DE4224125A1

DE4224125A1 - Verfahren zur verbesserung der stabilitaet von enzymen und stabilisierte enzyme

Info

Publication number: DE4224125A1
Application number: DE4224125A
Authority: DE
Inventors: Roman Vetter; Ingo Muecke; Detlef Wilke; Antoine Amory; Wolfgang Aehle; Harald Sobek; Dietmar Schomburg; Andre Clippe
Original assignee: Solvay Enzymes GmbH and Co KG
Current assignee: Chr Hansen GmbH
Priority date: 1991-07-27
Filing date: 1992-07-22
Publication date: 1993-01-28
Also published as: EP0525610A2; FI106315B; FI923372A; EP0525610A3; FI923372A0; US5453372A; EP0995801A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Ver fahren zur Verbesserung der Stabilität von Enzymen gegen über ionischen Tensiden durch gerichtete Mutagenese von für diese Enzyme codierenden DNA-Sequenzen und nachfol gende Expression dieser Enzyme mit verbesserter ionischer Tensidstabilität.

Enzyme wie Proteasen, Lipasen, Amylasen, Cellulasen etc. sind wertvolle industrielle Produkte mit vorteilhaf ten Anwendungen in der Waschmittelindustrie, da sie z. B. enzymatisch spaltbare Verunreinigungen abbauen und somit eine leichtere Entfernung dieser Verunreinigungen ermögli chen. Um wirksam zu sein, müssen diese Enzyme nicht nur enzymatische Aktivität unter Waschbedingungen (pH-Wert, Temperatur) besitzen, sondern müssen darüber hinaus auch mit anderen Waschmittelbestandteilen, insbesondere z. B. in Kombination mit Tensiden, verträglich sein, d. h. in Gegen wart dieser Substanzen ausreichende Stabilität und ausrei chende Wirksamkeit aufweisen. Hierbei können insbesondere die in Wasch- und Reinigungsmittelzusammensetzungen häufig verwendeten Tenside ionischen Typs die Stabilität der ver wendeten Waschmittelenzyme negativ beeinflussen, so daß die Aktivität der Enzyme in Gegenwart des ionischen Ten sids rasch absinkt und die Aktivität selbst bei kurzen Waschzyklen von etwa 30 Minuten kaum ausreichend genutzt werden kann. Die auf die mangelnde Stabilität der Enzyme gegenüber ionischen Tensiden zurückzuführende unzurei chende Ausnutzung der enzymatischen Aktivität während des Wasch- bzw. Reinigungsvorganges bedingt somit auch deut lich verminderte Wasch- bzw. Reinigungsleistungen. Eine gute Stabilität der Wasch- und Reinigungsmittelenzyme ge genüber ionischen Tensiden ist insbesondere für Flüssig formulierungen von Wasch- und Reinigungsmitteln erforder lich, da die Enzyme in diesen Formulierungen nicht wie in Pulverformulierungen durch Beschichtungsverfahren gegen destabilisierende Einwirkungen anderer Formulierungskompo nenten, wie insbesondere ionische Tenside, geschützt wer den können.

Es bestand daher die Aufgabe, Enzyme mit einer guten Stabilität gegenüber ionischen, insbesondere anionischen, Tensiden bereitzustellen und ein hierfür geeignetes Ver fahren anzugeben.

Es wurde gefunden, daß in Enzymen durch Austausch von Aminosäuren in einem hydrophoben Oberflächenbereich des Enzyms eine gute Stabilität gegenüber ionischen Tensiden erzielt werden kann.

Gegenstand der Erfindung sind gegen destabilisierende Einwirkungen von ionischen Tensiden stabilisierte Enzyme, bei denen wenigstens eine der Aminosäuren, die sich in einem hydrophoben Oberflächenbereich des Enzyms oder in direkter Nachbarschaft zu diesem hydrophoben Oberflächen bereich befinden, durch eine andere Aminosäure ausge tauscht ist, wobei

a) eine hydrophobe Aminosäure, deren Aminosäurerest an der Bildung eines hydrophoben Oberflächenbereiches be teiligt ist, in dessen räumlicher Nachbarschaft sich wenigstens eine Aminosäure mit ionischem Aminosäure rest befindet, durch eine andere Aminosäure mit hydro philem Aminosäurerest ausgetauscht ist, und/oder wobei
b) eine polare, ungeladene Aminosäure, die an einen hydrophoben Oberflächenbereich angrenzt, in dessen räumlicher Nachbarschaft sich wenigstens eine Amino säure mit ionischem Aminosäurerest befindet, durch eine gegenüber der ursprünglichen Aminosäure sterisch anspruchsvollere Aminosäure, vorzugsweise durch eine sterisch anspruchsvollere Aminosäure mit einem langket tigeren hydrophilen Aminosäurerest, ausgetauscht ist, und/oder wobei
c) eine ionische Aminosäure, die sich in räumlicher Nach barschaft zu einem hydrophoben Oberflächenbereich be findet, durch eine Aminosäure mit einem ungeladenen hydrophilen Aminosäurerest oder durch eine geladene Aminosäure, deren Aminosäurerest eine zum ionischen Tensid gleichgerichtete Ladung aufweist, ausgetauscht ist.

In einer zweckmäßigen Ausgestaltung der Erfindung liegen Enzyme vor, in denen die ursprüngliche Aminosäure gemäß (a), (b) und/oder (c) in bzw. bei einem solchen hydrophoben Oberflächenbereich des Enzyms ausgetauscht ist, der auf der Enzymoberfläche als eine Vertiefung, ins besondere als eine Mulde, eine Senke oder ein in das Enzyminnere eindringendes Loch, ausgebildet ist.

Ohne hier eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, kann angenommen werden, daß geladene Gruppen von ionischen Tensiden durch elektrostatisch entgegengesetzt geladene Bereiche auf der Enzymoberfläche angezogen werden und durch elektrostatische Kräfte eine erste Bindung mit dem Enzym eingehen. Es kann wahrscheinlich angenommen werden, daß nach dieser ersten Bindung des ionischen Tensids der langkettige unpolare Rest des Tensidmoleküls in enge Wechselwirkung mit zugänglichen hydrophoben Oberflächenbe reichen des Enzyms treten kann, die sich in direkter Nach barschaft zur elektrostatischen Bindungsstelle des ioni schen Tensids befinden. Die Wechselwirkungen zwischen dem apolaren Tensidrest und dem hydrophen Oberflächenbereich des Enzyms kann zur Denaturierung des Enzyms und damit zu dessen Desaktivierung führen, insbesondere dann, wenn der hydrophobe Bereich als Mulde, Senke oder Loch ausgebildet ist. Hierdurch wird dem apolaren Tensidrest der Zugang in den hydrophoben Kern des Enzyms ermöglichst, sofern dem apolaren Tensidrest der Weg in das Enzyminnere nicht durch stabile Strukturelemente des Enzyms wie beispielsweise eine Helix oder eine rigide Faltung etc. versperrt wird. Kann der apolare Tensidrest, insbesondere im Falle von hydrophoben Mulden, Senken oder Löchern, über den hydro phoben Oberflächenbereich des Enzyms leicht in das Enzym innere eindringen, so ist die Auffaltung und des Desakti vierung des Enzyms wahrscheinlich.

In bevorzugten stabilisierten Enzymen der Erfindung ist die Stabilität des Enzyms gegen destabilisierende Ein wirkung von anionischen Tensiden durch einen Aminosäure austausch gemäß (a) oder (b) oder durch einen Austausch einer kationischen Aminosäure durch eine Aminosäure mit einem ungeladenen hydrophilen oder mit einem anionischen Aminosäurerest verbessert.

Die erfindungsgemäßen stabilisierten Enzyme können an sich jedes in der Wasch- und Reinigungsmittelindustrie einsetzbare Enzym umfassen, beispielsweise Enzyme wie Pro teasen, Lipasen, Amylasen, Pullulanasen, Glucanasen, Pek tinasen, Nukleasen, Oxidoreduktasen etc. Zweckmäßig sind als stabilisierte Enzyme insbesondere Proteasen, Lipasen, Amylasen oder Cellulasen, wobei gegen destabilisierende Einwirkungen von ionischen Tensiden stabilisierte Prote asen in einer Ausgestaltung der Erfindung bevorzugt sind. Im folgenden wird daher die Erfindung stellvertretend für die vorstehend genannten Enzyme am Beispiel der Proteasen eingehender beschrieben. Als Proteasen sind insbesondere die sogenannten Subtilisine vorteilhaft. Subtilisine sind alkalische Serinproteasen, d. h. Proteasen mit pH-Optimum im alkalischen pH-Bereich und mit einem essentiellen Serinrest im aktiven Zentrum. Die Subtilisine der vorlie genden Erfindung können durch Kultivierung von Gram-posi tiven Bakterien oder Pilzen gewonnen werden. Sehr bekannte Subtilisine des Standes der Technik werden aus Bacillus-Stämmen gewonnen, beispielsweise Subtilisine wie Subtili sin BPN′ oder Subtilisin Carlsberg. Hierzu gehören auch alkalische Proteasen, die durch Kultivierung von Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus lichenifor mis oder Bacillus lentus gewonnen werden können. Ganz be sonders bevorzugte Subtilisine sind die hochalkalischen Serinproteasen, die insbesondere durch Kultivierung von Bacillus-Spezies wie z. B. Bacillus alcalophilus gewonnen werden können.

In einer speziellen Ausgestaltung der Erfindung be sitzen diese hochalkalischen Proteasen eine Aminosäurense quenz mit mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, insbesondere aber mindestens 95% Homologie zu der in Fig. 1 angegebenen Aminosäurensequenz, wobei in der Amino säurensequenz der hochalkalischen Protease wenigstens eine der ursprünglichen Aminosäuren wie oben unter (a), (b) und/oder (c) angegeben gegen eine andere Aminosäure ausge tauscht ist.

Unter Homologie zu der in Fig. 1 angebenen Aminosäu rensequenz wird hier die strukturelle Verwandtschaft der betreffenden Aminosäurensequenzen zu der in Fig. 1 angege benen Aminosäurensequenz verstanden. Zur Bestimmung der Homologie werden jeweils die einander strukturell entspre chenden Abschnitte der Aminosäurensequenz der Fig. 1 und der damit zu vergleichenden Aminosäurensequenz so zur Deckung miteinander gebracht, daß maximale Strukturüber einstimmung zwischen den Aminosäurensequenzen besteht, wobei durch Deletion oder Insertion einzelner Aminosäuren verursachte Unterschiede berücksichtigt und durch entspre chende Verschiebungen von Sequenzabschnitten ausgeglichen werden. Die Zahl der nunmehr in den Sequenzen miteinander übereinstimmenden Aminosäuren ("homologe Positionen") be zogen auf die Gesamtzahl der in der Sequenz der Fig. 1 enthaltenen Aminosäuren gibt dabei die Homologie in % an. Abweichungen in den Sequenzen können sowohl durch Varia tion, Insertion als auch Deletion von Aminosäuren bedingt sein.

Es versteht sich dementsprechend von selbst, daß bei Einsatz von zur Fig. 1 wenigstens zu 80% homologen hoch alkalischen Proteasen, die mit Bezug auf die Fig. 1 be zeichneten Aminosäurenpositionen sich auf die dazu homolo gen Positionen der jeweils eingesetzten Protease beziehen. Deletionen oder Insertionen in den Aminosäurensequenzen der zu Fig. 1 homologen Proteasen können zu einer relati ven Verschiebung der Aminosäurenpositionen führen, so daß in homologen Teilstücken von zueinander homologen Amino säurensequenzen die numerischen Bezeichnungen der einander entsprechenden Aminosäurepositionen nicht identisch zu sein brauchen.

Zweckmäßig stabilisierte hochalkalische Proteasen der Erfindung sind insbesondere solche, die durch Austauschen von Aminosäuren in wenigstens einer der Positionen 4, 14, 27, 39, 43, 47, 49, 77, 80, 89, 111, 117, 118, 127, 143, 161, 164, 165, 208, 232, 233, 235, 237, 249 oder 256, vor zugsweise 27, 43, 118, 143, 164, 237, oder 249, der Fig. 1 oder in einer der dazu homologen Positionen stabilisiert sind. Von den vorstehenden Austauschpositionen sind insbe sondere die Positionen 27, 43, 118, 143, 164, 237 und 249 der Fig. 1 sowie die dazu homologen Postitionen vorteil haft. Beispiele für besonders bevorzugt stabilisierte hochalkalische Proteasen sind solche, die durch wenigstens einen der Aminosäureaustauscher K27Q, I43R, I43K, I43Q, I43E, H118W, H118Y, R143N, R143S, R143T, R164Q, N237P, T249R, T249K, T249Q und T249E, mit den auf Fig. 1 bezo genen Positionen oder einen hierzu homologen Aminosäure austausch stabilisiert sind. Für die Bezeichnung der Muta tionen wird hier die im Stand der Technik übliche Nomen klatur verwendet. Die Aminosäuren werden durch den Ein buchstabencode bezeichnet, wobei die ursprüngliche Amino säure der Positionsangabe vorangestellt und die zur Stabi lisierung eingeführte Aminosäure der Positionsangabe nach gestellt ist.

Gemäß Variante (a) der Erfindung ist in den Enzymen eine hydrophile Aminosäure anstelle einer hydrophoben Aminosäure in einen apolaren Bereich der Enzymoberfläche eingeführt. Die ausgetauschten hydrophoben Aminosäuren im Sinne der Erfindung können Glycin (= Gly, G), Alanin (= Ala, A), Valin (= Val, V), Leucin (= Leu, L), Isoleucin (= Ile, I), Phenylalanin (= Phe, F), Prolin (= Pro, P) sein; insbesondere die Aminosäuren Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin. Die an die Stelle der ursprünglichen, hydrophoben Aminosäure tretende neue, hydrophile Amino säure kann sowohl einen geladenen als auch einen ungela denen polaren Aminosäurerest besitzen. Hydrophile Amino säuren mit geladenem Aminosäurerest sind z. B. die Amino säuren Asparaginsäure (= Asp, D), Glutaminsäure (= Glu, E), Lysin (= Lys, K), Arginin (= Arg, R); hydro phile Aminosäuren mit einem ungeladenen polaren Amino säurerest sind insbesondere z. B. Asparagin (= Asn, N) und Glutamin (= Gln, Q). Bevorzugt sind insbesondere die lang kettigeren Aminosäuren Glutamin, Glutaminsäure, Arginin und Lysin. Ein Beispiel für einen hydrophoben Bereich, in dem ein Aminosäureaustausch gemäß (a) zu einer stabili sierten hochalkalischen Protease aus Bacillus alcalophilus führt, ist der in Fig. 9 dargestellte hydrophobe Bereich der Aminosäureposition Ile 43. Dieser hydrophobe Bereich ist durch die polaren Aminosäuren Gln 57, Asn 42 und die ionische Aminosäure Arg 44 umgeben. In diesem hydrophoben Bereich führt der Ersatz von Ile 43 beispielsweise durch Arginin, Lysin, Glutamin oder Glutaminsäure zu erfindungs gemäß stabilisierten hochalkalischen Proteasen mit einer der Mutationen I43R, I43K, I43Q und I43E.

Gemäß Variante (b) der Erfindung ist in den Enzymen anstelle einer polaren ungeladenen, an den apolaren Bereich der Enzymoberfläche angrenzenden Aminosäure eine gegenüber dieser ursprünglichen Aminosäure sterisch an spruchsvollere Aminosäure eingeführt. Die auszutauschenden polaren ungeladenen Aminosäuren im Sinne dieser Variante der Erfindung sind bspw. die Aminosäuren Tyrosin, und ins besondere Threonin, Asparagin und Histidin. Für den Aus tausch der ursprünglichen Aminosäure gemäß Variante (b) der Erfindung ist an sich jede gegenüber der ursprüngli chen Aminosäure sterisch genügend anspruchsvolle Amino säure, ggf. sogar hydrophobe Aminosäure, geeignet. Durch die sterisch anspruchsvollere Aminosäure wird der apolare Bereich gegen die destabilisierende Einwirkung des lipo philen Tensidrestes abgeschirmt, so daß der lipophile Ten sidrest nicht mehr in das hydrophobe Enzyminnere ein dringen kann. Diese Variante der Erfindung eignet sich insbesondere zum Abschirmen von hydrophoben Löchern gegen die destabilisierende Einwirkung eines lipophilen Tensid restes. Ein Beispiel für Variante (b) der Erfindung mit einem hydrophoben Bereich, bei dem der Austausch einer an grenzenden polaren ungeladenen Aminosäure durch eine sterisch anspruchsvollere Aminosäure zu einer stabilisier ten hochalkalischen Protease führt, ist in Fig. 10 darge stellt. Dieser hydrophobe Bereich ist als ein tief in das hydrophobe Enzyminnere eindringendes Loch ausgebildet, welches von einem polaren, durch die Aminosäuren His 118, Lys 229, Asn 237 und Arg 143 gebildeten Bereich umgeben ist. Die polaren ungeladenen Aminosäuren His 118 und Asn 237 grenzen direkt an den hydrophoben Bereich an. Der Ersatz der Aminosäure His 118 oder der Aminosäure Asn 237 durch eine der hier bspw. sterisch anspruchsvolleren Aminosäuren Tryptophan, Tyrosin oder Prolin führt zu er findungsgemäß stabilisierten hochalkalischen Proteasen mit z. B. einer der Mutationen H118W, H118Y oder N237P.

Vorzugsweise wird der apolare Bereich der Enzymober fläche in Variante (b) der Erfindung durch eine gegenüber der ursprünglichen Aminosäure sterisch anspruchsvollere Aminosäure mit einem langkettigeren hydrophilen Amino säurerest abgeschirmt. Ein Beispiel für einen solchen hydrophoben Bereich, bei dem der Austausch einer angren zenden polaren ungeladenen Aminosäure durch eine langket tigere hydrophile Aminosäure zu einer stabilisierten hoch alkalischen Protease führt, ist in Fig. 11 dargestellt. Dieser hydrophobe Bereich wird von den Aminosäuren Leu 261 und Val 262 gebildet und ist von einem polaren Bereich aus den Aminosäuren Glu 265, Asn 263, Gln 12, Arg 10, Asn 178 umgeben. Die polare ungeladene Aminosäure, die an den hydrophoben Bereich bei Leu 261-Val 262 angrenzt, ist Thr 249. Der Ersatz der Aminosäure Thr 249 durch bspw. eine der langkettigeren hydrophilen Aminosäuren Arginin, Lysin, Glutamin oder Glutaminsäure führt zu erfindungsge mäß stabilisierten hochalkalischen Proteasen mit z. B. einer der Mutationen T249R, T249K, T249Q, und T249E.

Gemäß Variante (c) der Erfindung ist anstelle einer ionischen Aminosäure, die in Nachbarschaft zu einem apola ren Bereich der Enzymoberfläche angesiedelt ist und deren geladener Aminosäurerest einen Anknüpfungspunkt für das ionische Tensid bilden kann, eine ungeladene hydrophile oder eine zum Tensid gleichgerichtet geladene Aminosäure eingeführt. Die auszutauschenden ionischen als auch die zum Tensid gleichgerichtet geladenen Aminosäuren im Sinne der Erfindung sind hierbei die oben bereits genannten hydrophilen Aminosäuren mit geladenen Aminosäureresten, d. h. Asparaginsäure, Glutaminsäure, Lysin und Arginin. In Enzymen, die gegen kationische Tenside stabilisiert sind, ist eine der anionischen Aminosäuren wie Asparaginsäure und Glutaminsäure gegen eine kationische Aminosäure wie Lysin oder Arginin ausgetauscht. Demgegenüber ist in Enzymen, die gegen anionische Tenside stabilisiert sind, gemäß dieser Variante der Erfindung eine kationische Aminosäure wie Lysin und Arginin gegen eine anionische Aminosäure ausgetauscht. In einer weiteren, hier bevorzug ten Ausgestaltung der Variante (c) der Erfindung ist die auszutauschende ionische Aminosäure jedoch durch eine un geladene hydrophile Aminosäure ausgetauscht. Ungeladene hydrophile Aminosäuren für diese bevorzugte Ausgestaltung sind insbesondere die Aminosäuren Serin (= Ser, S), Threo nin (Thr, T), Asparagin (= Asp, N), Glutamin (= Gln, Q), Tyrosin (= Tyr, Y); die Aminosäuren mit kürzeren polaren Aminosäureresten wie Serin, Threonin und insbesondere As paragin sind bevorzugt, in den Fällen, in denen die Ladung der ursprünglichen ionischen Aminosäure vom Enzym weit in das umgebende Medium hineinragt. Die Einführung einer un geladenen hydrophilen Aminosäure für die ursprüngliche, ionische Aminosäure führt zu Enzymen, die sowohl gegen die Einwirkung von kationischen als auch von anionischen Ten siden stabilisiert sind. Ein Beispiel für einen hydropho ben Bereich der Enzymoberfläche, in dem ein Aminosäureaus tausch gemäß Variante (c) der Erfindung zu einer stabili sierten hochalkalischen Protease aus Bacillus alcalophilus führt, ist in Fig. 12 dargestellt. Dieser hydrophobe Be reich ist als ein tief in das hydrophobe Enzyminnere ein dringendes Loch ausgebildet und ist von den Aminosäuren Glu 110, Asn 114 und Arg 143 umgeben. Der Austausch der ionischen Aminosäure Arg 143, die einen bevorzugten An knüpfungspunkt für ein anionisches Tensid bilden kann, durch bspw. insbesondere Asparagin, Serin oder Threonin führt zu erfindungsgemäß stabilisierten hochalkalischen Proteasen mit z. B. einer der Mutationen R143N, R143S oder R143T.

Die oben beschriebenen, erfindungsgemäß stabilisier ten hochalkalischen Proteasen sind bspw. solche, die durch Kultivierung von Mikroorganismen wie z. B. Bacillus alcalo philus erhältlich sind. Insbesondere sind diese hochalka lischen Bacillus-Proteasen durch Kultivierung von Bacillus-Spezies erhältlich, die die Identifizierungsmerk male von Bacillus alcalophilus DSM 5466 aufweisen. Die er findungsgemäß stabilisierten Proteasen besitzen somit eine durch die oben angegebene Homologie definierte Verwandt schaft zu der aus Bacillus alcalophilus DSM 5466 erhält lichen Protease, deren Aminosäurensequenz in Fig. 1 als Bezugspunkt für die erfindungsgemäß stabilisierten Prote asen angegeben ist. Diese hochalkalischen Proteasen besit zen Molekulargewichte von 26 000 bis 28 000 g/mol, gemessen durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese gegenüber Refe renzproteinen mit bekanntem Molekulargewicht. Sie zeichnen sich weiterhin durch ein pH-Optimum im Bereich von 10 bis 12,5 aus, wobei unter pH-Optimum derjenige pH-Bereich ver standen wird, in dem die Proteasen maximale proteolytische Aktivität aufweisen und die Proteasen eine gute pH-Stabi lität besitzen.

Die oben beschriebenen, erfindungsgemäß stabilisier ten Enzyme können durch das in den Ansprüchen angegebene Verfahren zur Stabilisierung hergestellt werden. Dieses Verfahren zur Verbesserung der Stabilität von Enzymen ge gen destabilisierende Einwirkungen von ionischen Tensiden zeichnet sich dadurch aus, daß man wenigstens eine der Aminosäuren, die sich in einem hydrophoben Oberflächenbe reich des Enzyms oder in direkter Nachbarschaft zu diesem hydrophoben Oberflächenbereich befinden, durch eine andere Aminosäure austauscht, wobei

a) eine hydrophobe Aminosäure, deren Aminosäurerest an der Bildung eines hydrophoben Oberflächenbereiches be teiligt ist, in dessen räumlicher Nachbarschaft sich wenigstens eine Aminosäure mit ionischem Aminosäure rest befindet, durch eine andere Aminosäure mit hydro philem Aminosäurerest ausgetauscht wird, und/oder wobei
b) eine polare, ungeladenen Aminosäure, die an einem hydrophoben Oberflächenbereich angrenzt, in dessen räumlicher Nachbarschaft sich wenigstens eine Amino säure mit ionischem Aminosäurerest befindet, durch eine gegenüber der ursprünglichen Aminosäure sterisch anspruchsvollere Aminosäure, vorzugsweise durch eine sterisch anspruchsvollere Aminosäure mit einem langket tigen hydrophilen Aminosäurerest, ausgetauscht wird, und/oder wobei
c) eine ionische Aminosäure, die sich in räumlicher Nach barschaft zu einem hydrophoben Oberflächenbereich be findet, durch eine Aminosäure mit einen ungeladenen hydrophilen Aminosäurerest oder durch eine geladene Aminosäure, deren Aminosäurerest eine zum ionischen Tensid gleichgerichtete Ladung aufweist, ausgetauscht wird.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden in der Aminosäurensequenz des jeweils zu stabilierenden Enzyms gemäß den Vorgaben der Verfahrensvarianten (a), (b) und/oder (c) Aminosäuren durch gerichtete Mutagenese der DNA-Sequenz, die für die Aminosäurensequenz des Enzyms codiert, ausgetauscht. Die nachfolgende Expression der mutierten DNA-Sequenz mit Hilfe eines geeigneten Mikroor ganismus liefert dann das durch Aminosäurenaustausch er findungsgemäß stabilisierte Enzym. Hierbei kann zur Durch führung des Verfahrens im Einzelnen so vorgegangen werden, daß man

a) zunächst aus einem geeigneten Mikroorganismus, welcher das zu stabilisierende Enzym produziert, die für das Enzym codierende DNA-Sequenz (d. h. das Strukturgen des Enzyms) isoliert;
b) die Nukleotidabfolge dieser DNA-Sequenz bestimmt;
c) in der nunmehr bekannten DNA-Sequenz solche Mutatio nen erzeugt, daß die mutierte DNA-Sequenz nun für ein Enzym codiert, in dem eine Aminosäure des Ursprungsen zyms gemäß den Vorgaben der Verfahrensvarianten (a), (b) und/oder (c) durch eine andere Aminosäure ausge tauscht ist;
d) nachfolgend die mutierte DNA-Sequenz in einen geeig neten Expressionsvektor einbaut;
e) mit dem erhaltenen Expressionsvektor einen geeigneten Mikroorganismus, welcher schließlich zur Herstellung des mutierten Enzyms eingesetzt werden kann, trans formiert.

Die einzelnen Verfahrensschritte zur erfindungsgemä ßen Stabilisierung und zur Gewinnung der erfindungsgemäß stabilisierten Enzyme, sowie die hierbei erhaltenen Pro dukte sowie Zwischenprodukte in Form von DNA-Sequenzen, Vektoren, insbesondere Expressionsvektoren, und transfor mierten Mikroorganismen werden nachfolgend am Beispiel der hochalkalischen Proteasen näher beschrieben. Zur erfin dungsgemäßen Stabilisierung anderer Enzyme - bspw. Lipa sen, Amylasen, Cellulasen etc. - kann in analoger Weise vorgegangen werden.

Zu Herstellung von erfindungsgemäß stabilisierten hochalkalischen Proteasen wird zunächst aus einem geeig neten Bakterium, welches eine hochalkalische Protease mit einer Aminosäurensequenz mit mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, insbesondere aber mindestens 95% Homolo gie zu der Aminosäurensequenz der Fig. 1 produziert, die für die Protease codierende DNA-Sequenz (d. h. das Struk turgen der Protease) isoliert. Die Strukturgene, die für Aminosäurensequenzen dieser hochalkalischen Proteasen co dieren, können nach an sich bekannten, allgemeinen Metho den erhalten werden. Hierzu wird z. B. aus einem Bakterium ("Donor-Bakterium"), insbesondere aus einer Bacillus-Spe zies, die die hochalkalische Protease produziert, die chromosomale DNA nach an sich bekannten Methoden isoliert und mit geeigneten Restriktionsendonukleasen in an sich be kannter Weise partiell hydrolysiert. Die hierdurch erhal tenen Restriktionsfragmente der Donor-DNA können z. B. durch Gelelektrophorese nach Größe aufgetrennt und die Fragmente gewünschter Größe dann mit einer geeigneten, doppelsträngigen Vektor-DNA in vitro verbunden (ligiert) werden (Rekombination). Häufig verwendete Vektoren sind die sogenannten Plasmide, d. h. extrachromosomale, ring förmige, doppelsträngige Bakterien-DNA, die sich durch geeignete Methoden (Transformation) in Mikroorganismen einbringen läßt und dort vermehrbar (autonom replizierbar) ist. Gegebenenfalls besitzen die Plasmide sogenannte Marker, d. h. DNA-Fragmente, die für bestimmte, beobacht bare Eigenschaften (z. B. Antibiotika-Resistenz) codieren und die zur Selektion der transformierten Mikroorganismen (Transformanten) dienen können.

Mit den vorstehenden Plasmiden (aus Vektor-DNA + Re striktionsfragmenten der Donor-DNA) können Bakterien, vor zugsweise eine Bacillus-Spezies, transformiert werden und die Transformanten nach der bekannten Markereigenschaft (z. B. Neomycin-Resistenz) selektiert werden. Man erhält so Klone, d. h. genetisch identische Transformanten. Unter diesen Transformanten können solche, die vermehrt Protease ausscheiden, auf proteinhaltigen Platten gesucht und da nach isoliert werden. Aus einem Klon mit Proteaseaktivität wird schließlich die in diesen Transformanten eingeführte Plasmid-DNA isoliert und durch erneute Transformation eines Bakteriums überprüft, ob die Proteaseaktivität Plas mid-gebunden ist, d. h. ob die Proteaseaktivität mit der Markereigenschaft gekoppelt ist.

Das so isolierte Plasmid enthält neben der Vektor-DNA mit bekannten Restriktionsstellen das gewünschte Struktur gen für die zu stabilisierende hochalkalische Ausganspro tease und weitere, hier aber nicht benötigte DNA-Sequenzen aus dem Donor-Bakterium. Um den Aufwand für die nachfol gende Sequenzierung des Strukturgens der zu stabilisieren den hochalkalischen Protease möglichst gering zu halten, empfiehlt es sich, vor der eigentlichen Sequenzierung die zusätzlichen, nicht benötigten DNA-Sequenzen aus der Donor-DNA-Sequenz zu eliminieren und die Donor-DNA-Sequenz im wesentlichen auf das Strukturgen für die Protease zu reduzieren. Hierzu wird z. B. das Plasmid, welches das Strukturgen und die zusätzliche DNA-Sequenz umfaßt, mit einer Anzahl verschiedener Restriktionsendonukleasen ge schnitten (restringiert), die erhaltenen DNA-Fragmente durch Gelelektrophorese nach Größe getrennt und anhand des gefundenen Bandenmusters eine Restriktionskarte erstellt. Es werden so die Restriktionsstellen, die im Bereich der Donor-DNA-Sequenz angesiedelt sind, ermittelt. Die Kennt nis der Restriktionskarte des Plasmids ermöglicht es, durch Schneiden mit ausgewählten Restriktionsendonukleasen ein DNA-Fragment aus der Donor-DNA-Sequenz herauszuschnei den, welches im wesentlichen nur das Strukturgen für die hochalkalische Protease, die zugehörigen Pre- und Pro-Ein heiten, sowie die für die Genexpression benötigte Promo tor-Einheit umfaßt.

Durch den Wiedereinbau dieser in der Größe reduzier ten Donor-DNA-Sequenz in einen geeigneten Vektor kann ein neuer, replizierbarer Vektor erhalten werden, dessen Fähigkeit zur Expression der hochalkalischen Ausgangspro tease überprüft werden kann, indem man ein Bakterium, ins besondere eine Bacillus-Spezies, mit diesem Vektor trans formiert, den erhaltenen Transformanten kultiviert und auf Proteaseaktivität überprüft. Ein Beispiel für einen sol chen reduzierten Vektor mit der Bezeichnung pCLEAN4 gibt die Restriktionskarte der Fig. 2 wieder.

Zur Bestimmung der Nukleotidsequenz (Sequenzierung) des Proteasestrukturgens wird zunächst der vorstehend be schriebene Vektor in einem geeigneten Mikroorganismus re pliziert, und das Proteasegen isoliert. Dieses wird sodann in einen Phagemiden subkloniert und die erhaltenen Phage miden anschließend in einen geeigneten Mikroorganismus z. B. E. coli transformiert und durch Kultivierung der Transformanten einzelsträngige, das Proteasegen enthal tende DNA produziert. Die gebildete einzelsträngige DNA wird isoliert und der Sequenzierung zugeführt. Die Sequen zierung wird nach an sich bekannten Methoden ausgeführt, indem man z. B. die Einzelstrang-DNA mit dem Proteasegen nach Maxam und Gilbert einer basenspezifischen partiellen chemischen Spaltung zuführt (1980, in Methods in Enzymo logy, Grossmann L., Moldave K., eds., Academic Press Inc., New York und London, Vol. 65, 499), oder indem man z. B. die Einzelstrang-DNA mit dem Proteasegen als Matrize für die partielle Synthese von Teilstücken des komplementären DNA-Stranges nach der Dideoxy-Kettenterminator-Methode nach Sanger et al. (1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463) einsetzt.

Die ermittelte Nukleotidsequenz kann nunmehr mit Hilfe des genetischen Codes (ein Triplett-Wort = Codon steht für eine definierte Aminosäure) in die Aminosäuren sequenz der Protease übersetzt werden. Zur Bestimmung des Anfangspunktes der Aminosäurensequenz des reifen Protease-Enzyms (d. h. das Enzym ohne die Pre- und Pro-Einheiten) wird am N-terminalen Ende der reifen Protease ein kurzes Stück der Aminosäurenabfolge durch an sich bekannte Metho den zur Bestimmung von Aminosäurensequenzen in Peptiden bestimmt. Die bekannte N-terminale Aminosäurensequenz kann nun anhand des genetischen Codes dem entsprechenden Teil stück der obigen Nukleotidsequenz zugeordnet werden und so der Anfangspunkt der für die reife Protease codierenden DNA-Sequenz festgelegt werden. Die weitere Aminosäuren abfolge der Protease ergibt sich dann zwangsläufig aus der DNA-Sequenz durch Zuordnung der nachfolgenden Aminosäuren mit Hilfe des genetischen Codes.

Erfindungsgemäß wird die für die hochalkalische Pro tease codierende DNA-Sequenz durch Änderung der entspre chenden Codons derart mutiert, daß die mutierte DNA-Se quenz für eine gegen Einwirkung von ionischen Tensiden stabilisierte hochalkalische Protease codiert, in deren Aminosäurensequenz in einer der Positionen 4, 14, 27, 39, 43, 47, 49, 77, 80, 89, 111, 117, 118, 127, 143, 161, 164, 165, 208, 232, 233, 235, 237, 249, 256 der Fig. 1 oder in einer der dazu homologen Positionen die betreffende Amino säure durch eine Aminosäure gemäß einer der Verfahrens varianten (a), (b) und/oder (c) ausgetauscht ist.

Die Einführung der Mutationen in die für die hochal kalische Protease codierende DNA wird durch an sich be kannte Methoden zur gerichteten Mutagenese bewerkstelligt. Hierzu wird aus geeigneten Vektoren (Phagemide), z. B. aus pCLMUTN1 der Fig. 4 oder pCLMUTC1 der Fig. 5, gegebenen falls unter Mithilfe eines Helfer-Phagen, ringförmige Einzelstrang-DNA erzeugt, die das gesamte Strukturgen, oder aber vorzugsweise nur denjenigen Teil (z. B. nur den N-terminalen Teil bzw. den C-terminalen Teil) des Struk turgens der Ursprungsprotease, in welchem die Mutation vorgenommen werden soll, enthält. Mit dieser ringförmigen Einzelstrang-DNA hybridisiert man ein synthetisches, hy bridisierfähiges Oligonukleotid, welches in der gewünsch ten Mutationsstelle ein Basentriplett (Codon) enthält, welches statt für die originäre, auszutauschende Amino säure erfindungsgemäß für eine neue Aminosäure, gemäß (a), (b) oder (c) codiert. Zusätzlich ist das Oligonukleotid gegenüber der zu hybridisierenden, originären Nukleotid sequenz noch derart durch einen oder einige wenige weitere Nukleotidbausteine abgewandelt, daß die Codierung der originären Aminosäurensequenz zwar im Rahmen der Degenera tion des genetischen Codes erhalten bleibt, jedoch in der originären Protease-Nukleotidsequenz eine gegebenenfalls vorhandene Restriktionsstelle im synthetischen Oligo nukleotid entfernt bzw. eine weitere Restriktionsstelle in das synthetische Oligonukleotid eingeführt wird. Die ent fernte bzw. eingeführte Restriktionsstelle dient später mit Hilfe geeigneter Restriktionsendonukleasen zur Identi fizierung der Mutanten-DNA-Sequenz gegenüber der Ausgangs typ-DNA-Sequenz. Die durch Hybridisierung erhaltene, par tiell doppelsträngige DNA-Sequenz wird durch Zugabe der benötigten Nukleotide und unter Einwirkung von DNA-Poly merase und DNA-Ligase zum vollständigen Doppelstrang er gänzt. Die erzeugte ringförmige, doppelsträngige DNA-Se quenz wird nachfolgend als Vektor in einen geeigneten Mikroorganismus transformiert und nach ausreichender Re plikation die mutierten DNA-Sequenzen über die entfernte bzw. zusätzlich eingeführte Restriktionsstelle im Oligo nukleotidsequenzteil identifiziert und anschließend iso liert.

In einer Verfahrensvariante wird in der gerichteten Mutagenese uracylierte Einzelstrang-DNA als Matrize er zeugt und für die Hybridisierung mit den synthetischen Oligonukleotiden verwendet. Nach Beendigung der Reaktionen des Verfahrens der gerichteten Mutagenese kann der Uracil-hal tige DNA-Einzelstrang, der als Matrize zur Erzeugung mutierter DNA-Stränge (Vektoren) diente, durch Behandlung mit Uracil-N-Glycosylase beseitigt werden, ohne daß es einer phänotypischen Selektion von Mutanten bedarf. Die Glycosylase-Behandlung kann z. B. mit Hilfe eines geeigne ten Mikroorganismus mit Uracil-N-Glycosylase-Aktivität durchgeführt werden, der mit mutierter Vektor-DNA trans formiert wurde. Die Replikation kann z. B. in einem E. coli-Stamm vorgenommen werden, der nur den mutierten, nicht-uracylierten DNA-Strang des im Mutationsverfahren erzeugten Doppelstrang-Vektors vermehrt. Hierdurch wird die Selektion der mutierten DNA-Vektoren zusätzlich er leichtert.

Die für die gerichtete Mutagenese benötigten syn thetischen Oligonukleotide werden nach an sich bekannten Methoden hergestellt. Beispielsweise kann die Herstellung der Oligonukleotide nach Beaucage S. L. und Caruthers M. H. (1981, Tetrahedron Letters 22: 1859-1862) mit β-Cyano ethylphosphoramidit in einem Cyclone-Synthetiser (Bio search) erfolgen. Die erhaltenen Oligonukleotide können z. B. durch Elution aus Polyacrylamid-Gelen und gegebenen falls anschließende Entsalzung mit Hilfe von Sephadex-Säu len gereinigt und der weiteren Verwendung zugeführt werden. Die synthetischen Oligonukleotide können direkt als Primer für die DNA-Polymerase im vorstehend beschrie benen Mutagenese-Verfahren dienen. Die synthetischen Oligonukleotidsequenzen umfassen z. B. 20 bis 30 Nukleotid bausteine, die für etwa 7 bis 10 Aminosäuren codieren. Es ist natürlich auch möglich längere Nukleotidsequenzen für die obige Hybridisierung einzusetzen, doch führt dies zu keinen weiteren Vorteilen, solange eine ausreichende Hy bridisierungsfähigkeit der kurzkettigen synthetischen Oligonukleotide sichergestellt ist.

Die durch das oben beschriebene Verfahren der ge richteten Mutagenese erhaltenen ringförmigen, doppelsträn gigen DNA-Sequenzen mit den eingeführten Mutationen stel len mutierte Vektoren dar, aus denen durch Behandlung mit geeigneten Restriktionsendonukleasen, je nach Fall, das gesamte mutierte Protease-Strukturgen oder das mutierte Teilstück des Protease-Strukturgens herausgeschnitten und in einen geeigneten Expressionsvektor eingebracht (subklo niert) werden kann. Mit diesem Expressionsvektor werden dann geeignete Mikroorganismen, z. B. Bacillus-Spezies, transformiert, die nachfolgend zur Expression und Gewin nung der mutierten hochalkalischen Proteasen unter geeig neten Bedingungen kultiviert werden.

In einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens wird nicht das gesamte Strukturgen für die gerichtete Mutagenese eingesetzt, sondern nur ein Teilstück dessel ben, in dem die Mutation erzeugt werden soll. Hierzu wird aus dem Vektor der zur Replikation der Strukturgene dient, z. B. die N-terminale oder C-terminale Hälfte des Struktur gens mit geeigneten Restriktionsendonukleasen herausge schnitten und in einen passenden Phagemiden subkloniert. Man erhält so Vektoren, die entweder die N-terminale oder die C-terminale Hälfte des Strukturgens der Protease ent halten und die in einem geeigneten Mikroorganismus, z. B. E. coli, zunächst ausreichend repliziert und dann der oben beschriebenen, gerichteten Mutagenese zugeführt werden. Die Mutagenese von Teilstücken des Strukturgenes hat den Vorteil, daß kürzere Einzelstrang-DNA-Sequenzen verwendet werden können und somit nach dem Hybridisierungsschritt mit synthetischen Oligonukleotiden im partiellen DNA-Dop pelstrang wesentlich weniger Nukleotide als bei Verwendung der gesamten DNA-Sequenz zu ergänzen sind. Hier durch wird der synthetische Aufwand und zusätzlich die Gefahr uner wünschter zufälliger Mutationen reduziert.

Die mutierten DNA-Sequenzen können aus dem zur Er zeugung der Mutationen dienenden Klonierungsvektoren durch geeignete Restriktionsendonukleasen herausgeschnitten und in Vektoren mit passenden Restriktionsstellen eingebaut werden. Die erhaltenen Vektoren sind bspw. Vorläufer der eigentlichen, für die Expression der hochalkalischen Pro tease benötigten Expressionsvektoren. Diese Vektoren sind so aufgebaut, daß sie außer den geeigneten Restriktions stellen (z. B. aus einem synthetischen Linker) auch bereits die für die Proteaseexpression in einem Wirtsorganismus benötigten regulatorischen Sequenzen, Signalsequenzen, Promotorsequenzen und die für die Pre- und Proeinheiten der Protease codierenden DNA-Sequenzen enthalten.

Durch die Subklonierung einer mutierten DNA-Sequenz in einen solchen Vektor wird der eigentliche Expressions vektor für eine optimierte hochalkalische Protease erhal ten. Der Einbau der mutierten DNA-Sequenz in diesen Vor läufer des Expressionsvektors erfolgt so, daß ein Expres sionsvektor mit geeignetem Leseraster entsteht. Hierbei können mutierte Teilstücke der für die Protease codieren den DNA-Sequenz, z. B. ein C-terminales oder ein N-termi nales Teilstück, in bereits das jeweils restliche nicht mutierte Teilstück enthaltende Vektoren eingebaut werden; oder es wird die gesamte für die Protease codierende mutierte DNA-Sequenz in Vektoren, welche noch keine Teil stücke dieser Protease-DNA-Sequenz enthalten, eingebaut. Beispiele für solche, bereits ein Teilstück der nicht-mu tierten DNA-Sequenz enthaltende Vorläufervektoren eines Expressionsvektors sind die weiter unten und in den Bei spielen näher beschriebenen Vektoren mit der Bezeichnung pAL1N und pAL1C. Ein Vektor, der noch kein Teilstück der Protease-DNA-Sequenz enthält, ist der Vektor pAL1P mit der in Fig. 7 angegebenen Restriktionskarte.

Die Expressionsvektoren-Vorläufer für die bevorzugte Variante der Erfindung (Mutation in der N-terminalen Hälf te oder in der C-terminalen Hälfte) werden z. B. wie folgt erhalten. Zunächst führt man in ein Bacillus-Plasmid eine Polyklonierungsstelle ein. Das so erhaltene Plasmid wird restringiert und mit einem E. coli-Plasmidfragment, wel ches Marker und für die Replikation wichtige Sequenzteile enthält, rekombiniert. Anschließend werden gegebenenfalls solche Restriktionsstellen z. B. durch gerichtete Mutage nese entfernt, die spätere Verfahrensschritte stören wür den. Aus dem so erhaltenen Plasmid wird ein neuer Vektor konstruiert, der die aus dem Bacillus-Plasmid und dem E. coli-Plasmid zur Replikation dienenden DNA-Sequenzen, DNA-Sequenzen für den Promotor, DNA-Sequenzen, die für die Pre-Prosequenz der Protease codieren (erhalten aus z. B. dem Plasmid pCLEAN4 der Fig. 2), und einen synthetischen Linker enthält. Ein Beispiel für ein solches Plasmid mit der Bezeichnung pAL1P gibt die Restriktionskarte der Fig. 7 wieder. Der synthetische Linker ist dabei derart ausgewählt, daß nach Schneiden mit geeigneten Restrik tionsendonukleasen entweder mit dem gesamten Ursprungs strukturgen bzw. dem gesamten mutierten Strukturgen bzw. mit mutierten oder nicht mutierten Teilstücken des Struk turgens rekombiniert werden kann. Zur Herstellung eines Expressionsvektor-Vorläufers, der z. B. mit einer mutierten N-terminalen Hälfte des Strukturgens rekombiniert werden soll, wird in den vorstehend konstruierten Vektor, der die genannten Bacillus-, E. coli-, die Promotor- und die Pre- und Prosequenzen der Protease sowie den synthetischen Linker enthält, durch Schneiden des synthetischen Linkers z. B. zunächst die nichtmutierte C-terminale Hälfte des Strukturgens der Protease eingeführt. Man erhält so die bereits genannten Vektoren vom Typ pAL1C. Anschließend wird durch nochmaliges Schneiden des synthetischen Linkers die noch fehlende, mutierte N-terminale Hälfte des Pro tease-Strukturgens eingeführt. Auf diese Weise erhält man einen Vektor vom Typ pAL1NC der Fig. 8. Analoges gilt für den umgekehrten Fall. Es wird dann zunächst die nicht-mu tierte N-terminale Hälfte in einen Vektor vom Typ pAL1P und in den so erhaltenen Vektor vom Typ pAL1N später die mutierte C-terminale Hälfte eingeführt, wobei man eben falls einen Vektor vom Typ pAL1NC der Fig. 8 erhält.

Mit den oben beschriebenen Expressionsvektoren werden geeignete Bakterien, vorzugsweise Bacillus-Spezies, insbe sondere Bacillus subtilis, licheniformis und alcalophilus, transformiert. Die Transformanten werden anschließend in an sich bekannter Weise kultiviert und die gebildete, er findungsgemäß stabilisierte hochalkalische Protease aus dem Kulturmedium isoliert. Die Expressionsvektoren können hierzu sowohl in Bakterien, die noch zur Bildung von Ei genprotease befähigt sind, als auch in Protease-defiziente Bakterien (die keine Eigenprotease mehr bilden) transfor miert werden. Bei Wirtsorganismen mit Eigenproteasebildung kann die erfindungsgemäß stabilisierte hochalkalische Pro tease gewünschtenfalls durch anschließende Reinigungsope rationen, z. B. durch hochauflösende Flüssigchromatographie (HPLC), von den gebildeten Eigenproteasen befreit werden. Ein solcher Reinigungsschritt kann demgegenüber bei Pro tease-defizienten Wirtsorganismen entfallen, da diese nur (oder im wesentlichen nur) die stabilisierte Protease zu bilden vermögen.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Stabili sierung von Enzymen gegen destabilierende Einwirkungen von ionischen Tensiden werden auch neue DNA-Sequenzen erzeugt, die ebenfalls einen Erfindungsgegenstand darstellen. Diese erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen zeichnen sich dadurch aus, daß sie für eine hochalkalische Protease codieren, deren Aminosäurensequenz mindestens 80%, vorzugsweise minde stens 90%, insbesondere aber mindestens 95% Homologie zu der in Fig. 1 angegebenen Aminosäurensequenz aufweist und sich von dieser in einer der Positionen 4, 14, 27, 39, 43, 47, 49, 77, 80, 89, 111, 117, 118, 127, 143, 161, 164, 165, 208, 232, 233, 235, 237, 249 oder 256, vorzugsweise 27, 43, 118, 143, 164, 237 oder 249, der Fig. 1 oder in einer der dazu homologen Positionen, die sich in einem hydrophoben Oberflächenbereich der Protease oder in Nach barschaft zu diesem hydrophoben Oberflächenbereich befin den, dadurch unterscheidet, daß die in der betreffenden Position befindliche Aminosäure im Falle von Positionen mit

a) einer hydrophoben Aminosäure, deren Aminosäurerest an der Bildung eines hydrophoben Oberflächenbereiches be teiligt ist, in dessen räumlicher Nachbarschaft sich wenigstens eine Aminosäure mit ionischem Aminosäure rest befindet, durch eine andere Aminosäure mit hydro philem Aminosäurerest ersetzt ist, und/oder daß im Falle von Positionen mit
b) einer polaren ungeladenen Aminosäure, die an einen hydrophoben Oberflächenbereich angrenzt, in dessen räumlicher Nachbarschaft sich wenigstens eine Amino säure mit ionischem Aminosäurerest befindet, durch eine gegenüber der ursprünglichen Aminosäure sterisch anspruchsvollere Aminosäure, vorzugsweise durch eine sterisch anspruchsvollere Aminosäure mit einem lang kettigeren, hydrophilen Aminosäurerest, ersetzt ist, und/oder daß im Falle von Positionen mit
c) einer ionischen Aminosäure, die sich in räumlicher Nachbarschaft zu einem hydrophoben Oberflächenbe reich befindet, durch eine Aminosäure mit einem un geladenen hydrophilen Aminosäurerest oder durch eine geladene Aminosäure, deren Aminosäurerest eine zum ionischen Tensid gleichgerichtete Ladung aufweist, ersetzt ist.

Positionen hydrophober Aminosäuren, die sich in einem hydrophoben Bereich der Enzymoberfläche befinden sind bspw. Val 4, Pro 14, Pro 39, Ile 43, Ala 47, Phe 49, Ile 77, Leu 80, Trp 111, Met 117, Pro 127, Pro 233, Trp 235, Leu 256. Positionen polarer ungeladener Aminosäuren, die an einen hydrophoben Bereich der Enzymoberfläche angrenzen sind bspw. die Tyrosinpositionen 89, 161, 165, 208; die Asparaginpositionen 232 und 237; die Histidinposition 118 und die Threoninposition 249. Beispiele für Positionen ionischer Aminosäuren, die sich in Nachbarschaft zu einem hydrophoben Bereich befinden, sind insbesondere die Argi ninpositionen 143 und 164 sowie die Lysinposition 27.

Die erfindungsgemäß stabilisierten Enzyme eignen sich einzeln oder in Kombination miteinander oder mit anderen im Stand der Technik bekannten Enzymen hervorragend für die Anwendung in festen und flüssigen Wasch- und Reini gungsmittelformulierungen, insbesondere aber für die An wendung in Flüssigformulierungen. Diese Wasch- und Reini gungsmittelformulierungen können in an sich üblicher Weise formuliert werden. Die erfindungsgemäß stabilisierten Enzyme können dazu z. B. in Form von Granulaten, Prills oder Pellets, gegebenenfalls auch mit Oberflächenüberzügen versehen, oder bei Flüssigformulierungen auch in gelöster Form, mit den anderen Komponenten der Wasch- und Reini gungsmittelformulierung in an sich bekannter Weise ver mischt werden. Die erfindungsgemäß stabilisierten Enzyme können in den Formulierungen in für Wasch- und Reinigungs mittelenzyme üblichen Mengen, insbesondere in Mengen von bis zu 3 Gew.-% (bezogen auf die Trockensubstanz der Ge samtzusammensetzung), vorzugsweise in einer Menge von 0,2 bis 1,5 Gew.-%, eingesetzt werden. Die Erfindung umfaßt daher weiterhin Wasch- und Reinigungsmittelformulierungen, die wenigstens eines der erfindungsgemäß stabilisierten Enzyme enthalten; insbesondere solche Formulierungen, die erfindungsgemäße Enzyme und ionische, vorzugsweise an ionische Tenside, enthalten. Außer den erfindungsgemäßen Enzymen können in den Wasch- und Reinigungsmittelformulie rungen weiterhin auch an sich bekannte Enzyme und alle an sich im Stand der Technik üblichen Waschmittelinhaltstoffe wie Tenside, Bleichmittel oder Gerüststoffe (Builder), sowie weitere übliche Hilfstoffe für die Formulierung von Waschmitteln in an sich üblichen Mengen enthalten sein. Zu den Hilfsstoffen gehören z. B. Verstärker, Enzymstabilato ren, Schmutzträger und/oder Kompatibilisierungsmittel, Komplex- und Chelatbildner, Seifenschaumregulatoren und Zusatzstoffe wie optische Aufheller, Opazifizierungsmit tel, Korrosionsinhibitoren, Antielektrostatika, Farb stoffe, Bakterizide, Bleichmittelaktivatoren, Persäure bleichmittelvorstufen. So enthalten erfindungsgemäße Wasch- und Reinigungsmittelformulierungen in typischer beispielhafter Zusammensetzung bezogen auf Trockensubstanz

a) wenigstens 5 Gew.-% z. B. 10 bis 50 Gew.-%, eines ioni schen, vorzugsweise anionischen Tensids oder eines Ge misches dieser Tenside;
b) bis zu 40 Gew.-% eines Builders oder eines Builder-Ge misches;
c) bis zu 40 Gew.-% eines Bleichmittels oder Bleichmittel gemisches, vorzugsweise ein Perborat wie Natriumperbo rat-Tetrahydrat oder Natriumperborat-Monohydrat;
d) bis zu 3 Gew.-% wenigstens eines erfindungsgemäßen Enzyms, insbesondere einer erfindungsgemäßen Protease;
e) weitere Bestandteile wie Hilfsstoffe etc. zur Ergänzung auf 100 Gew.-%.

Erläuterungen zu den Figuren

Fig. 1 Sequenzprotokoll für die DNA-Sequenz des AvaI/HindIII-Frag mentes mit dem Strukturgen der hochalkalischen Aus gangsprotease aus Bacillus alcalophilus HA1, sowie die Aminosäurensequenz dieser Ausgangsprotease.

Fig. 2 Restriktionskarte des Plasmides pCLEAN4.

Fig. 3 Beispiele für DNA-Sequenzen für zur gerichteten Mutagenese verwendete synthetische Oligonukleotide und Angabe elimi nierter bzw. erzeugter Erkennungsstellen für einzelne Re striktionsendonukleasen; die gegenüber der ursprünglichen DNA-Sequenz der Ausgangsprotease erzeugten Nukleotidverän derungen sind durch Angabe der veränderten Nukleotide mit kleinen Buchstaben gekennzeichnet.

Fig. 4 Restriktionskarte des Vektors pCLMUTN1.

Fig. 5 Restriktionskarte des Vektors pCLMUTC1.

Fig. 6 Restriktionskarte des Vektors pUBC132.

Fig. 7 Restriktionskarte des Plasmides pAL1P.

Fig. 8 Restriktionskarte der Expressionsvektoren vom Typ pAL1NC für die Expression der durch Mutation stabilisierten hoch alkalischen Proteasen und der nicht-mutierten hochalkali schen Ausgangsprotease.

Fig. 9 Die Figur zeigt einen flachen hydrophoben Bereich bei der Position Ile 43.

Fig. 10 Die Figur zeigt ein hydrophobes, tief in das Enzyminnere eindringendes Loch, an das die austauschbaren, polaren ungeladenen Aminosäuren His 118 und Asn 237 angrenzen.

Fig. 11 Die Figur zeigt einen hydrophoben Bereich bei den Positio nen Val 261-Leu 262.

Fig. 12 Die Figur zeigt ein hydrophobes, tief in das Enzyminnere eindringendes Loch, in dessen Nachbarschaft sich die aus tauschbare, ionische Aminosäure Arg 143 befindet.

Beispiele

Die folgende Offenbarung gibt zur weiteren Erläute rung der Erfindung typische beispielhafte Ausgestaltungen der Erfindung am Beispiel einer hochalkalischen Protease aus Bacillus alcalophilus HA1 wieder, ohne jedoch dadurch die Erfindung zu beschränken.

Um die Beispiele zu vereinfachen werden einige häufig wiederkehrende Methoden und Begriffe im folgenden näher erläutert und dann in den einzelnen Beispielen nur noch durch eine Kurzbezeichnung referiert. Sofern nicht anders angegeben, wurde generell nach Methoden gearbeitet, wie sie in Maniatis et al. (Maniatis et al. = T. Maniatis, E. F. Fritsch, J. Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) beschrieben sind.

Hier verwendete Ausgangsvektoren sind käuflich und auf unbeschränkter Basis verfügbar; oder sie können nach an sich bekannten Methoden aus verfügbaren Vektoren herge stellt werden. Beispielsweise wurden Phagemide mit der Bezeichnung pBS (z. B. pBS(+), pBS(-) etc.) von Stratagene, La Jolla, Kalifornien bezogen; der Helfer-Phage M13K07 von Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien; der Vektor M13tg131 von Amersham, Buckinghamshire, England; das Plas mid pUC18 von Pharmacia LKB, Uppsala, Schweden.

Die verschiedenen benutzten Restriktionsendonukleasen gehören zum Stand der Technik und sind kommerziell verfüg bar. Die bei Verwendung dieser bekannten Restriktionsendo nukleasen jeweils erforderlichen Reaktions-, Kofaktor- und übrigen Bedingungen sind ebenfalls bekannt.

An das Schneiden von Vektoren mit Restriktionsendo nukleasen kann sich gegebenenfalls eine Hydrolyse des terminalen 5′-Phosphatrestes mit einer alkalischen Phos phatase (Dephosphorylierung) anschließen. Dadurch kann verhindert werden, daß die beim Schneiden entstandenen Enden des restringierten Vektors mit sich selbst rekom binieren und somit die gewünschte Insertion eines Fremd-DNA-Fragmentes in die Restriktionsstelle verhindert würde. Sofern in den Beispielen eine Dephosphorylierung des 5′-Endes vorgenommen wurde, geschah dieses in an sich bekannter Weise. Weitere Angaben zur Durchführung einer Dephosphorylierung und zu dafür benötigten Reagentien können Maniatis et al. (S. 133-134) entnommen werden.

Partielle Hydrolyse bedeutet unvollständige Verdauung von DNA durch eine Restriktionsendonuklease. Die Reak tionsbedingungen werden dabei so gewählt, daß in einem DNA-Substrat zwar an einigen, nicht aber an allen Erken nungsstellen für die eingesetzte Restriktionsendonuklease geschnitten wird.

Zur Gewinnung und Isolierung von bestimmten DNA-Frag menten, z. B. nach Behandlung von DNA mit Restriktionsendo nukleasen, wurden die angefallenen DNA-Fragmente in an sich bekannter Weise durch Gelelektrophorese (z. B. auf Agarosegel) getrennt, nachfolgend über das Molekularge wicht (Bestimmung durch Vergleich mit Referenz-DNA-Frag menten mit bekanntem Molekulargewicht) identifiziert und die gewünschten DNA-Fragmente aus den entsprechenden Gel zonen abgetrennt.

Behandlung mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I aus E. coli bedeutet ein Verfahren zum Auffüllen der inneren 3′-Enden von doppelsträngiger DNA mit Nukleotiden, die zu den Nukleotiden der jeweiligen überstehenden 5′-Enden des DNA-Doppelstranges komplementär sind. Das Klenow-Fragment sowie für die Klenow-Behandlung benötigte Reagentien sind im Stand der Technik bekannt und kommer ziell verfügbar. Details zur Klenow-Behandlung sind z. B. aus Maniatis et al. (S. 107 bis 108) entnehmbar.

Ligation (ligieren) bedeutet ein Verfahren zur Bil dung von Phosphodiesterbindungen zwischen DNA-Fragmenten (siehe z. B. Maniatis et al., S. 146). Ligationen können unter an sich bekannten Bedingungen, z. B. in einem Puffer mit etwa 10 Units T4-DNA-Ligase pro 0,5 µg einer etwa gleich molaren Menge der zu ligierenden DNA-Fragmente, ausgeführt werden.

Unter Transformation wird die Einschleusung von DNA in einen Mikroorganismus verstanden, so daß die DNA in diesem repliziert bzw. exprimiert werden kann. Für die Transformation von E. coli ist z. B. die Calciumchlorid methode nach Mandel et al. (1970, J. Mol. Biol. 53: 159) oder nach Maniatis et al. (S. 250 bis 251) geeignet. Für Bacillus-Spezies ist z. B. die Methode Anagnostopoulos et al. (1961, J. Bact. 81: 741-746) geeignet.

Ein Linker ist ein kurzkettiges doppelsträngiges DNA-Fragment, welches einige Erkennungsstellen für Re striktionsendonukleasen aufweist und sich zum Verbinden von DNA-Fragmenten eignet. Linker werden z. B. beim Re kombinieren von DNA-Fragmenten zu einem Vektor eingesetzt und können zur Einführung bestimmter Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen in diesen Vektor dienen.

Eine Polyklonierungsstelle (Polylinker) ist ein kur zes bis mittleres doppelsträngiges DNA-Fragment, welches eng benachbart eine Vielzahl von Erkennungsstellen für Re striktionsendonukleasen aufweist. Eine in den Beispielen verwendete, aus dem Vektor M13tg131 entstammende, Polyklo nierungsstelle besitzt z. B. eine Größe von etwa 0,07 KB (Kilo Basenpaare) und weist Erkennungsstellen für 14 ver schiedene Restriktionsendonukleasen auf.

Der im Beispiel 1 eingesetzte und als Bacillus alcalophilus HA1 benannte Bacillus alcalophilus-Stamm ist bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) mit der DSM-Nummer 5466 am 28. Juli 1989 hinterlegt worden. Andere verwendete Mikroorganismen sind käuflich verfügbar, z. B. Bacillus subtilis BD244 (Bacillus Genetic Stock Center 1A 46) oder Bacillus subtilis BD 366 (Bacillus Genetic Stock Center 1E 6).

Beispiel 1

Herstellung einer genomischen DNA-Bibliothek und Iso lierung des Gens für ein Enzym am Beispiel von B. alca lophilus und dessen hochalkalischer Protease.

Aus dem Naturisolat Bacillus alcalophilus HAI (hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Nummer DSM 5466) wurde nach der Methode von Saito et al. (1963, Biochim.Biophys. Acta. 72: 619-629) chromosomale DNA isoliert und mit der Restriktionsendonuklease Sau3A par tiell hydrolisiert. Die Restriktionsfragmente wurden durch Elektrophorese auf einem Agarosegel aufgetrennt und die Fragmente mit einer Größe von 3 bis 8 Kilobasen (KB) wur den isoliert.

Die isolierten und größenselektierten DNA-Fragmente aus Bacillus alcalophilus HA1 wurden mit Vektor-DNA des Plas mids pUB 110 (Gewinnung wie in Beispiel 7 beschrieben) in vitro neukombiniert.

Hierzu wurde das Plasmid pUB110 zunächst mit der Restrik tionsendonuklease BamHI restringiert und anschließend mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm dephosphoryliert. Anschließend wurden 2 µg der restringierten und dephos phorylierten Vektor-DNA mit 8 µg der Bacillus alcalophilus DNA-Fragmente in einem Gesamtvolumen von 100 µl mit T4-DNA Ligase 24 h bei 16°C inkubiert.

Mit der erhaltenen in vitro neukombinierten DNA wurden Protoplasten des Stammes Bacillus subtilis BD224 nach der von S. Chang und N. Cohen (1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115) beschriebenen Methode transformiert. Die Trans formanten wurden auf Platten mit Neomycin selektiert und anschließend auf Magermilchagar überführt. Unter 13 800 untersuchten Transformanten wurde eine gefunden, die durch Proteolyse des Magermilchagars einen deutlich größeren Hof bildete. Aus diesem Klon wurde die Plasmid-DNA nach Mania tis et al. isoliert. Das in diesem Plasmid enthaltene klo nierte Fragment aus der B. alcalophilus-DNA hatte eine Größe von 4,1 KB und enthielt die vollständige Information für die hochalkalische Protease aus Bacillus alcalophilus HAI.

Zur Vereinfachung des weiteren Verfahrens wurde das 4,1 KB große DNA-Fragment zunächst in der Größe reduziert. Hierzu wurden die auf dem DNA-Fragment befindlichen Erkennungs stellen für Restriktionsendonukleasen durch Schneiden des Plasmids mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen und Auftrennung der Fragmente der restringierten DNA durch Elektrophorese auf einem Agarosegel ermittelt. Es wurde ein 2,3 KB großes, durch Schneiden mit den Restriktions endonukleasen AvaI und HindIII erhältliches DNA-Fragment ermittelt, welches die vollständige Information für die hochalkalische Protease aufwies und welches für das wei tere Verfahren verwendet wurde. Hierzu wurde das obige Plasmid mit dem 4,1 KB-Fragment mit den Restriktionsendo nukleasen AvaI und HindIII restringiert. Das 2,3 KB große DNA-Fragment wurde isoliert und mit dem Vektor pUB131 (Ge winnung wie in Beispiel 7 beschrieben), der zuvor eben falls mit AvaI und HindIII geschnitten wurde, ligiert.

Das erhaltene Plasmid, das die Bezeichnung pCLEAN4 er hielt, wurde in den Stamm B. subtilis BD224 eingebracht. Die Transformanten waren in der Lage, die hochalkalische Protease auszuscheiden, was zeigt, daß das AvaI/HindIII-Frag ment das vollständige Strukturgen für die hochalka lische Protease aus B. alcalophilus HA1 enthält. Die Re striktionskarte des Plasmids pCLEAN4 ist in Fig. 2 wieder gegeben.

Beispiel 2 Sequenzierung von Strukturgenen am Beispiel der hoch alkalischen Protease aus B. alcalophilus

Zur Herstellung von Einzelstrang-DNA des Protease strukturgens wurde das Plasmid pCLEAN4 mit den Restrik tionsendonukleasen AvaI und HindIII geschnitten und das etwa 2,3 KB große AvaI/HindIII-DNA-Fragment (Protease strukturgen) in den Phagemiden pBS(+) oder pBS(-) ein gebracht. Die Nukleotidsequenz des in den isolierten Ein zelstrang-Phagemiden enthaltenen Proteasegens wurde nach der Dideoxy-Kettenterminator-Methode von Sanger et al. (1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463) und der Methode der basenspezifischen chemischen Spaltung des DNA-Einzel stranges nach Maxam et al. (1980, in Methods in Enzymo logy, Grossmann L., Moldave K., eds., Academic Press Inc., New York und London, Vol. 65, 499) bestimmt. Die ermit telte Nukleotidsequenz und die zugeordnete Aminosäuren sequenz der Protease sind in Fig. 1 wiedergegeben. Der Start für die Aminosäurensequenz der reifen hochalkali schen Protease in Position 1190 der Nukleotidsequenz wurde durch Aminosäurensequenzierung des N-terminalen Endes der hochalkalischen Protease bestimmt.

Beispiel 3 Herstellung mutierter DNA-Sequenzen durch gerichtete Mutagenese

Die gerichteten Mutationen wurden in DNA-Teilsequenzen des Proteasestrukturgens mit der von Kunkel, T.A. (1985, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82: 488-492) beschriebenen "primer extension" Technik durchgeführt. Hierzu wurden die Plas mide pCLMUTN1 (Herstellung wie in Beispiel 4 beschrieben) und pCLMUTC1 (Herstellung wie in Beispiel 5 beschrieben), die zunächst wie nachfolgend beschrieben in ihre uracy lierten, einzelsträngigen Analoga umgewandelt wurden, ein gesetzt. Die Ausgangsvektoren pCLMUTN1 und pCLMUTC1 ent halten nicht die gesamte DNA-Sequenz des Proteasestruk turgens aus B. alcalophilus HA1, sondern nur die N-termi nale Hälfte (pCLMUTN1) oder die C-terminale Hälfte (pCLMUTC1) desselben.

Diese Vektoren sind als Abkömmlinge eines Phagemiden in gewissem Umfange zur Bildung von Einzelstrang-Vektor-DNA befähigt, die unter den hier gegebenen Bedingungen aus dem zur Replikation dienenden Wirtsorganismus ausgeschleust und isoliert werden konnte.

Jeder dieser Vektoren wurde nach Maniatis et al. (S. 250 bis 251) mit Hilfe der CaCl₂ Methode in E. coli CJ236 als Wirtsorganismus eingebracht.

Da das Bakterium E. coli CJ236 (Uracil-N-Glycosylase-Mangel mutante) bei der Replikation von Vektoren statt Thymin das Nukleotid Uracil in die DNA-Sequenz des Vektors einbaut, wurden durch Kultivierung der vorstehenden Trans formanten die Uracil-haltigen Analoga des Vektors pCLMUTN1 oder pCLMUTC1 erhalten. Diese Uracil-enthaltenden Vektoren sind von den gewöhnlichen Thymin-enthaltenden Vektoren bei in vitro-Reaktionen nicht unterscheidbar. Der Uracil-Ge halt in der Vektor-DNA stört in vitro DNA-Synthesen nicht, da Uracil weder in vitro noch in vivo mutagen ist und Ura cil gleichermaßen wie Thymin codiert. Uracylierte Vektoren lassen sich vorteilhaft für die nachfolgenden in vitro Re aktionen der gerichteten Mutagenese einsetzen. Nach Be endigung der Reaktionen kann der Uracil-haltige DNA-Ein zelstrang, der als Matrize zur Erzeugung mutierter DNA-Stränge (Vektoren) diente, durch Behandlung mit Uracil-N-Glycosylase beseitigt werden, ohne daß es einer phäno typischen Selektion von Mutanten bedarf. Die Glyco sylase-Behandlung kann sowohl mit dem isolierten Enzym als auch mit einem durch Vektor-DNA transformierten E. coli-Stamm mit Uracil-N-Glycosylase-Aktivität durchgeführt werden.

Die für die gerichtete Mutagenese als Matrize benötigte, uracylierte einzelsträngige DNA der Vektoren pCLMUTN1 und pCLMUTC1 wurde hergestellt, indem mit einem der beiden Vektoren transformierte E. coli CJ236-Bakterien kultiviert wurden, die zusätzlich mit dem Helfer-Phagen M13K07 infi ziert wurden.

Der Helfer-Phage selbst ist kaum vermehrungsfähig und zeigt keine störende Interaktion mit der Vektor-DNA der Vektoren pCLMUTN1 oder pCLMUTC1. Seine Aufgabe besteht in der Synthese von Hüllproteinen für die gebildete uracy lierte einzelsträngige Vektor-DNA. Umhüllte Einzelstrang- Vektor-DNA wird aus dem Wirtsorganismus E. coli CJ236 aus geschleust und kann aus dem Kulturmedium isoliert werden. Durch die Mithilfe des Helfer-Phagen wird die qualitative und quantitative Ausbeute an (hier an uracylierter) Einzelstrang-Vektor-DNA wesentlich erhöht.

Die isolierten, uracylierten DNA-Einzelstrang-Vektoren pCLMUTN1 oder pCLMUTC1 wurden mit den nach Beispiel 6 hergestellten, synthetischen Oligonukleotiden hybridi siert, die eine Mutationsstelle enthielten und gleichzei tig als Primer für die nachfolgende Ergänzung zum voll ständigen DNA-Doppelstrang mit Mutation dienten.

Die Synthese des zweiten DNA-Stranges wurde unter Zugabe von Nukleotiden mit T4-DNA-Polymerase und die nachfolgende Ligation des neugebildeten Stranges mit T4-DNA-Ligase durchgeführt (Kunkel et al. 1987, Methods in Enzymol. 154, 367-382). Die gebildete Doppelstrang-Vektor-DNA wurde in E. coli MC1061 transformiert und die mutierten Vektoren wurden durch Überprüfen der entsprechenden unitären Re striktionsendonukleasen-Erkennungsstellen, die mit den synthetischen Oligonukleotiden eingeführt bzw. entfernt wurden, identifiziert.

Beispiel 4 Konstruktion des Vektors pCLMUTN1

Das in Beispiel 1 hergestellte Plasmid pCLEAN4 wurde mit AvaI geschnitten. Die überstehenden Enden ("sticky ends") wurden unter Zugabe der benötigten Nukleotide mit Hilfe des Klenow-Fragments der E. coli DNA-Polymerase I (Mania tis et al., S. 114) zum DNA-Doppelstrang aufgefüllt. Nach anschließender Restriktion dieser DNA mit XbaI wurde das N-terminale 1618 Basenpaar (BP) umfassende Fragment des Proteasegens isoliert und in die SmaI/XbaI-Stelle von pBS kloniert. Der resultierende Vektor erhielt die Bezeichnung pCLMUTN1. Die Restriktionskarte dieses Vektors ist in Fig. 4 wiedergegeben.

Beispiel 5 Konstruktion des Vektors pCLMUTC1

Das in Beispiel 1 hergestellte Plasmid pCLEAN4 wurde mit den Restriktionsendonukleasen XbaI und Asp718 geschnitten. Das 658 BP umfassende Xbal/Asp718-Doppelstrang-DNA-Frag ment, welches die C-terminale Hälfte des Proteasestruktur gens umfaßt, wurde in die XbaI/Asp718-Stelle von pBS klo niert. Der resultierende Vektor erhielt die Bezeichnung pCLMUTC1. Die Restriktionskarte des Vektors ist in Fig. 5 wiedergegeben.

Beispiel 6 Synthese künstlicher Oligonukleotide für die gerichtete Mutagenese

Synthetische Oligonukleotide wurden nach Beaucage S.L. und Caruthers M.H. (1981, Tetrahedron Letters 22: 1859-1862) mit β-Cyanoethyl-phosphoramidit in einem Cyclone Synthe tiser (Biosearch) hergestellt. Die erhaltenen Oligonukleo tide wurden gereinigt durch Elution aus Polyacrylamidgelen und anschließende Entsalzung mit Hilfe von Sephadex-G25-Säulen. Beispiele für die synthetisierten Nukleotidsequen zen und deren Eigenschaften sind in Fig. 3 wiedergegeben. Die Sequenzen der synthetischen Oligonukleotide, die im Verfahren nach Beispiel 3 zur Einführung der Mutationen in das Proteasegen dienten, waren so gewählt, daß sie die nachfolgenden Bedingungen erfüllten.

- Die DNA-Sequenz der synthetischen Oligonukleotide war zur entsprechenden Sequenz des Proteasegens noch so weit komplementär, daß ausreichende Hybridisierungs fähigkeit derselben sichergestellt war.
- Austausch eines oder mehrerer Nukleotide innerhalb des Codons, welches für die auszutauschende Amino säure codiert, durch andere Nukleotide, so daß dieses mutierte Codon nunmehr für eine Aminosäure mit einem voluminöseren und/oder ionischen Aminosäurerest codierte (Mutationen). Für die neue Aminosäure wurde dasjenige Codon eingesetzt, welches im Proteasegen für die entsprechende Aminosäure am häufigsten vorge funden wurde.
- Austausch von weiteren Nukleotiden innerhalb anderer Codons, so daß die ursprüngliche Codierung der Amino säure zwar erhalten blieb, aber dadurch im Protease gen vorkommende Erkennungssequenzen für Restriktions endonukleasen entfernt oder neue erzeugt wurden. Diese dienten im Verfahren nach Beispiel 3 zur Er leichterung des Screenings nach den Vektoren mit den mutierten DNA-Sequenzen für die neuen hochalkalischen Proteasen.

Beispiel 7 Isolierung und Reinigung des Plasmids pUB110 und Kon struktion des Vektors pUB131

Aus dem Stamm Bacillus subtilis BD366 wurde nach der Methode von T.J. Gryczan et al. (1978, J. Bacteriol. 134: 318-329) das Plasmid pUB110 isoliert und anschließend nach Maniatis et al. (S. 93) über Cäsiumchlorid-Dichtegradien tenzentrifugation gereinigt. Der Vektor pUB110 enthält eine nur einmal vorkommende Restriktionsstelle für die Restriktionsendonuklease BamHI und als Marker eine DNA-Sequenz, die für Antibiotikaresistenz gegenüber Neomycin codiert, sowie für die Replikation in Bacillus-Spezies benötigte DNA-Sequenzen ("origin of replication").

Das vorstehend erhaltene Plasmid pUB110 wurde mit EcoRI und BamHI restringiert. Das kleinere Fragment (790 BP) wurde ersetzt durch einen aus 67 Basenpaaren bestehenden Polylinker, der zuvor als EcoRI/BglII-Fragment aus dem Vektor M13tg131 isoliert worden war. Der so erhaltene Vek tor mit der Bezeichnung pUB131 ist somit ein Abkömmling von pUB110, bei dem das etwa 0,8 KB große EcoRI/BamHI Fragment deletiert und dafür eine Polyklonierungsstelle eingebaut wurde.

Beispiel 8 Konstruktion der Vektoren pUBC131 und pUBC132

Das Plasmid pUC18 wurde mit AatII und PvuII geschnitten. Das 1990 Basenpaar große Fragment mit dem β-Lactamase-Gen und dem E. coli "origin of replication" wurde isoliert. Die überstehenden Enden ("sticky ends") wurden unter Zu gabe der benötigten Nukleotide mit Hilfe des Klenow-Frag mentes der E. coli DNA-Polymerase I (Maniatis et al., S. 114) zum DNA-Doppelstrang aufgefüllt. Das Fragment wurde anschließend in die SnaBI-Stelle des nach Beispiel 7 erhaltenen Vektors pUB131 eingebaut, wodurch der Vektor mit der Bezeichnung pUBC131 erhalten wurde.

Das 2187 BP EcoRI/BglII-Fragment des vorstehend erhal tenen Vektors pUBC131 wurde in die EcoRI/BamHI-Stelle von pBS(+) subkloniert, wobei man den Vektor mit der Bezeich nung pBSREPU erhielt. Anschließend wurde die NcoI- bzw. StyI-Erkennungsstelle, die in der DNA-Sequenz für das repU-Polypeptid im Vektor pBSREPU vorhanden ist (I. Maciag et al. 1988, Mol. Gen. Genet. 212: 232-240), durch gerich tete Mutagenese eliminiert, indem die Nukleotidsequenz CCA TGG durch die Nukleotidsequenz CCG TGG (beide Nukleotidse quenzen codieren für die Aminosäurenfolge Tryptophan-Pro lin) ersetzt wurde. Die Durchführung war analog der Ver fahrensweise des Beispiels 3. Hierzu wurde uracylierte einzelsträngige DNA des Vektors pBSREPU als Matrize für die gerichtete Mutation zur Eliminierung der NcoI- bzw. StyI-Erkennungsstelle hergestellt. Anschließend wurde diese Matrize analog zur im Beispiel 3 beschriebenen "pri mer extension"-Technik unter Verwendung des folgenden syn thetischen Oligonukleotids (hergestellt und gereinigt ana log zum Verfahren zur Herstellung der synthetischen Oligo nukleotide des Beispiels 6),

zum DNA-Doppelstrang-Vektor ergänzt und durch Transforma tion und Kultivierung von E. coli MC1061 die nunmehr NcoI- bzw. StyI-Erkennungstellen-freien Vektoren isoliert. Das 1726 BP EcoRI/ApaI-Fragment des isolierten Vektors wurde in die EcoRI/ApaI-Stelle von pUBC131 eingeführt. Der neue Vektor, dessen Restriktionskarte in Fig. 6 wiedergegeben ist, erhielt die Bezeichnung pUBC132.

Beispiel 9 Konstruktion des Plasmids pAL1P

Das Plasmid pAL1P wurde hergestellt durch Ligation der folgenden drei Elemente:

- das 2218 Basenpaar große AvaI/NcoI-Fragment von pCLEAN4; das Fragment enthält den Promotor und die Prepro-Region der hochalkalischen Ausgangsprotease.
- Der folgende synthetische Linker mit einzelnen Erken nungsstellen für die Restriktionsendonukleasen NcoI, XbaI und Asp718, die die Einführung der mutierten N-terminalen bzw. C-terminalen Hälften des Proteasegens aus den mutierten Vektoren pCLMUT1 bzw. pCLMUTC1 oder die Einführung des gesamten Gens der Ausgangsprotease aus dem Plasmid pCLEAN4 ermöglichen; Der vorstehende doppelsträngige synthetische Linker mit überstehenden 5′-Enden wurde hergestellt, indem man zunächst die beiden Einzelstrang-DNA-Sequenzen analog zur Synthese der synthetischen Oligonukleotide in Beispiel 6 jeweils für sich herstellte und reinigte. Die so erhaltenen Einzelstränge wurden nachfolgend miteinander zum Doppelstrang hybridisiert.
- das 5776 Basenpaar große AvaI/HindIII-Fragment aus dem in Beispiel 8 hergestellten Vektor pUBC132; dieses Fragment enthält DNA-Sequenzen zur Replikation und selektierbare Marker in E. coli, sowie DNA-Sequenzen zur Replikation und selektierbare Marker in B. subti lis, B. licheniformis und B. alcalophilus.

Die Konstruktion des Vektors pAL1P wurde in E. coli MC1061 durchgeführt und der Vektor aus Ampicillin-resi stenten E. coli-Transformanten isoliert. Die Restriktions karte des erhaltenen Vektors ist in Fig. 7 wiedergegeben.

Beispiel 10 Konstruktion der Plasmide pAL1N und pAL1C

Die Konstruktion der Vektoren pAL1N und pAL1C wurde in E. coli MC1061 durchgeführt, wobei die Vektoren aus Ampicillin-resistenten E. coli-Transformanten isoliert wurden.

Das Plasmid pAL1N wurde konstruiert, indem zunächst der in Beispiel 1 erhaltene Vektor pCLEAN4 mit den Restriktions endonukleasen NcoI und XbaI geschnitten und das erhaltene NcoI/XbaI-Fragment anschließend in die NcoI/XbaI-Stelle des Vektors pAL1P (hergestellt nach Beispiel 9) kloniert wurde. Der hergestellte Vektor enthielt den N-terminalen Teil der DNA-Sequenz, die für das reife Enzym codiert, und die regulatorischen Elemente für die Transkription und Translation der hochalkalischen Protease, sowie die Signal-Sequenz und die Processing-Sequenz.

Das Plasmid pAL1C wurde konstruiert, indem zunächst der in Beispiel 1 erhaltene Vektor pCLEAN4 mit den Restrik tionsendonukleasen XbaI und Asp718 geschnitten und das erhaltene XbaI/Asp718-Fragment in die xbaI/Asp718-Stelle des Vektors pAL1P (hergestellt nach Beispiel 9) kloniert wurde. Der hergestellte Vektor enthielt den C-terminalen Teil der DNA-Sequenz, die für die reife Protease codiert, und die regulatorischen Elemente für die Transkription und Translation der hochalkalischen Protease, sowie die Sig nal-Sequenz und die Processing-Sequenz.

Beispiel 11 Konstruktion der Expressionsvektoren pAL1NC

Es wurden Expressionsvektoren mit Mutationen im C-termi nalen Teil der Protease-DNA-Sequenz, Expressionsvektoren mit Mutationen im N-terminalen Teil der Protease-DNA-Se quenz und zu Vergleichszwecken auch Expressionsvektoren ohne Mutationen in der Protease-DNA-Sequenz hergestellt.

Die Konstruktion der drei nachfolgend aufgeführten Expres sionsvektoren wurde jeweils in E. coli MC1061 durchge führt. Aus Ampicillin-resistenten E. coli-Transformanten wurden die Expressionsvektoren isoliert. Zur Expression mutierter und nicht-mutierter Proteasegene wurden die in diesem Beispiel hergestellten und isolierten Expressions vektoren in B. subtilis BD224 eingebracht. Die Selektion erfolgte hier nach Neomycin- oder Phleomycin-Resistenz. Die Transformanten waren zur Produktion der durch Mutation stabilisierten (Transformanten mit Vektoren aus Abschnit ten A., B. dieses Beispiels) bzw. der nicht-mutierten (Transformanten mit Vektor aus Abschnitt C. dieses Bei spiels) hochalkalischen Protease befähigt. Die Restrik tionskarte der hergestellten Vektoren des Typs pAL1NC ist in Fig. 8 wiedergegeben.

A. Expressionsvektor mit Mutationen im N-terminalen Teil der DNA-Sequenz der Protease

Der nach Beispiel 3 durch gerichtete Mutagenese erhaltene mutierte Vektor pCLMUTN1 wurde mit den Restriktionsendo nukleasen NcoI und XbaI geschnitten. Das isolierte NcoI/XbaI-Fragment (mutierter N-terminaler Teil des Prote asestrukturgens mit den Mutationen K27Q, I43R, I43K, I43Q, I43E, H118W, H118Y) wurde in die NcoI/XbaI-Stelle des nach Beispiel 10 erhaltenen Plasmides pAL1C kloniert. Die er haltenen Vektoren stellten vollständige Expressionsvekto ren mit geeignetem Leseraster zur Expression der durch Mutation stabilisierten Proteasen dar.

B. Expressionsvektor mit Mutationen im C-terminalen Teil der DNA-Sequenz der Protease

Der nach Beispiel 3 durch gerichtete Mutagenese erhal tene mutierte Vektor pCLMUTC1 wurde mit den Restriktions endonukleasen XbaI und Asp718 geschnitten. Das isolierte Xbal/Asp718-Fragment (mutierter C-terminaler Teil des Proteasestrukturgens mit den R143N, R143S, R143T, R164Q, N237P, T249R, T249K, T249Q, T249E) wurde in die XbaI/Asp718-Stelle des nach Beispiel 10 erhaltenen Plas mides pAL1N kloniert. Die erhaltenen Vektoren stellten vollständige Expressionsvektoren mit geeignetem Leseraster zur Expression der durch Mutation stabilisierten Proteasen dar.

C. Expressionsvektor mit der nicht-mutierten DNA-Sequenz der Ausgangsprotease

Der Expressionsvektor mit dem nicht-mutierten Ausgangs strukturgen der Protease wurde erhalten, indem entweder das nicht-mutierte NcoI/XbaI-Fragment aus dem nach Bei spiel 1 erhaltenen Plasmid pCLEAN4 in die NcoI/XbaI-Stelle von pAL1C (Beispiel 10) kloniert wurde; oder indem das XbaI/Asp718-Fragment aus dem nach Beispiel 1 erhaltenen Plasmid pCLEAN4 in die XbaI/Asp718-Stelle von pAL1N (Bei spiel 10) kloniert wurde. Die so erhaltenen Vektoren waren vollständige Expressionsvektoren mit geeignetem Leseraster zur Expression der Ausgangsprotease.

Beispiel 12 Herstellung der durch Mutation stabilisierten hochalka lischen Proteasen und zu Vergleichszwecken auch der un stabilisierten Ausgangsprotease

50 ml Vorkulturmedium (20 g Tryptone, 10 g Hefe-Extrakt, 5 g NaCl, 75 g lösliche Stärke, 10 ml Maisquellwasser pro Liter) wurden mit einer Kolonie der zu testenden Stämme (jeweils mit einem der nach Beispiel 11 hergestellten Vektoren pAL1NC transformierte B. subtilis BD224) beimpft. Die Kultur wurde für 16 h bei 37°C und 250 Upm inkubiert. Mit 2,5 ml dieser Kultur wurden 50 ml Hauptkulturmedium (30 g Sojamehl, 90 g Kartoffelstärke, 10 g Na-Caseinat und 10 ml Maisquellwasser pro Liter) beimpft.

Die Hauptkultur wurde unter den gleichen Bedingungen wie die Vorkultur inkubiert. Nach 72 h wurden die Kulturen zentrifugiert. Die gebildeten Proteasen wurden aus den Kulturüberständen mit Aceton gefällt und anschließend wie folgt gereinigt: Kationenaustauscher Mono S, FPLC; Elution mit ansteigendem Gradient 20 mM bis 200 mM Ammoniumacetat, pH = 6.

Es wurden einerseits die Ausgangsprotease und andererseits die stabilisierten Proteasen der Aminosäurensequenz der Fig. 1 mit den Mutationen K27Q, I43K, I43Q, I43E, H118, H118Y, R143N, R143S, R143T, R164Q, N237P, T249R, T249K, T249Q und T249E gewonnen.

Beispiel 13 Waschleistungen der durch Mutation stabilisierten hoch alkalischen Proteasen

Die Waschleistungen erfindungsgemäß stabilisierter Pro teasen wurde in Waschversuchen mit unterschiedlichen Waschmitteln und für unterschiedlich verschmutzte Gewebe ermittelt.

Beispiel 13a

Es wurde die Waschleistung der Proteasen durch Waschver suche am Testgewebe EY-PC (Eigelb/Tusche-Anschmutzung auf Polyester-Baumwolle-Mischgewebe - eigene Herstellung) in Laborwaschmaschinen (Typ: Polycolor) bestimmt. Hierzu wurden das Testgewebe mit einer wäßrigen Waschlauge, der die jeweils zu untersuchende Protease in einer Konzen tration von 0,71 mg/l zugesetzt wurde, gewaschen. Als Waschmittel wurde eine für ein pulverförmiges Vollwasch mittel übliche Waschmittelformulierung mit üblichen Waschmittelinhaltsstoffen (18,4% Zeolith, 7,3% Na₂CO₃, 4,8% lineares Alkylbenzolsulfonat, 3,3% Nonionics, 3,3% Seife, 0,1% Entschäumer, 1,5% Carboxymethylcellulose, 0,15% optischen Aufheller, 3,8% Natrium-di-silikat, 25% Perborat, 1,5% TAED, 30,85% Na₂SO₄) eingesetzt. Die Dosierung der Waschmittelformulierung in der Waschlauge betrug 6 g/l. Das verwendete Wasser hatte eine Wasserhärte von 15°dH (°dH = deutsche Härte). Gewaschen wurde im Tem peraturbereich von 15°C bis 60°C für 45 min (2°C/min; 22,5 min Haltezeit bei 60°C). Die enzymhaltige Waschlauge wirkte in einem rotierenden Probengefäß, das über ein Wasserbad entsprechend dem Temperaturprogramm gesteuert wurde, auf das Testgewebe ein. Nach dem Waschvorgang wurde das Testgewebe zweimal mit Leitungswasser gespült und an schließend gebügelt.

Die Waschleistung wurde durch Messung der Reflektion des gewaschenen Testgewebes mit Hilfe eines Remissionsphoto meters bestimmt. Zum Vergleich wurde ebenfalls die Reflek tion des unter gleichen Bedingungen nur mit der Waschmit telformulierung ohne Proteasezusatz gewaschenen Test gewebes ermittelt.

In Waschversuchen mit der durch Austausch in der Amino säurensequenz in Position N237P stabilisierten Protease wurde eine um 6,8% höhere Reflektion des Testgewebes als bei ohne Proteasezusatz gewaschenen Testgewebe gemessen.

Beispiel 13b

Die Waschversuche wurden wie im Beispiel 13a beschrieben durchgeführt. Als Waschmittel wurde eine enzymfreie von Waschmittelherstellern beziehbare Waschmittelformulierung eingesetzt, wie sie für ein pulverförmiges Kompaktvoll waschmittel üblich ist. Die Dosierung der Waschmittelfor mulierung in der Waschlauge betrug 3 g/l. In diesen Ver suchen wurde im Temperaturbereich 15°C bis 40°C für 45 min (2°C/min; 32,5 min Haltezeit bei 40°C) gewaschen.

Als Testgewebe wurde ein mit Blut, Milch und Tusche ange schmutztes Polyester-Baumwolle-Mischgewebe (EMPA 117, be zogen von der Eidgenössischen Materialprüfungsanstalt, St. Gallen, Schweiz) verwendet.

Es wurden die in der nachfolgenden Tabelle 1 angegebenen Proteasen auf ihre Waschleistungen untersucht. Die ange gebene Erhöhung der Reflexion des gewaschenen Testgewebes bezieht sich dabei auf unter gleichen Bedingungen ohne Proteasezusatz nur mit der Waschmittelformulierung ge waschenes Testgewebe.

Waschleistungen erfindungsgemäß stabilisierter Proteasen auf Testgewebe EMPA 117 in Waschversuchen mit einer für ein pulverförmiges Kompaktvollwaschmittel üblichen Waschmittelformulierung
Stabilisierte Protease durch Austausch in der Aminosäurensequenz in Position
Erhöhung der Reflexion des Testgewebes in Relation zu ohne Proteasezusatz gewaschenes Testgewebe in %
I43Q
21,3
I43K	20,9
N114R/N237P	20,7

Beispiel 13c

Die Waschversuche wurden wie im Beispiel 13b beschrieben durchgeführt. Es wurde jedoch ein Testgewebe EY-PC (Eigelb/Tusche-Anschmutzungen auf Polyester-Baumwolle-Misch gewebe - eigene Herstellung) verwendet.

Es wurden die in der nachfolgenden Tabelle 2 angegebenen Proteasen auf ihre Waschleistungen untersucht. Wie bereits beschrieben, bezieht die angegebene Erhöhung der Reflexion des Testgewebes sich auf ohne Proteasezusatz unter gleichen Bedingungen nur mit der Waschmittelformulierung gewaschenes Testgewebe.

Waschleistungen erfindungsgemäß stabilisierter Proteasen auf Testgewebe EY-PC in Waschversuchen mit einer für ein pulverförmiges Kompaktvollwaschmittel üblichen Waschmittelformulierung
Stabilisierte Protease durch Austausch in der Aminosäurensequenz in Position
Erhöhung der Reflexion des Testgewebes in Relation zu ohne Proteasezusatz gewaschenes Testgewebe in %
I43Q
11,0
I43K	7,7

Beispiel 13d

Die Waschversuche wurden wie im Beispiel 13a beschrieben durchgeführt. Als Waschmittel wurde eine enzymfreie von Waschmittelherstellern beziehbare Waschmittelformulierung eingesetzt, wie sie für ein Flüssigvollwaschmittel üblich ist. Die Dosierung der Waschmittelformulierung in der Waschlauge betrug 4 g/l. Gewaschen wurde im Temperatur bereich 15°C bis 40°C für 45 min (2°C/min; 32,5 min Haltezeit bei 40°C). Als Testgewebe wurde ein Testgewebe EY-PC (Eigelb/Tusche-Anschmutzungen auf Polyester-Baum wolle-Mischgewebe - eigene Herstellung) eingesetzt.

Es wurden die in der nachfolgenden Tabelle 3 angegebenen Proteasen auf ihre Waschleistungen untersucht. Die ange gebene Reflexion des Testgewebes bezieht sich dabei auf ohne Proteasezusatz unter gleichen Bedingungen nur mit der Waschmittelformulierung gewaschenes Testgewebe.

Waschleistungen erfindungsgemäß stabilisierter Proteasen auf Testgewebe EY-PC in Waschversuchen mit einer für ein Flüssigvollwaschmittel üblichen Waschmittelformulierung
Stabilisierte Protease durch Austausch in der Aminosäurensequenz in Position
Erhöhung der Reflexion des Testgewebes in Relation zu ohne Proteasezusatz gewaschenes Testgewebe in %
T249K
4,0
T249E	5,3
I43E	4,5

In allen durchgeführten Waschversuchen wurde für das unter Zusatz erfindungsgemäßer Proteasen gewaschene Testgewebe eine höhere Reflexion als bei für mit der Waschmittel formulierung gewaschenes Testgewebe gemessen. Dies belegt die sehr guten Wascheigenschaften erfindungsgemäß stabili sierter Proteasen, wobei auch unterschiedliche Proteinver schmutzungen problemlos beim Waschgang aus dem Gewebe ent fernt wurden.

Claims

1. Gegen destabilisierende Einwirkungen von ionischen Tensiden stabilisiertes Enzym, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine der Aminosäuren, die sich in einem hydro phoben Oberflächenbereich des Enzyms oder in direkter Nachbarschaft zu diesem hydrophoben Oberflächenbereich be finden, durch eine andere Aminosäure ausgetauscht ist, wobei

a) eine hydrophobe Aminosäure, deren Aminosäurerest an der Bildung eines hydrophoben Oberflächenbereiches be teiligt ist, in dessen räumlicher Nachbarschaft sich wenigstens eine Aminosäure mit ionischem Aminosäure rest befindet, durch eine andere Aminosäure mit hydro philem Aminosäurerest ausgetauscht ist, und/oder wobei
b) eine polare, ungeladene Aminosäure, die an einen hydrophoben Oberflächenbereich angrenzt, in dessen räumlicher Nachbarschaft sich wenigstens eine Amino säure mit ionischem Aminosäurerest befindet, durch eine gegenüber der ursprünglichen Aminosäure sterisch anspruchsvollere Aminosäure, vorzugsweise durch eine sterisch anspruchsvollere Aminosäure mit einem lang kettigeren hydrophilen Aminosäurerest, ausgetauscht ist, und/oder wobei
c) eine ionische Aminosäure, die sich in räumlicher Nachbarschaft zu einem hydrophoben Oberflächenbereich befindet, durch eine Aminosäure mit einem ungeladenen hydrophilen Aminosäurerest oder durch eine geladene Aminosäure, deren Aminosäurerest eine zum ionischen Tensid gleichgerichtete Ladung aufweist, ausgetauscht ist.

2. Stabilisiertes Enzym nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß die Enzyme in einem solchen hydrophoben Oberflächenbereich des Enzyms durch Austausch von Amino säuren stabilisiert sind, der als Vertiefung, insbesondere als Mulde, Senke oder Loch ausgebildet ist.

3. Stabilisiertes Enzym nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Stabilität des Enzyms gegen destabilisierende Einwirkung von anionischen Tensiden durch einen Aminosäureaustausch gemäß (a) oder (b) oder durch einen Austausch einer kationischen Amino säure durch eine Aminosäure mit einem ungeladenen hydro philen oder mit einem anionischen Aminosäurerest verbes sert ist.

4. Stabilisiertes Enzym nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym eine Pro tease, Lipase, Amylase oder Cellulase, vorzugsweise eine Protease ist.

5. Stabilisiertes Enzym nach Anspruch 4, dadurch ge kennzeichnet, daß die Protease eine Bacillus-Protease, vorzugsweise ein Subtilisin ist.

6. Stabilisiertes Enzym nach Anspruch 5, dadurch ge kennzeichnet, daß das Subtilisin eine hochalkalische Pro tease mit einer Aminosäurensequenz mit mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, insbesondere aber mindestens 95% Homologie zu der in Fig. 1 angegebenen Aminosäurense quenz ist.

7. Stabilisiertes Enzym nach Anspruch 6, dadurch ge kennzeichnet, daß die hochalkalische Protease durch Aus tausch von Aminosäuren in wenigstens einer der Positionen 4, 14, 27, 39, 43, 47, 49, 77, 80, 89, 111, 117, 118, 127, 143, 161, 164, 165, 208, 232, 233, 235, 237, 249 oder 256, vorzugsweise 27, 43, 118, 143, 164, 237 oder 249, der Fig. 1 oder in einer der dazu homologen Positionen stabilisiert ist.

8. Stabilisiertes Enzym nach Anspruch 7, dadurch ge kennzeichnet, daß die hochalkalische Protease durch wenig stens einen der Aminosäureaustausche K27Q, I43R, I43K, I43Q, I43E, Y89Q, H118W, H118Y, R143N, R143S, R143T, R164Q, N237P, T249R, T249K, T249Q und T249E, mit den auf Fig. 1 bezogenen Positionen, oder einen hierzu homologen Aminosäureaustausch stabilisiert ist.

9. Verfahren zur Verbesserung der Stabilität von En zymen gegen destabilisierende Einwirkungen von ionischen Tensiden, dadurch gekennzeichnet, daß man wenigstens eine der Aminosäuren, die sich in einem hydrophoben Ober flächenbereich des Enzyms oder in direkter Nachbarschaft zu diesem hydrophoben Oberflächenbereich befinden, durch eine andere Aminosäure austauscht, wobei

a) eine hydrophobe Aminosäure, deren Aminosäurerest an der Bildung eines hydrophoben Oberflächenbereiches be teiligt ist, in dessen räumlicher Nachbarschaft sich wenigstens eine Aminosäure mit ionischem Aminosäure rest befindet, durch eine Aminosäure mit hydrophilem Aminosäurerest ausgetauscht wird, und/oder wobei
b) eine polare, ungeladene Aminosäure, die an einen hydrophoben Oberflächenbereich angrenzt, in dessen räumlicher Nachbarschaft sich wenigstens eine Amino säure mit ionischem Aminosäurerest befindet, durch eine gegenüber der ursprünglichen Aminosäure sterisch anspruchsvollere Aminosäure, vorzugsweise durch eine sterische anspruchsvollere Aminosäure mit einem lang kettigeren hydrophilen Aminosäurerest, ausgetauscht wird, und/oder wobei
c) eine ionische Aminosäure, die sich in räumlicher Nach barschaft zu einem hydrophoben Oberflächenbereich be findet, durch eine Aminosäure mit einem ungeladenen hydrophilen Aminosäurerest oder durch eine geladene Aminosäure, deren Aminosäurerest eine zum ionischen Tensid gleichgerichtete Ladung aufweist, ausgetauscht wird.

10. DNA-Sequenz, codierend für eine hochalkalische Protease mit einer Aminosäurensequenz, welche mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, insbesondere aber min destens 95% Homologie zu der in Fig. 1 angegebenen Amino säurensequenz aufweist und sich von dieser in wenigstens einer der Positionen 4, 14, 27, 39, 43, 47, 49, 77, 80, 89, 111, 117, 118, 127, 143, 161, 164, 165, 208, 232, 233, 235, 237, 249 oder 256, vorzugsweise 27, 43, 118, 143, 164, 237 oder 249, der Fig. 1 oder in einer der dazu homo logen Positionen dadurch unterscheidet, daß Positionen mit

a) einer hydrophoben Aminosäure, deren Aminosäurerest an der Bildung eines hydrophoben Oberflächenbereiches be teiligt ist, in dessen räumlicher Nachbarschaft sich wenigstens eine Aminosäure mit ionischem Aminosäure rest befindet, durch eine andere Aminosäure mit hydro philem Aminosäurerest ersetzt sind, und/oder daß Posi tionen mit
b) einer polaren, ungeladenen Aminosäure, die an einen hydrophoben Oberflächenbereich angrenzt, in dessen räumlicher Nachbarschaft sich wenigstens eine Amino säure mit ionischem Aminosäurerest befindet, durch eine gegenüber der ursprünglichen Aminosäure sterisch anspruchsvollere, vorzugsweise durch eine sterisch anspruchsvollere Aminosäure mit einem langkettigeren hydrophilen Aminosäurerest, ersetzt sind, und/oder daß Positionen mit
c) einer ionischen Aminosäure, die sich in räumlicher Nachbarschaft zu einem hydrophoben Oberflächenbereich befindet, durch eine Aminosäure mit einem ungeladenen hydrophilen Aminosäurerest oder durch eine geladene Aminosäure, deren Aminosäurerest eine zum ionischen Tensid gleichgerichtete Ladung aufweist, ausgetauscht sind.

11. Wasch- und Reinigungsmittelzusammensetzungen, insbesondere enthaltend ionische Tenside, vorzugsweise an ionische Tenside und ggf. weitere an sich übliche Wasch- und Reinigungsmittelkomponenten, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzungen wenigstens ein stabilisiertes Enzym gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 enthalten.