DE69633512T2

DE69633512T2 - MULTILAYER MEMBRANE STRUCTURE FOR POLAROGRAPHIC MEASUREMENTS AND METHOD FOR THE PRODUCTION OF SUCH STRUCTURES

Info

Publication number: DE69633512T2
Application number: DE69633512T
Authority: DE
Inventors: M. Jay JOHNSON
Original assignee: YSI Inc
Current assignee: YSI Inc
Priority date: 1995-08-01
Filing date: 1996-07-30
Publication date: 2005-10-13
Anticipated expiration: 2016-07-31
Also published as: JPH11510599A; WO1997004954A1; DE69633512D1; EP0857107B1; EP0857107A1; EP0857107A4

Description

Gebiet der ErfindungTerritory of invention

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine verbesserte Laminat-Membran-Struktur, die für die Verwendung in Kombination mit einer Enzym-Elektrode geeignet ist, und auf Verfahren zur Herstellung dieser Laminat-Struktur.The The present invention relates to an improved laminate-membrane structure suitable for use in combination with an enzyme electrode, and methods for producing this laminate structure.

Hintergrund der Erfindungbackground the invention

Polarografische Zellsysteme haben eine breite Anerkennung gefunden, insbesondere auf dem medizinischen Gebiet für den Nachweis und die Konzentrationsbestimmung vieler erwünschter Analyten. In diesen Systemen werden üblicherweise Enzyme verwendet, insbesondere in den Situationen, in denen der Analyt selbst polarografisch nicht aktiv ist, jedoch ein gebildetes Reaktionsprodukt oder ein bei einer enzymatischen Reaktion mit dem Analyten verbrauchter Reaktant polarografisch aktiv ist.polarographic Cell systems have found wide acceptance, in particular in the medical field for the detection and concentration determination of many desired Analytes. These systems usually use enzymes especially in the situations where the analyte itself is polarographic is not active, but a formed reaction product or a Reactant consumed in an enzymatic reaction with the analyte polarographically active.

So besteht beispielsweise bei medizinischen Anwendungen ein übliches Verfahren darin, im Blut eines Patienten die Glucose zu bestimmen. In der Regel werden dem Patienten Blutproben entnommen zur Durchführung einer Analyse zur Bestimmung der Glucose-Konzentration unter Verwendung einer Glucose-Oxidase-Elektrode mit einem polarografischen Detektor für den Nachweis von H₂O₂, das nach der folgenden Reaktion gebildet wird:For example, in medical applications, a common method is to measure glucose in a patient's blood. Typically, blood samples are taken from the patient for analysis to determine glucose concentration using a glucose oxidase electrode with a polarographic detector for detection of H ₂ O ₂ formed by the following reaction:

Das durch die Reaktion gebildete Wasserstoffperoxid ist durch einen polarografischer Detektor messbar und durch eine geeignete Eichung und Berechnung kann der Glucose-Gehalt in der Probe anhand des bei der Reaktion gebildeten H₂O₂ genau bestimmt werden.The hydrogen peroxide formed by the reaction can be measured by a polarographic detector and, by suitable calibration and calculation, the glucose content in the sample can be accurately determined from the H ₂ O ₂ formed in the reaction.

Die für diese Messungen üblicherweise verwendeten polarografischen Zellsysteme umfassen eine ein Enzym enthaltende Laminatmembran, welche die Analyt-Probe von der Arbeitselektrode der Zelle trennt. Diese Membran-Typen sind in den US-Patenten 3 973 274 und 4 073 713 (beide Newman) beschrieben, auf deren Offenbarungsinhalt hier Bezug genommen wird. In diesen Membranen ist eine dünne innerste Membran, hier als Sperrschicht bezeichnet, die besteht aus Celluloseacetat, Siliconkautschuk oder Methylmethacrylat, benachbart zu der Arbeitselektrode der polarografischen Zelle angeordnet. Das Glucoseoxidase-Enzym ist zwischen dieser Sperrschicht und einer äußeren Polycarbonat-Trägerschicht angeordnet. Die äußere Trägerschicht hat in der Regel eine Dicke von etwa 5 μm und steht mit der den Analyten enthaltenden Probe in Kontakt.The for this Measurements usually Polarographic cell systems used include an enzyme containing laminate membrane containing the analyte sample from the working electrode the cell separates. These types of membranes are disclosed in US Pat. Nos. 3,973,274 and 4,073,713 (both Newman), to the disclosure of which is referred to here. In these membranes is a thin innermost Membrane, here referred to as a barrier layer consisting of cellulose acetate, Silicone rubber or methyl methacrylate adjacent to the working electrode the polarographic cell arranged. The glucose oxidase enzyme is between this barrier layer and an outer polycarbonate backing layer arranged. The outer carrier layer usually has a thickness of about 5 microns and is consistent with the analyte containing sample in contact.

Bei einer analytischen Glucose-Bestimmung durchdringen die Glucose und der Sauerstoff die äußere Trägerschicht und reagieren in Gegenwart des Enzyms. Das gebildete Wasserstoffperoxid durchdringt die innere Sperrschicht, an der es polarografisch nachgewiesen wird. Die Trägerschicht erlaubt den Durchgang von Glucose, Sauerstoff und anderen Molekülen, während sie den Durchgang von Substanzen mit einem hohen Molekulargewicht, wie z. B. von Proteinen, roten Blutkörperchen und anderen Makromolekülen, nicht erlaubt.at an analytical glucose determination permeate the glucose and the oxygen the outer carrier layer and react in the presence of the enzyme. The formed hydrogen peroxide Penetrates the inner barrier layer, where it is polarographically detected becomes. The carrier layer allows the passage of glucose, oxygen and other molecules while they are the passage of high molecular weight substances, such as z. Of proteins, red blood cells and other macromolecules, not allowed.

Die Sperrschicht erlaubt den Zutritt von Wasserstoffperoxid zu der Arbeitselektrode, während sie den Durchgang von Substanzen mit hohen Molekulargewichten in der Größenordnung von etwa 150 und mehr, wie z. B. Ascorbinsäure und Harnsäure, blockiert.The Barrier layer allows access of hydrogen peroxide to the working electrode, while in the passage of substances with high molecular weights in of the order of magnitude of about 150 and more, such as As ascorbic acid and uric acid, blocked.

Es wurde festgestellt, dass es zur Erzielung einer genauen linearen Messung in Lösungen, die hohe Glucose-Konzentrationen enthalten, wie z. B. in Vollblut, Plasma oder Serum, wünschenswert ist, die Diffusion der Glucose zu der Enzymschicht, relativ zur Einwanderung von Sauerstoff in diese, zu hemmen. Wenn dies nicht geschieht, wird das Verhältnis von Glucose zu Sauerstoff, der mit dem Enzym in Kontakt kommt, ungünstig und macht den Sauerstoff-Gehalt anstelle der Glucose-Konzentration der Probe zu der die Geschwindigkeit begrenzenden Komponente der Reaktion. Dies führt seinerseits zu ungenauen Glucose-Konzentrations-Messungen mit dem Instrument. Eine Linearität liegt in solchen Situationen nur über den Bereich einer niedrigen Glucose-Konzentration vor. Dieses Problem ist nicht nur begrenzt auf die Glucose-Bestimmung, sondern ist auch festzustellen bei der Messung anderer Analyten, wie z. B. von Lactat.It It was found that it was necessary to achieve an accurate linear Measurement in solutions, containing high glucose concentrations, such as. In whole blood, Plasma or serum, desirable is the diffusion of glucose to the enzyme layer, relative to Immigration of oxygen into it, to inhibit. If not happens, the relationship becomes From glucose to oxygen, which comes into contact with the enzyme, unfavorable and makes the oxygen content instead of the glucose concentration of the Sample to the rate limiting component of the reaction. this leads to turn to inaccurate glucose concentration measurements with the Instrument. A linearity in such situations is only over the range of low glucose concentration in front. This problem is not only limited to the determination of glucose, but is also found in the measurement of other analytes, such as B. lactate.

Um dieses Problem zu beseitigen, ist es übliche Praxis, die Glucose- und Lactat-Konzentrationen der Probe so zu verdünnen, dass der gemessene Analyt-Konzentrationswert innerhalb des Konzentrationsbereiches, der eine Linearität aufweist, liegt. Es ist jedoch häufig zeitraubend und unpraktisch, die den Analyten enthaltende Probe zu verdünnen. Außerdem wird es allgemein üblich, die Bestimmung von Analyten, wie z. B. von Glucose und/oder Lactat, in einer einzigen analytischen Testvorrichtung durchzuführen, die auch andere (weitere) Messkanäle umfasst. Diese anderen Messkanäle erfordern nicht-verdünntes Vollblut oder Plasma als Analytproben-Zufuhr; deshalb ist es erforderlich, dass der Glucose- und/oder Lactat-Messkanal auch bei der Messung des Analyten in dem gleichen unverdünnten Vollblut- oder Plasma-Proben-Medium funktioniert.Around It is common practice to eliminate the glucose and lactate concentrations dilute the sample so that the measured analyte concentration value is within the concentration range, the one linearity has, lies. It is however common time-consuming and impractical, the sample containing the analyte to dilute. Furthermore it becomes common practice the determination of analytes, such. From glucose and / or lactate, in a single analytical test device, the also other (further) measuring channels includes. These other measurement channels require non-dilute Whole blood or plasma as analyte sample delivery; therefore it is necessary that the glucose and / or lactate measuring channel also in the measurement of the analyte in the same undiluted whole blood or plasma sample medium works.

Um eine genaue Messung von Glucose oder Lactat im Vollblut zu ermöglichen, wurde die mit der Probe in Kontakt kommende Membranschicht der Membranen vom Newman-Typ so modifiziert, dass die Diffusion des Analyten in die Enzymschicht begrenzt wird. So ist beispielsweise in der Japanischen Patentanmeldung Sho 59- 40182 beschrieben, dass die Porengröße der äußeren, mit der Probe in Kontakt kommenden Membran 200 Å oder weniger betragen sollte, wobei getestete 150 Å-Porengrößen eine verbesserte Glucose-Bestimmung in Vollblut-Proben ergeben. Später wurde in einer naheliegenden Abänderung der Lehren der Japanischen Patentanmeldung von Young et al. in dem US-Patent 4 759 828 darauf hingewiesen, dass die äußere, mit der Probe in Kontakt kommende Schicht Poren mit einer Größe in der Größenordnung von etwa 10 bis 125 Å-Einheiten im Durchmesser haben sollte. In diesem US-Patent wird ausdrücklich darauf hingewiesen, dass äußere Schichten mit einer Porengröße von 150 Å-Einheiten "die Diffusion von Glucose-Molekülen nicht ausreichend begrenzen, um Glucose-Messungen bei einem unverdünnten Serum durchführen zu können".Around to allow accurate measurement of glucose or lactate in whole blood, became the membrane-contacting membrane layer of the membranes modified by the Newman type so that the diffusion of the analyte in the enzyme layer is limited. For example, in Japanese Patent Application Sho 59-40182 described that the pore size of the outer, with the sample contacting membrane should be 200 Å or less, where tested 150 Å pore sizes one improved glucose determination in whole blood samples. Later became in an obvious amendment the teachings of the Japanese Patent Application of Young et al. by doing US Patent 4,759,828 noted that the outer, with the sample is in contact with the pores of a size in the sample Magnitude from about 10 to 125 Å units should have in diameter. In this US patent is expressly stated noted that outer layers with a pore size of 150 Å units "the diffusion of Glucose molecules are not limit enough to glucose measurements on undiluted serum carry out to be able to ".

Zusätzlich zur Betonung der geringen Porengröße in den äußeren, mit der Lösung in Kontakt kommenden Schichten der Laminat-Membran haben Vadgama et al. die Bedeutung von Materialien mit geringer Porosität betont. Der Prozentsatz der Porosität ist definiere als das Produkt Porendichte × Porengröße × 100. Porositäten in dem Bereich von 0,001% oder 0,005% bis 0,5% und im Allgemeinen von weniger als 2% sind in der Europäischen Patentanmeldung 0 216 577 von Vadgama et al. beschrieben (vgl. auch das US-Patent 5 437 973 von Vagdama et al.).In addition to Emphasizing the small pore size in the outer, with the solution In contact layers of the laminate membrane have Vadgama et al. emphasizes the importance of materials with low porosity. The percentage of porosity is defined as the product pore density × pore size × 100. porosities in the Range of 0.001% or 0.005% to 0.5% and generally less than 2% are in the European Patent Application 0 216 577 to Vadgama et al. described (see also U.S. Patent 5,437,973 to Vagdama et al.).

Der Trend zur Verwendung von Trägerschichten mit einer geringen Porengröße ist jedoch nicht problemfrei. So werden beispielsweise während der Herstellung von Filmen mit kleinen Poren des Typs, wie er für die äußeren, mit der Lösung in Kontakt stehenden Schichten in ein Enzym enthaltenden Laminat-Membranen verwendet wird, die Poren häufig gebildet durch ein Bestrahlungsverfahren, bei dem Spaltprodukte aus einem Uranatom oder andere Formen von Bestrahlung den festen Filmvorläufer durchdringen unter Bildung der gewünschten Filmporendichte. Die Porengrößen werden in einer nachfolgenden Ätzstufe unter Verwendung einer starken Alkalilösung eingestellt. In den Endstufen dieses Verfahrens werden die Filme mit Tensiden mit einem hohem Molekulargewicht, wie z. B. Polyvinylpyrrolidon, gewaschen oder behandelt.Of the Trend for the use of carrier layers however, with a small pore size not problem free. For example, during the production of films with small pores of the type that he uses for the outer, with the solution in Contact standing layers used in an enzyme-containing laminate membranes the pores are frequent formed by an irradiation process in which fission products from a uranium atom or other forms of irradiation the solid film precursor penetrate to form the desired film pore density. The Pore sizes are in a subsequent etching step adjusted using a strong alkali solution. In the final stages In this process, the films with surfactants with a high Molecular weight, such as. As polyvinylpyrrolidone, washed or treated.

Es wurde eine geringe Gleichförmigkeit festgestellt, wenn diese Filme in Enzym enthaltende Laminat-Membranen eingearbeitet werden. Es wird angenommen, dass die großen sperrigen Tensid-Moleküle, die während der Filmherstellungsverfahren verwendet werden, die Neigung haben, einige der Poren zu blockieren oder zu verstopfen. Weil dies in unterschiedlichen Graden innerhalb der verhältnismäßig kleinen Einheitsfläche des Films auftreten kann, der schließlich in einer Enzym enthaltenden Laminat-Membran verwendet wird, können verhältnismäßig große Ungleichmäßigkeiten von Membran zu Membran festgestellt werden. Geringe Porengrößen erschweren im Allgemeinen auch die Erzielung einer Membrangleichförmigkeit während der Membran-Herstellung.It became a low uniformity detected when these films in enzyme-containing laminate membranes be incorporated. It is believed that the big bulky ones Surfactant molecules the while used in film production processes that tend to block or clog some of the pores. Because this is in different degrees within the relatively small unit area of the Films may eventually appear in an enzyme-containing Laminate membrane is used, relatively large irregularities be detected from membrane to membrane. Small pore sizes make it difficult generally also achieving membrane uniformity while the membrane production.

Wenn Träger-Membranen mit kleinen Poren verwendet werden, besteht außerdem die Gefahr einer Verstopfung oder Blockierung während der Verwendung in dem analytischen Verfahren.If Carrier membranes With small pores, there is also a risk of clogging or blocking during use in the analytical method.

Es gibt daher im Stand der Technik einen Bedarf für die Bereitstellung einer ein Enzym enthaltenden Laminat-Membran-Anordnung, mit der Glucose und/oder Lactat in unverdünntem Vollblut, in Plasma oder Serum bestimmt werden kann (können), bei der die oben genannten Probleme nicht auftreten.It There is therefore a need in the art for providing a an enzyme-containing laminate-membrane assembly containing glucose and / or lactate in undiluted Whole blood, in plasma or serum can (can) be determined at the above problems do not occur.

Diese und andere Ziele werden erreicht mit den Laminat-Membranen, die in der vorliegenden Anmeldung beschrieben und im Patentanspruch 1 beansprucht werden. Im Prinzip stellt die vorliegende Erfindung eine Verbesserung gegenüber den in den oben genannten Newman-Patenten beschriebenen Membranen dar. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in dem Aufbau der äußeren Schicht oder der Trägerschicht, wie sie gelegentlich auch bezeichnet wird, der Laminat-Membran.These and other objects are achieved with the laminate membranes that described in the present application and in the claim 1 are claimed. In principle, the present invention provides a Improvement over the membranes described in the above Newman patents An aspect of the present invention is the structure the outer layer or the carrier layer, as it is sometimes referred to, the laminate membrane.

Im Gegensatz zu den Lehren des Standes der Technik wurde gefunden, dass die äußere Schicht der Laminat-Membran mit supergroßen Poren ausgestattet sein sollte. Diese großen Poren sind schwer zu blockieren oder zu verstopfen, wenn der Film mit großen Tensid-Molekülen gewaschen oder behandelt wird, oder während der Verwendung in einem analytischen Instrument. Gleichzeitig haben diese äußeren Schichten die Funktion, die Glucose- oder Lactat-Diffusion zu der Enzym-Schicht zu verhindern, sodass eine Messung in unverdünnten Vollblut- oder Plasma-Proben durchgeführt werden kann.In contrast to the teachings of the prior art, it has been found that the outer layer of the Laminate membrane should be equipped with super-large pores. These large pores are difficult to block or clog when the film is washed or treated with large surfactant molecules, or during use in an analytical instrument. At the same time, these outer layers function to prevent glucose or lactate diffusion to the enzyme layer so that measurement can be made in undiluted whole blood or plasma samples.

Die äußere semipermeable Membran weist Porengrößen von mehr als 27 nm (270 Å-Einheiten), vorzugsweise von mehr als 30 nm (300 Å-Einheiten) im Durchmesser auf. Die Porendichte beträgt vorzugsweise weniger als 6 × 10⁸ Poren/cm². Vorzugsweise liegt die Porosität der äußeren semipermeablen Membran innerhalb des Bereiches von 0,001 bis 0,2%.The outer semipermeable membrane has pore sizes greater than 27 nm (270 Å units), preferably greater than 30 nm (300 Å units) in diameter. The pore density is preferably less than 6 × 10 ⁸ pores / cm ² . Preferably, the porosity of the outer semipermeable membrane is within the range of 0.001 to 0.2%.

Es wurde gefunden, dass eine Enzymschicht, die selbst eine hohe Dichte aufweist, ebenfalls zu einem verbesserten dynamischen Bereich oder einer verbesserten Linearität führt. So wurde beispielsweise gefunden, dass die Konzentration des Puffers in der Pufferlösung, die während des Immobilisierungsverfahrens mit dem Enzym gemischt wird, so eingestellt werden sollte, dass sie innerhalb des Bereiches von 1 × 10^–6 bis 0,1 M, vorzugsweise innerhalb des Bereiches von 1 × 10^–6 bis 0,05 M und am meisten bevorzugt innerhalb des Bereiches von 0,001 bis 0,005 M biegt. Überraschenderweise wurde gefunden, dass dann, wenn die Puffer-Konzentration abnimmt, die Linearität des Ansprechverhaltens von Sensoren, in denen diese verbesserten Membranen verwendet werden, verbessert wird.It has been found that an enzyme layer which itself has a high density also results in an improved dynamic range or improved linearity. For example, it has been found that the concentration of the buffer in the buffer solution mixed with the enzyme during the immobilization process should be adjusted to within the range of 1 × 10 ^-6 to 0.1 M, preferably within the range from 1 × 10 ^-6 to 0.05 M, and most preferably within the range of 0.001 to 0.005 M. Surprisingly, it has been found that as the buffer concentration decreases, the linearity of the response of sensors using these improved membranes is improved.

Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher beschrieben, wobei zeigen:The Invention will be described below with reference to the accompanying Drawings closer described, wherein show:

1 eine vergrößerte schematische Ansicht eines Querschnitts einer ein Enzym enthaltenden erfindungsgemäßen Laminat-Membran; 1 an enlarged schematic view of a cross section of an enzyme-containing laminate membrane according to the invention;

2 ein Diagramm, in dem der in einem polarografischen analytischen Instrument YSI, Modell 2700, erhaltene Plateau-Strom gegen die Molarität der Pufferlösung aufgetragen ist, die während der Immobilisierung des Enzyms vorliegt, das in der Enzymschicht eines ersten Laminat-Membran-Aufbaus vorliegt, der in Verbindung mit dem Test einer 40 g/l Glucose-Probe verwendet wird; 2 a graph in which the plateau current obtained in a model 2700 polarographic analytical instrument YSI, is plotted against the molarity of the buffer solution, which is present during the immobilization of the enzyme present in the enzyme layer of a first laminate membrane structure used in conjunction with the assay of a 40 g / l glucose sample;

3 ein Diagramm, in dem der in dem YSI-Modell 2700-Instrument erhaltene Plateau-Strom aufgetragen ist gegen die Molarität der Pufferlösung, die bei der Herstellung der Enzymschicht des ersten Laminat-Membran-Aufbaus verwendet wird, der in Kombination mit dem Test einer 3 mg%igen Lösung von H₂O₂ eingesetzt wird; 3 FIG. 4 is a graph plotting the plateau current obtained in the YSI Model 2700 instrument against the molarity of the buffer solution used in the preparation of the enzyme layer of the first laminate membrane assembly, which in combination with the test of FIG mg% solution of H ₂ O _{2 is} used;

4 ein Diagramm, in dem die Glucose-Konzentration, bestimmt unter Verwendung des YSI-Modell 2700-Instruments, gegen die Molarität der Pufferlösung aufgetragen ist, die bei der Herstellung der Enzymschicht des ersten Laminat-Membran-Aufbaus verwendet wird; 4 a graph in which the glucose concentration, determined using the YSI model 2700 instrument, plotted against the molarity of the buffer solution used in the preparation of the enzyme layer of the first laminate membrane assembly;

5 ein Diagramm, in dem der Plateau-Strom und die Molarität der Pufferlösung ähnlich wie in 2 gegeneinander aufgetragen sind, das diesmal jedoch die Daten zeigt, die mit einem zweiten Laminat-Membran-Aufbau erhalten wurden; 5 a diagram in which the plateau current and the molarity of the buffer solution are similar to those in 2 against each other, but this time shows the data obtained with a second laminate-membrane structure;

6 ein Diagramm, in dem der Plateau-Strom gegen die Molarität der Pufferlösung aufgetragen ist, ähnlich der 3, das diesmal jedoch die Daten zeigt, die mit dem zweiten Laminat-Membran-Aufbau erhalten wurden; 6 a diagram in which the plateau current is plotted against the molarity of the buffer solution, similar to the 3 but this time shows the data obtained with the second laminate membrane construction;

7 ein Diagramm, in dem die Glucose-Konzentrationen gegen die Molarität der Pufferlösung aufgetragen sind, ähnlich wie in 4, das diesmal jedoch die Daten zeigt, die mit dem zweiten Laminat-Membran-Aufbau erhalten wurden; 7 a diagram in which the glucose concentrations are plotted against the molarity of the buffer solution, similar to in 4 but this time shows the data obtained with the second laminate membrane construction;

8 ein Diagramm ähnlich der 5, das jedoch die Daten zeigt, die bei Verwendung einer zweiten Pufferlösung und bei Verwendung eines dritten Laminat-Membran-Aufbaus erhalten wurden; 8th a diagram similar to the one 5 but showing the data obtained using a second buffer solution and using a third laminate membrane assembly;

9 ein Diagramm ähnlich der 6, das jedoch die Daten zeigt, die bei Verwendung einer zweiten Pufferlösung und eines dritten Laminat-Membran-Aufbaus erhalten wurden; 9 a diagram similar to the one 6 however, showing the data obtained using a second buffer solution and a third laminate membrane assembly;

10 ein Diagramm ähnlich der 7, das jedoch die Daten zeigt, die bei Verwendung einer zweiten Pufferlösung und eines dritten Laminat-Membran-Aufbaus erhalten wurden; 10 a diagram similar to the one 7 however, showing the data obtained using a second buffer solution and a third laminate membrane assembly;

11 ein Diagramm, in dem die mit dem YSI Modell 2700-Analysator für variierende Menge an Ferrocyanid- und H₂O₂-Proben erhaltenen Ströme aufgetragen sind, wobei die Proben getestet wurden unter Verwendung einer speziell aufgebauten, ein Enzym enthaltenden Laminat-Membran, um die Bedeutung der Bereitstellung einer Enzymschicht mit hoher Dichte zu zeigen; und 11 a graph plotting the currents obtained with the YSI Model 2700 Analyzer for varying amounts of ferrocyanide and H ₂ O ₂ samples, which samples were tested using a specially constructed enzyme-containing laminate membrane to show the importance of providing a high density enzyme layer; and

12 ein Diagramm, das die tatsächlichen Ergebnisse zeigt, die erhalten wurden im Vergleich zu den erwarteten Ergebnissen bei Verwendung des Modell 2700-Analysators, wobei kein Puffersalz in der Enzymschicht während ihrer Herstellung vorhanden war, jedoch steigende Mengen an Rinderserumalbumin (BSA) darin enthalten waren. 12 a graph showing the actual results obtained compared to the expected results using the Model 2700 analyzer with no buffer salt present in the enzyme layer during its preparation but with increasing levels of bovine serum albumin (BSA) contained therein.

Detaillierte Beschreibungdetailed description

In der 1 ist ein vergrößerter Querschnitt einer ein Enzym enthaltenden Laminat-Membran 28 dargestellt. Die Membran 28 ist geeignet für die Verwendung in Kombination mit einer handelsüblichen analytischen Apparatur, mit der beispielsweise die Glucose- oder Lactat-Konzentration in unverdünnten Vollblut-, Plasma- oder Serum-Lösungen bestimmt werden kann.In the 1 Fig. 10 is an enlarged cross section of an enzyme-containing laminate membrane 28 shown. The membrane 28 is suitable for use in combination with a commercially available analytical apparatus with which, for example, the glucose or lactate concentration in undiluted whole blood, plasma or serum solutions can be determined.

Die Sperrschicht 32 umfasst eine homogene Celluloseacetat/Celluloseacetatbutyrat-Polymermischung und hat eine Dicke von 2 μm oder weniger, vorzugsweise von 1 bis 2 μm. Zwischen der Sperrschicht 32 und der Trägerschicht 30 ist ein Enzym 34 angeordnet. Das Enzym 34 wird in der Regel zwischen den Schichten 32 und 30 durch Verwendung von Glutaraldehyd in situ vernetzt, obgleich auch irgendein anderer einer Reihe von Klebstoffen und Vernetzungs-Promotoren verwendet werden kann.The barrier layer 32 comprises a homogeneous cellulose acetate / cellulose acetate butyrate polymer blend and has a thickness of 2 microns or less, preferably from 1 to 2 microns. Between the barrier layer 32 and the carrier layer 30 is an enzyme 34 arranged. The enzyme 34 is usually between the layers 32 and 30 by using glutaraldehyde in situ, although any of a variety of adhesives and crosslinking promoters may be used.

Es sei außerdem darauf hingewiesen, dass das Enzym auch selbst als Klebstoff verwendet werden kann, ohne dass ein zusätzlicher Klebstoff oder ein Vernetzungsmittel zugegeben wird.It Beyond that noted that the enzyme also used itself as an adhesive can be without an additional Adhesive or a crosslinking agent is added.

Die äußere Schicht oder Trägerschicht 30 kann aus einem Polycarbonat-Polymer bestehen. Es sei jedoch darauf hingewiesen, dass die Art des Polymers nicht kritisch ist. Beispielsweise kann die Schicht 30 auch Polyurethan, regenerierte Cellulose umfassen oder einen anderen Polymer-Aufbau haben. In der Regel hat die Schicht 30 eine Dicke von etwa 5 bis etwa 10 μm.The outer layer or carrier layer 30 may consist of a polycarbonate polymer. It should be noted, however, that the nature of the polymer is not critical. For example, the layer 30 also include polyurethane, regenerated cellulose or have a different polymer construction. In general, the shift has 30 a thickness of about 5 to about 10 microns.

Wie dargestellt, umfasst die Trägerschicht 30 eine einzige Schicht. Es ist aber auch möglich, dass die Trägerschicht 30 einen Mehrschichtenaufbau hat, wobei beispielsweise Rinderserumalbumin oder ein anderer geeigneter Klebstoff zwischen den Schichten angeordnet sein kann unter Ausbildung einer Verbundstruktur. Bei dieser Ausführungsform können die Porengrößen und die Dicken der einzelnen Schichten beispielsweise so kontrolliert werden, dass die Wanderung einer gegebenen chemischen Species zu dem Enzym 34 eingeschränkt oder gefördert wird.As shown, the carrier layer comprises 30 a single layer. But it is also possible that the carrier layer 30 has a multi-layered structure wherein, for example, bovine serum albumin or other suitable adhesive may be interposed between the layers to form a composite structure. For example, in this embodiment, the pore sizes and thicknesses of the individual layers can be controlled such that the migration of a given chemical species to the enzyme 34 restricted or promoted.

Es sei darauf hingewiesen, dass die Trägerschicht 30 benachbart zu der Analyt-Probe angeordnet ist und dass die Sperrschicht 32 daher benachbart zu einer Sensorelektrode 36 (in der Regel aus Platin) in einer Elektrolyt-Lösung angeordnet ist. In dem Elektrolyten ist außerdem eine Referenz-Elektrode 38 angeordnet. Es wird daher eine polarografische Zelle verwendet, in der die Elektroden und der Elektrolyt durch die Laminat-Membran von der Analyt-Lösung getrennt sind.It should be noted that the carrier layer 30 is arranged adjacent to the analyte sample and that the barrier layer 32 therefore adjacent to a sensor electrode 36 (usually platinum) is placed in an electrolyte solution. In the electrolyte is also a reference electrode 38 arranged. Therefore, a polarographic cell is used in which the electrodes and the electrolyte are separated from the analyte solution by the laminate membrane.

In der Offenbarung der vorliegenden Erfindung wird das Enzym 34 durchgehend als Glucoseoxidase-Enzym bezeichnet. Der Fachmann weiß aber natürlich, dass das Enzym in Abhängigkeit von dem jeweils gewünschten Analyten und der ausgewählten Reaktion variieren kann. So wird beispielsweise in analytischen Situationen, bei denen es erwünscht ist, die Lactat-Gehalte in Blutproben zu überwachen, Lactatoxidase als Enzym 34 verwendet. Weitere Kandidaten-Analyte und ihre entsprechenden Oxidoreduktase-Enzyme sind nachstehend beispielhaft angegeben: Analyt Oxidoreduktase-Enzym Lactose Galactoseoxidase Saccharose (Invertase (Mutarotase (Glucoseoxidase Alkohol Alkoholoxidase Galactose Galactoseoxidase In the disclosure of the present invention, the enzyme becomes 34 throughout referred to as glucose oxidase enzyme. However, it will be understood by those skilled in the art that the enzyme may vary depending on the analyte of interest and the reaction selected. For example, in analytical situations where it is desired to monitor lactate levels in blood samples, lactate oxidase as an enzyme 34 used. Other candidate analytes and their corresponding oxidoreductase enzymes are exemplified below: analyte Oxidoreductase enzyme lactose galactose sucrose (Invertase (mutarotase (glucose oxidase alcohol alcohol galactose galactose

Die Membran 32 besteht vorzugsweise aus einer Mischung von Cetluloseacetat/Celluloseacetatbutyrat-Celluloseestern. Das Gewichtsverhältnis zwischen Celluloseacetat und Celluloseacetatbutyrat, das zur Bildung der Sperrschicht 32 angewendet wird, variiert über einen breiten Bereich von (1,5 bis 20) : 1. Auf der Basis der erfindungsgemäßen Angaben ist es bevorzugt, eine Mischung von Celluloseacetat/Celluloseacetatbutyrat im Gewichtsverhältnis 4 : 1 zu verwenden, um den Film zu gießen, der für die Bildung der Sperrschicht 32 der Membran 28 verwendet wird.The membrane 32 is preferably a mixture of cetlulose acetate / cellulose acetate butyl rat-Celluloseestern. The weight ratio between cellulose acetate and cellulose acetate butyrate used to form the barrier layer 32 On the basis of the indications according to the invention it is preferred to use a mixture of cellulose acetate / cellulose acetate butyrate in the weight ratio 4: 1 in order to cast the film which for the formation of the barrier layer 32 the membrane 28 is used.

Das erforderliche Verhältnis von Celluloseacetat zu Celluloseacetatbutyrat wird in einem Zwei-Lösungsmittel-System gelöst. Das erste Lösungsmittel ist ein leicht flüchtiges organisches Lösungsmittel, das einen niedrigen Siedepunkt aufweist. Derzeit können Nitromethan, Dimethylformamid und Cylcohexanon als beispielhafte Vertreter dieser Klasse von leicht flüchtigen organischen Lösungsmitteln genannt werden, wobei all diese unter Atmosphärenbedingungen Siedepunkte von weniger als 200°C aufweisen. Derzeit ist es bevorzugt, Nitromethan als leicht flüchtiges organisches Lösungsmittel zu verwenden.The required ratio from cellulose acetate to cellulose acetate butyrate is in a two-solvent system solved. The first solvent is a volatile one organic solvent, which has a low boiling point. Currently, nitromethane, Dimethylformamide and Cylcohexanon as exemplary representatives of these Class of volatile organic solvents all of which are boiling under atmospheric conditions less than 200 ° C exhibit. At present it is preferred to use nitromethane as a volatile organic solvent to use.

Zusätzlich zur Verwendung des flüchtigen Lösungsmittels wird ein organischer flüssiger Weichmacher als zweite Komponente der Gießlösung verwendet. Die CA/CAB-Mischung ist auch in dem Weichmacher löslich. Dieser Weichmacher ist dadurch charakterisiert, dass er einen Siedepunkt von höher als etwa 200°C aufweist und in der Lage sein muss, das CA und das CAB miteinander verträglich zu machen (d. h. zur Bildung eines homogenen CA/CAB-Films zu führen). Zu beispielhaften organischen flüssigen Weichmachern gehören die Phthalate, Phosphate, Lactone und Ester von aliphatischen dibasischen Säuren, Kampfer und dgl. Besonders bevorzugt sind die Lactone, beispielsweise γ-Butyrolacton und Valerolacton. γ-Butyrolacton ist derzeit ganz besonders bevorzugt.In addition to Use of the volatile solvent becomes an organic liquid Plasticizer used as a second component of the casting solution. The CA / CAB mix is as well soluble in the plasticizer. This plasticizer is characterized by having a boiling point from higher as about 200 ° C and be able to connect the CA and the CAB compatible (i.e., to form a homogeneous CA / CAB film). To exemplary organic liquid Plasticizers belong to the Phthalates, phosphates, lactones and esters of aliphatic dibasic acids, Camphor and the like. Particularly preferred are the lactones, for example γ-butyrolactone and valerolactone. γ-butyrolactone is currently very much preferred.

Eine der überraschenden Eigenschaften des Butyrolactons und Valerolactons besteht darin, dass sie hohe Siedepunkte für derart kleine Moleküle aufweisen.A the surprising Properties of the butyrolactone and valerolactone is that they have high boiling points for such small molecules exhibit.

Es wird angenommen, dass das leicht flüchtige Lösungsmittel die Gießlösung schnell verlässt, während der Weichmacher die Lösung viel langsamer verlässt und schließlich die Poren in der Schicht definiert, wenn er aus dieser austritt. Es ist bevorzugt, dass der Weichmacher einen Siedepunkt hat, der um etwa 45°C (80°F) höher ist als der Siedepunkt des flüchtigen organischen Lösungsmittels. Da das leicht flüchtige organische Lösungsmittel die Lösung zuerst verlässt, nimmt die Viskosität des Films schnell genug zu, sodass er nicht mehr merklich fließt oder durchhängt, nachdem er gegossen worden ist. Der Weichmacher gewährleistet, dass der gegossene Film seine Struktur-Integrität beibehält, wobei die Poren in dem Film dann gebildet werden, wenn das Weichmacher-Lösungsmittel verdampft.It It is believed that the volatile solvent quickly dissolves the casting solution leaves, while the plasticizer is the solution leaves much slower and finally defines the pores in the layer as it exits from it. It is preferred that the plasticizer has a boiling point that is about 45 ° C (80 ° F) higher as the boiling point of the volatile organic solvent. Because the volatile organic solvents the solution first leaves, takes the viscosity fast enough so that it does not flow noticeably or sags, after being poured. The plasticizer ensures that the cast film retains its structural integrity, with the pores in the Film then be formed when the plasticizer solvent evaporated.

Das erste Lösungsmittel und das zweite Lösungsmittel können in einem breiten Bereich der Zugabe zu den Celluloseestern verwendet werden. Das Volumenverhältnis von flüchtigem organischem Lösungsmittel zu Weichmacher kann beispielsweise von (0,5 bis 1,5) : 1 variieren, wobei ein Lösungsmittel : Weichmacher-Verhältnis von etwa 1 : 1 derzeit bevorzugt ist.The first solvent and the second solvent can used in a wide range of addition to the cellulose esters become. The volume ratio of fleeting organic solvent too Plasticizer can vary, for example, from (0.5 to 1.5): 1, being a solvent : Plasticizer ratio of about 1: 1 is currently preferred.

Das flüchtige organische Lösungsmittel und der Weichmacher müssen im Wesentlichen frei von Verunreinigungen mit hohem Molekulargewicht sein, weil diese Verunreinigungen konzentriert würden, wenn der Film trocknet, und einen übermäßig großen Einfluss auf den Film ausüben würden aufgrund ihres Prozentsatzes in dem Ausgangs-Lösungsmittel.The volatile organic solvents and the plasticizer need essentially free of high molecular weight contaminants because these impurities would be concentrated as the film dries, and an overly large influence to exercise the film would due to their percentage in the starting solvent.

Die Gestalt des Weichmacher-Moleküls kann ebenfalls einen Einfluss auf die Porengeometrie der Sperrschicht haben. Nach dem derzeitigen Wissensstand bewegen sich lineare Moleküle durch "Schlängeln" (d. h. in einer schlangenartigen Bewegung), sodass der Weichmacher durch eine sehr unregelmäßige und gewundene Pore entweichen kann. Andererseits hat ein im Wesentlichen kugelförmiges Molekül wie γ-Butyrolacton einen definierten Durchmesser und führt zu einer Pore, die mindestens so groß wie der Durchmesser ist, um entweichen zu können. Dies lässt darauf schließen, dass mehr kugelförmige Weichmacher-Moleküle eine besser definierte Pore bilden, wenn sie aus dem Film austreten.The Shape of the plasticizer molecule also has an influence on the pore geometry of the barrier layer to have. According to the current state of knowledge, linear molecules move through "meandering" (ie in a snake-like movement), so that the plasticizer through a very irregular and winding pore can escape. On the other hand, one has essentially spherical molecule such as γ-butyrolactone one defined diameter and leads to a pore that is at least as big as the diameter, to escape. This leaves to conclude that more spherical Plasticizer molecules one form better defined pores as they exit the film.

Zusätzlich zu dem Lösungsmittel und dem Weichmacher, wie sie vorstehend beschrieben worden sind, kann erforderlichenfalls auch ein Verdünnen oder Verdünnungsmittel zugegeben werden, um die Viskosität der Gießlösung genau steuern zu können. Als geeignete Beispiele können genannt werden Isopropanol, Methylethylketon und Ethylacetat. Das Verdünnungsmittel kann in einer Gewichtsmenge von etwa (0,5 bis 1,5) : 1, bezogen auf das Gewicht des zugegebenen Weichmachers, zugesetzt werden. Derzeit ist es bevorzugt, Isopropanol als Verdünnungsmittel zu verwenden, das in einen Menge von 0,88 Gew.-Teilen Isopropanol pro Gew.-Teil Weichmachers vorliegt.In addition to the solvent and the plasticizer as described above If necessary, it may also contain a diluent or diluent can be added to precisely control the viscosity of the casting solution. When suitable examples can are called isopropanol, methyl ethyl ketone and ethyl acetate. The thinner may be in an amount by weight of about (0.5 to 1.5): 1, based to the weight of added plasticizer. At present it is preferred to use isopropanol as a diluent, in an amount of 0.88 parts by weight of isopropanol per part by weight Plasticizer is present.

Die Celluloseester werden dem leicht flüchtigen organischen Lösungsmittel und dem Weichmachers in einer ausreichenden Menge zugesetzt, um 10 bis 40 gew.-%ige Lösungen von (Celluloseestern) : (Gesamtgewicht von Celluloseestern + Lösungsmittel + Weichmacher) zu ergeben.The Cellulose esters become the volatile organic solvent and the plasticizer in an amount sufficient to 10 to 40% strength by weight solutions of (cellulose esters): (total weight of cellulose esters + solvent + Plasticizer).

Das Celluloseacetatbutyrat (CAB), das verwendet wird, umfasst eine Mischung von Celluloseessigsäureestern und -buttersäureestern. Handelsübliche CABs sind abgestuft entsprechend ihrem Butyryl-Gehalt von 17, 27, 38 und 50%. Besonders bevorzugt ist derzeit ein CAB-Produkt, das 28 bis 31% Acetylgruppen und etwa 16 Butyrylgruppen aufweist. Dieses Produkt ist erhältlich von der Firma Eastman Kodak.The Cellulose acetate butyrate (CAB) used comprises a mixture of cellulose acetic acid esters and butyric acid esters. commercial CABs are graded according to their butyryl content of 17, 27, 38 and 50%. Particularly preferred is currently a CAB product, the 28 to 31% acetyl groups and about 16 butyryl groups. This Product is available from the company Eastman Kodak.

Was den Aufbau der Trägerschicht gemäß der vorliegenden Erfindung angeht, so ist die Trägerschicht 30 vorzugsweise mit großen Poren in der Größenordnung von mindestens 300 Å-Einheiten im Durchmesser ausgestattet. Die Schicht 30 hat vorzugsweise eine Porendichte von weniger als 6 × 10⁸ Poren/cm² und eine Porosität (Porengröße × Porendichte × 100) zwischen 0,001 und 0,200%. Semipermeable Filme, die diese Eigenschaften aufweisen, sind von der Firma Poretics, Inc., Livermore, Californien, erhältlich.As for the construction of the carrier layer according to the present invention, the carrier layer is 30 preferably equipped with large pores on the order of at least 300 Å units in diameter. The layer 30 preferably has a pore density of less than 6 × 10 ⁸ pores / cm ² and a porosity (pore size × pore density × 100) between 0.001 and 0.200%. Semipermeable films having these properties are available from Poretics, Inc., Livermore, California.

Am meisten bevorzugt umfasst die Schicht 30 Poren in der Größenordnung von 31 bis 75 nm (310–750 Å-Einheiten) im Durchmesser und einen Prozentsatz der Porosität von 1 × 10^–1 bis 5 × 10^–3. Besonders bevorzugt ist eine Polycarbonatschicht mit einer Porengröße von etwa 310 Å-Einheiten und mit einer Porendichte von 1 × 10⁸ Poren/cm² und einem resultierenden Prozentsatz der Porosität von 7,53 × 10^–2.Most preferably, the layer comprises 30 Pores of the order of 31 to 75 nm (310-750 Å units) in diameter and a porosity percentage of 1 x 10 ^-1 to 5 x 10 ^-3 . Particularly preferred is a polycarbonate layer having a pore size of about 310 Å units and having a pore density of 1 x 10 ⁸ pores / cm ² and a resulting percentage porosity of 7.53 x 10 ^-2 .

Zu Beispielen für andere beispielhafte semipermeable Filme, die als Schicht 30 verwendbar sind, gehören die folgenden:Examples of other exemplary semipermeable films used as a layer 30 are usable, include the following:

Wie vorstehend erläutert, wird das Enzym 34 in der Regel zwischen der Sperrschicht 32 und der Trägerschicht 30 immobilisiert durch Verwendung von Glutaraldehyd oder eines ähnlichen Klebstoffes und/oder Vernetzungsmittels. Eine Lösung, die etwa 1 bis 15 Gew.-% Glutaraldehyd enthält, wird mit dem Enzym 34 gemischt. In der Regel wird eine Pufferlösung dem Glutaraldehyd-Enzym zugemischt, um eine vorteilhafte pH-Umgebung von 4 bis 9 aufrechtzuerhalten, sodass die Reaktion, die in der Enzymschicht abläuft, unter verhältnismäßig konstanten günstigen Bedingungen abläuft. Insgesamt beträgt die Dicke dieser Schicht oder dieser Enzym enthaltenden Matrix 0,1 bis 0,2 μm.As explained above, the enzyme 34 usually between the barrier layer 32 and the carrier layer 30 immobilized by using glutaraldehyde or a similar adhesive and / or crosslinking agent. A solution containing about 1 to 15% by weight of glutaraldehyde is reacted with the enzyme 34 mixed. Typically, a buffer solution is admixed with the glutaraldehyde enzyme to maintain a favorable pH environment of 4 to 9 so that the reaction occurring in the enzyme layer proceeds under relatively constant favorable conditions. Overall, the thickness of this layer or matrix containing this enzyme is 0.1 to 0.2 microns.

Bei der Herstellung der Laminat-Membranen ist die Enzym enthaltende Mischung, die den Puffer enthält, zwischen der Trägerschicht und der Sperrschicht angeordnet. Man kann eine leichte Druckkraft darauf einwirken lassen, um eine Struktur vom Sandwichtyp zu erhalten. Die Laminat-Struktur lässt man dann bei Umgebungsbedingungen und/oder in einem Ofen trocknen. Bevorzugte Bedingungen erfordern eine Lufttrocknung von etwa einer halben Stunde, woran sich eine Ofentrocknung für etwa 30 min bei etwa 45°C anschließt.at The preparation of the laminate membranes is the enzyme-containing Mixture containing the buffer between the carrier layer and the barrier layer arranged. You can have a slight compressive force let it act to obtain a sandwich-type structure. The laminate structure leaves you then dry at ambient conditions and / or in an oven. Preferred conditions require air drying of about one half an hour, followed by oven drying for about 30 minutes at about 45 ° C followed.

O-Ringe oder dgl. können dann auf die äußere Oberfläche der Laminat-Membran aufgeklebt werden, um die Verwendung der Membran in dem gewünschten analytischen Instrument, beispielsweise einem YSI Modell 2700-Analysator zu erleichtern. Diese Membranen werden vorzugsweise vor der Verwendung gekühlt.O-rings or the like. Can then on the outer surface of the Laminate membrane to be glued to the use of the membrane in the desired analytical instrument, such as a YSI Model 2700 analyzer to facilitate. These membranes are preferably before use cooled.

Völlig überraschend wurde gefunden, dass verminderte Mengen an Puffer in der Pufferlösung, die dem Enzym zugemischt wird, tatsächlich die Linearität des Ansprechverhaltens des Sensors erhöhen. Ohne dass der Anmelder an irgendeine spezielle Arbeitstheorie gebunden ist, wird angenommen, dass die verminderte Menge an Puffer in der immobilisierten Enzym-Matrix tatsächlich dazu dient, die Dichte der ein Enzym enthaltenden Matrix zu erhöhen, wodurch das Fließen von Glucose oder eines anderen Analyten zu der und durch die Enzymschicht hindurch gehemmt wird.Completely surprising It was found that reduced amounts of buffer in the buffer solution, the actually added to the enzyme the linearity increase the response of the sensor. Without the applicant is bound to any specific theory of work, it is believed that the reduced amount of buffer in the immobilized enzyme matrix indeed serves to increase the density of the enzyme-containing matrix, thereby the flow from glucose or other analyte to and through the enzyme layer is inhibited.

Der Puffer liegt in der Immobilisierungslösung vorzugsweise in einer Menge zwischen etwa 0,001 und 0,1 mol vor. Besonders bevorzugt liegt er in einer Menge von etwa 0,001 bis 0,050 mol vor. Am meisten bevorzugt liegt die Puffer-Konzentration in dem Bereich zwischen etwa 0,001 und 0,005 mol. Auf der Basis der derzeit verfügbaren Daten sollte die Puffer-Konzentration insbesondere etwa 0,001 M betragen.The buffer is preferably present in the immobilizing solution in an amount between about 0.001 and 0.1 mol. It is particularly preferably present in an amount of about 0.001 to 0.050 mol. Most be Preferably, the buffer concentration is in the range between about 0.001 and 0.005 mol. Specifically, based on currently available data, the buffer concentration should be about 0.001M.

Bei der kommerziellen Praxis des Standes der Technik war es bisher üblich, Puffersalz-Konzentrationen in der Enzym-Immobilisierungs-Matrix von etwa 0,029 bis 0,043 mol zu verwenden. Die so hergestellten Enzymschichten wurden jedoch in Kombination mit verdünnten Glucoseprobe-Analysen verwendet, bei denen die äußere Polycarbonat-Trägerschicht der Laminat-Anordnung in der Regel Porengrößen in der Größenordnung von etwa 300 Å aufwies bei einer Porendichte von 6 × 10⁸ Poren/cm². Aufgrund dieser kommerziellen Praxis des Standes der Technik war es nicht zu erwarten, dass die Absenkung der Puffer-Konzentration, um im Effekt die Dichte der Enzymschicht zu erhöhen, zu einer erhöhten Linearität bei der Durchfüh rung der Messungen von unverdünntem Blut oder Plasma führen würde; insbesondere in Kombination mit der gleichzeitigen Verwendung von Porengrößen der Trägerschicht in der Größenordnung von etwa 300 Å und größer und Porendichten von weniger als 6 × 10⁸ Poren/cm².In the commercial practice of the prior art, it has heretofore been common to use buffer salt concentrations in the enzyme immobilization matrix of about 0.029 to 0.043 moles. However, the enzyme layers so prepared were used in combination with dilute glucose sample analyzes in which the outer polycarbonate backing layer of the laminate array typically had pore sizes on the order of about 300 Å with a pore density of 6x10 ⁸ pores / cm ² , Due to this commercial practice of the prior art, lowering the buffer concentration to effectively increase the density of the enzyme layer would not be expected to result in increased linearity in making the measurements of undiluted blood or plasma; especially in combination with the simultaneous use of carrier layer pore sizes on the order of about 300 Å and larger and pore densities of less than 6 x 10 ⁸ pores / cm ² .

Was die speziellen Puffer-Lösungen angeht, die verwendet werden können, so sind diese nicht kritisch. Der Puffer sollte jedoch in der Lage sein, den pH-Wert der das Enzym enthaltenden Schicht innerhalb des Bereiches von etwa 4 bis 9 zu halten. Beispielhafte Puffer-Zusammensetzungen sind solche, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, und sie umfassen:
Essigsäure – Natriumacetat
Ammoniumhydroxid – Ammoniumchlorid
Puffer auf Phosphatbasis
Puffer auf Carbonatbasis
Puffer auf Citratbasis
Puffer auf Succinatbasis
Puffer auf Glycinbasis
Puffer auf Maleatbasis
und allgemein alle biochemischen Puffer, die auf den Seiten 79 bis 82 von "Concise Encyclopedia Biochemistry", zweite Auflage, Walter de Gruyter, 1988, aufgezählt sind.As for the special buffer solutions that can be used, these are not critical. However, the buffer should be able to maintain the pH of the enzyme-containing layer within the range of about 4 to 9. Exemplary buffer compositions are those known in the art and include:
Acetic acid - sodium acetate
Ammonium hydroxide - ammonium chloride
Phosphate-based buffer
Buffer based on carbonate
Citrate-based buffer
Succinate-based buffer
Glycine-based buffer
Buffer based on maleate
and generally all biochemical buffers enumerated on pages 79 to 82 of "Concise Encyclopedia Biochemistry", Second Edition, Walter de Gruyter, 1988.

Der Puffer, der in den in den nachstehend beschrieben Beispielen 1 und 2 durchgeführten Untersuchungen verwendet worden ist, ist ein Trinatriumcitrat/Bernsteinsäure-Puffer, in dem die Citrat-Verbindung in einem Gewichtsverhältnis von etwa 8 : 1, bezogen auf das Gewicht der Bernsteinsäure, vorliegt. Diese Verbindungen werden mit etwa 0,25 Gew.-Teilen, bezogen auf die Bernsteinsäure, eines Kaliumsalzes von EDTA gemischt. Dieser spezielle Puffer weist einen brauchbaren pH-Bereich von nicht mehr als 4,0 bis 6,0 auf.Of the Buffer used in Examples 1 and 2 described below 2 performed Has been used, is a trisodium citrate / succinic acid buffer, in which the citrate compound is in a weight ratio of about 8: 1, based on the weight of succinic acid. These compounds are used at about 0.25 parts by weight, based on succinic acid, a potassium salt of EDTA mixed. This special buffer has a useful pH range of not more than 4.0 to 6.0.

Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, auf welche die Erfindung jedoch in keiner Weise eingeschränkt ist, näher beschrieben. Die nachstehend beschriebenen Beispiele dienen lediglich der Erläuterung der Arbeitsprinzipien der Erfindung.The Invention will be described below with reference to the following examples, to which, however, the invention is in no way limited, described in more detail. The examples described below are illustrative only the working principles of the invention.

Beispiel 1example 1

Um die Effekte einer Änderung der Konzentration des Puffers (pH 5,4–5,6 Natriumcitrat/Bernsteinsäure), der in der Enzym-Immobilisierungs-Matrix einer Glucoseoxidase enthaltenden Laminat-Membran vom Newman-Typ verwendet wurde, zu bewerten, wurden die folgenden Verfahrensmaßnahmen durchgeführt.Around the effects of a change the concentration of the buffer (pH 5.4-5.6 sodium citrate / succinic acid), the in the enzyme immobilization matrix of a glucose oxidase-containing Newman-type laminate membrane was used to evaluate the following procedures carried out.

1. Materialien1. Materials

Glucoseoxidase-Membranen wurden hergestellt unter Verwendung einer Celluloseacetat/Celluloseacetatbutyrat-Membran (Dicke 1 bis 2 μm), die unter Verwendung von YSI als innerer Schicht und einer 10 μm dicken äußeren Polycarbonat-Membran mit einer durchschnittlichen Porengröße im Durchmesser von 310 Å und einer Porendichte von 1 × 10⁸ Poren/cm² hergestellt wurden.Glucose oxidase membranes were prepared using a cellulose acetate / cellulose acetate butyrate membrane (thickness 1 to 2 μm) using YSI as the inner layer and a 10 μm thick outer polycarbonate membrane having an average pore size of 310 Å in diameter and a pore density of 1 × 10 ⁸ pores / cm ² .

2. Membranaufbau2. Membrane structure

a) 10 mg glucose oxidase (BMC catalog # 105 105) were dissolved in 100 μL DI H 2 O and stirred for 10 minutes until dissolution was complete.
b) 150 μL of a 2.5% glutaraldehyde solution containing the citrate / succinate buffer mentioned above was added to the enzyme / H 2 O solution and then the combined solution was stirred for 60 minutes at room temperature.
c) A small drop of the resulting solution (ie the solution obtained in step (b)) was added de then applied to the surface of the cellulose acetate membrane.
d) Then it became a piece the polycarbonate membrane immediately placed on top of this solution and the solution was spread / spread between the two layers.
e) Then a slight pressure on a large rubber stopper acted on, over the surface of the laminate was rolled, and it became an absorbent fabric used to add the excess solution too absorb.
f) Then the membrane was left in air at room temperature for 30 minutes dried and then dried for 30 minutes at 45 ° C in the oven.
g) Then, silicone rubber O-rings were applied to the outer surface of the Laminate membrane glued to the use of the membrane in the facilitate analytical test instrument.

Das obige Verfahren wurde mehrmals wiederholt, wobei nur die Konzentration des der 2,5%igen Glutaraldehyd-Lösung zugesetzten Citrat/Succinat-Puffers geändert wurde. Alle Membranen wurden bis zu ihrer Bewertung in einem Kühlschrank aufbewahrt.The above procedure was repeated several times, with only the concentration of the 2.5% glutaraldehyde solution added citrate / succinate buffer was changed. All membranes were stored in a refrigerator until evaluated.

3. Membran-Bewertungsverfahren3. Membrane evaluation method

Die Membranen wurden bewertet in einem YSI Modell 2700 Select-Doppelkanal-Analysator unter Verwendung eines YSI 2357 Phosphat-Puffers (pH 7,2) als innerem Puffer. Es wurden acht Membranen jedes Typs bewertet, eine auf jeder von acht verschiedenen Wasserstoffperoxid-Elektroden. Nachdem die Membranen in das Instrument eingebaut worden waren und der angegebene Hintergrund-Strom auf unter 6 nAs gefallen war, wurde eine Eichung durchgeführt unter Verwendung einer bekannten 40 g/l Glucose-Lösung. (Die tatsächliche Glucose-Konzentration in der 2700-Probenkammer betrug 2 g/l oder 200 mg% aufgrund des Umstandes, dass je de Probe automatisch in einem Verdünnungs-Verhältnis von 20 : 1 verdünnt wurde, wenn sie in den Probenkanal des 2700-Instruments injiziert wurde).The Membranes were evaluated in a YSI Model 2700 Select Dual Channel Analyzer Using a YSI 2357 phosphate buffer (pH 7.2) as internal Buffer. Eight membranes of each type were evaluated, one on each of eight different hydrogen peroxide electrodes. after the Membranes were installed in the instrument and the specified Background current had fallen below 6 nas, became a gauge carried out using a known 40 g / l glucose solution. (The actual Glucose concentration in the 2700 sample chamber was 2 g / l or 200 mg% due to the fact that each de sample automatically in one Dilution ratio of Diluted 20: 1 when injected into the sample channel of the 2700 instrument has been).

Dann wurde eine Reihe von Glucose-Lösungen, die einen breiten Konzentrationsbereich abdeckten, in dreifacher Ausfertigung untersucht. Eine 3 mg%-Wasserstoffperoxid-Lösung (ohne Glucose) wurde ebenfalls als eine Probe untersucht. Die Plateau-Ströme (bei einer Ablesezeit von 30 s) der Glucose-Ablesungen und die Steigungen bzw. Anstiege der Response- bzw. Antwort-Kurven wurden tabellarisch dargestellt (die Steigung der Response-Kurve ist ein Maß für die Ansprech-Geschwindigkeit und sie wird bestimmt durch Verwendung von 10 Ablesungen zwischen 20 und 30 s nach der Probeninjektion und Berechnung der durchschnittlichen Änderung des Stromes pro min).Then was a series of glucose solutions, which covered a wide concentration range, in threefold Examined. A 3 mg% hydrogen peroxide solution (without Glucose) was also tested as a sample. The plateau currents (at a reading time of 30 s) of the glucose readings and the slopes and increases in the response and response curves, respectively, were tabulated (The slope of the response curve is a measure of the response speed and it is determined by using 10 readings between 20 and 30 s after the sample injection and calculation of the average change of the current per minute).

Für jeden Membran-Typ wurden der durchschnittliche Plateau-Strom, die durchschnittliche Steigung (Anstieg) und die durchschnittliche Glucose-Ablesung, die für jede Lösung erhalten wurden, errechnet.For each Membrane type were the average plateau current, the average Slope (increase) and the average glucose reading, the for every solution were obtained, calculated.

4. Ergebnisse4. Results

Die als Ergebnis der Untersuchung erhaltenen Daten sind in den folgenden Tabellen 1 bis 3 angegeben.The data obtained as a result of the study are in the following Tables 1 to 3 indicated.

Tabelle 1

Table 1

Tabelle 2

Table 2

Tabelle 3

Table 3

In den Daten können einige signifikante Trends festgestellt werden. Erstens hat der für jede gegebene Glucose-Lösung erhaltene durchschnittliche Plateau-Strom die Neigung, mit steigender Konzentration des Citrat/Succinat-Puffers in der Glucose-Immobilisierungs-Matrix anzusteigen. Dies ist insbesondere dargestellt in der 2 für die Response bzw. Ansprechempfindlichkeit gegenüber der 40 g/l-Eichsubstanz. Die 3 zeigt, dass genau der gleiche Ansprechempfindlichkeitstrend zu beobachten ist für die 3 mg% Wasserstoffperoxid-Lösung, wenn die Konzentration des Citrat/Succinat-Puffers ansteigt. Am bedeutsamsten ist, dass der lineare Bereich der Membran zunimmt, wenn die Puffer-Konzentration abnimmt. Dies wird in der 4 erläutert, die das durchschnittliche Ergebnis zeigt, das erhalten wurde für jeden der hergestellten Membran-Typen bei hohen Glucose-Konzentrationen.There are some significant trends in the data. First, the average plateau current obtained for any given glucose solution tends to increase with increasing concentration of the citrate / succinate buffer in the glucose immobilization matrix. This is particularly shown in the 2 for the response or responsiveness to the 40 g / l calibration substance. The 3 shows that exactly the same response trend is observed for the 3 mg% hydrogen peroxide solution as the concentration of citrate / succinate buffer increases. Most significantly, the linear area of the membrane increases as the buffer concentration decreases. This is in the 4 which shows the average result obtained for each of the manufactured membrane types at high glucose concentrations.

Beispiel 2Example 2

Die in dem obigen Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, dass ein anderer Trägerschicht-Aufbau für die Laminat-Membran verwendet wurde. In diesem Beispiel bestand die Trägerschicht 30 aus einer Polycarbonatschicht mit einer durchschnittlichen Porengröße von 686 Å-Einheiten und einer Porendichte von 6 × 10⁶ Poren/cm². Die 5, 6 und 7 zeigen jeweils die Glucose-Response bzw. -Ansprechempfindlichkeit, die Wasserstoffperoxid-Response bzw. -Ansprechempfindlichkeit und den errechneten Glucosemesswert.The procedures described in Example 1 above were repeated, except that a different backing layer construction was used for the laminate membrane. In this example, the carrier layer was 30 of a polycarbonate layer having an average pore size of 686 Å units and a pore density of 6 × 10 ⁶ pores / cm ² . The 5 . 6 and 7 each show the glucose response, the hydrogen peroxide response, and the calculated glucose reading.

Die Ergebnisse sind vergleichbar mit denjenigen, die in den 2, 3 und 4 angegeben sind und stützen die Schlussfolgerung, dass ein Puffersalz-Effekt bei größeren Porengrößen und niedrigeren Porendichten vorliegt.The results are comparable to those found in the 2 . 3 and 4 and support the conclusion that a buffer salt effect is present at larger pore sizes and lower pore densities.

Beispiel 3Example 3

Die in dem obigen Beispiel 1 angegebenen Verfahren wurden wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, dass eine andere Pufferlösung und ein anderer Aufbau der Trägerschicht 30 wie nachstehend angegeben verwendet wurden: Puffer-Lösung NaH₂PO₄) vorliegend in einem Gewichtsverhältnis von monobasischem Na₂H PO₄) Phosphat zu dibassischem Phosphat von etwa 0,54 : 1 pH-Wert etwa 7,0 The procedures given in Example 1 above were repeated, but with the exception that that another buffer solution and another structure of the carrier layer 30 were used as follows: Buffer solution NaH ₂ PO ₄ ) present in a weight ratio of monobasic Na ₂ H PO ₄ ) Phosphate to dibasic phosphate of about 0.54: 1 pH about 7.0

Aufbau der Trägerschicht 30Structure of the carrier layer 30

polycarbonate
Pore diameter 343 Å units
Pore density 1 × 10 8

Die als Ergebnis der Verfahren des Beispiels 3 erhaltenen Daten sind in den 8 bis 10 dargestellt. Diese Daten stimmen vollständig überein mit denjenigen, die für die Beispiele 1 und 2 angegeben sind und sie zeigen erneut, dass ungeachtet des verwendeten Puffer-Typs und des angewendeten pH-Wertes der lineare Bereich der Membranen zunimmt, wenn die Puffer-Konzentration der während der Enzym-Immobilisierungsstufe verwendeten Puffer-Lösung abnimmt.The data obtained as a result of the methods of Example 3 are shown in FIGS 8th to 10 shown. These data are fully consistent with those given for Examples 1 and 2 and again show that, regardless of the type of buffer used and the pH applied, the linear area of the membranes increases as the buffer concentration increases during the Enzyme immobilization step used decreases buffer solution.

Es sei darauf hingewiesen, dass die Molarität der oben angegebenen Puffer-Lösungen bezogen ist auf die Konzentration des Puffers in der Lösung, wenn er mit dem Enzym während der Enzym-Immobilisierungsphase gemischt wird vor dem Trocknen der Membran. Nach dem Trocknen beträgt jedoch die Konzentration des Puffers, der in der Enzym-Schicht verbleibt, im Allgemeinen etwa 1 × 10^–4 bis 1 × 10^–8 mol/cm² Enzymschicht.It should be noted that the molarity of the above-mentioned buffer solutions is based on the concentration of the buffer in the solution when it is mixed with the enzyme during the enzyme immobilization phase before the membrane is dried. After drying, however, the concentration of the buffer remaining in the enzyme layer is generally about 1 × 10 ^-4 to 1 × 10 ^-8 mol / cm ^{2 of the} enzyme layer.

Ohne dass der Anmelder an irgendeine spezielle Arbeitstheorie gebunden ist, wird angenommen, dass die Kombination von verbessertem dynamischem Bereich und verminderter Empfindlichkeit, die festzustellen ist, wenn die Puffersalz-Konzentration abnimmt, nur zurückgeführt werden kann auf eine Zunahme der Dichte der Enzymschicht. Tatsächlich gibt es Literatur, in der angegeben ist, dass die Permeabilität der immobilisierten Enzymschicht wichtig sein kann bei der Bestimmung der Response- bzw. Ansprechempfindfichkeits-Charakteristiken einer Enzym-Elektrode (A. Neikov und S. Sokolov, "Analytica Chimica ACTA", 307 (1995) Seiten 27–36, und M. Mutlu und S. Mutlu, "Biotechnology Techniques", 9, Nr. 4 (1995), Seiten 277–282). Niemand hat jedoch bisher jemals gezeigt, dass die Dichte der Enzymschicht in einem Drei-Schichten-Laminat des Newman-Typs bis zu einem Punkt erhöht werden könnte, bei dem der dynamische Bereich erhalten werden kann, der für eine klinische Glucose-Messung mit unverdünntem Vollblut erforderlich ist.Without that the applicant is bound by some special working theory is, it is believed that the combination of improved dynamic Range and diminished sensitivity, which is when the buffer salt concentration decreases, only be recycled may indicate an increase in the density of the enzyme layer. Actually there there literature, in which it is stated that the permeability of the immobilized Enzyme layer may be important in determining response characteristics an enzyme electrode (A. Neikov and S. Sokolov, "Analytica Chimica ACTA ", 307 (1995) Pages 27-36, and M. Mutlu and S. Mutlu, "Biotechnology Techniques ", 9, No. 4 (1995), pages 277-282). Nobody however, has ever shown that the density of the enzyme layer in a three-layer Newman-type laminate to a point elevated could be in which the dynamic range can be obtained, which for a clinical Glucose measurement with undiluted Whole blood is required.

Es sei betont, dass die in den 2 bis 10 dargestellten Ergebnisse unter Umständen erhalten wurden, bei denen die wässrige Glucose-Probe im Verhältnis 1 : 20 in einem voroxygenierten und gepufferten Verdünnungsmittel verdünnt wurden. Die in den 2, 4, 5, 7, 8 und 10 angegebenen Glucose-Konzentrationen sollten daher durch 20 dividiert werden, um repräsentativ zu sein für die tatsächlichen Glucose-Konzentrationen, die vom Sensor festgestellt werden. Wenn nun das obere Ende des klinisch relevanten Glucose-Konzentrationsbereiches 900 mg% oder 9 g/l (unverdünnt) ist, würde diese Konzentration in den 4, 7 und 10 durch den 180 g/l (20 × 9 g/l)-Datenpunkt repräsentiert. Obgleich die Daten erkennen lassen, dass die Genauigkeit bei 180 g/l nicht stark beeinflusst wird durch die Herstellung von Membranen unter Verwendung von Puffersalz-Konzentrationen bei oder unter 0,1 mol, wurden diese Ergebnisse bei höheren Sauerstoff-Konzentrationen erhalten als sie üblicherweise im Vollblut zu finden sind. Da gezeigt wurde, dass die Linearität von Sensoren dieses Typs im Allgemeinen begrenzt ist durch die Sauerstoff-Konzentration, wird angenommen, dass die für jeden gegebenen Membran-Typ beobachtete Nicht-Linearität bei niedrigen Sauerstoff-Konzentrationen schlechter wäre.It should be stressed that in the 2 to 10 may be obtained in circumstances where the aqueous glucose sample was diluted 1:20 in a preoxygenated and buffered diluent. The in the 2 . 4 . 5 . 7 . 8th and 10 glucose concentrations should therefore be divided by 20 to be representative of the actual glucose concentrations detected by the sensor. Now, if the upper end of the clinically relevant glucose concentration range is 900 mg% or 9 g / L (neat), this concentration would be in the 4 . 7 and 10 represented by the 180 g / l (20 x 9 g / l) data point. Although the data indicate that the accuracy at 180 g / l is not greatly affected by the preparation of membranes using buffer salt concentrations at or below 0.1 mol, these results were obtained at higher oxygen concentrations than commonly used in the art Whole blood can be found. Since it has been shown that the linearity of sensors of this type is generally limited by the oxygen concentration, it is believed that the non-linearity observed for any given membrane type would be inferior at low oxygen concentrations.

Beispiel 4Example 4

Um nachzuweisen, dass der beobachtete vergrößerte dynamische Bereich ein Ergebnis des Anstiegs der Dichte der Enzymschicht ist, wurde eine spezielle Glucoseoxidase-Enzym-Membran hergestellt, deren Gesamtporosität stärker von der Porosität der Enzymschicht abhing als bei dem Standard-Drei-Schichten-Laminat vom Newman-Typ (vgl. oben, Beispiel 1). Dies wurde durchgeführt durch Ersatz sowohl der äußeren Polycarbonat-Membran (1 × 10⁸ Poren/cm², Porendurchmesser 310 Å) als auch der inneren Celluloseacetat-Schicht durch eine sehr poröse Polycarbonat-Membran (6 × 10⁸ Poren/cm², Porendurchmesser 500 Å). Membranen dieses Aufbaus wurden auch in anderen Untersuchungen der Enzymschicht-Dichte verwendet (M. Mutlu und S. Mutlu, "Biotechnology Techniques", 9, Nr. 4 (1995), Seiten 277–282).To demonstrate that the observed increased dynamic range is a result of the increase in density of the enzyme layer, a special glucose oxidase enzyme membrane was made whose overall porosity depended more strongly on the porosity of the enzyme layer than on the Newman standard three-layer laminate Type (see above, Example 1). This was done by replacing both the outer butt lycarbonate membrane (1 × 10 ⁸ pores / cm ² , pore diameter 310 Å) and the inner cellulose acetate layer through a very porous polycarbonate membrane (6 × 10 ⁸ pores / cm ² , pore diameter 500 Å). Membranes of this construction have also been used in other studies of enzyme layer density (Mutalu, M. Mutlu, "Biotechnology Techniques", 9, No. 4 (1995), pages 277-282).

Alle anderen Aufbaumaterialien (einschließlich der "salzfreien" Glucoseoxidase, BMC Katalog Nr. 105 147) und angewendeten Verfahren waren genau die gleichen wie diejenigen, die für die Standard-Laminat-Membran verwendet bzw. angewendet wurden. Dieser Aufbau erlaubt die Bestimmung der Permeabilität der Enzymschicht durch Verwendung eines größeren elektroaktiven Moleküls als es ansonsten ver wendet werden könnte, wenn die Celluloseacetatschicht vorhanden wäre. Dies ist wichtig, weil man erwarten würde, dass die Transportgeschwindigkeit eines größeren Moleküls durch die Enzymschicht empfindlicher gegenüber Änderungen der Dichte der Schicht wäre als diejenige eines kleineren Moleküls. Es wurde Ferrocyanid (M. G. = 211,9) als eine solche Sonde in anderen ähnlichen Studien in Bezug auf die Enzymschicht-Permeabilität/Dichte verwendet und sie wurde auch in dieser Arbeit verwendet (J. F. Castner und L. B. Wingard, "Biochemistry" 23 (1980, Seiten 2203–2310; L. B. Wingard, L. A. Canton und J. F. Castner, "Biochemica et Biophysica Acta", Band 748, 1983 Seiten 21–27).All other building materials (including "salt-free" glucose oxidase, BMC Catalog No. 105 147) and methods used were exactly the same as those the for the standard laminate membrane was used. This Construction allows the determination of the permeability of the enzyme layer by use a larger electroactive molecule otherwise it could be used if the cellulose acetate layer would be present. This is important because you would expect the transport speed of a larger molecule the enzyme layer is more sensitive to changes in the density of the layer would be considered that of a smaller molecule. It was similar to ferrocyanide (M.G. = 211.9) as such a probe in others Enzyme layer permeability / density studies It was also used in this work (J. F. Castner and L.B. Wingard, "Biochemistry" 23 (1980, pages 2203-2310; Wingard, L.A. Canton and J.F. Castner, "Biochemica et Biophysica Acta", Vol. 748, 1983 Pages 21-27).

Innerhalb von 36 h nach der Herstellung wurden die speziellen Doppel-Polycarbonat(DPC)-Membranen installiert und bewertet mit genau dem gleichen Satz von YSI Modell 2700 H₂O₂-Sonden, wie er für die Bewertung der Standard-Membranen eingesetzt wurde. wach dem Anlaufen wurden die Ansprechempfindlichkeiten sowohl für Ferrocyanid als auch für H₂O₂ 30 s nach der Injektion gemessen. Das 2700 System ermöglicht die aperometrische Messung einer elektrisch aktiven Species, wie z. B. von Ferrocyanid, an einer mit 0,7 V polarisierten Platinanode. Der in diesem Systemen verwendete Elektrolyt ist ein 0,05 M PO₄-Puffer mit 1,5 g/l NaCl, der pH-Wert des Elektrolyten beträgt 7,2 (d. h. ein YSI 2357-Puffer).Within 36 hours of manufacture, the special double polycarbonate (DPC) membranes were installed and evaluated using exactly the same set of YSI Model 2700 H ₂ O ₂ probes used in the evaluation of the standard membranes. At start-up, the sensitivities for both ferrocyanide and H ₂ O _{2 were} measured 30 seconds after injection. The 2700 system allows the aperometric measurement of an electrically active species, such. B. of ferrocyanide, to a polarized with 0.7 V platinum anode. The electrolyte used in this system is a 0.05 M PO ₄ buffer with 1.5 g / l NaCl, the pH of the electrolyte is 7.2 (ie, a YSI 2357 buffer).

Die 11 zeigt die Ergebnisse, die bei dieser Studie erhalten wurden. Die Ansprechempfindlichkeit sowohl von Ferrocyanide als auch von H₂O₂ sind gegen die in der Enzymschicht der DPC-Membran verwendete Puffer-Konzentration aufgetragen. Ebenfalls aufgetragen ist darin das molare Response- bzw. Ansprechverhältnis für Ferrocyanid, das errechnet wird durch Dividieren der Ansprechempfindlichkeit für Ferrocyanid durch die Ansprechempfindlichkeit für eine äquimolare Konzentration von H₂O₂. Dieses Verhältnis ist charakteristisch für die tatsächlichen Unterschiede in Bezug auf die Enzymschicht-Permeabilität für die verschiedenen Membran-Typen, weil es so genormt ist, dass die Unterschiede von Sonde zu Sonde und von einer Membran zur anderen Membran eliminiert werden. Dies ist das Ergebnis des Umstandes, dass die Elektroden-Ansprechempfindlichkeit für H₂O₂ von den gleichen Faktoren abhängt wie die Ansprechempfindlichkeit für Ferrocyanid einschließlich der Permeabilität der Polycarbonat-Schichten und der Größe der Arbeitselektrode. Der differenzielle Effekt dieser Faktoren mit Ausnahme des Faktors für die Enzymschicht-Permeabilität ist jedoch verhältnismäßig unempfindlich gegenüber dem Unterschied in Bezug auf die Molekülgröße zwischen H₂O₂ und Ferrocyanid, Dieses Verhältnis kann angewendet werden zur quantitativen Bestimmung der Enzymschicht-Permeabilität, da es die Geschwindigkeit des Ferrocyanid-Transports oder -Strom durch die Enzymschicht, bezogen auf den Transport oder Strom des H₂O₂, darstellt. Es ist klar zu erkennen, dass die Form des molaren Ansprech-Verhältnisses (Ferrocyanid/H₂O₂) in Abhängigkeit von der Puffersalz-Konzentrations-Kurve, die bei den DPC-Membranen erhalten wird (11) genau dem gleichen Trend folgt wie die Glucose-Ansprechempfindlichkeit in Abhängigkeit von der Puffersalz-Konzentrations-Kurve, die bei der Standard-Drei-Schichten-Membran vom Newman-Typ erhalten wird (2).The 11 shows the results obtained in this study. The responsiveness of both ferrocyanides and H ₂ O ₂ are plotted against the buffer concentration used in the enzyme layer of the DPC membrane. Also plotted therein is the molar response ratio for ferrocyanide, which is calculated by dividing the responsiveness to ferrocyanide by the sensitivity to an equimolar concentration of H ₂ O ₂ . This ratio is characteristic of the actual differences in enzyme layer permeability for the different types of membranes because it is so standardized that the differences are eliminated from probe to probe and from one membrane to the other membrane. This is the result of the fact that the electrode responsiveness to H ₂ O ₂ depends on the same factors as the responsiveness to ferrocyanide including the permeability of the polycarbonate layers and the size of the working electrode. However, the differential effect of these factors, except for the enzyme layer permeability factor, is relatively insensitive to the difference in molecular size between H ₂ O ₂ and ferrocyanide. This ratio can be used to quantitatively determine the enzyme layer permeability since it can be used Rate of ferrocyanide transport or current through the enzyme layer based on the transport or flow of H ₂ O ₂ . It can be clearly seen that the shape of the molar response ratio (ferrocyanide / H ₂ O ₂ ) as a function of the buffer salt concentration curve obtained in the DPC membranes ( 11 ) follows exactly the same trend as the glucose responsiveness depending on the buffer salt concentration curve obtained on the standard three-layer Newman-type membrane ( 2 ).

Die Schlussfolgerung ist die, dass die Verbesserung, die in Bezug auf den dynamischen Bereich (d. h., in Bezug auf die Linearität, die bei Standard-Laminat-Enzym-Membranen vom Newman-Typ, die mit abnehmenden Mengen an Puffer in der Immobilisierungs-Matrix hergestellt werden, festzustellen ist, tatsächlich auf die erhöhte Enzymschicht-Dichte, d. h. die verminderte Permeabilität, zurückzuführen ist.The Conclusion is that the improvement in terms of the dynamic range (that is, in terms of linearity, at Standard laminate enzyme membranes of the Newman type, with decreasing amounts of buffer in the immobilization matrix can be established, in fact, on the increased enzyme layer density, d. H. the reduced permeability is due.

Außerdem weisen Membranen, die Enzymschichten enthalten, die eine höhere Dichte aufweisen, dargestellt durch ein durchschnittliches molares Ferrocyanid/H₂O₂-Ansprechverhältnis von 0,05 oder weniger, einen verbesserten linearen Bereich auf, verglichen mit Membranen mit niedrigeren Dichten oder mit durchschnittlichen molaren Ansprechverhältnissen, die größer als 0,05 sind (vgl. 4, 7, 10 und 11).In addition, membranes containing enzyme layers having a higher density, represented by an average molar ferrocyanide / H ₂ O ₂ response ratio of 0.05 or less, have an improved linear range compared to lower density or average molar membranes Response ratios greater than 0.05 (cf. 4 . 7 . 10 and 11 ).

Im Allgemeinen führt jede Zugabe zu der Enzym/Immobilisierungs-Matrix über das Enzym und das Vernetzungsmittel hinaus dazu, die vernetzte Enzymschicht weniger dicht zu machen und die Enzymelektrode weniger linear zu machen. Es wird nicht nur der dynamische Bereich verbessert, wenn Puffer aus der Immobilisierungsmatrix weggelassen wird, sondern es verbessert sich auch die Wiederholbarkeit von Membran zu Membran (vgl. die Größe der Messfehler-Stäbe bei niedriger Puffer- Konzentration gegenüber hoher Puffer-Konzentration in den 2 bis 10). Die Ergebnisse mit Puffersalzen zeigen an, dass ein nachteiliger Effekt auftritt, der mit ihrem Einschluss in der Immobilisierungsmatrix verbunden ist. Dies steht im Widerspruch zu dem konventionellen Wissensstand, wonach Puffer in der Matrix enthalten sein müssen, um den pH-Wert und die Ionen-Konzentration zu steuern, bei der die Reaktion durchgeführt wird (Yacynych, "Advances in Biosensors", Band 2 (1992) (A. P. F. Turner ed.), Seiten 24–25, JAI Press Ltd., London, und I. Chibata "Immobilized Enzymes; Research and Development", Seite 9, (1978), John Wiley and Sons, New York).In general, any addition to the enzyme / immobilization matrix beyond the enzyme and crosslinking agent will render the crosslinked enzyme layer less dense and render the enzyme electrode less linear. Not only is the dynamic range improved when buffer is removed from the immobilization matrix, but also membrane-to-membrane repeatability improves (see size of measurement error bars at low buffer concentration versus high puff) fer concentration in the 2 to 10 ). The results with buffer salts indicate that there is an adverse effect associated with their inclusion in the immobilization matrix. This is in contrast to the conventional wisdom that buffers must be included in the matrix to control the pH and ion concentration at which the reaction is carried out (Yacynych, "Advances in Biosensors", Vol. 2 (1992) (APF Turner ed.), Pp. 24-25, JAI Press Ltd., London, and I. Chibata "Immobilized Enzymes; Research and Development," page 9, (1978), John Wiley and Sons, New York).

Beispiel 5Example 5

Ähnliche Ergebnisse werden erhalten, wenn Rinderserumalbumin (BSA) der Immobilisierungsmatrix einverleibt wird. Es wurden wie in Beispiel 1 beschrieben Membranen hergestellt, jedoch mit der Ausnahme, dass variierende Mengen an Rinderserumalbumin (Fraktion V; Sigma-Katalog Nr. A – 4503) der bei der Herstellung der Membran verwendeten Glucoseoxidase-Wasser-Mischung zugesetzt wurden. Eine äquivalente Menge Glucoseoxidase wurde weggelassen, sodass die Gesamtprotein-Konzentration in 250 μL bei 10 mg konstant gehalten wurde. Die Membranen wurden in dem Modell 2700s wie oben angegeben bewertet.Similar Results are obtained when bovine serum albumin (BSA) is incorporated into the immobilization matrix becomes. Membranes were prepared as described in Example 1, with the exception, however, that varying amounts of bovine serum albumin (Fraction V, Sigma Catalog No. A-4503) used in the preparation added to the membrane used glucose oxidase-water mixture were. An equivalent amount Glucose oxidase was omitted so that the total protein concentration in 250 μL at 10 mg was kept constant. The membranes were in the model 2700s rated as above.

Die 12 erläutert, wie die Linearität von Sensoren, die Glucoseoxidase-Schichten mit steigenden Konzentrationen an BSA enthalten, abnimmt, während die Empfindlichkeit zunimmt. Die angegebenen Glucose-Konzentrationen sind korrigiert für die Verdünnung und zeigen daher entweder die tatsächliche Glucose-Konzentration (Abszisse) oder die errechnete Glucose-Konzentration (Ordinate), die durch den Sensor bestimmt wird. Die rechts von jeder Standardkurve angegebenen Werte stellen die durchschnittlichen Glucose-Empfindlichkeiten in nAs, gemessen bei 2 g/l Glucose, dar. Dies steht ebenfalls im Widerspruch zu dem konventionellen Wissensstand, wonach eine "co-immobilisierende" Glucoseoxidase mit BSA erwünscht ist, weil das BSA irgendwie das Enzym während der Immobilisierung stabilisiert (P. Pantano und W. G. Kuhr, "Electroanalysis", 7 (1995) 406–416). Obgleich die Glucoseempfindlichkeit zunahm mit steigenden BSA-Konzentrationen (auch wenn die Glucoseoxidase wirksam verdünnt worden ist!) ging dies auf Kosten eines verkleinerten linearen Bereiches. Auch dies lässt erkennen, dass die Dichte der Enzymschicht abnimmt, wenn die BSA-Konzentration zunimmt. Es ist interessant darauf hinzuweisen, dass nach bestem Wissen alle früheren Studien in Bezug auf die Enzymschichtdichte mit Glucoseoxidase durchgeführt wurden, die mit BSA coimmobilisiere worden war, und dass die möglichen Effekte von BSA auf die Schichtdichte weder erkannt noch untersucht wurden (vgl. die oben genannten Literaturhinweise von Mutlu et al., Castner et al. und Wingard et al.).The 12 describes how the linearity of sensors containing glucose oxidase layers with increasing concentrations of BSA decreases as sensitivity increases. The indicated glucose concentrations are corrected for dilution and therefore show either the actual glucose concentration (abscissa) or the calculated glucose concentration (ordinate) determined by the sensor. The values given to the right of each standard curve represent the average glucose sensitivities in nAs, measured at 2 g / l glucose. This is also in contradiction to the conventional wisdom that a "co-immobilizing" glucose oxidase with BSA is desirable because the BSA somehow stabilized the enzyme during immobilization (P. Pantano and WG Kuhr, "Electroanalysis", 7 (1995) 406-416). Although glucose sensitivity increased with increasing BSA concentrations (although the glucose oxidase has been effectively diluted!), This was at the expense of a reduced linear region. Again, this indicates that the density of the enzyme layer decreases as the BSA concentration increases. It is interesting to note that to the best of our knowledge, all previous enzyme density studies have been conducted with glucose oxidase coimmobilized with BSA and the potential effects of BSA on the layer density have neither been recognized nor studied (see the above cited references by Mutlu et al., Castner et al., and Wingard et al.).

Schließlich sei darauf hingewiesen, dass die beschriebenen Phänomene nicht für Glucoseoxidase spezifisch sind, sondern auch für andere Enzyme gelten. Frühere Ergebnisse mit Lactatoxidase stützen diese Schlussfolgerung.Finally, be noted that the phenomena described are not specific for glucose oxidase are, but also for other enzymes apply. earlier Support results with lactate oxidase this conclusion.

Claims

Laminated membrane ( 28 ) for use in a polarographic cell array for assaying an analyte in a mixture or solution, the laminated membrane comprising: - an outer layer ( 30 with pores therein, with a pore diameter of more than 27 nm (270 Å), - an inner layer ( 32 ), and - an enzyme layer arranged between the outer layer and the inner layer ( 34 ), characterized in that the enzyme layer ( 34 ) contains a buffer solution therein which is designed to maintain a pH of 4 to 9.0 in the enzyme layer, the buffer being present in the solution in an amount of 1 x 10 ^-6 to 0.1M.

A laminated membrane according to claim 1, wherein the outer layer (30) has a pore diameter of 31 to 75 nm (310 to 750 Å).

The laminated membrane of claim 2, wherein the buffer in the buffer solution in an amount of 0.001 to 0.05 M is present.

A laminated membrane according to claim 3, wherein the buffer in the buffer solution in an amount of 0.001 to 0.005 M is present.

Laminated membrane according to one of the preceding claims, wherein the enzyme layer ( 34 ) further characterized as having a molar response ratio of ferrocyanide: H ₂ O of 0.05 or less.

Laminated membrane according to one of the preceding claims, wherein the outer layer ( 30 ) has a pore density of less than 6 × 10 ⁸ pores / cm ² .

Laminated membrane according to one of the preceding claims, wherein the outer layer ( 30 ) has a porosity of 0.001 to 0.2%.

Use of a laminated membrane according to one of previous claims in a polarographic cell array for examination of a Analyte contained in a sample of undiluted whole blood, plasma or Serum is present.

Process for producing a laminated membrane arrangement according to one of Claims 1 to 7, comprising the steps of: a) providing a porous outer support layer ( 30 ) having a pore diameter greater than 27 nm (270 Å); b) providing an inner barrier layer ( 32 ); c) providing an enzyme-containing mixture containing the buffer solution; d) insertion of the enzyme-containing mixture ( 34 ) between the base layer and the barrier layer, and e) applying a small compressive force such that a sandwich. Structure ( 28 ) is formed.