DD150656A1

DD150656A1 - Enzymelektrode zur bestimmung von peroxidase-substraten

Info

Publication number: DD150656A1
Application number: DD22107880A
Authority: DD
Inventors: Frieder Scheller; Michael Jaenchen; Reinhard Renneberg; Dorothea Pfeiffer; Martina Siepe; Hartmut Weise; Brigitte Bernard
Original assignee: Frieder Scheller; Michael Jaenchen; Reinhard Renneberg; Dorothea Pfeiffer; Martina Siepe; Hartmut Weise; Brigitte Bernard
Priority date: 1980-05-13
Filing date: 1980-05-13
Publication date: 1981-09-09

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Enzymelektrode zur Bestimmung der Konzentration von Substraten der Peroxidase, insbesondere von Aminophenazon und Bilirubin. Das Ziel der Erfindung besteht darin, mit einer solchen Enzymelektrode kurze Meszzeiten und einen niedrigen Chemikalienverbrauch zu erreichen. Erfindungsgemaesz wird auf eine Elektrode eine Enzymschicht aus Peroxidase und Katalase und/oder Glukoseoxidase homogen oder in getrennten Schichten aufgebracht und durch einen Dialyseschlauch abgedeckt, wobei die Meszloesung eine definierte Menge H&ind2! O&ind2! oder Glukose enthaelt. D. Enzymelektrode ist besonders fuer den Einsatz im klinischen und toxikologischen Labor und in der Arzneimittelforschung geeignet.

Description

-A-

F. Scheller (ZIM)

M. Jänchen (PMD)

R. Renneberg (ZIM)

D* Pfeiffer (ZIM)

M. Siepe (ZIM)

H. Weise (ItM)

S. Bernard (PMD)

"Enzymelektrode zur Bestimmung von Peroxidase-Substraten"

Anwendungsgebiet der Erfindung;

Die Erfindung betrifft eine Enzymelektrode zur Bestimmung der Konzentration von Substraten der Peroxidase, insbesondere von Aminophenazon und Bilirubin. Sie ist besonders für den Einsatz im klinischen und toxikologischen Labor und in der Arzneimittelforschung geeignete

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Freies Bilirubin, das aus dem Blutfarbstoff entsteht, ist vor allem bei Neugeborene hoch toxisch. Die bisher übliche Bestimmung von Bilirubin basiert auf dem Umsatz mit diazotierter Sulfanilsäure oder 2,5-Dichlorphenol zu einem Azofarbstoffe Die Reaktionsdauer beträgt 60 min· Die Auswertung erfordert ein empfindliches Spektralphotometer· Außerdem werden teure Chemikalien v/ie Coffein und Tartrat verbraucht. (A. Wahlefeld u. a., Scan. J. Clin. Lab. Invest. 29, 126 (1972)). Aminophenazon ist ein antipyretisch wirksames Arzneimittel,~ seine Bestimmung ist deshalb im pharmakologisehen und toxikologischen Labor wichtig.

Die Bestimmung von Aminophenazon erfordert eine vorgeschaltete Extraktion. Erst danach ist die komplexometrische oder kolorimetrische Bestimmung möglich (R. Bontemps u. a., J. Pharm. Belgique 16, 146 (1961)).

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, eine Enzymelektrode zur Bestimmung der Konzentration von Substraten der Peroxidase zu entwik-

kein. Dabei sollen kurze Meßzeiten und durch Immobilisierung der verwendeten Enzyme ein niedriger Chemikalienverbrauch erreicht werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, durch Kombination von Enzymen in einer Enzymelektrode ein Signal zu erhalten, das von der Konzentration von Substraten der Peroxidase abhängt;¹

Die Aufgabe wird mit einer Enzymelektrode dadurch gelöst^ daß neben Peroxidase auch Katalase und/oder Glukoseoxidase vor einer üblichen Sauerstoffelektrode oder HpOp anzeigenden Elektrode angeordnet sind und der Meßlösung eine definierte Menge H₂O₂ oder Glukose zugesetzt wird.

Bei Einsatz einer Enzymschicht, die Glukoseoxidase und Peroxidase enthält, wird durch die Reaktion der in der Meßlösung befindlichen Glukose H₂O₂ in der Enzymschicht erzeugt. Die HgOg-anzeigende Elektrode liefert dabei ein Stromsignal, das der Glukosekonzentration proportional ist (Prinzip der Glukoeeelektrode, P· Scheller et al_o, Z. med. Lab. Diagn. 18, (1977)· Bei Zugabe eines Substrates der Peroxidase wird ein Teil des bei der Glukoseoxidation gebildeten H₂O₂ in dem durch Peroxidase katalysierten Substratumsatz verbraucht« Damit wird das Signal für die anodisehe Oxidation des H₂O₂ in Abhängigkeit von der Konzentration des Peroxidasesubstrates verkleinert.

Das dargelegte Prinzip ist anwendbar, wenn das Peroxidasesubstrat nicht selbst ein Signal beim Potential der anodischen HpOrj-Oxidation hervorruft. Wenn das der Fall ist, muß die Elektrode von der Meßlösung durch eine Membran abgetrennt werden, die für das Peroxidasesubstrat undurchlässig ist. Damit wird aber auch die Messung der Hp0₂-Konzentration unmöglich, so daß erfindungsgemäß durch eine Sauerstoffmessung das Problem gelöst wird_o Dazu wird Peroxidase mit Katalase gemeinsam vor eine Sauerstoffelektrode gebracht und der Meßlösung eine definierte Menge H₂O₂ zugesetzt. Die Zersetzung des

H₂O₂ durch Katalase ruft eine Erhöhung des Sauerstoffreduktionsstromes hervor, wobei diese Erhöhung der HpOp-Konzentration proportional ist. Bei Zugabe eines Peroxidasesubstrates wird ein Teil des H₂O₂ in der peroxidasekatalysierten Substratumsetzung verbraucht, so daß die Erhöhung des Säuerst offredukti ons stromes in Abhängigkeit von der Substratkonzentration erniedrigt wird_o

Bei Koimmobilisierung von Glukoseoxidase, Peroxidase und Katalase werden die beiden vorher beschriebenen Varianten kombiniert: Die Störung der Elektrodenreaktion wird durch die säuerstoffpermeable Membran verhindert und die Erzeugung des H₂O₂ in der Enzymschicht umgeht< > Probleme, die bei katalasehaltigen Meßproben auftreten. Bei diesem Verfahren wird in Abwesenheit von Peroxidasesubstraten das in der Glukoseoxidationsreaktion gebildet H₂O₂ durch Katalase zersetzt, so daß die Erniedrigung des 0₂-Reduktionsstromes kleiner als in Abwesenheit von Katalase ist· Der Verbrauch von HpO₂ in der peroxidasekatalisierten Substratumsetzung ruft eine Vergrößerung des Abfalls des 0₂-Reduktionsstromes hervor:

Glukose + O₂ + H₂O ^{Gluko3eoxidase}> ^H2°2 ⁺ 2 SH + H₂O₂ 2 S' + 2 H₂O H₂O + 1/2 O₂

Da das Prinzip der Messung in der Konkurrenz zwischen Peroxidase und Katalase liegt, ist es vorteilhaft, Peroxidase in einer getrennten Schicht auf der Lösungsseite vor Katalase zur Erhöhung der Empfindlichkeit anzubringen Die Konzentrationsbestimmung mit der erfindungsgemäßen Enzymelektrode ist auf Grund der einfachen Durchführbarkeit für den Routinebetrieb geeignete

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung soll nachstehend an drei Ausführungsbeispielen erläutert werdend

1, Beispiel

Auf der Polyethylenfolie einer Sauerstoffelektrode wird ein 3 x 3 mm großes Blättchen-der Enzympräparation mit einem Dialyseschlauch fixiert;¹ Die Enzymschicht enthält

p О

32 U/cm Peroxidase, 1.000 U/cm Katalase, wobei Gelatine als Träger dient. Die präparierte Enzymelektrode taucht in die gerührte Meßlösung ein, die auf 25⁰C temperiert ist? Die Enzymelektrode wird über ein pO₂-Meter mit Schreiber angeschlossen..Als Meßlösung wird 0,1 M Phosphatpuffer pH 6 verwendet.

Die Meßzelle enthält 2 ml der Pufferlösung, die mit Luft gesättigt isto Nachdem sich die Enzymelektrode auf den Wert der Luftsättigung eingestellt hat, wird HpOo zugegeben, so daß die Konzentration in der Meßzelle 0,125 mM beträgt; Anschließend wird die Meßzelle gespült und erneut mit 2 ml Pufferlösung beschickt. Zur Aufnahme der Eichkurve werden steigende Mengen Aminophenazon (0,025 - 1 mM) zugesetzt und anschließend nach Zugabe der gleichen H₂O₂-Menge die Größe des 0₂-Reduktionsstromes bestimmt; Im Konzentrationsbereich von 0,025 - 0,25 mM Aminophenazon hängt die Erniedrigung des 0₂-Reduktionsstromes linear von der Konzentration ab;-

Auf der Grundlage der aufgenommenen Eichkurve erfolgt die Messung der Aminophenazonkonzentration in Abhängigkeit von der Zeit bei der Umsetzung durch Lebermikrosomen. Dazu wird jeweils eine aliquote Menge des aminophenazonhaltigen Reaktionsansatzes zur Meßlösung gegeben und der O₂-Reduk~ tionsstrom bei Zugabe von H₂O₂ gemessen«, 2; Beispiel

Über den Mantel einer üblichen Sauerstoffelektrode wird ein Dialyseschlauch gespannt. In der Mitte der Stirnfläche

befindet sich eine Enzymschicht, die 32 U/cm Peroxidase und 40 U/cm . Glukoseoxidase in Gelatine enthält· Zur Lösungsseite wird ein weiterer Dxalyseschlauch unmittelbar über die Enzymschicht gespannt. Die Pt-Indikatorelektrode wird mittels eines Polarographen auf + 600 mV gegenüber

der AgCl-Bezugselektrode polarisierte" Die präparierte Enzymelektrode wird in die gerührte Meßzelle eingebrachte Als Meßlösung dient 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,5. Zu dieser Lösung werden 50 /Ul Glukoselösuhg zugegeben, so daß die Konzentration 250 mg/dl beträgt«,¹ Die Glukosezugabe ruft einen anodischen Strom hervor, der infolge der hohen Glukosekonzentration auch bei Zugabe von weiterer Glukose nicht erhöht werden kann» Damit ist eine Störung durch die Glukose der Meßlösung ausgeschaltet« Nachdem der Strom einen konstanten Wert erreicht hat, werden 50 ,ли. einer 10 mg/dl haltigen Bilirubinlösung zugesetzt· Der anodische Strom verkleinert sich entsprechend der HgOg-verbrauchenden Umsetzung von Bilirubin durch Peroxidase_e Analog dazu. werden unterschiedliche Mengen der Bilirubinlösung zugesetzt und eine Eichkurve aufgenommen· Die Bestimmung des Bilirubingehaltes in Serumproben erfolgt wie bei der Messung der Eichlösung· Die Konzentration wird aus der Abnahme des anodischen Stromes mit Hilfe der Eichkurve bestimmt· 3. Beispiel

Auf die Polyethylenmembran einer Sauerstoffelektrode werden folgende Schichten aufgebracht: Unmittelbar auf der Polyethylenmembran befindet sich eine Katalaseschicht von 50 xaa. Dicke (Gelatineeinschluß), die durch einen Dialyseschlauch von einer Enzymschicht getrennt ist, die Glukoseoxidase und PeroxLdase enthalte Zur Lösungsseite hin befindet sich ein weiterer Dialyseschlauch. Die so präparierte Enzymelektrode taucht in die gerührte und temperierte Meßzelle ein» Als Meßlösung dient 0,1 M Phosphatpuffer pH 6,5. In die Meßlösung werden 50 /Ul Glukoseeichlösung gegeben, so daß die Meßlösung 5 mg/dl Glukose enthält;;· Nachdem der katodische Strom auf einen konstanten Wert abgefallen ist, werden 50 /Ul einer 4 mM Dimethylanilin-Iiösung zugesetzt. Die Vergrößerung des katodischen Stromes'hängt im Konzentrationsbereich von 0,05 mM bis 0,25 mM linear von der Konzentration ab. Die Zeit für die Einstellung des Meßwertes dauert etwa 1 min·, die Gesamtzeit etwa 5 min. je Messung.

Die Bestimmung der Konzentration für Dimethylanilin erfolgt analog zur Eichung und die Auswertung auf der Grundlage der Eichkurve·

Claims

Erfindung3an3pruoh

Enzymelektrode zur Bestimmung von PeroxidaseSubstraten insbesondere Aminophenazon und Bilirubin mittels einer Op- oder HpOp-anzeigenden Elektrode, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrode mit einer Enzymschicht, in der Peroxidase und Katalase und/oder Glukoseoxidase homogen oder in getrennten Schichten aufgebracht und durch einen Dialyseschlauch abgedeckt ist,-wobei die Meßlösung eine definierte Menge HpO^ oder Glukose enthalte"