DE4438087A1 - Sensoranordnung mit amperometrischer oder potentiometrischer H¶2¶0¶2¶-anzeigender Elektrode zur Bestimmung von Superoxid 0¶2¶- - Google Patents

Sensoranordnung mit amperometrischer oder potentiometrischer H¶2¶0¶2¶-anzeigender Elektrode zur Bestimmung von Superoxid 0¶2¶-

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Description

Die Erfindung betrifft eine Sensoranordnung mit amperometrischer oder potentiometrischer H₂O₂-anzeigender Elektrode zur Bestimmung von Superoxid O₂⁻. Anwendung findet die Sensoranordnung zur Bestimmung und zum. Nachweis von lebenden Zellen und Biomakromalekülen, wie Proteine, Viren oder Bakterien.
O₂⁻ ist ein kurzlebiges Radikal mit einer Halbwertszeit bei pH 7 von wenigen ms. Deshalb ist eine direkte Anzeige sehr kompliziert, z. B. kann der Spin des ungepaarten Elektrons mit der Elektronenspinresonanz und damit auch die O₂⁻- Konzentration erfaßt werden. Hierzu ist aber eine "Schockgefrierung" der Meßprobe erforderlich, um den Zerfall des O₂⁻ zu verlangsamen. Der chemische O₂⁻- Nachweis benutzt die Reaktion von O₂⁻ mit Cytochrom c, Sulfit oder Nitroblau-Tetrazolium (McCord et al, Superoxide Dismutase Assays: A Review of Methodology in: Superoxide and Superoxide Dismutases. Ed.: Michaelson, Academic Press, London, 1977).
Allerdings ist dieses Verfahren unspezifisch, da auch andere reduzierende Substanzen zu dieser Farbbildung führen können. Es ist ein weiterer Sensor zur Bestimmung von O₂⁻ bekannt, bei dem die Reduktion des Ferri-Cytochrom durch O₂⁻ elektrochemisch angezeigt wird (McNeil et al, Free rad. Res. Comm., 17, 6, 399- 406, 1992; Cooper et al, J. Electroanal. Chem., 347, 267-275, 1993). Für die Messung ist es erforderlich, das Cytochrom c an platinierten Kohleelektroden zu adsorbieren oder es über SH- Spacer kovalent an eine Goldelektrode zu fixieren. Das Meßsignal wird durch die Oxidation des durch O₂⁻ reduzierten Cytochrom c erzeugt, wozu ein Potential von + 100 mV v.s. S.C.E- angelegt werden muß. Bei diesem Potential werden aber andere Substanzen an der Elektrode oxidiert, z. B. Ascorbinsäure und SH-haltige Peptide, wie Glutathion.
Aufgabe der Erfindung ist es, eine Sensoranordnung bereitzustellen, die Störeffekte durch Probenbestandteile an der Elektrode völlig ausschließt.
Die Erfindung wird gemäß Anspruch 1 realisiert, die Unteransprüche 2 bis 8 sind Vorzugsvarianten.
Erfindungsgemäß wird für die Sensoranordnung eine gaspermeable Membran zur Abdeckung der Indikatorlösung gegenüber der Meßlösung eingesetzt, wobei überraschenderweise das Superoxid durch diese Membran permeiert. Dadurch wird es möglich, daß vor die Elektrode gelangte O₂⁻ mittels des Enzyms Superoxiddismutase in H₂O₂ und O₂ zu zerlegen, wobei das entstehende H₂O₂bei dem angelegten Potential oxidiert wird, wobei der Strom der ursprünglichen O₂⁻- Konzentration vor der Membran proportional ist.
Die kurze Lebensdauer des O₂⁻ führt dazu, daß im Innern der Meßlösung entstandenes O₂⁻ nur zu einem kleinen Signal führt, während die gleiche Menge in der Nähe der Deckmembran einen erheblich höheren Strom liefert. Dieses Verhalten ist für die Trennung der Signale von Lösung und Membranoberfläche, wie sie bei trennungsfreien Immunoassays erforderlich ist, eine gewünschte Eigenschaft. Deshalb wird die erfindungsgemäße Sensoranordnung für solche "pseudohomogenen" Immunoassays eingesetzt, wobei das O₂⁻ durch ein Markerenzym erzeugt wird. Durch die kurze Lebensdauer des Superoxids wird nur ein Teil des Markerenzyms erfaßt, der an Immunkomponenten auf der Deckmembran fixiert wird. Dagegen liefern die im Innern der Meßlösung befindlichen Markerenzyme kein Meßsignal. Daüber hinaus hat die erfindungsgemäße Sensoranordnung gegenüber den bisher beschrie­ benen "pseudohomogenen" Immunoassays den Vorteil, daß die Zugabe eines Scavanger-Enzyms, wie z. B. Katalase, in die Lösung, um die in der Lösung gebildeten Reaktionsprodukte zu zerstören, nicht erforderlich ist.
Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß die Benutzung einer gaspermeablen Membran als Abdeckung der Indikatorelektrode gegenüber der Meßlösung zum vollständigen Ausschalten von Störeffekten an der Elektrode durch Probenbestandteile führt. So ruft die Gegenwart von H₂O₂ oder Ascorbinsäure an der membranbedeckten Indikatorelektrode kein Störsignal hervor.
Die erfindungsgemäße Sensoranordnung kann vorzugsweise zur Bestimmung und zum Nachweis von Proteinen, Zellen oder Zellbestandteilen, Viren und Bakterien eingesetzt werden.
Bei Miniaturisierung kann die Sensoranordnung als O₂⁻- Sonde zur Lokalisierung von O₂⁻- Quellen, z. B. im Organismus oder in der Zelle direkt eingesetzt werden.
Anschließend wird die Erfindung an Ausführungsbeispielen näher erläutert, die sie jedoch nicht begrenzen sollen.
Beispiel 1
Bestimmung des Schilddrüsenhormons TSH (Thyroid stimulating hormone) im Blut.
Es wird ein Sandwich-Immunoassay im pseudohomogenen Format (nur Zugabe des Analyten) eingesetzt, wobei als O₂⁻- produzierendes Markerenzym Xanthinoxidase (XOD) mit dem 2. Antikörper konjugiert wird. Die Elektrode wird mit einem Fängerantikörper (1. Antikörper) beschichtet, der Nachweis-Antikörper (tracer, 2. Antikörper) befindet sich in Form des Konjugates mit der Xanthinoxidase in der Lösung, die Xanthin oder Hypoxanthin als Substrat der XOD bereits im Überschuß enthält. Bei Einführen der Blutprobe, die TSH enthält, in die Meßlösung wird durch Vermittlung der Blutprobe das Konjugat und damit der Marker in unmittelbare Nähe zur Elektrodenoberfläche gebracht und damit das Signal für O₂⁻ stark erhöht. Die Erhöhung entspricht dem Gehalt an TSH in der untersuchten Probe.
Nach dieser Methode können alle Analyte, die einen Sandwich- Immunoassay zulassen, wie Proteinen, Zellbestandteile, Viren oder Bakterien bestimmt werden.
Beispiel 2
Detektion des Pestizides 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) mittels Verdrängungsassay.
Der vor der Sensoranordnung immobilisierte Antikörper gegen 2,4- D wird mit einem 2,4-D-Xanthinoxidase-Konjugat (oder einem entsprechenden O₂⁻- produzierenden Enzym, das mit 2,4-D gekoppelt wurde) beladen. In Abwesenheit von 2,4-D wird das an der Sensoranordnungs-Oberfläche produzierte O₂⁻ nachgewiesen. Bei Zugabe von 2,4-D wird das Konjugat entsprechend der Konzentration abgelöst (verdrängt) und das Signal fällt.
Nach dieser Methode können auch andere Haptene, kleine Moleküle, die nicht selbst immunogen wirken und in der Regel nicht von 2 Antikörpern gleichzeitig gebunden werden können, nachgewiesen werden. Die zusätzliche Zugabe eines Analyt-Enzym-Konjugates zur Meßlösung vor der Inkubation mit der Antikörper-beschichteten Elektrode führt in analoger Weise zum kompetitiven Assayformat. Der Vorteil des waschfreien Immunoassays bleibt ebenfalls erhalten, da zum Analyten nur ein Nachweisreagenz (Analyt- Xathinoxidase Konjugat) zugegeben werden muß.

Claims (8)

1. Sensoranordnung (SAO) mit amperometrischer oder potentiometrischer H₂O₂-anzeigender Elektrode zur Bestimmung von Superoxid O₂⁻-, gekennzeichnet durch
  • - ein O₂⁻-produzierendes Objekt oder eine O₂⁻-haltige Meßlösung in direktem Kontakt mit einer
  • - gaspermeablen Membran und
  • - einer mit einer superoxiddismutierenden Substanz beschichteten H₂O₂-anzeigenden Elektrode.
2. SAO nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, daß O₂⁻­ produzierende Objekte lebende Zellen und Biomakromoleküle sind.
3. SAO nach Anspruch 1 und 2 gekennzeichnet dadurch, daß es sich um Lymphozyten, Makrophagen, Leukozyten, Epithelzellen, das Enzym Xanthinoxidase, Lipoxigenase oder NADH-Oxidase oder mit Xanthinoxidase, Lipoxigenase oder NADH-Oxidase konjugierte Antikörper oder Antigene handelt.
4. SAO nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, daß als gaspermeable Membran eine Polypropylen- oder Polytetrafluorethylenmembran mit einer Dicke von 5 bis 40 µm eingesetzt wird.
5. SAO nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, daß die Elektrode aus Kohle oder Platin besteht.
6. SAO nach Anspruch 1 und 5 gekennzeichnet dadurch, daß die Kohle- oder Platinelektrode auf +100 bis +900 mV polarisiert ist.
7. SAO nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, daß die superoxiddismutierende Substanz Superoxiddismutase oder ein niedermolekularer superoxiddismutatisch aktiver Metallkomplex ist.
8. SAO nach Anspruch 1 und 7 gekennzeichnet dadurch, daß die Schichtdicke der immobilisierten superoxiddismutatisch aktiven Schicht 0,5-50 µm beträgt.
DE19944438087 1994-10-25 1994-10-25 Sensoranordnung mit amperometrischer oder potentiometrischer H¶2¶0¶2¶-anzeigender Elektrode zur Bestimmung von Superoxid 0¶2¶- Withdrawn DE4438087A1 (de)

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