DE69633512T2

DE69633512T2 - Mehrschichtige membranstruktur für polarographische messungen und verfahren zur herstellung solcher strukturen

Info

Publication number: DE69633512T2
Application number: DE69633512T
Authority: DE
Inventors: M. Jay JOHNSON
Original assignee: YSI Inc
Current assignee: YSI Inc
Priority date: 1995-08-01
Filing date: 1996-07-30
Publication date: 2005-10-13
Anticipated expiration: 2016-07-31
Also published as: EP0857107B1; WO1997004954A1; EP0857107A4; JPH11510599A; DE69633512D1; EP0857107A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine verbesserte Laminat-Membran-Struktur, die für die Verwendung in Kombination mit einer Enzym-Elektrode geeignet ist, und auf Verfahren zur Herstellung dieser Laminat-Struktur.
Hintergrund der Erfindung
Polarografische Zellsysteme haben eine breite Anerkennung gefunden, insbesondere auf dem medizinischen Gebiet für den Nachweis und die Konzentrationsbestimmung vieler erwünschter Analyten. In diesen Systemen werden üblicherweise Enzyme verwendet, insbesondere in den Situationen, in denen der Analyt selbst polarografisch nicht aktiv ist, jedoch ein gebildetes Reaktionsprodukt oder ein bei einer enzymatischen Reaktion mit dem Analyten verbrauchter Reaktant polarografisch aktiv ist.
So besteht beispielsweise bei medizinischen Anwendungen ein übliches Verfahren darin, im Blut eines Patienten die Glucose zu bestimmen. In der Regel werden dem Patienten Blutproben entnommen zur Durchführung einer Analyse zur Bestimmung der Glucose-Konzentration unter Verwendung einer Glucose-Oxidase-Elektrode mit einem polarografischen Detektor für den Nachweis von H₂O₂, das nach der folgenden Reaktion gebildet wird:
Das durch die Reaktion gebildete Wasserstoffperoxid ist durch einen polarografischer Detektor messbar und durch eine geeignete Eichung und Berechnung kann der Glucose-Gehalt in der Probe anhand des bei der Reaktion gebildeten H₂O₂ genau bestimmt werden.
Die für diese Messungen üblicherweise verwendeten polarografischen Zellsysteme umfassen eine ein Enzym enthaltende Laminatmembran, welche die Analyt-Probe von der Arbeitselektrode der Zelle trennt. Diese Membran-Typen sind in den US-Patenten 3 973 274 und 4 073 713 (beide Newman) beschrieben, auf deren Offenbarungsinhalt hier Bezug genommen wird. In diesen Membranen ist eine dünne innerste Membran, hier als Sperrschicht bezeichnet, die besteht aus Celluloseacetat, Siliconkautschuk oder Methylmethacrylat, benachbart zu der Arbeitselektrode der polarografischen Zelle angeordnet. Das Glucoseoxidase-Enzym ist zwischen dieser Sperrschicht und einer äußeren Polycarbonat-Trägerschicht angeordnet. Die äußere Trägerschicht hat in der Regel eine Dicke von etwa 5 μm und steht mit der den Analyten enthaltenden Probe in Kontakt.
Bei einer analytischen Glucose-Bestimmung durchdringen die Glucose und der Sauerstoff die äußere Trägerschicht und reagieren in Gegenwart des Enzyms. Das gebildete Wasserstoffperoxid durchdringt die innere Sperrschicht, an der es polarografisch nachgewiesen wird. Die Trägerschicht erlaubt den Durchgang von Glucose, Sauerstoff und anderen Molekülen, während sie den Durchgang von Substanzen mit einem hohen Molekulargewicht, wie z. B. von Proteinen, roten Blutkörperchen und anderen Makromolekülen, nicht erlaubt.
Die Sperrschicht erlaubt den Zutritt von Wasserstoffperoxid zu der Arbeitselektrode, während sie den Durchgang von Substanzen mit hohen Molekulargewichten in der Größenordnung von etwa 150 und mehr, wie z. B. Ascorbinsäure und Harnsäure, blockiert.
Es wurde festgestellt, dass es zur Erzielung einer genauen linearen Messung in Lösungen, die hohe Glucose-Konzentrationen enthalten, wie z. B. in Vollblut, Plasma oder Serum, wünschenswert ist, die Diffusion der Glucose zu der Enzymschicht, relativ zur Einwanderung von Sauerstoff in diese, zu hemmen. Wenn dies nicht geschieht, wird das Verhältnis von Glucose zu Sauerstoff, der mit dem Enzym in Kontakt kommt, ungünstig und macht den Sauerstoff-Gehalt anstelle der Glucose-Konzentration der Probe zu der die Geschwindigkeit begrenzenden Komponente der Reaktion. Dies führt seinerseits zu ungenauen Glucose-Konzentrations-Messungen mit dem Instrument. Eine Linearität liegt in solchen Situationen nur über den Bereich einer niedrigen Glucose-Konzentration vor. Dieses Problem ist nicht nur begrenzt auf die Glucose-Bestimmung, sondern ist auch festzustellen bei der Messung anderer Analyten, wie z. B. von Lactat.
Um dieses Problem zu beseitigen, ist es übliche Praxis, die Glucose- und Lactat-Konzentrationen der Probe so zu verdünnen, dass der gemessene Analyt-Konzentrationswert innerhalb des Konzentrationsbereiches, der eine Linearität aufweist, liegt. Es ist jedoch häufig zeitraubend und unpraktisch, die den Analyten enthaltende Probe zu verdünnen. Außerdem wird es allgemein üblich, die Bestimmung von Analyten, wie z. B. von Glucose und/oder Lactat, in einer einzigen analytischen Testvorrichtung durchzuführen, die auch andere (weitere) Messkanäle umfasst. Diese anderen Messkanäle erfordern nicht-verdünntes Vollblut oder Plasma als Analytproben-Zufuhr; deshalb ist es erforderlich, dass der Glucose- und/oder Lactat-Messkanal auch bei der Messung des Analyten in dem gleichen unverdünnten Vollblut- oder Plasma-Proben-Medium funktioniert.
Um eine genaue Messung von Glucose oder Lactat im Vollblut zu ermöglichen, wurde die mit der Probe in Kontakt kommende Membranschicht der Membranen vom Newman-Typ so modifiziert, dass die Diffusion des Analyten in die Enzymschicht begrenzt wird. So ist beispielsweise in der Japanischen Patentanmeldung Sho 59- 40182 beschrieben, dass die Porengröße der äußeren, mit der Probe in Kontakt kommenden Membran 200 Å oder weniger betragen sollte, wobei getestete 150 Å-Porengrößen eine verbesserte Glucose-Bestimmung in Vollblut-Proben ergeben. Später wurde in einer naheliegenden Abänderung der Lehren der Japanischen Patentanmeldung von Young et al. in dem US-Patent 4 759 828 darauf hingewiesen, dass die äußere, mit der Probe in Kontakt kommende Schicht Poren mit einer Größe in der Größenordnung von etwa 10 bis 125 Å-Einheiten im Durchmesser haben sollte. In diesem US-Patent wird ausdrücklich darauf hingewiesen, dass äußere Schichten mit einer Porengröße von 150 Å-Einheiten "die Diffusion von Glucose-Molekülen nicht ausreichend begrenzen, um Glucose-Messungen bei einem unverdünnten Serum durchführen zu können".
Zusätzlich zur Betonung der geringen Porengröße in den äußeren, mit der Lösung in Kontakt kommenden Schichten der Laminat-Membran haben Vadgama et al. die Bedeutung von Materialien mit geringer Porosität betont. Der Prozentsatz der Porosität ist definiere als das Produkt Porendichte × Porengröße × 100. Porositäten in dem Bereich von 0,001% oder 0,005% bis 0,5% und im Allgemeinen von weniger als 2% sind in der Europäischen Patentanmeldung 0 216 577 von Vadgama et al. beschrieben (vgl. auch das US-Patent 5 437 973 von Vagdama et al.).
Der Trend zur Verwendung von Trägerschichten mit einer geringen Porengröße ist jedoch nicht problemfrei. So werden beispielsweise während der Herstellung von Filmen mit kleinen Poren des Typs, wie er für die äußeren, mit der Lösung in Kontakt stehenden Schichten in ein Enzym enthaltenden Laminat-Membranen verwendet wird, die Poren häufig gebildet durch ein Bestrahlungsverfahren, bei dem Spaltprodukte aus einem Uranatom oder andere Formen von Bestrahlung den festen Filmvorläufer durchdringen unter Bildung der gewünschten Filmporendichte. Die Porengrößen werden in einer nachfolgenden Ätzstufe unter Verwendung einer starken Alkalilösung eingestellt. In den Endstufen dieses Verfahrens werden die Filme mit Tensiden mit einem hohem Molekulargewicht, wie z. B. Polyvinylpyrrolidon, gewaschen oder behandelt.
Es wurde eine geringe Gleichförmigkeit festgestellt, wenn diese Filme in Enzym enthaltende Laminat-Membranen eingearbeitet werden. Es wird angenommen, dass die großen sperrigen Tensid-Moleküle, die während der Filmherstellungsverfahren verwendet werden, die Neigung haben, einige der Poren zu blockieren oder zu verstopfen. Weil dies in unterschiedlichen Graden innerhalb der verhältnismäßig kleinen Einheitsfläche des Films auftreten kann, der schließlich in einer Enzym enthaltenden Laminat-Membran verwendet wird, können verhältnismäßig große Ungleichmäßigkeiten von Membran zu Membran festgestellt werden. Geringe Porengrößen erschweren im Allgemeinen auch die Erzielung einer Membrangleichförmigkeit während der Membran-Herstellung.
Wenn Träger-Membranen mit kleinen Poren verwendet werden, besteht außerdem die Gefahr einer Verstopfung oder Blockierung während der Verwendung in dem analytischen Verfahren.
Es gibt daher im Stand der Technik einen Bedarf für die Bereitstellung einer ein Enzym enthaltenden Laminat-Membran-Anordnung, mit der Glucose und/oder Lactat in unverdünntem Vollblut, in Plasma oder Serum bestimmt werden kann (können), bei der die oben genannten Probleme nicht auftreten.
Diese und andere Ziele werden erreicht mit den Laminat-Membranen, die in der vorliegenden Anmeldung beschrieben und im Patentanspruch 1 beansprucht werden. Im Prinzip stellt die vorliegende Erfindung eine Verbesserung gegenüber den in den oben genannten Newman-Patenten beschriebenen Membranen dar. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in dem Aufbau der äußeren Schicht oder der Trägerschicht, wie sie gelegentlich auch bezeichnet wird, der Laminat-Membran.
Im Gegensatz zu den Lehren des Standes der Technik wurde gefunden, dass die äußere Schicht der Laminat-Membran mit supergroßen Poren ausgestattet sein sollte. Diese großen Poren sind schwer zu blockieren oder zu verstopfen, wenn der Film mit großen Tensid-Molekülen gewaschen oder behandelt wird, oder während der Verwendung in einem analytischen Instrument. Gleichzeitig haben diese äußeren Schichten die Funktion, die Glucose- oder Lactat-Diffusion zu der Enzym-Schicht zu verhindern, sodass eine Messung in unverdünnten Vollblut- oder Plasma-Proben durchgeführt werden kann.
Die äußere semipermeable Membran weist Porengrößen von mehr als 27 nm (270 Å-Einheiten), vorzugsweise von mehr als 30 nm (300 Å-Einheiten) im Durchmesser auf. Die Porendichte beträgt vorzugsweise weniger als 6 × 10⁸ Poren/cm². Vorzugsweise liegt die Porosität der äußeren semipermeablen Membran innerhalb des Bereiches von 0,001 bis 0,2%.
Es wurde gefunden, dass eine Enzymschicht, die selbst eine hohe Dichte aufweist, ebenfalls zu einem verbesserten dynamischen Bereich oder einer verbesserten Linearität führt. So wurde beispielsweise gefunden, dass die Konzentration des Puffers in der Pufferlösung, die während des Immobilisierungsverfahrens mit dem Enzym gemischt wird, so eingestellt werden sollte, dass sie innerhalb des Bereiches von 1 × 10^–6 bis 0,1 M, vorzugsweise innerhalb des Bereiches von 1 × 10^–6 bis 0,05 M und am meisten bevorzugt innerhalb des Bereiches von 0,001 bis 0,005 M biegt. Überraschenderweise wurde gefunden, dass dann, wenn die Puffer-Konzentration abnimmt, die Linearität des Ansprechverhaltens von Sensoren, in denen diese verbesserten Membranen verwendet werden, verbessert wird.
Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher beschrieben, wobei zeigen:
1 eine vergrößerte schematische Ansicht eines Querschnitts einer ein Enzym enthaltenden erfindungsgemäßen Laminat-Membran;
2 ein Diagramm, in dem der in einem polarografischen analytischen Instrument YSI, Modell 2700, erhaltene Plateau-Strom gegen die Molarität der Pufferlösung aufgetragen ist, die während der Immobilisierung des Enzyms vorliegt, das in der Enzymschicht eines ersten Laminat-Membran-Aufbaus vorliegt, der in Verbindung mit dem Test einer 40 g/l Glucose-Probe verwendet wird;
3 ein Diagramm, in dem der in dem YSI-Modell 2700-Instrument erhaltene Plateau-Strom aufgetragen ist gegen die Molarität der Pufferlösung, die bei der Herstellung der Enzymschicht des ersten Laminat-Membran-Aufbaus verwendet wird, der in Kombination mit dem Test einer 3 mg%igen Lösung von H₂O₂ eingesetzt wird;
4 ein Diagramm, in dem die Glucose-Konzentration, bestimmt unter Verwendung des YSI-Modell 2700-Instruments, gegen die Molarität der Pufferlösung aufgetragen ist, die bei der Herstellung der Enzymschicht des ersten Laminat-Membran-Aufbaus verwendet wird;
5 ein Diagramm, in dem der Plateau-Strom und die Molarität der Pufferlösung ähnlich wie in 2 gegeneinander aufgetragen sind, das diesmal jedoch die Daten zeigt, die mit einem zweiten Laminat-Membran-Aufbau erhalten wurden;
6 ein Diagramm, in dem der Plateau-Strom gegen die Molarität der Pufferlösung aufgetragen ist, ähnlich der 3, das diesmal jedoch die Daten zeigt, die mit dem zweiten Laminat-Membran-Aufbau erhalten wurden;
7 ein Diagramm, in dem die Glucose-Konzentrationen gegen die Molarität der Pufferlösung aufgetragen sind, ähnlich wie in 4, das diesmal jedoch die Daten zeigt, die mit dem zweiten Laminat-Membran-Aufbau erhalten wurden;
8 ein Diagramm ähnlich der 5, das jedoch die Daten zeigt, die bei Verwendung einer zweiten Pufferlösung und bei Verwendung eines dritten Laminat-Membran-Aufbaus erhalten wurden;
9 ein Diagramm ähnlich der 6, das jedoch die Daten zeigt, die bei Verwendung einer zweiten Pufferlösung und eines dritten Laminat-Membran-Aufbaus erhalten wurden;
10 ein Diagramm ähnlich der 7, das jedoch die Daten zeigt, die bei Verwendung einer zweiten Pufferlösung und eines dritten Laminat-Membran-Aufbaus erhalten wurden;
11 ein Diagramm, in dem die mit dem YSI Modell 2700-Analysator für variierende Menge an Ferrocyanid- und H₂O₂-Proben erhaltenen Ströme aufgetragen sind, wobei die Proben getestet wurden unter Verwendung einer speziell aufgebauten, ein Enzym enthaltenden Laminat-Membran, um die Bedeutung der Bereitstellung einer Enzymschicht mit hoher Dichte zu zeigen; und
12 ein Diagramm, das die tatsächlichen Ergebnisse zeigt, die erhalten wurden im Vergleich zu den erwarteten Ergebnissen bei Verwendung des Modell 2700-Analysators, wobei kein Puffersalz in der Enzymschicht während ihrer Herstellung vorhanden war, jedoch steigende Mengen an Rinderserumalbumin (BSA) darin enthalten waren.
Detaillierte Beschreibung
In der 1 ist ein vergrößerter Querschnitt einer ein Enzym enthaltenden Laminat-Membran 28 dargestellt. Die Membran 28 ist geeignet für die Verwendung in Kombination mit einer handelsüblichen analytischen Apparatur, mit der beispielsweise die Glucose- oder Lactat-Konzentration in unverdünnten Vollblut-, Plasma- oder Serum-Lösungen bestimmt werden kann.
Die Sperrschicht 32 umfasst eine homogene Celluloseacetat/Celluloseacetatbutyrat-Polymermischung und hat eine Dicke von 2 μm oder weniger, vorzugsweise von 1 bis 2 μm. Zwischen der Sperrschicht 32 und der Trägerschicht 30 ist ein Enzym 34 angeordnet. Das Enzym 34 wird in der Regel zwischen den Schichten 32 und 30 durch Verwendung von Glutaraldehyd in situ vernetzt, obgleich auch irgendein anderer einer Reihe von Klebstoffen und Vernetzungs-Promotoren verwendet werden kann.
Es sei außerdem darauf hingewiesen, dass das Enzym auch selbst als Klebstoff verwendet werden kann, ohne dass ein zusätzlicher Klebstoff oder ein Vernetzungsmittel zugegeben wird.
Die äußere Schicht oder Trägerschicht 30 kann aus einem Polycarbonat-Polymer bestehen. Es sei jedoch darauf hingewiesen, dass die Art des Polymers nicht kritisch ist. Beispielsweise kann die Schicht 30 auch Polyurethan, regenerierte Cellulose umfassen oder einen anderen Polymer-Aufbau haben. In der Regel hat die Schicht 30 eine Dicke von etwa 5 bis etwa 10 μm.
Wie dargestellt, umfasst die Trägerschicht 30 eine einzige Schicht. Es ist aber auch möglich, dass die Trägerschicht 30 einen Mehrschichtenaufbau hat, wobei beispielsweise Rinderserumalbumin oder ein anderer geeigneter Klebstoff zwischen den Schichten angeordnet sein kann unter Ausbildung einer Verbundstruktur. Bei dieser Ausführungsform können die Porengrößen und die Dicken der einzelnen Schichten beispielsweise so kontrolliert werden, dass die Wanderung einer gegebenen chemischen Species zu dem Enzym 34 eingeschränkt oder gefördert wird.
Es sei darauf hingewiesen, dass die Trägerschicht 30 benachbart zu der Analyt-Probe angeordnet ist und dass die Sperrschicht 32 daher benachbart zu einer Sensorelektrode 36 (in der Regel aus Platin) in einer Elektrolyt-Lösung angeordnet ist. In dem Elektrolyten ist außerdem eine Referenz-Elektrode 38 angeordnet. Es wird daher eine polarografische Zelle verwendet, in der die Elektroden und der Elektrolyt durch die Laminat-Membran von der Analyt-Lösung getrennt sind.
In der Offenbarung der vorliegenden Erfindung wird das Enzym 34 durchgehend als Glucoseoxidase-Enzym bezeichnet. Der Fachmann weiß aber natürlich, dass das Enzym in Abhängigkeit von dem jeweils gewünschten Analyten und der ausgewählten Reaktion variieren kann. So wird beispielsweise in analytischen Situationen, bei denen es erwünscht ist, die Lactat-Gehalte in Blutproben zu überwachen, Lactatoxidase als Enzym 34 verwendet. Weitere Kandidaten-Analyte und ihre entsprechenden Oxidoreduktase-Enzyme sind nachstehend beispielhaft angegeben:

Analyt Oxidoreduktase-Enzym

Lactose Galactoseoxidase

Saccharose (Invertase (Mutarotase (Glucoseoxidase

Alkohol Alkoholoxidase

Galactose Galactoseoxidase
Die Membran 32 besteht vorzugsweise aus einer Mischung von Cetluloseacetat/Celluloseacetatbutyrat-Celluloseestern. Das Gewichtsverhältnis zwischen Celluloseacetat und Celluloseacetatbutyrat, das zur Bildung der Sperrschicht 32 angewendet wird, variiert über einen breiten Bereich von (1,5 bis 20) : 1. Auf der Basis der erfindungsgemäßen Angaben ist es bevorzugt, eine Mischung von Celluloseacetat/Celluloseacetatbutyrat im Gewichtsverhältnis 4 : 1 zu verwenden, um den Film zu gießen, der für die Bildung der Sperrschicht 32 der Membran 28 verwendet wird.
Das erforderliche Verhältnis von Celluloseacetat zu Celluloseacetatbutyrat wird in einem Zwei-Lösungsmittel-System gelöst. Das erste Lösungsmittel ist ein leicht flüchtiges organisches Lösungsmittel, das einen niedrigen Siedepunkt aufweist. Derzeit können Nitromethan, Dimethylformamid und Cylcohexanon als beispielhafte Vertreter dieser Klasse von leicht flüchtigen organischen Lösungsmitteln genannt werden, wobei all diese unter Atmosphärenbedingungen Siedepunkte von weniger als 200°C aufweisen. Derzeit ist es bevorzugt, Nitromethan als leicht flüchtiges organisches Lösungsmittel zu verwenden.
Zusätzlich zur Verwendung des flüchtigen Lösungsmittels wird ein organischer flüssiger Weichmacher als zweite Komponente der Gießlösung verwendet. Die CA/CAB-Mischung ist auch in dem Weichmacher löslich. Dieser Weichmacher ist dadurch charakterisiert, dass er einen Siedepunkt von höher als etwa 200°C aufweist und in der Lage sein muss, das CA und das CAB miteinander verträglich zu machen (d. h. zur Bildung eines homogenen CA/CAB-Films zu führen). Zu beispielhaften organischen flüssigen Weichmachern gehören die Phthalate, Phosphate, Lactone und Ester von aliphatischen dibasischen Säuren, Kampfer und dgl. Besonders bevorzugt sind die Lactone, beispielsweise γ-Butyrolacton und Valerolacton. γ-Butyrolacton ist derzeit ganz besonders bevorzugt.
Eine der überraschenden Eigenschaften des Butyrolactons und Valerolactons besteht darin, dass sie hohe Siedepunkte für derart kleine Moleküle aufweisen.
Es wird angenommen, dass das leicht flüchtige Lösungsmittel die Gießlösung schnell verlässt, während der Weichmacher die Lösung viel langsamer verlässt und schließlich die Poren in der Schicht definiert, wenn er aus dieser austritt. Es ist bevorzugt, dass der Weichmacher einen Siedepunkt hat, der um etwa 45°C (80°F) höher ist als der Siedepunkt des flüchtigen organischen Lösungsmittels. Da das leicht flüchtige organische Lösungsmittel die Lösung zuerst verlässt, nimmt die Viskosität des Films schnell genug zu, sodass er nicht mehr merklich fließt oder durchhängt, nachdem er gegossen worden ist. Der Weichmacher gewährleistet, dass der gegossene Film seine Struktur-Integrität beibehält, wobei die Poren in dem Film dann gebildet werden, wenn das Weichmacher-Lösungsmittel verdampft.
Das erste Lösungsmittel und das zweite Lösungsmittel können in einem breiten Bereich der Zugabe zu den Celluloseestern verwendet werden. Das Volumenverhältnis von flüchtigem organischem Lösungsmittel zu Weichmacher kann beispielsweise von (0,5 bis 1,5) : 1 variieren, wobei ein Lösungsmittel : Weichmacher-Verhältnis von etwa 1 : 1 derzeit bevorzugt ist.
Das flüchtige organische Lösungsmittel und der Weichmacher müssen im Wesentlichen frei von Verunreinigungen mit hohem Molekulargewicht sein, weil diese Verunreinigungen konzentriert würden, wenn der Film trocknet, und einen übermäßig großen Einfluss auf den Film ausüben würden aufgrund ihres Prozentsatzes in dem Ausgangs-Lösungsmittel.
Die Gestalt des Weichmacher-Moleküls kann ebenfalls einen Einfluss auf die Porengeometrie der Sperrschicht haben. Nach dem derzeitigen Wissensstand bewegen sich lineare Moleküle durch "Schlängeln" (d. h. in einer schlangenartigen Bewegung), sodass der Weichmacher durch eine sehr unregelmäßige und gewundene Pore entweichen kann. Andererseits hat ein im Wesentlichen kugelförmiges Molekül wie γ-Butyrolacton einen definierten Durchmesser und führt zu einer Pore, die mindestens so groß wie der Durchmesser ist, um entweichen zu können. Dies lässt darauf schließen, dass mehr kugelförmige Weichmacher-Moleküle eine besser definierte Pore bilden, wenn sie aus dem Film austreten.
Zusätzlich zu dem Lösungsmittel und dem Weichmacher, wie sie vorstehend beschrieben worden sind, kann erforderlichenfalls auch ein Verdünnen oder Verdünnungsmittel zugegeben werden, um die Viskosität der Gießlösung genau steuern zu können. Als geeignete Beispiele können genannt werden Isopropanol, Methylethylketon und Ethylacetat. Das Verdünnungsmittel kann in einer Gewichtsmenge von etwa (0,5 bis 1,5) : 1, bezogen auf das Gewicht des zugegebenen Weichmachers, zugesetzt werden. Derzeit ist es bevorzugt, Isopropanol als Verdünnungsmittel zu verwenden, das in einen Menge von 0,88 Gew.-Teilen Isopropanol pro Gew.-Teil Weichmachers vorliegt.
Die Celluloseester werden dem leicht flüchtigen organischen Lösungsmittel und dem Weichmachers in einer ausreichenden Menge zugesetzt, um 10 bis 40 gew.-%ige Lösungen von (Celluloseestern) : (Gesamtgewicht von Celluloseestern + Lösungsmittel + Weichmacher) zu ergeben.
Das Celluloseacetatbutyrat (CAB), das verwendet wird, umfasst eine Mischung von Celluloseessigsäureestern und -buttersäureestern. Handelsübliche CABs sind abgestuft entsprechend ihrem Butyryl-Gehalt von 17, 27, 38 und 50%. Besonders bevorzugt ist derzeit ein CAB-Produkt, das 28 bis 31% Acetylgruppen und etwa 16 Butyrylgruppen aufweist. Dieses Produkt ist erhältlich von der Firma Eastman Kodak.
Was den Aufbau der Trägerschicht gemäß der vorliegenden Erfindung angeht, so ist die Trägerschicht 30 vorzugsweise mit großen Poren in der Größenordnung von mindestens 300 Å-Einheiten im Durchmesser ausgestattet. Die Schicht 30 hat vorzugsweise eine Porendichte von weniger als 6 × 10⁸ Poren/cm² und eine Porosität (Porengröße × Porendichte × 100) zwischen 0,001 und 0,200%. Semipermeable Filme, die diese Eigenschaften aufweisen, sind von der Firma Poretics, Inc., Livermore, Californien, erhältlich.
Am meisten bevorzugt umfasst die Schicht 30 Poren in der Größenordnung von 31 bis 75 nm (310–750 Å-Einheiten) im Durchmesser und einen Prozentsatz der Porosität von 1 × 10^–1 bis 5 × 10^–3. Besonders bevorzugt ist eine Polycarbonatschicht mit einer Porengröße von etwa 310 Å-Einheiten und mit einer Porendichte von 1 × 10⁸ Poren/cm² und einem resultierenden Prozentsatz der Porosität von 7,53 × 10^–2.
Zu Beispielen für andere beispielhafte semipermeable Filme, die als Schicht 30 verwendbar sind, gehören die folgenden:
Wie vorstehend erläutert, wird das Enzym 34 in der Regel zwischen der Sperrschicht 32 und der Trägerschicht 30 immobilisiert durch Verwendung von Glutaraldehyd oder eines ähnlichen Klebstoffes und/oder Vernetzungsmittels. Eine Lösung, die etwa 1 bis 15 Gew.-% Glutaraldehyd enthält, wird mit dem Enzym 34 gemischt. In der Regel wird eine Pufferlösung dem Glutaraldehyd-Enzym zugemischt, um eine vorteilhafte pH-Umgebung von 4 bis 9 aufrechtzuerhalten, sodass die Reaktion, die in der Enzymschicht abläuft, unter verhältnismäßig konstanten günstigen Bedingungen abläuft. Insgesamt beträgt die Dicke dieser Schicht oder dieser Enzym enthaltenden Matrix 0,1 bis 0,2 μm.
Bei der Herstellung der Laminat-Membranen ist die Enzym enthaltende Mischung, die den Puffer enthält, zwischen der Trägerschicht und der Sperrschicht angeordnet. Man kann eine leichte Druckkraft darauf einwirken lassen, um eine Struktur vom Sandwichtyp zu erhalten. Die Laminat-Struktur lässt man dann bei Umgebungsbedingungen und/oder in einem Ofen trocknen. Bevorzugte Bedingungen erfordern eine Lufttrocknung von etwa einer halben Stunde, woran sich eine Ofentrocknung für etwa 30 min bei etwa 45°C anschließt.
O-Ringe oder dgl. können dann auf die äußere Oberfläche der Laminat-Membran aufgeklebt werden, um die Verwendung der Membran in dem gewünschten analytischen Instrument, beispielsweise einem YSI Modell 2700-Analysator zu erleichtern. Diese Membranen werden vorzugsweise vor der Verwendung gekühlt.
Völlig überraschend wurde gefunden, dass verminderte Mengen an Puffer in der Pufferlösung, die dem Enzym zugemischt wird, tatsächlich die Linearität des Ansprechverhaltens des Sensors erhöhen. Ohne dass der Anmelder an irgendeine spezielle Arbeitstheorie gebunden ist, wird angenommen, dass die verminderte Menge an Puffer in der immobilisierten Enzym-Matrix tatsächlich dazu dient, die Dichte der ein Enzym enthaltenden Matrix zu erhöhen, wodurch das Fließen von Glucose oder eines anderen Analyten zu der und durch die Enzymschicht hindurch gehemmt wird.
Der Puffer liegt in der Immobilisierungslösung vorzugsweise in einer Menge zwischen etwa 0,001 und 0,1 mol vor. Besonders bevorzugt liegt er in einer Menge von etwa 0,001 bis 0,050 mol vor. Am meisten bevorzugt liegt die Puffer-Konzentration in dem Bereich zwischen etwa 0,001 und 0,005 mol. Auf der Basis der derzeit verfügbaren Daten sollte die Puffer-Konzentration insbesondere etwa 0,001 M betragen.
Bei der kommerziellen Praxis des Standes der Technik war es bisher üblich, Puffersalz-Konzentrationen in der Enzym-Immobilisierungs-Matrix von etwa 0,029 bis 0,043 mol zu verwenden. Die so hergestellten Enzymschichten wurden jedoch in Kombination mit verdünnten Glucoseprobe-Analysen verwendet, bei denen die äußere Polycarbonat-Trägerschicht der Laminat-Anordnung in der Regel Porengrößen in der Größenordnung von etwa 300 Å aufwies bei einer Porendichte von 6 × 10⁸ Poren/cm². Aufgrund dieser kommerziellen Praxis des Standes der Technik war es nicht zu erwarten, dass die Absenkung der Puffer-Konzentration, um im Effekt die Dichte der Enzymschicht zu erhöhen, zu einer erhöhten Linearität bei der Durchfüh rung der Messungen von unverdünntem Blut oder Plasma führen würde; insbesondere in Kombination mit der gleichzeitigen Verwendung von Porengrößen der Trägerschicht in der Größenordnung von etwa 300 Å und größer und Porendichten von weniger als 6 × 10⁸ Poren/cm².
Was die speziellen Puffer-Lösungen angeht, die verwendet werden können, so sind diese nicht kritisch. Der Puffer sollte jedoch in der Lage sein, den pH-Wert der das Enzym enthaltenden Schicht innerhalb des Bereiches von etwa 4 bis 9 zu halten. Beispielhafte Puffer-Zusammensetzungen sind solche, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, und sie umfassen:
Essigsäure – Natriumacetat
Ammoniumhydroxid – Ammoniumchlorid
Puffer auf Phosphatbasis
Puffer auf Carbonatbasis
Puffer auf Citratbasis
Puffer auf Succinatbasis
Puffer auf Glycinbasis
Puffer auf Maleatbasis
und allgemein alle biochemischen Puffer, die auf den Seiten 79 bis 82 von "Concise Encyclopedia Biochemistry", zweite Auflage, Walter de Gruyter, 1988, aufgezählt sind.
Der Puffer, der in den in den nachstehend beschrieben Beispielen 1 und 2 durchgeführten Untersuchungen verwendet worden ist, ist ein Trinatriumcitrat/Bernsteinsäure-Puffer, in dem die Citrat-Verbindung in einem Gewichtsverhältnis von etwa 8 : 1, bezogen auf das Gewicht der Bernsteinsäure, vorliegt. Diese Verbindungen werden mit etwa 0,25 Gew.-Teilen, bezogen auf die Bernsteinsäure, eines Kaliumsalzes von EDTA gemischt. Dieser spezielle Puffer weist einen brauchbaren pH-Bereich von nicht mehr als 4,0 bis 6,0 auf.
Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, auf welche die Erfindung jedoch in keiner Weise eingeschränkt ist, näher beschrieben. Die nachstehend beschriebenen Beispiele dienen lediglich der Erläuterung der Arbeitsprinzipien der Erfindung.
Beispiel 1
Um die Effekte einer Änderung der Konzentration des Puffers (pH 5,4–5,6 Natriumcitrat/Bernsteinsäure), der in der Enzym-Immobilisierungs-Matrix einer Glucoseoxidase enthaltenden Laminat-Membran vom Newman-Typ verwendet wurde, zu bewerten, wurden die folgenden Verfahrensmaßnahmen durchgeführt.
1. Materialien
Glucoseoxidase-Membranen wurden hergestellt unter Verwendung einer Celluloseacetat/Celluloseacetatbutyrat-Membran (Dicke 1 bis 2 μm), die unter Verwendung von YSI als innerer Schicht und einer 10 μm dicken äußeren Polycarbonat-Membran mit einer durchschnittlichen Porengröße im Durchmesser von 310 Å und einer Porendichte von 1 × 10⁸ Poren/cm² hergestellt wurden.
2. Membranaufbau

a) 10 mg Glucoseoxidase (BMC-Katalog-Nr. #105 107) wurden in 100 μL DI H₂O gelöst und 10 min lang gerührt bis die Auflösung beendet war.
b) 150 μL einer 2,5%igen Glutaraldehyd-Lösung, die den oben genannten Citrat/Succinat-Puffer enthielt, wurden zu der Enzym/H₂O-Lösung zugegeben und dann wurde die kombinierte Lösung 60 min bei Raumtemperatur gerührt.
c) Ein kleiner Tropfen der resultierenden Lösung (d. h. der Lösung, die in der Stufe (b) erhalten wurde) wurde dann auf die Oberfläche der Celluloseacetat-Membran aufgebracht.
d) Dann wurde ein Stück der Polycarbonat-Membran sofort auf die Oberseite dieser Lösung aufgelegt und die Lösung wurde sich zwischen den beiden Schichten verteilen/ausbreiten gelassen.
e) Dann wurde ein leichter Druck auf einen großen Gummistopfen einwirken gelassen, der über die Oberfläche des Laminats gerollt wurde, und es wurde ein absorptionsfähiges Gewebe verwendet, um die überschüssige Lösung zu absorbieren.
f) Dann wurde die Membran 30 min lang an der Luft bei Raumtemperatur getrocknet und danach 30 min lang bei 45°C im Ofen getrocknet.
g) Dann wurden Silicon-Kautschuk-O-Ringe auf die äußere Oberfläche der Laminat-Membran aufgeklebt, um die Verwendung der Membran in dem analytischen Testinstrument zu erleichtern.

Das obige Verfahren wurde mehrmals wiederholt, wobei nur die Konzentration des der 2,5%igen Glutaraldehyd-Lösung zugesetzten Citrat/Succinat-Puffers geändert wurde. Alle Membranen wurden bis zu ihrer Bewertung in einem Kühlschrank aufbewahrt.
3. Membran-Bewertungsverfahren
Die Membranen wurden bewertet in einem YSI Modell 2700 Select-Doppelkanal-Analysator unter Verwendung eines YSI 2357 Phosphat-Puffers (pH 7,2) als innerem Puffer. Es wurden acht Membranen jedes Typs bewertet, eine auf jeder von acht verschiedenen Wasserstoffperoxid-Elektroden. Nachdem die Membranen in das Instrument eingebaut worden waren und der angegebene Hintergrund-Strom auf unter 6 nAs gefallen war, wurde eine Eichung durchgeführt unter Verwendung einer bekannten 40 g/l Glucose-Lösung. (Die tatsächliche Glucose-Konzentration in der 2700-Probenkammer betrug 2 g/l oder 200 mg% aufgrund des Umstandes, dass je de Probe automatisch in einem Verdünnungs-Verhältnis von 20 : 1 verdünnt wurde, wenn sie in den Probenkanal des 2700-Instruments injiziert wurde).
Dann wurde eine Reihe von Glucose-Lösungen, die einen breiten Konzentrationsbereich abdeckten, in dreifacher Ausfertigung untersucht. Eine 3 mg%-Wasserstoffperoxid-Lösung (ohne Glucose) wurde ebenfalls als eine Probe untersucht. Die Plateau-Ströme (bei einer Ablesezeit von 30 s) der Glucose-Ablesungen und die Steigungen bzw. Anstiege der Response- bzw. Antwort-Kurven wurden tabellarisch dargestellt (die Steigung der Response-Kurve ist ein Maß für die Ansprech-Geschwindigkeit und sie wird bestimmt durch Verwendung von 10 Ablesungen zwischen 20 und 30 s nach der Probeninjektion und Berechnung der durchschnittlichen Änderung des Stromes pro min).
Für jeden Membran-Typ wurden der durchschnittliche Plateau-Strom, die durchschnittliche Steigung (Anstieg) und die durchschnittliche Glucose-Ablesung, die für jede Lösung erhalten wurden, errechnet.
4. Ergebnisse
Die als Ergebnis der Untersuchung erhaltenen Daten sind in den folgenden Tabellen 1 bis 3 angegeben.
Tabelle 1
Tabelle 2
Tabelle 3
In den Daten können einige signifikante Trends festgestellt werden. Erstens hat der für jede gegebene Glucose-Lösung erhaltene durchschnittliche Plateau-Strom die Neigung, mit steigender Konzentration des Citrat/Succinat-Puffers in der Glucose-Immobilisierungs-Matrix anzusteigen. Dies ist insbesondere dargestellt in der 2 für die Response bzw. Ansprechempfindlichkeit gegenüber der 40 g/l-Eichsubstanz. Die 3 zeigt, dass genau der gleiche Ansprechempfindlichkeitstrend zu beobachten ist für die 3 mg% Wasserstoffperoxid-Lösung, wenn die Konzentration des Citrat/Succinat-Puffers ansteigt. Am bedeutsamsten ist, dass der lineare Bereich der Membran zunimmt, wenn die Puffer-Konzentration abnimmt. Dies wird in der 4 erläutert, die das durchschnittliche Ergebnis zeigt, das erhalten wurde für jeden der hergestellten Membran-Typen bei hohen Glucose-Konzentrationen.
Beispiel 2
Die in dem obigen Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, dass ein anderer Trägerschicht-Aufbau für die Laminat-Membran verwendet wurde. In diesem Beispiel bestand die Trägerschicht 30 aus einer Polycarbonatschicht mit einer durchschnittlichen Porengröße von 686 Å-Einheiten und einer Porendichte von 6 × 10⁶ Poren/cm². Die 5, 6 und 7 zeigen jeweils die Glucose-Response bzw. -Ansprechempfindlichkeit, die Wasserstoffperoxid-Response bzw. -Ansprechempfindlichkeit und den errechneten Glucosemesswert.
Die Ergebnisse sind vergleichbar mit denjenigen, die in den 2, 3 und 4 angegeben sind und stützen die Schlussfolgerung, dass ein Puffersalz-Effekt bei größeren Porengrößen und niedrigeren Porendichten vorliegt.
Beispiel 3
Die in dem obigen Beispiel 1 angegebenen Verfahren wurden wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, dass eine andere Pufferlösung und ein anderer Aufbau der Trägerschicht 30 wie nachstehend angegeben verwendet wurden: Puffer-Lösung

NaH₂PO₄) vorliegend in einem Gewichtsverhältnis von monobasischem

Na₂H PO₄) Phosphat zu dibassischem Phosphat von etwa 0,54 : 1

pH-Wert etwa 7,0
Aufbau der Trägerschicht 30

Polycarbonat
Porendurchmesser 343 Å-Einheiten
Porendichte 1 × 10⁸

Die als Ergebnis der Verfahren des Beispiels 3 erhaltenen Daten sind in den 8 bis 10 dargestellt. Diese Daten stimmen vollständig überein mit denjenigen, die für die Beispiele 1 und 2 angegeben sind und sie zeigen erneut, dass ungeachtet des verwendeten Puffer-Typs und des angewendeten pH-Wertes der lineare Bereich der Membranen zunimmt, wenn die Puffer-Konzentration der während der Enzym-Immobilisierungsstufe verwendeten Puffer-Lösung abnimmt.
Es sei darauf hingewiesen, dass die Molarität der oben angegebenen Puffer-Lösungen bezogen ist auf die Konzentration des Puffers in der Lösung, wenn er mit dem Enzym während der Enzym-Immobilisierungsphase gemischt wird vor dem Trocknen der Membran. Nach dem Trocknen beträgt jedoch die Konzentration des Puffers, der in der Enzym-Schicht verbleibt, im Allgemeinen etwa 1 × 10^–4 bis 1 × 10^–8 mol/cm² Enzymschicht.
Ohne dass der Anmelder an irgendeine spezielle Arbeitstheorie gebunden ist, wird angenommen, dass die Kombination von verbessertem dynamischem Bereich und verminderter Empfindlichkeit, die festzustellen ist, wenn die Puffersalz-Konzentration abnimmt, nur zurückgeführt werden kann auf eine Zunahme der Dichte der Enzymschicht. Tatsächlich gibt es Literatur, in der angegeben ist, dass die Permeabilität der immobilisierten Enzymschicht wichtig sein kann bei der Bestimmung der Response- bzw. Ansprechempfindfichkeits-Charakteristiken einer Enzym-Elektrode (A. Neikov und S. Sokolov, "Analytica Chimica ACTA", 307 (1995) Seiten 27–36, und M. Mutlu und S. Mutlu, "Biotechnology Techniques", 9, Nr. 4 (1995), Seiten 277–282). Niemand hat jedoch bisher jemals gezeigt, dass die Dichte der Enzymschicht in einem Drei-Schichten-Laminat des Newman-Typs bis zu einem Punkt erhöht werden könnte, bei dem der dynamische Bereich erhalten werden kann, der für eine klinische Glucose-Messung mit unverdünntem Vollblut erforderlich ist.
Es sei betont, dass die in den 2 bis 10 dargestellten Ergebnisse unter Umständen erhalten wurden, bei denen die wässrige Glucose-Probe im Verhältnis 1 : 20 in einem voroxygenierten und gepufferten Verdünnungsmittel verdünnt wurden. Die in den 2, 4, 5, 7, 8 und 10 angegebenen Glucose-Konzentrationen sollten daher durch 20 dividiert werden, um repräsentativ zu sein für die tatsächlichen Glucose-Konzentrationen, die vom Sensor festgestellt werden. Wenn nun das obere Ende des klinisch relevanten Glucose-Konzentrationsbereiches 900 mg% oder 9 g/l (unverdünnt) ist, würde diese Konzentration in den 4, 7 und 10 durch den 180 g/l (20 × 9 g/l)-Datenpunkt repräsentiert. Obgleich die Daten erkennen lassen, dass die Genauigkeit bei 180 g/l nicht stark beeinflusst wird durch die Herstellung von Membranen unter Verwendung von Puffersalz-Konzentrationen bei oder unter 0,1 mol, wurden diese Ergebnisse bei höheren Sauerstoff-Konzentrationen erhalten als sie üblicherweise im Vollblut zu finden sind. Da gezeigt wurde, dass die Linearität von Sensoren dieses Typs im Allgemeinen begrenzt ist durch die Sauerstoff-Konzentration, wird angenommen, dass die für jeden gegebenen Membran-Typ beobachtete Nicht-Linearität bei niedrigen Sauerstoff-Konzentrationen schlechter wäre.
Beispiel 4
Um nachzuweisen, dass der beobachtete vergrößerte dynamische Bereich ein Ergebnis des Anstiegs der Dichte der Enzymschicht ist, wurde eine spezielle Glucoseoxidase-Enzym-Membran hergestellt, deren Gesamtporosität stärker von der Porosität der Enzymschicht abhing als bei dem Standard-Drei-Schichten-Laminat vom Newman-Typ (vgl. oben, Beispiel 1). Dies wurde durchgeführt durch Ersatz sowohl der äußeren Polycarbonat-Membran (1 × 10⁸ Poren/cm², Porendurchmesser 310 Å) als auch der inneren Celluloseacetat-Schicht durch eine sehr poröse Polycarbonat-Membran (6 × 10⁸ Poren/cm², Porendurchmesser 500 Å). Membranen dieses Aufbaus wurden auch in anderen Untersuchungen der Enzymschicht-Dichte verwendet (M. Mutlu und S. Mutlu, "Biotechnology Techniques", 9, Nr. 4 (1995), Seiten 277–282).
Alle anderen Aufbaumaterialien (einschließlich der "salzfreien" Glucoseoxidase, BMC Katalog Nr. 105 147) und angewendeten Verfahren waren genau die gleichen wie diejenigen, die für die Standard-Laminat-Membran verwendet bzw. angewendet wurden. Dieser Aufbau erlaubt die Bestimmung der Permeabilität der Enzymschicht durch Verwendung eines größeren elektroaktiven Moleküls als es ansonsten ver wendet werden könnte, wenn die Celluloseacetatschicht vorhanden wäre. Dies ist wichtig, weil man erwarten würde, dass die Transportgeschwindigkeit eines größeren Moleküls durch die Enzymschicht empfindlicher gegenüber Änderungen der Dichte der Schicht wäre als diejenige eines kleineren Moleküls. Es wurde Ferrocyanid (M. G. = 211,9) als eine solche Sonde in anderen ähnlichen Studien in Bezug auf die Enzymschicht-Permeabilität/Dichte verwendet und sie wurde auch in dieser Arbeit verwendet (J. F. Castner und L. B. Wingard, "Biochemistry" 23 (1980, Seiten 2203–2310; L. B. Wingard, L. A. Canton und J. F. Castner, "Biochemica et Biophysica Acta", Band 748, 1983 Seiten 21–27).
Innerhalb von 36 h nach der Herstellung wurden die speziellen Doppel-Polycarbonat(DPC)-Membranen installiert und bewertet mit genau dem gleichen Satz von YSI Modell 2700 H₂O₂-Sonden, wie er für die Bewertung der Standard-Membranen eingesetzt wurde. wach dem Anlaufen wurden die Ansprechempfindlichkeiten sowohl für Ferrocyanid als auch für H₂O₂ 30 s nach der Injektion gemessen. Das 2700 System ermöglicht die aperometrische Messung einer elektrisch aktiven Species, wie z. B. von Ferrocyanid, an einer mit 0,7 V polarisierten Platinanode. Der in diesem Systemen verwendete Elektrolyt ist ein 0,05 M PO₄-Puffer mit 1,5 g/l NaCl, der pH-Wert des Elektrolyten beträgt 7,2 (d. h. ein YSI 2357-Puffer).
Die 11 zeigt die Ergebnisse, die bei dieser Studie erhalten wurden. Die Ansprechempfindlichkeit sowohl von Ferrocyanide als auch von H₂O₂ sind gegen die in der Enzymschicht der DPC-Membran verwendete Puffer-Konzentration aufgetragen. Ebenfalls aufgetragen ist darin das molare Response- bzw. Ansprechverhältnis für Ferrocyanid, das errechnet wird durch Dividieren der Ansprechempfindlichkeit für Ferrocyanid durch die Ansprechempfindlichkeit für eine äquimolare Konzentration von H₂O₂. Dieses Verhältnis ist charakteristisch für die tatsächlichen Unterschiede in Bezug auf die Enzymschicht-Permeabilität für die verschiedenen Membran-Typen, weil es so genormt ist, dass die Unterschiede von Sonde zu Sonde und von einer Membran zur anderen Membran eliminiert werden. Dies ist das Ergebnis des Umstandes, dass die Elektroden-Ansprechempfindlichkeit für H₂O₂ von den gleichen Faktoren abhängt wie die Ansprechempfindlichkeit für Ferrocyanid einschließlich der Permeabilität der Polycarbonat-Schichten und der Größe der Arbeitselektrode. Der differenzielle Effekt dieser Faktoren mit Ausnahme des Faktors für die Enzymschicht-Permeabilität ist jedoch verhältnismäßig unempfindlich gegenüber dem Unterschied in Bezug auf die Molekülgröße zwischen H₂O₂ und Ferrocyanid, Dieses Verhältnis kann angewendet werden zur quantitativen Bestimmung der Enzymschicht-Permeabilität, da es die Geschwindigkeit des Ferrocyanid-Transports oder -Strom durch die Enzymschicht, bezogen auf den Transport oder Strom des H₂O₂, darstellt. Es ist klar zu erkennen, dass die Form des molaren Ansprech-Verhältnisses (Ferrocyanid/H₂O₂) in Abhängigkeit von der Puffersalz-Konzentrations-Kurve, die bei den DPC-Membranen erhalten wird (11) genau dem gleichen Trend folgt wie die Glucose-Ansprechempfindlichkeit in Abhängigkeit von der Puffersalz-Konzentrations-Kurve, die bei der Standard-Drei-Schichten-Membran vom Newman-Typ erhalten wird (2).
Die Schlussfolgerung ist die, dass die Verbesserung, die in Bezug auf den dynamischen Bereich (d. h., in Bezug auf die Linearität, die bei Standard-Laminat-Enzym-Membranen vom Newman-Typ, die mit abnehmenden Mengen an Puffer in der Immobilisierungs-Matrix hergestellt werden, festzustellen ist, tatsächlich auf die erhöhte Enzymschicht-Dichte, d. h. die verminderte Permeabilität, zurückzuführen ist.
Außerdem weisen Membranen, die Enzymschichten enthalten, die eine höhere Dichte aufweisen, dargestellt durch ein durchschnittliches molares Ferrocyanid/H₂O₂-Ansprechverhältnis von 0,05 oder weniger, einen verbesserten linearen Bereich auf, verglichen mit Membranen mit niedrigeren Dichten oder mit durchschnittlichen molaren Ansprechverhältnissen, die größer als 0,05 sind (vgl. 4, 7, 10 und 11).
Im Allgemeinen führt jede Zugabe zu der Enzym/Immobilisierungs-Matrix über das Enzym und das Vernetzungsmittel hinaus dazu, die vernetzte Enzymschicht weniger dicht zu machen und die Enzymelektrode weniger linear zu machen. Es wird nicht nur der dynamische Bereich verbessert, wenn Puffer aus der Immobilisierungsmatrix weggelassen wird, sondern es verbessert sich auch die Wiederholbarkeit von Membran zu Membran (vgl. die Größe der Messfehler-Stäbe bei niedriger Puffer- Konzentration gegenüber hoher Puffer-Konzentration in den 2 bis 10). Die Ergebnisse mit Puffersalzen zeigen an, dass ein nachteiliger Effekt auftritt, der mit ihrem Einschluss in der Immobilisierungsmatrix verbunden ist. Dies steht im Widerspruch zu dem konventionellen Wissensstand, wonach Puffer in der Matrix enthalten sein müssen, um den pH-Wert und die Ionen-Konzentration zu steuern, bei der die Reaktion durchgeführt wird (Yacynych, "Advances in Biosensors", Band 2 (1992) (A. P. F. Turner ed.), Seiten 24–25, JAI Press Ltd., London, und I. Chibata "Immobilized Enzymes; Research and Development", Seite 9, (1978), John Wiley and Sons, New York).
Beispiel 5
Ähnliche Ergebnisse werden erhalten, wenn Rinderserumalbumin (BSA) der Immobilisierungsmatrix einverleibt wird. Es wurden wie in Beispiel 1 beschrieben Membranen hergestellt, jedoch mit der Ausnahme, dass variierende Mengen an Rinderserumalbumin (Fraktion V; Sigma-Katalog Nr. A – 4503) der bei der Herstellung der Membran verwendeten Glucoseoxidase-Wasser-Mischung zugesetzt wurden. Eine äquivalente Menge Glucoseoxidase wurde weggelassen, sodass die Gesamtprotein-Konzentration in 250 μL bei 10 mg konstant gehalten wurde. Die Membranen wurden in dem Modell 2700s wie oben angegeben bewertet.
Die 12 erläutert, wie die Linearität von Sensoren, die Glucoseoxidase-Schichten mit steigenden Konzentrationen an BSA enthalten, abnimmt, während die Empfindlichkeit zunimmt. Die angegebenen Glucose-Konzentrationen sind korrigiert für die Verdünnung und zeigen daher entweder die tatsächliche Glucose-Konzentration (Abszisse) oder die errechnete Glucose-Konzentration (Ordinate), die durch den Sensor bestimmt wird. Die rechts von jeder Standardkurve angegebenen Werte stellen die durchschnittlichen Glucose-Empfindlichkeiten in nAs, gemessen bei 2 g/l Glucose, dar. Dies steht ebenfalls im Widerspruch zu dem konventionellen Wissensstand, wonach eine "co-immobilisierende" Glucoseoxidase mit BSA erwünscht ist, weil das BSA irgendwie das Enzym während der Immobilisierung stabilisiert (P. Pantano und W. G. Kuhr, "Electroanalysis", 7 (1995) 406–416). Obgleich die Glucoseempfindlichkeit zunahm mit steigenden BSA-Konzentrationen (auch wenn die Glucoseoxidase wirksam verdünnt worden ist!) ging dies auf Kosten eines verkleinerten linearen Bereiches. Auch dies lässt erkennen, dass die Dichte der Enzymschicht abnimmt, wenn die BSA-Konzentration zunimmt. Es ist interessant darauf hinzuweisen, dass nach bestem Wissen alle früheren Studien in Bezug auf die Enzymschichtdichte mit Glucoseoxidase durchgeführt wurden, die mit BSA coimmobilisiere worden war, und dass die möglichen Effekte von BSA auf die Schichtdichte weder erkannt noch untersucht wurden (vgl. die oben genannten Literaturhinweise von Mutlu et al., Castner et al. und Wingard et al.).
Schließlich sei darauf hingewiesen, dass die beschriebenen Phänomene nicht für Glucoseoxidase spezifisch sind, sondern auch für andere Enzyme gelten. Frühere Ergebnisse mit Lactatoxidase stützen diese Schlussfolgerung.

Claims

Laminierte Membran (28) zur Verwendung in einer polarographischen Zellanordnung zur Untersuchung eines Analyten in einer Mischung oder Lösung, wobei die laminierte Membran umfasst: – eine Außenschicht (30) mit Poren darin, mit einem Porendurchmesser von mehr als 27 nm (270 Å), – eine Innenschicht (32), sowie – eine zwischen der Außenschicht und der Innenschicht angeordnete Enzymschicht (34), dadurch gekennzeichnet, dass die Enzymschicht (34) eine Pufferlösung darin enthält, die dazu ausgelegt ist, in der Enzymschicht einen pH von 4 bis 9.0 beizubehalten, wobei der Puffer in der Lösung in einer Menge von 1 × 10^–6 bis 0,1 M vorhanden ist.
Laminierte Membran nach Anspruch 1, wobei die Außenschicht (30) einen Porendurchmesser von 31 bis 75 nm (310 bis 750 Å) aufweist.
Laminierte Membran nach Anspruch 2, wobei der Puffer in der Pufferlösung in einer Menge von 0,001 bis 0,05 M vorhanden ist.
Laminierte Membran nach Anspruch 3, wobei der Puffer in der Pufferlösung in einer Menge von 0,001 bis 0,005 M vorhanden ist.
Laminierte Membran nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Enzymschicht (34) ferner dadurch gekennzeichnet ist, dass sie ein molares Antwortverhältnis von Ferrozyanid: H₂O von 0,05 oder weniger aufweist.
Laminierte Membran nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Außenschicht (30) eine Porendichte von weniger als 6 × 10⁸ Poren/cm² aufweist.
Laminierte Membran nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Außenschicht (30) eine Porosität von 0,001 bis 0,2% hat.
Verwendung einer laminierten Membran nach einem der vorhergehenden Ansprüche in einer polarographischen Zellanordnung zur Untersuchung eines Analyten, der in einer Probe von unverdünntem Ganzblut, Plasma oder Serum vorliegt.
Verfahren zur Herstellung einer laminierten Membrananordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer porösen Außentragschicht (30) mit einem Porendurchmesser von mehr als 27 nm (270 Å); b) Bereitstellen einer Innenbarriereschicht (32); c) Bereitstellen einer enzymhaltigen Mischung, die die Pufferlösung enthält; d) Einfügen der enzymhaltigen Mischung (34) zwischen die Tragschicht und die Barriereschicht, sowie e) Ausüben einer kleinen Kompressionskraft derart, dass eine sandwichartige. Struktur (28) gebildet wird.