DE3824258A1 - Modifizierte enzymmembran fuer enzymelektroden mit hoher selektivitaet und verfahren zu ihrer anwendung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine modifizierte Enzymmembran mit hoher Selektivität für Enzymelektroden und Verfahren zu ihrer Anwendung, zum Einsatz z. B. bei der Bestimmung von Glucose, Laktat, Saccharose oder Harnsäure in physiologi­ schen Lösungen, Fermentationsproben sowie Getränken und Nahrungsmitteln. Die Erfindung ist in der klinischen Di­ agnostik, der Lebensmittelindustrie, der Fermentationskon­ trolle und im Umweltschutz einsetzbar.

Enzymelektroden basieren auf der Kopplung der Umsetzung des zu bestimmenden Substrates unter der Wirkung von immobili­ sierten Enzymen mit der elektrochemischen Anzeige eines elektrodenaktiven Partners der Enzymreaktion. Während die Enzymreaktionen im allgemeinen eine hohe Selektivität be­ sitzen, ist die daran gekoppelte elektrochemische Anzeige­ reaktion relativ unspezifisch. Die Ursache dafür liegt in der elektrochemischen Umsetzung aller Bestandteile der Meßprobe mit einem Abscheidungspotential unterhalb des Potentials der Indikatorelektrode. Diese Störungen werden durch permselektive Membranen ausgeschaltet, die entweder unmittelbar vor die Indikatorelektrode (US-PS 39 79 274) oder zwischen Meßlösung und Enzymschicht (Toshiba Rev. 132) angebracht werden. Diese Membranen besitzen eine selektive Permeabilität aufgrund des Porenausschlußvolumens oder der Ladung des Permeanten. Moleküle mit einem ähnlichen Moleku­ largewicht wie die an der Elektrode angezeigte Substanz können trotzdem zu Störungen führen. Außerdem ist die Her­ stellung solcher permselektiver Membranen aufwendig, und die Verwendung in Enzymelektroden ist wegen der mechani­ schen Instabilität unzweckmäßig.

Ein anderes Prinzip zur Ausschaltung dieser Störungen be­ ruht auf der Differenzmessung zwischen einer enzymfreien und einer mit Enzym beladenen Indikatorelektrode (BRD-Pat. 15 98 285). Dieses Verfahren erlaubt zwar die Ausschaltung des Einflusses von Störsubstanzen der Meßprobe, sie ist aber apparativ sehr aufwendig und erfordert ein häufiges Nacheichen. Außerdem ist diese Methode für die "kinetische Meßmethode" nicht geeignet, da das kinetische Verhalten dieser beiden unterschiedlichen Elektroden verschieden ist. Es wurde weiterhin vorgeschlagen, Störsubstanzen der Meß­ probe mittels enzymatischer Reaktion in einer vor der eigentlichen Enzymschicht befindlichen weiteren Schicht zu entfernen. Dieses Verfahren erfordert für jede Störsubstanz ein spezifisches Enzym und ist deshalb nur für den Einsatz bei Meßproben, die jeweils die gleichen Störsubstanzen enthalten, geeignet.

Bei einer laminierten Enzymmembran wurde zur Erzielung richtiger Messungen die Enzymschicht zwischen zwei semiper­ meable Membranen angeordnet, obwohl alle Spezies bis zu einem Molkulargewicht von 15 000 Dalton durch diese lami­ nierte Membran gelangen können, rufen niedrige Konzentra­ tionen an Störsubstanzen keine Meßwertverfälschung hervor, da das in der Enzymreaktion entstehende H₂O₂ wesentlich schneller durch die Enzymschicht und die zweite Dialysemem­ bran permeiert. Dagegen treten bei der Bestimmung der Urin­ glucose, wo die Konzentration der Störsubstanzen erheblich höher als die der Analysen sein kann, häufig überhöhte Meßwerte auf.

Weiterhin ist eine Bienzymelektrode bekannt (DD-WP 2 36 553), die sowohl ein die zu bestimmende Substanz in ein elektroaktives Produkt umwandelndes Enzym (Indikatorenzyme) als auch ein die interferierenden Substanzen in elektroche­ misch nicht interferierende Substanzen umsetzendes Enzym (Eliminatorenzym) enthält. Interferierende Substanzen, die nicht effektiv durch das Eliminatorenzym umgesetzt werden, können durch eine vorgeschaltete chemische Reaktion in der Meßlösung in nicht interferierende Substanzen und eine interferierende Substanz, die ein Substrat der Eliminator­ enzyme ist, umgesetzt werden. Auch durch eine zusätzliche Eliminatorelektrode wurde der Einfluß störender Substanzen unterdrückt. Die Differenzmessung und die Verwendung einer Eliminatorelektrode erfordern einen erhöhten apparativen Aufwand und sind dadurch erheblich teurer als einfache Messungen, wobei die Eliminatorelektrode nicht zum voll­ ständigen Ausschluß der Interferenz führt. Die beschriebe­ nen Membranen sind ebenfalls sehr kostenaufwendig, dabei sehr dünn und wenig stabil.

Durch die Verwendung von mehreren übereinanderliegenden Enzymschichten werden die Messungen wesentlich verlangsamt, wodurch sie für den Einsatz in üblichen Analysatoren nicht geeignet sind.

Weiterhin wird die Funktionsstabilität des Eliminatorenzyms häufig durch Produkte der Indikator-Enzymreaktion, z. B. H₂O₂, drastisch herabgesetzt, so daß die Einsatzdauer nur sehr kurz ist.

Das Ziel der Erfindung besteht darin, eine modifizierte Membran mit hoher Selektivität für Enzymelektroden und ein Verfahren zu ihrer Anwendung zu entwickeln. Ein Verfälschen des Meßergebnisses durch den Gehalt an verschiedenen elek­ trodenaktiven Störsubstanzen in der jeweiligen Meßprobe soll ausgeschlossen werden. Die Membran soll sich durch eine gute mechanische Stabilität auszeichnen und preis­ günstig sein.

Die erfindungsgemäße modifizierte Enzymmembran besteht aus einer laminierten Enzymmembran, die auf beiden Seiten von einer Zellulosemembran eingeschlossen ist. Die zwei Zellu­ losemembranen sind mit Zellulosenitrat durch Behandeln mit einer Zellulosenitratlösung beschichtet. Die laminierte Enzymmembran ist mit den beiden Zellulosemembranen über Diisocyanat, Triisocyanat oder Polyisocyanat verbunden. Diese laminierte Enzymmembran besteht aus einer Enzyme einschließenden Polyurethanschicht. Es können einzelne Enzyme und ggf. feinteilige niedermolekulare enzymatische Reaktionen beeinflussende Substanzen enthalten sein aber auch Enzymgemische und Substanzgemische. Bei einer Ge­ samtdicke des Laminats von etwa 25 µm sollte die Partikel­ größe der Enzyme unter 15 µm liegen. Eine besonders vor­ teilhafte Ausführung des Laminats weist durchschnittliche Partikelgrößen unter einem µm auf.

Als Enzyme werden Glukoseoxidase, Laktatoxidase, Glutamat­ oxidase, Sarkosinoxidase, Uratoxidase oder Mutarotase ver­ wendet.

Die verwendeten Polyurethane bestehen vorzugsweise aus Polyesteralkoholen, Kettenverlängerern und Diphenylmethan­ diisocyanat sowie vernetzungsfähigen Gruppen.

Die erfindungsgemäße Enzymmembran wird hergestellt, in dem man ein Enzym in ein Polyurethansystem einbettet und mit zwei Zellulosemembranen abdeckt. Die so hergestellte Sand­ wichmembran wird auf beiden Seiten mit Zellulosenitratlö­ sung betropft und anschließend getrocknet.

Diese Modifizierung führt zu einer Verlangsamung der Perme­ ation geladener Substanzen, während der Transport des Produktes der enzymatischen Reaktion - H₂O₂ - nur unwesentlich verlangsamt wird. Deshalb wird beim kineti­ schen Meßprinzip nur der Verlauf der H₂O₂-Bildung erfaßt.

Das Verfahren zur Verbesserung der Selektivität bei Ver­ wendung der erfindungsgemäßen Membran für Enzymelektroden auf der Basis der H₂O₂-Anzeige ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Störsubstanzen unter Verwendung von Ferrizyanid oder Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Peroxidase oxi­ diert, die der Meßprobe, Meßvorlage oder Enzymmembran zuge­ setzt werden. Dabei werden die sonst an der Elektrode oxidierbaren Störsubstanzen bereits in der Meßvorlage zu nichtstörenden Substanzen oxidiert. Bei Verwendung von H₂O₂ wird vor der Messung die Zersetzung des nicht umgesetzten Restes H₂O₂ durch Zusatz von Katalase oder eines Überschus­ ses von Ferrozyanid, bezogen auf das H₂O₂, erreicht. Durch die bereits für die Oxidation der Störsubstanzen verwendete POD erfolgt eine schnelle Zersetzung des H₂O₂ unter Bildung von Ferrizyanid. Auf der anderen Seite ist die spontane Reaktion von H₂O₂ mit Ferrozyanid so langsam, daß keine Störung des Meßwertes durch Verbrauch des in der Enzymre­ aktion gebildeten H₂O₂ erfolgt. Der Überschuß an Ferrozya­ nid bei Einsatz von H₂O₂ bzw. das gebildete Ferrozyanid bei Verwendung von Ferrizyanid als Oxidationsmittel stören bei Einsatz der mit Nitrozellulose modifizierten Enzymmembran nicht die Messung der zu bestimmenden Substanz.

Die erfindungsgemäße Membran besitzt gute mechanische Sta­ bilität, ist preisgünstig, da kein Eliminatorenzym benötigt wird und hat eine lange störungsfreie Funktionsstabilität. Anschließend wird die Erfindung an Beispielen näher be­ schrieben.

Beispiel 1

Glukoseoxidase wird wie folgt immobilisiert:

Zu 1 ml einer Lösung von 0,5 g Polyurethan System Syspur K 8010^R in 100 ml Aceton werden 4000 U Glukoseoxidase gegeben und homogenisiert (starkes Rühren, Kugelhomogenisator, Zusatz eines Emulgators). Anschließend werden je 5-10 µl des so hergestellten Gemisches auf eine Zellulosefolie (Ne­ phrophan) von ca. 25 µm Stärke getropft. Die Tropfen läßt man 24 h abtrocknen.

Auf die so hergestellte Enzymschicht werden ca. 10 µl einer Lösung aus Polymethylen-polyphenyl-isocyanat (Systa­ nat MR^R) und Essigsäureethylester (Konzentration: 5-10 µl Isocyanat pro 10 ml Essigsäureethylester) aufgetropft, mit einer zweiten Nephrophanfolie abgedeckt und festgewalzt. Die so hergestellte Sandwichmembran wird auf beiden Seiten mit je 5-10 µl Zellulosenitratlösung (Lösungsmittel: Ace­ ton oder Essigsäureethylester, Konzentration der Lösung: 0,15 - 0,05%) betropft. Die Zellulosenitratlösung läßt man 1-2 Min. bei Raumtemperatur trocknen.

Beispiel 2 Immobilisierung von Laktatoxidase

Zu 0,5 ml einer Syspur K 8010^R-Lösung (0,5 g in 100 ml Aceton) werden 200 U Laktatoxidase gegeben und homogeni­ siert. 5-10 µl des Gemisches werden auf eine Zellulosemem­ bran (z. B. Nephrophan), d = 25 µm, gegeben und ca. 1 Min. bei Raumtemperatur getrocknet. Auf diese Enzymschicht werden 10 µl einer Lösung aus Polymethylen-polyphenyl-isocyanat (Systanat MR^R) und Essigsäureethylester (5-10 µl in 10 ml) gegeben. Die Schicht wird mit einer weiteren Zellulosemem­ bran bedeckt und festgewalzt.

Die so hergestellte Sandwichmembran wird auf beiden Seiten mit je 5-10 µl Zellulosenitratlösung (Lösungsmittel: Ace­ ton oder Essigsäureethylester, Konzentration der Lösung: 0,15 - 0,05%) betropft. Die Zellulosenitratlösung läßt man 1-2 min bei Raumtemperatur trocknen.

Beispiel 3 Oxidation von Störsubstanzen mit H₂O₂ unter Einwirkung von POD und Zerstörung des überschüssigen H₂O₂ durch Kalium­ hexacyanoferrat (II) bzw. Katalase

Zur Bestimmung des Glukosegehaltes werden 2 ml hypotonen Phosphatpuffers (3 mM KH₂PO₄; 10 mM Na₂HPO₄ · 2 H₂O; 10 mM NaF; 1 mM Na₂ EDTA · 2 H₂O; 20 mM KCl) in der Meßzelle des Glukometers GKM 01 vorgelegt und 50 µl der zu vermessenden Lösung zugegeben. Das Glukometer wird gegen Glukosestan­ dards (5,5; 11 und 22 mM) in dem genannten Puffer kali­ briert.

Bei der Messung des Glukosegehaltes einer reinen Glucoselö­ sung (4,25 mM) wird der Meßwert durch Zugabe von Vanillin (4,25 mM Glukose; 3,3 mM Vanillin) um etwa 100% erhöht. Um die Störsubstanz zu oxidieren, wird die Lösung außerhalb der Meßzelle mit H₂O₂ vorbehandelt. 500 µl der Probe werden mit 10 µl 0,5 mM H₂O₂ und 40 U POD versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 10 Minuten wird das überschüssige H₂O₂ durch die Zugabe von 500 µl einer 20 mM Kaliumhexa­ cyanoferrat (II)-Lösung zerstört. Eine Beeinträchtigung der nachfolgenden Glukosemessung wurde durch Verwendung der Zellulosenitrat modifizierten GOD-Sandwich-Membran verhin­ dert. Eine andere Möglichkeit zur Vernichtung des über­ schüssigen H₂O₂ ist die Anwendung von Katalase. Zu 500 µl der mit POD und H₂O₂ versetzten Probelösung werden nach 10 Minuten 10 µl einer Katalasesuspension (100 U) gegeben. Die Probe wird nach weiteren 10 Minuten vermessen.

Eine Erhöhung des Meßwertes bei der Glukosebestimmung durch Störsubstanzen wird auf die beschriebene Weise verhindert. Bei der Messung einer reinen Glukoselösung und einer vanil­ linhaltigen Glukoselösung (je 4,25 mM), die nach den ange­ gebenen Methoden vorbehandelt wurden, erhält man die glei­ chen Ergebnisse.

Beispiel 4 Bestimmung von Glukose im Urin

Die Enzymmembran enthält pro cm² 45 U Glukoseoxidase in Polyurethan und ist beidseitig von einer mit Zelluloseni­ trat vernetzten Zellulose-Dialysemembran umgeben. Die unmittelbar an der Enzym-Sandwich-Membran befindliche Pt- Indikatorelektrode wird gegenüber der Bezugselektrode auf +600 mV polarisiert, so daß als Meßsignal das während der Glukoseoxidation entstehende H₂O₂ erfaßt wird.

Dem hypotonen Phosphatpuffer, der zur Blutglukosemessung verwendet wird (3 mM KH₂PO₄, 10 mM Na₂HPO₄ · 2 H₂O, 10 mM NaF, 1 mM Na₂ EDTA · 2 H₂O und 20 mM KCl) wird für Urinmes­ sungen als Oxidationsmittel 2 mM K₃/Fe(CN)₆/ zugesetzt. Für die manuelle Uringlukosemessung werden 2 ml der obigen Pufferlösung in die Meßzelle des kalibrierten Glukometers GKM 01 vorgelegt. Unmittelbar danach erfolgt die Zugabe von 50 µl unverdünntem Urin. Innerhalb von 6 Sekunden wird an der Digitalanzeige des GKM 01 die Glukosekonzentration angezeigt. Auf Grund der Oxidation der reduzierenden Sub­ stanzen durch das vorgelegte Kaliumhexacyanoferrat III in der Meßzelle und der Diffusionsbehinderung für das entste­ hende Kaliumhexacyanoferrat II K₄/Fe(CN)₆/ durch die Modi­ fizierung der Zellulose gelingt es, Verfälschungen durch Cooxidation weitgehend zu beseitigen. Während bei Einsatz von hypotonem Puffer ohne K₃/Fe(CN)₆/ und unmodifizierter GOD-Membran für Harnsäure ein ca. 30% größerer Glukosewert vorgetäuscht wird, kann diese Störung bei Messung des obi­ gen Systems bis auf 3% erniedrigt werden. Askorbinsäure verursacht bis 20 mM keine Erhöhung des Uringlukosesignals. Im Falle der kontinuierlichen Durchflußmessung (ADM 300, Glukose VI, ECA 20) werden die Urine vor der Analyse 1 : 50 bis 1 : 100 mit dem K₃/Fe(CN)₆/-Puffer verdünnt.

Beispiel 5 Laktatbestimmung

Eine mit Nitrozellulose modifizierte LOD-Membran wird vor die Pt-Indikatorelektrode des Pt-Ag/AgCl-Sensors des Gluko­ meters gebracht, der zur anodischen Oxidation des in der Enzymreaktion gebildeten H₂O₂ auf +600 mV polarisiert wird. Der Meßvorlage (0,1 mol/l Phosphatpuffer, pH 7,0 wird 1 mM K₃/Fe(CN)₆/ zugesetzt. 2 ml dieser Lösung werden in die Meßzelle des Glukometers gegeben. Die Kalibrierung erfolgt nach Nullpunkteinstellung mit je 20 µl Lactatstandardlö­ sung von 1, 2, 5, 10 und 20 mmol/l. Dann wird die zu bestimmende Blut-, Plasma- oder Serumprobe in die Meßzelle gegeben und die gesuchte Konzentration am Glukometer abge­ lesen.

Claims (8)

1. Modifizierte Enzymmembran hoher Selektivität für Enzymelektroden, dadurch gekennzeichnet, daß man eine laminierte Enzymmembran mit zwei Zellulosemem­ branen einschließt.

2. Membran nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellulosemembranen mit Zellulosenitrat beschichtet sind.

3. Membran nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeich­ net, daß die laminierte Enzymmembran mit den beiden Zellulosemembranen mittels Diiso-, Triiso- oder Polyisocyanaten verbunden ist.

4. Laminierte Enzymmembran, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzyme in einer Polyurethanschicht einge­ schlossen sind.

5. Laminierte Enzymmembran nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie Glucoseoxidase, Laktatoxi­ dase, Glutamatoxidase, Uratoxidase, Sarkosinoxidase oder Mutarotase als Enzym enthält.

6. Laminierte Enzymmembran nach Anspruch 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Poly­ urethane aus Polyesteralkoholen, Kettenverlängerern und Diphenylmethandiisocyanat bestehen und vernet­ zungsfähige Gruppen aufweisen.

7. Verfahren zur Verbesserung der Selektivität von Enzymelektroden auf der Basis der H₂O₂-Anzeige bei hohen Konzentrationen an Störsubstanzen, dadurch gekennzeichnet, daß man der Meßprobe, Meßvorlage oder der Enzymmembran Ferrizyanid oder Wasserstoff­ peroxid in Gegenwart von Peroxidase zusetzt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man der Meßprobe oder Meßvorlage beim Einsatz von H₂O₂ vor der Messung Katalase oder Ferrozyanid im Überschuß zusetzt.