifusión del péptido modificado no se vea disminuida por el transportador. Por consiguiente, las composiciones pueden estar en forma de cremas, geles, espumas, lociones, pomadas, comprimidos, soluciones o pulverizaciones. El diluyente transportador o vehículo puede ser acuoso o no acuoso, por ejemplo alcohólico u oleaginoso, o su mezcla, y puede contener adicionalmente otros tensioactivos, emolientes, lubricantes, estabilizadores, colorantes, perfumes, agentes antimicrobianos ya sean como principios activos o como conservantes y ácidos o bases para ajustar el pH. El pH preferente es aproximadamente 4 a 5. Se utilizan los procedimientos convencionales en la preparación de las composiciones.
Preferentemente, el transportador o vehículo farmacéuticamente aceptable para las composiciones aplicadas por vía tópica se encuentra en forma de un líquido, gelatina o espuma que contiene el compuesto de la presente invención. El compuesto puede incorporarse en: (a) ungüentos y gelatinas, (b) insertos (supositorios, esponjas), (c) espumas,
(d) duchas vaginales y (e) fluidos limpiadores o jabones corporales. La composición se introduce preferentemente en la vagina de una mujer o en el recto de un hombre o mujer, aproximadamente en el momento de, y preferentemente antes de las relaciones sexuales, pero puede también administrarse en otras membranas mucosas. Las composiciones pueden emplearse para el tratamiento de y para la protección contra las enfermedades de transmisión sexual incluido el VIH. El modo de administración se concebirá preferentemente para obtener un contacto directo de las composiciones que contienen péptidos de la invención con los agentes causantes de enfermedades de transmisión sexual.
Para aplicaciones tópicas, el transportador farmacéuticamente aceptable puede comprender adicionalmente disolventes orgánicos, emulsionantes, agentes gelificantes, humectantes, estabilizadores, otros tensioactivos, agentes humectantes, conservantes, agentes de liberación prolongada, y cantidades menores de agentes humectantes, agentes secuestrantes, colorantes, perfumes, y otros componentes comúnmente empleados en composiciones farmacéuticas para la administración tópica.
Con respecto a los artículos proporcionados por la presente invención, las composiciones de la invención se pueden impregnar en materiales de sustrato de absorción, tales como esponjas, o revestirse en la superficie de materiales del sustrato sólido, tales como condones, diafragmas o guantes médicos, para administrar las composiciones al epitelio vaginal u otro potencialmente infectado, preferentemente antes o durante las relaciones sexuales. Otros artículos y sistemas de administración de este tipo resultarán fácilmente evidentes por los expertos en la materia. Los artículos actualmente preferentes son condones, que se recubren por pulverización de péptidos modificados en las superficies de los condones, o impregnando los péptidos en el condón durante la fabricación por procedimientos
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Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Thr-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Glu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser-OH. Se disolvieron en N,N-dimetilformamida (DMF) y, según la secuencia, se activan utilizando hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametil-uronio (HBTU) y diisopropiletilamina (DIEA). La eliminación del grupo protector Fmoc se logra utilizando una solución de piperidina al 20 % (v/v) en N,N-dimetilformamida (DMF) durante 20 minutos (etapa 1). El grupo amino del aminoácido final se acetiló con ácido acético activado utilizando hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametil-uronio (HBTU) y diisopropiletilamina (DIEA).
Etapa 2: La desprotección selectiva del grupo Lys (Aloc) se realizó manualmente y se logró tratando la resina con una solución de 3 eq de Pd(PPh3)4 disuelto en 5 ml de C6H6CHCI3 (1:1): NMM al 2,5 % (v:v): AcOH al 5 % (v:v) durante 2 h (Etapa 2). La resina se lava después con CHCI3 (6 x 5 ml), AcOH al 20 % en DCM (6 x 5 ml), DCM (6 x 5 ml), y DMF (6 x 5 ml).
Etapa 3: La síntesis se volvió a automatizar con la adición de Fmoc-AEEA-OH y ácido 3-maleimidopropiónico (Etapa 3). Entre cada acoplamiento, la resina se lavó 3 veces con N,N-dimetilformamida (DMF) y 3 veces con isopropanol (iPrOH).
Etapa 4: El péptido se escindió de la resina utilizando TFA al 85 %/TIS al 5 %/tioanisol al 5 % y fenil al 5 %, seguido de precipitación con Et2O helado en frío seco (Etapa 4).
Ejemplo 3 Síntesis de FB005CM
Etapa 1: El ejemplo describe la síntesis de péptidos en fase sólida del compuesto en una escala 1 mmol. Se añaden secuencialmente a la resina los siguientes aminoácidos protegidos: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, FmocGlu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-His-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Glu (tBu)-OH, Fmoc-Argpbf)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Thr-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Asn-OH, Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Glu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser-OH. Se disolvieron en N,N-dimetilformamida (DMF) y, según la secuencia, se activan utilizando hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HBTU) y diisopropiletilamina (DIEA). La eliminación del grupo protector Fmoc se logra utilizando una solución de piperidina al 20 % (v/v) en N,N-dimetilformamida (DMF) durante 20 minutos (etapa 1). El grupo amino del aminoácido final se acetiló con ácido acético activado utilizando hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'tetrametil-uronio (HBTU) y diisopropiletilamina (DIEA).
Etapa 2: La desprotección selectiva del grupo Lys (Aloc) se realizó manualmente y se logró tratando la resina con una solución de 3 eq de Pd(PPh3)4 disuelto en 5 ml de C6H6CHCI3 (1:1): NMM al 2,5 % (v:v): AcOH al 5 % (v:v) durante 2 h (Etapa 2). La resina se lava después con CHCI3 (6 x 5 ml), AcOH al 20 % en DCM (6 x 5 ml), DCM (6 x 5 ml), y DMF (6 x 5 ml).
Etapa 3: La síntesis se volvió a automatizar con la adición de Fmoc-AEEA-OH y ácido 3-maleimidopropiónico (Etapa 3). Entre cada acoplamiento, la resina se lavó 3 veces con N,N-dimetilformamida (DMF) y 3 veces con isopropanol (iPrOH).
Etapa 4: El péptido se escindió de la resina utilizando TFA al 85 %/TIS al 5 %/tioanisol al 5 % y fenol al 5 %, seguido de precipitación con Et2O helado en frío seco (Etapa 4).
Ejemplo 4 Síntesis de FB006
Etapa 1: El ejemplo describe la síntesis de péptidos en fase sólida del compuesto en una escala 1 mmol. Se añaden secuencialmente a la resina los siguientes aminoácidos protegidos: Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, FmocGln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-His-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu) OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH. Se disolvieron en N,N-dimetilformamida (DMF) y, según la secuencia, se activan utilizando hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametil-uronio (HBTU) y diisopropiletilamina (DIEA). La eliminación del grupo protector Fmoc se logra utilizando una solución de piperidina al 20 % (v/v) en N,Ndimetilformamida (DMF) durante 20 minutos (etapa 1). El grupo amino del aminoácido final se acetiló con ácido acético activado utilizando hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametil-uronio (HBTU) y diisopropiletilamina (DIEA).
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Etapa 4: El péptido se escindió de la resina utilizando TFA al 85 %/TIS al 5 %/tioanisol al 5 % y fenol al 5 %, seguido de precipitación con Et2O helado en frío seco (Etapa 4).
Ejemplo 5 Síntesis de FB006M
Etapa 1: El ejemplo describe la síntesis de péptidos en fase sólida del compuesto en una escala 1 mmol. Se añaden secuencialmente a la resina los siguientes aminoácidos protegidos: Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, FmocGln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-His-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH. Se disolvieron en N,N-dimetilformamida (DMF) y, según la secuencia, se activan utilizando hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametil-uronio (HBTU) y diisopropiletilamina (DIEA). La eliminación del grupo protector Fmoc se logra utilizando una solución de piperidina al 20 % (v/v) en N,Ndimetilformamida (DMF) durante 20 minutos (etapa 1). El grupo amino del aminoácido final se acetiló con ácido acético activado utilizando hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametil-uronio (HBTU) y diisopropiletilamina (DIEA).
Etapa 2: La desprotección selectiva del grupo Lys (Aloc) se realizó manualmente y se logró tratando la resina con una solución de 3 eq de Pd(PPh3)4 disuelto en 5 ml de C6H6CHCI3 (1:1): NMM al 2,5 % (v:v): AcOH al 5 % (v:v) durante 2 h (Etapa 2). La resina se lava después con CHCI3 (6 x 5 ml), AcOH al 20 % en DCM (6 x 5 ml), DCM (6 x 5 ml), y DMF (6 x 5 ml).
Etapa 3: La síntesis se volvió a automatizar con la adición de Fmoc-AEEA-OH y ácido 3-maleimidopropiónico (Etapa 3). Entre cada acoplamiento, la resina se lavó 3 veces con N,N-dimetilformamida (DMF) y 3 veces con isopropanol (iPrOH).
Etapa 4: El péptido se escindió de la resina utilizando TFA al 85 %/TIS al 5 %/tioanisol al 5 % y fenol al 5 %, seguido de precipitación con Et2O helado en frío seco (Etapa 4).
Ejemplo 6 Síntesis de FB007M
Etapa 1: El ejemplo describe la síntesis de péptidos en fase sólida del compuesto en una escala 1 mmol. Se añaden secuencialmente a la resina los siguientes aminoácidos protegidos: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, FmocGlu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-His-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH. Se disolvieron en N,N-dimetilformamida (DMF) y, según la secuencia, se activan utilizando hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametil-uronio (HBTU) y diisopropiletilamina (DIEA). La eliminación del grupo protector Fmoc se logra utilizando una solución de piperidina al 20 % (v/v) en N,N-dimetilformamida (DMF) durante 20 minutos (etapa 1). El grupo amino del aminoácido final se acetiló con ácido acético activado utilizando hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametil-uronio (HBTU) y diisopropiletilamina (DIEA).
Etapa 2: La desprotección selectiva del grupo Lys (Aloc) se realizó manualmente y se logró tratando la resina con una solución de 3 eq de Pd(PPh3)4 disuelto en 5 ml de C6H6CHCI3 (1:1): NMM al 2,5 % (v:v): AcOH al 5 % (v:v) durante 2 h (Etapa 2). La resina se lava después con CHCI3 (6 x 5 ml), AcOH al 20 % en DCM (6 x 5 ml), DCM (6 x 5 ml), y DMF (6 x 5 ml).
Etapa 3: La síntesis se volvió a automatizar con la adición de Fmoc-AEEA-OH y ácido 3-maleimidopropiónico (Etapa 3). Entre cada acoplamiento, la resina se lavó 3 veces con N,N-dimetilformamida (DMF) y 3 veces con isopropanol (iPrOH).
Etapa 4: El péptido se escindió de la resina utilizando TFA al 85 %/TIS al 5 %/tioanisol al 5 % y fenol al 5 %, seguido de precipitación con Et2O helado en frío seco (Etapa 4).
Ejemplo 7 Síntesis de FB010M
Etapa 1: El ejemplo describe la síntesis de péptidos en fase sólida del compuesto en una escala 1 mmol. Se añaden secuencialmente a la resina los siguientes aminoácidos protegidos: Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, FmocGlu(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, FmocLys(Boc)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, FmocGlu(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, FmocLys(Aloc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH,
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Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH. Se disolvieron en N,N-dimetilformamida (DMF) y, según la secuencia, se activan utilizando hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametil-uronio (HBTU) y diisopropiletilamina (DIEA). La eliminación del grupo protector Fmoc se logra utilizando una solución de piperidina al 20 % (v/v) en N,N-dimetilformamida (DMF) durante 20 minutos (etapa 1). El grupo amino del aminoácido final se acetiló con ácido acético activado utilizando hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametil-uronio (HBTU) y diisopropiletilamina (DIEA).
Etapa 2: La desprotección selectiva del grupo Lys (Aloc) se realizó manualmente y se logró tratando la resina con una solución de 3 eq de Pd(PPh3)4 disuelto en 5 ml de C6H6CHCI3 (1:1): NMM al 2,5 % (v:v): AcOH al 5 % (v:v) durante 2 h (Etapa 2). La resina se lava después con CHCI3 (6 x 5 ml), AcOH al 20 % en DCM (6 x 5 ml), DCM (6 x 5 ml), y DMF (6 x 5 ml).
Etapa 3: La síntesis se volvió a automatizar con la adición de Fmoc-AEEA-OH y ácido 3-maleimidopropiónico (Etapa 3). Entre cada acoplamiento, la resina se lavó 3 veces con N,N-dimetilformamida (DMF) y 3 veces con isopropanol (iPrOH).
Etapa 4: El péptido se escindió de la resina utilizando TFA al 85 %/TIS al 5 %/tioanisol al 5 % y fenol al 5 %, seguido de precipitación con Et2O helado en frío seco (Etapa 4).
Ejemplo 8 Síntesis de FB010KM
Etapa 1: El ejemplo describe la síntesis de péptidos en fase sólida del compuesto en una escala 1 mmol. Se añaden secuencialmente a la resina los siguientes aminoácidos protegidos: Fmoc-Lys(Aloc)-OH, Fmoc-Phe-OH, FmocTrp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, FmocTrp(Boc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, FmocGln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(tBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH. Se disolvieron en N,N-dimetilformamida (DMF) y, según la secuencia, se activan utilizando hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametil-uronio (HBTU) y diisopropiletilamina (DIEA). La eliminación del grupo protector Fmoc se logra utilizando una solución de piperidina al 20 % (v/v) en N,Ndimetilformamida (DMF) durante 20 minutos (etapa 1). El grupo amino del aminoácido final se acetiló con ácido acético activado utilizando hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametil-uronio (HBTU) y diisopropiletilamina (DIEA).
Etapa 2: La desprotección selectiva del grupo Lys (Aloc) se realizó manualmente y se logró tratando la resina con una solución de 3 eq de Pd(PPh3)4 disuelto en 5 ml de C6H6CHCI3 (1:1): NMM al 2,5 % (v:v): AcOH al 5 % (v:v) durante 2 h (Etapa 2). La resina se lava después con CHCI3 (6 x 5 ml), AcOH al 20 % en DCM (6 x 5 ml), DCM (6 x 5 ml), y DMF (6 x 5 ml).
Etapa 3: La síntesis se volvió a automatizar con la adición de Fmoc-AEEA-OH y ácido 3-maleimidopropiónico (Etapa 3). Entre cada acoplamiento, la resina se lavó 3 veces con N,N-dimetilformamida (DMF) y 3 veces con isopropanol (iPrOH).
Etapa 4: El péptido se escindió de la resina utilizando TFA al 85 %/TIS al 5 %/tioanisol al 5 % y fenol al 5 %, seguido de precipitación con Et2O helado en frío seco (Etapa 4).
Ejemplo 9 Inhibición viral mediante péptidos modificados
La actividad antiviral y la citotoxicidad de FB005, FB006, FB006M, FB007M, FB010KM y FM010M se evaluaron contra el VIH-1IIIB en cultivos de CMSP humanas recientes. Los cuatro péptidos modificados FB006M, FB007M, FB010M, y FB010KM se conjugaron en la seroalbúmina humana (SAH) mediante la mezcla antes de la prueba antiviral. Los resultados se muestran a continuación en la tabla 8, en la que el valor CI50 es la concentración del fármaco de inhibición viral al 50 %, y el valor CT50 es la concentración de la citotoxicidad del fármaco al 50 %.
Ensayo celular contra el VIH
Las alícuotas pretituladas de VIH-1IIIB se retiraron del congelador (-80 ºC) y se descongelaron rápidamente a temperatura ambiente en una cabina de seguridad biológica inmediatamente antes de su uso.
Las CMSP humanas recientes se aislaron a partir de donantes explorados, seronegativos para el VIH y el VHB (Banco de Sangre Interestatal, Inc.; Memphis, TN). Las células se peletaron/lavaron 2-3 veces por centrifugación a baja velocidad y se volvieron a suspender en STF para eliminar las plaquetas contaminantes. A continuación, la sangre leucoprocesada se diluyó 1:1 con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (STF) y se colocó en capas en 14 ml de Medio de Separación de Linfocitos en un tubo de centrifugación de 50 ml y después se centrifugó durante 30 minutos a 600 X g. Las CMSP unidas se aspiraron gradualmente de la interfaz resultante y posteriormente se lavaron 2 veces con STF mediante centrifugación a baja velocidad. Después del lavado final, las
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