DD277759A1 - Enzymelektrode zur spezifischen reagenzlosen bestimmung von stoffwechselprodukten - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft eine Enzymelektrode zur spezifischen reagenzlosen Bestimmung von Stoffwechselprodukten. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die klinische Diagnostik und die mikrobiologische Industrie. Die erfindungsgemaesse Enzymelektrode, bei der das Enzym an einer Kohleelektrode adsorbiert oder kovalent fixiert ist, ist dadurch gekennzeichnet, dass entweder die Molekueloberflaeche des Enzyms oder die Elektrodenoberflaeche mit einem Redoxmediator beladen ist. Bevorzugte Redoxmediatoren sind Benzochinon und dessen Derivate, als Enzyme werden bevorzugt Glucoseoxidase, Lactatoxidase, Cholinoxidase oder Cholesteroloxidase eingesetzt.
Description
Die Erfindung bezieht sich auf eine Enzymelektrode zur spezifischen reagendosen Bestimmung von Stoffwechselprodukten. Anwendungsgebiet der Erfindung sind die klinische Diagnostik und die mikrobiologische Industrie.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik ·
Um eine hohe Spezifität bei der Messung mit Enzymelektroden zu erreichen, ist es zweckmäßig, daß die Indikatorelektrode bei einem möglichst geringen Potential arbeitet. Nur so wird erreicht, daß elektrodenaktive Bestandteile der Meßprobe nicht an der Indikatorelektrode kooxidiert werden (Palleschi et ai, Anal. Biochem. 159,114,1986).
Durch die Verwendung von künstlichen Elektronenüberträgern anstelle des natürlichen Kosubstrats Sauerstoff wurde erreicht, daß bei einem erheblich niedrigeren Elektrodenpotential als bei der Anzeige der H2O2-Bildung (+500 bis +90OmV) gearbeitet werden kann, z. B. im Falle der Glucoseoxidase bei Ferrocenverbindungen bei +350 mV, bei Benzochinon bei +100mV (Schläpfer et al. Clin. Chim Acta 57,283,1974; Frew und Hill, Anal. Chem. 59,933 A, 1978; Cass et al. Anal. Chem. 56, 667,1984; Geppertund Asperger, Bioelectrochem. 17,399,1978).
Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, daß dabei die elektrochemischen Interferenzen nur teilweise ausgeschaltet werden.
Das führt zu Meßwertverfälschungen beim Einsatz der Enzymelektroden in der Praxis.
Ziel der Erfindung ist die Ausschaltung von Interferenzen bei der reagenzlosen Messung von Stoffwechselprodukten mit Enzymelektroden.
Die erfindungsgemäße Enzymelektrode zur spezifischen reagenzlosen Bestimmung von Stoffwechselprodukten ist dadurch gekennzeichnet, daß entweder die Moleküloberfläche des Enzyms oder die Elektrodenoberfläche mit einem Redoxmediator beladen ist. Als Redoxmediatoren werden bevorzugt Benzochinon oder dessen Derivate eingesetzt.
Die Bindung der Mediatoren an das Enzym, z. B. an Glucoseoxidase, Lactatoxidase, Cholinoxidase oder Cholesteroloxidase, erfolgt gemäß der Erfindung kovalent. Die Bindung an die Elektrodenoberfläche erfolgt bevorzugt absorptiv.
Durch diese Bindung wird überraschenderweise erreicht, daß ein schneller Elektronentransfer zwischen der redoxaktiven (prosthetischen) Gruppe des Enzyms und der Elektrode stattfindet. Der gleiche Effekt wird auch erreicht, wenn das unmodifizierte Enzym an die Oberfläche einer Kohleelektiode, die mit Benzochinon beladen ist, absorbiert wird.
Die Enzymelektrode gemäß der Erfindung ermöglicht, daß der Grenzstrom bei 100-20OmV oberhalb des Redoxpotentials der prosthetischen Gruppe analytisch ausgenutzt werden kann, z. B. bei Glucoseoxidase bei -20OmV.
Gegenüber den bisher bekannten Methoden der chemischen Modifizierung von Elektroden oder Enzymen durch Mediatoren besitzt die erfindungsgemäße Elektrode den Vorteil, daß sie bei dem niedrigsten prinzipiell möglichen Elektrodenpotential arbeitet, wodurch elektrochemische Interferenzen minimiert weraen.
Im Gegensatz zu den bisher beschriebenen, mit Mediatoren modifizierten Elektroden erfolgt der Elektronenübergang nicht durch direkte Mitwirkung der aufgebrachten Mediatorgruppen, sondern durch vorteilhafte Orientierung des Enzymmoleküls an der Elektrode.
Sie ist besonders geeignet zur Messung von Glucose, Lactat oder Ethanol in physiologischen Lösungen sowie in Nährmedien von Fermentern.
Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.
1 mg mit Benzochinon modifizierte Glucoseoxidase (GGD) wird in 2ml 0,05M Phosphatputfer pH6,5 aufgelöst. In diese Enzymlösung wird die Stirnfläche einer nichtporösen Kohleelektrode für 20 Minuten eingetaucht. Die Elektrode wurde vor der Beladung mit GOD auf Schleifpapier (Körnung 800) gesäubert und entweder mit Chromat oder elektrochemisch in bekannter Weise voroxidiert. Nach der Enzymbeladung wird die Elektrode mit enzymfreier Pufferlösung abgespült und danach in eine Meßzelle mit Magnetrührer sowie Gegen- und Referenzelektrode eingesetzt. Als Meßlösung dient 1,5m! 0,05 M Phosphatpuffer pH 6,5. Die Enzymelektrode wird auf ein Potential von -200mV gegenüber der Referenzelektroiie polarisiert. Nachdem der Grundstrom einen konstanten Wert erreicht hat, wird eine Bezugskurve durch Zugabe von jeweils 20μΙ einer 50-, 100-, 200-, 250- und 500-mM-Glucoselosunr) aufgenommen. Danach wird die Meßzelle gespült und erneut mit 1 ml Puffer gefüllt. Zur Glucosebestimmung in Prüf lösungen erfolgt analog dazu die Zugabe von 20/jl Probe. Die Elektrode ist für 10 Tage meßbereit.
Die gereinigte und voroxidierte Kohleelektrode wird in eine Lösung getaucht, die 1 mM Benzochinon in 0,05 M Phosphatpuffer pH 6,5 enthält. Nach 20 Minuten wird diese Elektrode aus der Benzochinonlösung in eine 20 U/ml lactatoxidasehaltige Pufferlösung überführt. Nach 2 h wird die Elektrode abgespült und analog wie in Beispiel 1 bei der Lactatmessung eingesetzt.
Claims (3)
1. Enzymelektrode zur spezifischen reagenzlosen Bestimmung von Stoffwechselprodukten, bei der das Enzym an einer Kohleelektrode adsorbiert oder kovalent fixiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß entweder die Moleküloberfläche des Enzyms oder die Elektrodenoberfläche mit einem Redoxmediator beladen ist.
2. Enzymelektrode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Redoxmediator Benzochinon und dessen Derivate eingesetzt werden.
3. Enzymelekirode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzyme Glucoseoxidase, Lactatoxidase, Cholinoxidase, Cholesteroloxidase verwendet werden.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| DD32266088A DD277759A1 (de) | 1988-12-03 | 1988-12-03 | Enzymelektrode zur spezifischen reagenzlosen bestimmung von stoffwechselprodukten |
Applications Claiming Priority (1)
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| DD32266088A DD277759A1 (de) | 1988-12-03 | 1988-12-03 | Enzymelektrode zur spezifischen reagenzlosen bestimmung von stoffwechselprodukten |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD277759A1 true DD277759A1 (de) | 1990-04-11 |
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ID=5604632
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD32266088A DD277759A1 (de) | 1988-12-03 | 1988-12-03 | Enzymelektrode zur spezifischen reagenzlosen bestimmung von stoffwechselprodukten |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD277759A1 (de) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0563795A1 (de) * | 1992-03-31 | 1993-10-06 | Dai Nippon Printing Co., Ltd. | Immobilisierte Enzym-Elektrode, Zusammensetzung zu ihrer Herstellung und elektrisch leitfähige Enzyme |
| EP0584794A2 (de) * | 1992-08-25 | 1994-03-02 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Elektrobiochemisches Nachweisverfahren und Elektroden dafür |
-
1988
- 1988-12-03 DD DD32266088A patent/DD277759A1/de not_active IP Right Cessation
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0563795A1 (de) * | 1992-03-31 | 1993-10-06 | Dai Nippon Printing Co., Ltd. | Immobilisierte Enzym-Elektrode, Zusammensetzung zu ihrer Herstellung und elektrisch leitfähige Enzyme |
| EP0584794A2 (de) * | 1992-08-25 | 1994-03-02 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Elektrobiochemisches Nachweisverfahren und Elektroden dafür |
| EP0584794A3 (de) * | 1992-08-25 | 1995-04-19 | Yissum Res Dev Co | Elektrobiochemisches Nachweisverfahren und Elektroden dafür. |
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