DD282030A5

DD282030A5 - Verfahren zur verbesserung der selektivitaet von enzymelektroden

Info

Publication number: DD282030A5
Application number: DD30528087A
Authority: DD
Inventors: Frieder Scheller; Guenter Hanke; Juergen Nentwig; Dorothea Pfeiffer; Anette Nuenchert; Florian Schubert; Wolfgang Meiske; Siegfried Kuehnel
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1987-07-23
Filing date: 1987-07-23
Publication date: 1990-08-29

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der Selektivitaet von Enzymelektroden. Anwendungsgebiet der Erfindung ist u. a. die klinische Diagnostik. Erfindungsgemaesz wird der Meszprobe, Meszvorlage oder Enzymmembran Ferrizyanid oder Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Peroxidase zugesetzt. Beim Einsatz von H2O2 wird vor der Messung Katalase oder Ferrozyanid zugegeben.{Selektivitaet, Enzymelektroden; H2O2-Anzeige; Stoersubstanzen; Meszprobe; Meszvorlage; Enzymmembran; Ferrizyanid; H2O2; Peroxidase; Katalase; Ferrozyanid}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verbesserung der Selektivität von Enzymelektroden, z. B. für die Bestimmung von Glukose, Laktat, Saccharose oder Harnsäure in physiologischen Lösungen, Fermentationsproben sowie Getränken und Nahrungsmitteln. Das Verfahren ist in der klinischen Diagnostik, der Lebensmittelindustrie, der Fermentationskontrolle sowie im Umweltschutz einsetzbar.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Enzymelektroden basieren auf der Kopplung der Umsetzung des zu bestimmenden Substrates unter der Wirkung.yon immobilisierten Enzymen mit der elektrochemischen Anzeige eines elektrodenaktiven Partners der Enzymreaktion. Während die Enzymreaktionen im allgemeinen eine hohe Selektivität besitzen, ist die daran gekoppelte elektrochemische Anzeigereaktion relativ unspezifisch. Die Ursache dafür liegt in der elektrochemischen Umsetzung aller Bestandteile der Meßprobe mit einem Abscheidungspotential unterhalb des Potentials der Indikatorelektrode. Diese Störungen werden durch permselektive Membranen ausgeschaltet, die entweder unmittelbar vor die Indikatorelektrode (US-Pat. 3979274) oder zwischen Meßlösung und Enzymschicht (Toshiba Rev. 132) angebracht werden. Diese Membranen besitzen eine selektive Permeabilität aufgrund des Porenausschlußvolumens oder der Ladung des Permeanten.

Dabei gelingt es zwar, Störungen durch Askorbinsäure weitgehend auszuschalten. Phenolische Substanzen, z. B. Vanillin oder Phenol sowie Jodazetamid, Parazetanol (die als Blutstabilisatoren eingesetzt werden) sowie von verschiedenen Pharmaka und deren Metabolite (ζ. B. Adrenalin, DOPA und Analgin) können jedoch mit diesen Membranen nicht vor dem Erreichen der Indikatorelektrode gehindert werden und führen deshalb zu Störungen. Deshalb ist der Einsatz dieser Enzymmembranen für die Messung in Urin-, Fermentations- sowie Lebensmittelproben nur bedingt möglich.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Verbesserung der Selektivität von Enzym elektroden auf der Basis der H₂O₂-Anzeige zu entwickeln, bei dem auch eine hohe Konzentration elektrodenaktiver Störsubstanzen das Meßergebnis nicht verfälscht

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Verbesserung der Selektivität von Enzymelektroden zu entwickeln, bei dem die elektrodenaktiven Störsubstanzen vor dem Erreichen der Elektrode bereits in der Meßvorlage in nichtstörende Substanzen umgewandelt werden.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe auf Basis einer Oxidation der Störsubstanzen unter Verwendung der Oxidationsmittel Ferrizyanid oder Wasserstoffperoxid in Gegenwart des Enzyms Peroxidase als Zusatz zur Meßprobe, Meßvorlage oder der Enzymmembran gelöst. Dabei werden die sonst an der Elektrode oxidierbaren Störsubstanzen bereits in der Meßvorlage zu nichtstörenden Substanzen oxidiert. Bei Verwendung von H₂O₂ wird vor der Messung die Zersetzung des nicht umgesetzten Restes H₂O₂ durch Zusatz von Katalase oder eines Überschusses von Ferrozyanid, bezogen auf das H₂O₂, erreicht. Durch die bereits für die Oxidation der Störsubstanzen verwendete POD erfolgt eine schnelle Zersetzung des H₂O₂ unter Bildung von Ferrizyanid. Auf der anderen Seite ist die spontane Reaktion von H₂O₂ mit Ferrozyanid so langsam, daß keine Störung des Meßwertes durch Verbrauch des in der Enzymreaktion gebildeten H₂O₂ erfolgt. Der Überschuß an Ferrozyanid bei Einsatz von H₂O₂ bzw. das gebildete Ferrozyanid bei Verwendung von Ferrizyanid als Oxidationsmittel stören bei Einsatz der mit Nitrozellulose modifizierten Enzymmembran nicht die Messung der zu bestimmenden Substanz.

Ausführungsbeispiele

1. Oxidation von Störsubstanzen mit H₂O₂ unter Einwirkung von POD und Zerstörung des überschüssigen H₂O₂ durch

Kaliumhexacyanoferrat (II) bzw. Katalase

Zur Bestimmung des Glucosegehaltes werden 2ml hypotonen Phosphatpuffers (3 mM KH₂PO^ 1OmM Na₂HPO^ 2H₂O; 1OmM NaF; 1 mM Na₂ EDTA 2H₂O; 2OmM KCI) in der Meßzelle des Glukometers GKM 01 vorgelegt und 50 μΙ der zu vermessenden Lösung zugegeben. Das Glukometer wird gegen Glucosestandards (5,5; 11 und 22 mM) in dem genannten Puffer kalibriert.

Bei der Messung des Glucosegehaltes einer reinen Glucoselösung (4,25mM) wird der Meßwert durch Zugabe von Vanillin (4,2SmM Glucose; 3,3 mM Vanillin) um etwa 100% erhöht

Um die Störsubstanz zu oxidieren, wird die Lösung außerhalb der Meßzelle mit H₂O₂ vorbehandelt. 500 μΙ der Probe werden mit 10 μΙ 0,5 mM H₂O₂ und 4OU POD versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 10 Minuten wird das überschüssige H₂O₂ durch die Zugabe von 500 μΙ einer 2OmM Kaliumhexacyanoferrat (Il)-Lösung zerstört. Eine Beeinträchtigung der nachfolgenden Glucosemessung wurde durch Verwendung der Zellulosenitrat-vernetzten GOD-Sandwich-Membran verhindert.

Eine andere Möglichkeit zur Vernichtung des überschüssigen H₂O₂ ist die Verwendung von Katalase. Zu 500 μΙ der mit POD und H₂O₂ versetzten Probelösung werden nach 10 Minuten 10μ! einer Katalasesuspension (100U) gegeben. Die Probe wird nach weiteren 10 Minuten vermessen.

Eine Erhöhung des Meßwertes bei der Glucosebestimmung durch Störsubstanzen wird auf die beschriebene Weise verhindert.

Bei der Messung einer reinen Glucoselösung und einer vanillinhaltigen Glucoselösung (je 4,25 mM), die nach den angegebenen Methoden vorbehandelt wurden, erhält man die gleichen Ergebnisse.

2. Bestimmung von Glukose in Urin

Die Enzymmembran enthält pro cm² 46U Glukoseoxidase in Polyurethan und ist beidseitig von einer mit Zellulosenitrat vernetzten Zellulose-Dialysemembran umgeben. Die unmittelbar an der Enzym-Sandwich-Membran befindliche Pt-Indikatorelektrode wird gegenüber der Bezugselektrode auf +60OmV polarisiert, so daß als Meßsignal das während der ' Glukoseoxidation entstehende H₂O₂ erfaßt wird.

Dem hypotonen Phosphatpuffer, der zur Blutglukosemessung verwendet wird |3mM KH₂PO₄,1OmM Na₂HPO₄ · 2H₂0,1OmM - ~: NaF, 1 mM Na₂ EDTA · 2H₂O und 2OmM KCI) wird für Urinmessungen als Oxidationsmittel 2mM K₃ /Fe(CN)₆/ 2ugesetzt. Für die manuelle Uringlukosemessung werden 2 ml der obigen Pufferlösung in die Meßzelle des kalibrierten Glukometers GKM 01 vorgelegt. Unmittelbar danach erfolgt die Zugabe von 50μΙ unverdünntem Urin. Innerhalb von 6 Sekunden wird an der Digitalanzeige des GKM 01 die Glukosekonzentration angezeigt. Auf Grund der Oxidation der reduzierenden Substanzen durch das vorgelegte Kaliumhexacyanoferrat III in der Meßzelle und der Diffusionsbehinderung für das entstehende Kaliumhexacyanoferrat Il [K₄ZFe(CN)₆/] durch die Vernetzung der Zellulose gelingt es, Verfälschungen durch Cooxidation weitgehend zu beseitigen. Während bei Einsatz von hypotonem Puffer ohne K₃ZFe(CN)₆/ und unvernetrter GOD-Membran für " Harnsäure ein etwa 30% größerer Glukosewert vorgetäuscht wird, kann diese Störung bei Nutzung des obigen Systems bis auf "·*'" 3%erniedrigt werden. Askorbinsäure verursacht bei 2OmM (klinisch keine Relevanz) keine Erhöhung des Uringlukosesignals.-' ,V-.· Im Falle der kontinuierlichen Durchflußmessung (ADM 300), ME Glukose Vl; ECA 20) werden die Urine vor der Analyse 1:50 bis ·.'·'.· J 1:100 mit dem K₃/Fe(CN)6/-Puffer verdünnt und so der Glukoseelektrode mit vernetzter GOD-Membran über ein Pumpsystem .^: zugeführt. JhA ;>:. ^

3. Bestimmung von Glukose in Kakaoproben \_:., _:>\/'.{}-·' ;, Die vorliegenden Werte sind Ergebnisse kinetischer Messungen, die mit Hilfe des Gerätes GMK 01 durchgeführt wurden. Es i^·,^-"^; wurden jeweils 2 ml Puffer vorgelegt und 50 μΙ derzu vermessenden Probe zugegeben. Geeicht wurde gegen 3; 6 und 12 mM bzwl V . ^ gegen 5,5; 11 und 22mM Glucosestandards. ' ;!?,* ₄ Für die durchgeführten Oj-Messungen wurde eine einfache GOD-Membran in Verbindung mit einer Polyethylenmembran ,; ;,? .' '' ¹^ verwendet und für die H₂O₂-Messungen eine mit Nitrocellulose geblockte GOD-Membran. Vor Beginn der Messungen wurde die'' ·' ·ί! geblockte Membran mit 5mM und 1OmM Ferrocyanidlösungen auf Durchlässigkeit geprüft. .___

I. Anwendung des Schweriner Puffers mit Zusatz von K₃ZFe(CN)₆/ zur Oxidation störender Substanzen

Es wurden drei verschiedene Kakaoproben untersucht, von denen jeweils 100 mg in 10ml Puffer (2mmol/1 Ks/FefCNV) gelöst wurden. Die Probelösungen wurden 2 Stunden gerührt und 10 min durch Einblasen von Luft mit Sauerstoff gesättigt. Vergleichend wurden für jede Probe H₂O₂ in 2mM K₃Fe(CN)₆/-Puffer und O₂ in Schweriner Puffer gemessen.

Ergebnisse

H₂O₂-Messung O₂-Messung

Trinkfix 83,4 mg/g 83,1 mg/g

Tropengold 169,5 mg/g 169,7 mg/g

von Houten 84,5 mg/g 83,2 mg/g

Außerdem wurde auch Analgin als Störsubstanz untersucht. Dazu wurde eine Analginlösung mit einer Konzentration von 12,5mM vermessen.

H₂O₂-Messung in H₂O₂-Messung in 2 mM

Schweriner Puffer K₃ZFe(CN)₆Z Puffer Analgin in

Schweriner Puffer 6,58 0,68

Analgin in 2OmM

K₃/Fe(CN)₆Z-Puffer 0,59 0,50

II. Oxidation von Störsubstanzen mit H₂O₂ unter Einwirkung von POD und Zerstörung des überschüssigen H₂O₂ durch Katalase Es wurden 10 mg Vanillin in 10 ml Schweriner Puffer gelöst. Von dieser 6,5 mM Vanillinlösung wurde 1 ml mit 1 mg POD (40U) und 10μΙ einer 5M H₂O₂-Lösung versetzt. Nach 15 Minuten wurde das überschüssige H₂O₂ durch Zugabe von 10μΙ einer Katalasesuspension (100U) zerstört.

Bei einer anschließenden H₂O₂-Messung konnte kein Störsignal beobachtet werden.

III. Zerstörung des überflüssigen H₂O₂ durch K₄ZFe(CN)₆/

5 μΙ einer 0,5M H₂O₂-Lösung wurden zu 500μΙ einer 1OmM K4ZFe(CN)₆/-Lösung gegeben und mit 1 mg POD versetzt. Dabei konnte eine rasche Gelbfärbung der Lösung beobachtet werden. Bei einer anschließenden Messung nach etwa 15 Minunten wurden keine H₂O₂ gefunden.

Claims

1. Verfahren zur Verbesserung der Selektivität von Enzymelektroden auf der Basis der H₂O₂-Anzeige bei hohen Konzentrationen an Störsubstanzen, dadurch gekennzeichnet, daß man der Meßprobe, Meßvorlage oder der Enzymmembran Ferrizyanid oder Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Peroxidase zersetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man der Meßprobe oder Meßvorlage beim Einsatz von H₂O₂ vor der Messung Katalase oder Ferrozyanid im Überschuß zusetzt.