DD239274B1

DD239274B1 - Verfahren zur stabilisierung eines elektrochemischen messverfahrens zur analytischen bestimmung von harnsaeure

Info

Publication number: DD239274B1
Application number: DD27852285A
Authority: DD
Inventors: Michael Jaenchen; Gerd Honymus
Original assignee: Fi F Medizin Diagnostik
Priority date: 1985-07-12
Filing date: 1985-07-12
Publication date: 1988-12-28
Also published as: DD239274A1

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein einfaches Verfahren zur Vorbehandlung von Meßelektrodenanordnungen für die elektrochemisch-amperometrische Harnsäurebestimmung an manuellen Meßplätzen oder automatisierten Fließsystemen. Die Meßelektrode wird im Potentialbereich der Sauerstoffreduktion vorpolarisiert und anschließend beim Harnsäuremeßpotential einer hohen Harnsäurekonzentration ausgesetzt. Die nachfolgende Calibrierung erfolgt unter Anwendung salzhaltiger Calibrierlösungen oder Richtigkeitsseren. Das Verfahren ist vorwiegend in chemischen, biochemischen und klinisch-chemischen Laboratorien anzuwenden.

Description

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, mit einer an sich bekannten membrangeschützten, enzymlosen Elektrodenanordnung (Arbeitselektrode, Bezugselektrodensystem) bei der amperometrischen Bestimmung von Harnsäure in Untersuchungsflüssigkeiten auch über größere Meßserien stabil und zuverlässig richtige Messungen zu ermöglichen. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß vor Durchführung des Meßverfahrens die Arbeitselektrode bei einem katodischen, negativen Potential, das im Gebiet der Sauerstoffreduktion liegt und vom jeweiligen Elektrodenmaterial abhängt, mindestens eine Minute lang aktiviert beziehungsweise regeneriert wird und danach an der Arbeitselektrode Harnsäure in mindestens 5fach höherer Konzentration, als sie bei physiologischen Normwerten im menschlichen Blutserum vorkommt, amperometrisch im Potentialbereich der Harnsäureoxidation mindestens eine Minute oxidiert wird, wobei diese elektrochemischen Vorbehandlungsprozeduren in neutralen oder basischen Pufferlösungen wie Borat- oder Phosphatpuffer vorgenommen werden, die auch bei der nachfolgenden Harnsäuremessung zur Anwendung kommen. Die erfindungsgemäße Vorbehandlung der Elektrodenanordnung ist unkompliziert und nimmt sowohl im kontinuierlichen (Durchfluß, flow injection) als auch im diskontinuierlichen Betrieb nur etwa fünf Minuten zusätzliche Arbeitszeit vor Beginn des eigentlichen Meßvorganges in Anspruch.

Die Anwendung der erfindungsgemäßen Lösung ermöglicht stabile und zuverlässig richtige amperometrische Messungen der Harnsäurekonzentration in Untersuchungsflüssigkeiten ohne Einsatz von Enzymen und auch bei längeren Meßserien ohne die Notwendigkeit einer häufigen Nachcalibrierung.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung soll nachstehend an zwei Ausführungsbeispielen erläutert werden.

Beispiel 1:

Verwendet wird eine für direktamperometrische Harnsäuremessungen anwendbare Elektrodenanordnung (ähnlich einer Clark-Elektrode, allerdings mit einer für niedermolekulare Stoffe permeablen Membran). Arbeitselektrode ist eine Platinelektrode, Gegen- und Bezugselektrode eine größere Ag/AgCI-Elektrode, innerer Leitelektrolyt (Innenelektrolyt) ist 0,1 mol/l KCI-Lösung oder Gel. Die Elektrodenanordnung wird für die Messung in gut gerührte Boratpuffer- oder Phosphatpufferlösung mit 0,05 mmol/l KCI-Gehalt eingetaucht; zweckmäßig ist eiune Meßkammer entsprechend der elektrochemisch-enzymatischen Glucosemessung.

Die Elektrodenanordnung ist bei der Messung an ein elektronisches Meßgerät angeschlossen, das sowohl die Strom-Zeit-Kurve differenziert und.eine bei einem Potential von 0,4V zwischen Arbeits- und Bezugselektrode genügende Stromempfindlichkeit aufweist (bei Pt-Elektrodendurchmesser0,5... 1 mm im nA-Bereich). Außerdem soll das Gerät eine Umschaltung der Polarisation der Arbeitselektrode auf das Potential der O₂-Bildung gestatten, z. B. -0,6 V vs. Ag/AgCI.

Elektrodenvorbehandlung und Meßvorgang:

Der Meßvorgang entspricht der für die elektrochemische Harnsäurebestimmung angegebenen Verfahrensweise. Vor dem Meßvorgang sind erfindungsgemäß folgende Schritte vorzunehmen:

Zunächst erfolgt eine 2-3minütige Aktivierung der Pt-Arbeitselektrode bei dem Potential der GyReduktion in dem entsprechenden Grundpuffer. Danach wird dieser erneuert und das Potential auf das Potential der Harnsäureoxidation bzw. der Harnsäuremessung umgestellt. Danach erfolgt die Zugabe einer konzentrierten Harnsäurelösung (ζ. В. 6 mmol/l) so, daß eine Harnsäurekonzentration von ca. 1 mmol/l in der Meßkammer resultiert. Diese Lösung verbleibt mindestens 1 Minute vor der Elektrodenanordnung, wird danach abgesaugt und nach Spülen wieder durch Grundpuffer ersetzt; in dem sich der „harnsäurefreie" Grundstrom einstellt (Änderungsgeschwindigkeit des Stromsignals = 0).

Nun erfolgt die Calibrierung der Elektrodenanordnung mit 0,15 mol/l Chlorid enthaltenden Harnsäure-Calibrierlösungen.

Danach werden in den 0,15 mol/l Chlorid enthaltenden Meßlösungen die zu ermittelnden Harnsäurekonzentrationen bestimmt.

Der erfindungsgemäß einzusetzende Chloridgehalt liegt sowohl in der Calibrier- als auch in den Meßlösungen größenordnungsmäßig im Konzentrationsbereich des Innenelektrolyten der Elektrodenanordnung.

Die Meßlösungen werden durch Verdünnen der Untersuchungsflüssigkeiten, z. B. Patientenblutseren, mit Grundpuffer hergestellt.

Beispiel 2:

Verwendet wird eine Durchflußkammer nach derfür GvMessungen üblichen Art mit zugehöriger Mikro-Elektrodenanordnung oder nach Art der in Fließautomaten zur elektrochemischen Substratbestimmung mit Enzymelektroden hergestellten Durchflußmeßkammern ähnlichen Aufbaus.

Die eingesetzte Elektrodenanordnung wird an ein elektronisches Gerät entsprechend Beispiel 1 angeschlossen.

Elektrodenvorbehandlung und Meßvorgang:

Die Durchflußmeßkammer wird auf 25°C temperiert oder bei durchlaufendem Grundpuffer (Boratpuffer, Phosphatpuffer) auf ein Temperaturgleichgewicht mit der Umgebung gebracht.

Danach erfolgt als erfindungsgemäße Vorbehandlung die Aktivierung der Arbeitselektrode im durchlaufenden Grundpuffer durch Polarisation beim Potential der 0₂-Reduktion über ca. 3 Minuten.

Anschließend wird eine kontinuierliche Harnsäureoxidation aus einer 1-mmol/l-haltigen Harnsäure/Grundpufferlösung, die mindestens 1 Minute bei -f-0,4V gegen Ag/AgCI durch die Meßkammer gesaugt wird, vorgenommen.

Nach erneuter Einstellung des O-Stromes durch kontinuierliches Einsaugen des Grundpuffers zur Spülung erfolgt die Calibrierung der Anordnung mit 0,06 mol/l Chlorid enthaltenden Harnsäure-Calibrierlösungen. Danach werden in den 0,06 mol/l Chlorid enthaltenden Meßlösungen die zu ermittelnden Harnsäurekonzentrationen bestimmt.

Bei der Herstellung der Meßlösungen werden z. B. Blutseren mit G rund puffer verdünnt, wobei die zweckmäßige Verdünnung bei 1:10 bis 1:51 liegt.

Bei entsprechender Wahl von Spül- und Probenahmezeit sind Analyseraten bis zu 100 Bestimmungen/h möglich.

Claims

1. Verfahren zur Stabilisierung eines elektrochemischen Meßverfahrens zur analytischen Bestimmung von Harnsäure in physiologischen Flüssigkeiten unter Verwendung einer bekannten amperometrischen Meßanordnung und von in ihrer ionalen Zusammensetzung aufeinander abgestimmten salzhaltigen Calibrier- und Meßlösungen, dadurch gekennzeichnet, daß

— vor Durchführung des Meßverfahrens zunächst die Arbeitselektrode bei dem Potential der Sauerstoffreduktion aktiviert wird und anschließend

— an der Arbeitselektrode eine Harnsäurelösung mit einer gegenüber der in der Untersuchungsflüssigkeit vorhandenen mindestens 5fach höheren Konzentration an Harnsäure mindestens 1 Min. lang oxidiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Arbeitselektrode mindestens 1 Min. aktiviert wird.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Stabilisierung eines Verfahrens zur direkten Bestimmung von Harnsäurekonzentrationen in Untersuchungsflüssigkeiten₍wie z. B. Serum, Plasma oder Fermentationslösungen. Sie eignet sich für die Stabilisierung der quantitativen Harnsäurebestimmung in mikrobiologischen und in klinisch-chemischen Laboratorien und ist anwendbar bei der routinemäßigen Vorbereitung der Elektrodenanordnung für Einzel- oder Serientests.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die bisher in der Praxis angewandten Verfahren zur Hamsäurebestimmung beruhen entweder auf der Fähigkeit der Harnsäure, andere Stoffe zu reduzieren oder auf der Möglichkeit einer direkten oder indirekten spezifischen Messung der sich bei der enzymatischen Umsetzung mit Hilfe des Enzyms Uricase (Urat: O₂-Oxidreductase) verändernden Ausgangs-(O₂)~ bzw. Endproduktes (H₂O₂) oder auf der Möglichkeit der direkten elektrochemischen Harnsäureoxidation an einer amperometrischen Elektrodenanordnung entsprechend

Harnsäure ► Allantion+ Folgeprodukte.

Letzteres Verfahren hat den Vorteil einer vollständigen Einsparung von teurem Enzym in gelöster oder immobilisierter Form und wird nach einem kinetischen Meßprinzip durchgeführt (M.Jänchen et al., Biomed. Biochim. Acta, 42 [9] [1983], 1055-1065). Damit entfallen Probleme, die mit dem kommerziellen Vertrieb der empfindlichen Enzympräparate verbunden sind (Thermoinstabilität, Feuchtigkeit etc.). Als Meßkammer und Meßelektrodenanordnung dient eine übliche elektrochemischamperometrische Anordnung (DDR-Patent DD 150508BD, in der die Harnsäurebestimmung entsprechend einer bekannten Verfahrensweise vorgenommen wird (DDR-Patent DD 203810). Allerdings zeigte sich, daß dieses relativ einfach durchführbare enzymlose elektrochemisch-amperometrische Verfahren von einigen wichtigen Randproblemen hinsichtlich seiner Praktikabilität bzw. Stabilität über lange Meßzeiten abhängig ist: Vorbehandlung und Vorgeschichte der elektrochemischamperometrischen Elektrodenanordnung (Arbeitselektrode, Bezugselektrodensystem) haben einen großen Einfluß auf die Richtigkeit und Reproduzierbarkeit der gemessenen Harnsäurewerte in Untersuchungsflüssigkeiten wie z. B. biologischen Flüssigkeiten oder menschlichen Untersuchungsmaterialien. Hierfür sind Störungen an der Arbeitselektrode (z. B. Pt oder C) verantwortlich (R.N.Adams, „Electrochemistry at solid electrodes", M.Dekker, New York/Basel, 1969). Zur Umgehung dieser Einflüsse können neben einer vor der Messung erfolgenden Selektion der Elektroden bezüglich ihrer Eignung Elektrodenvorbehandlungsmethoden angewandt werden, die für einige andere elektrochemisch-analytische Probleme zwar bekannt, aber von Fall zu Fall unterschiedlich sind. Andererseits ist die Praktikabilität insbesondere für Routinemethoden durch zusätzliche aufwendige Elektronik oft eingeschränkt (z.B. K. Lemke et al.; Bioelectrochem. Bioenergetics8 [1981], 115-124). Andere Verfahren sind zeitaufwendig und bedienen sich aggressiver Lösungen zur Vorbehandlung der Elektroden. Sie sind daher nicht für membranbespannte Elektroden geeignet. Außerdem führen sie oft nur zeitweise zu reproduzierbaren Messungen. Insgesamt sind die Veränderungen an Elektrodenoberflächen wie Platin bei Polarisationsvorgängen kompliziert und noch nicht vollständig aufgeklärt.

Bei der elektrochemisch-amperometrischen Bestimmung von Harnsäure in Untersuchungsflüssigkeiten mittels einer membrangeschützten, enzymlosen Elektrodenanordnung (Arbeitselektrode, Bezugselektrodensystem) ist uns ein geeignetes Verfahren zur Stabilisierung der Messungen nicht bekannt geworden.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, die nachteiligen Einflüsse auf die Richtigkeit und Reproduzierbarkeit der Messungen, die infolge unterschiedlicher Vorgeschichte und Vorbehandlung der zur amperometrischen Bestimmung von Harnsäure in Untersuchungsflüssigkjiten verwendeten membrangeschützten, enzymlosen Elektrodenanordnung (Arbeitselektrode, Bezugselektrodensystem) auftreten, auszuschalten.