DE3786896T2 - Verwendung eines Spermin-Derivats mit anti-neoplastischer Wirkung zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen. - Google Patents

Verwendung eines Spermin-Derivats mit anti-neoplastischer Wirkung zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen.

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Description

    HINTERGRUND DER ERFINDUNG Anwendungsgebiet
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf antineoplastische pharmazeutische Zusammensetzungen.
    • Stand der Technik
  • In vergangener Zeit hat sich viel Aufmerksamkeit auf Polyamine gerichtet, wie z. B. Spermidin, Norspermidin, Homospermidin, 1,4-Diaminbutan (Putrescin) und Spermin. Diese Untersuchungen wurden im wesentlichen auf die biologischen Eigenschaften der Polyamine gerichtet, wahrscheinlich wegen ihrer Rolle in Bezug auf proliferative Prozesse. Es wurde bereits früh gezeigt, daß die Polyaminniveaus in sich teilenden Zellen, z. B. Krebszellen, viel höher sind als in ruhenden Zellen. Siehe hierzu Janne et al, A. Biochim. Biophys. Acta. 473, 241 (1978); Fillingame et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72 : 4042 (1975);
  • Metcalf et al, J. Am. Chem. Soc. 100 : 2551 (1978); Flink et al. Nature (London) 253 : 62 (1975); Pegg et al, Polyamine Metabolism and Function, Am. J. Cell. Physiol. 243 : 212-221 (1982).
  • Verschiedene Nachweise zeigten, daß Polyamine, insbesondere Spermidin, für Zellenproliferation erforderlich sind:
  • (i) Sie wurden in größeren Mengen bei wachsenden Geweben gefunden als bei nichtwachsenden Geweben;
  • (ii) prokaryontische und eukaryontische Mutanten, die arm an Polyaminbiosynthese sind, sind auxotroph für Polyamine;
  • (iii) für Polyaminbiosynthese typische Inhibitoren hemmen auch das Zellwachstum.
  • Trotz dieser Nachweise ist die genaue biologische Rolle der Polyamine im Hinblick auf Zellenproliferation unsicher. Es wurde vermutet, daß Polyamine aufgrund ihrer geladenen Beschaffenheit unter physiologischen Bedingungen und aufgrund ihrer anpassungsfähigen Flexibilität dazu dienen können, Makromoleküle wie z. B. Nukleinsäuren durch Anionenneutralisation zu stabilisieren. Siehe hierzu:
  • Dkystra et al, Science, 149 : 40 (1965);
  • Russell et al, Polyamines as Biochemical Markers of Normal and Malignant Growth (Raven, New York, 1978);
  • Hirschfield et al, J. Bacteriol., 101 : 725 (1970);
  • Morris et al, ibid, S. 731;
  • Whitney et al, ibid, 134 : 214 (1978);
  • Hafer et al, J. Biol. Chem., 254 : 12419 (1979);
  • Cohn et al, J. Bacteriol. 134 : 208 (1978);
  • Pohjatipelto et al, Nature (London), 293 : 4785 (1981);
  • Mamont et al, Biochem. Biophys. Res. Comm. 81 : 58 (1978);
  • Bloomfield et al, Polyamines in Biology and Medicine (D.R. Morris and L.J. Morton, Eds. - Dekker, New York, 1981), S. 183-205;
  • Gosule et al, Nature, 259 : 333 (1976);
  • Gabbay et al, Ann. N.Y. Acad. Sci., 171 : 810 (1970);
  • Suwalsky et al, J. Mol. Biol., 42 : 363 (1969);
  • Liquori et al, J. Mol. Biol., 24 : 113 (1968).
  • Unabhängig von den Gründen für erhöhte Polyaminniveaus kann jedoch das Phänomen für Chemotherapien ausgenutzt werden bzw. wurde bereits hierfür ausgenutzt. Siehe hierzu:
  • Sjoerdsma et al, Butterworths Int. Med. Rev.: aClin. Pharmacol. Ther. 35 : 287 (1984);
  • Israel et al, J. Med. Chem., 16 : 1 (1973);
  • Morris et al, Polyamines in Biology and Medicine, Dekker, New York, S.1223 (1982);
  • Wang et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 94 : 85 (1980).
  • Es ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung, neue antineoplastische pharmazeutische Zusammensetzungen hervorzubringen.
  • J. Biochemistry, 100 (1), S. 123-130 (1986) offenbart N¹, N&sup4;-Diäthylspermin und seine Anwendung bei einem DNA-Ligationsprozeß.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die obengenannten und andere Gegenstände sind durch die vorliegende Erfindung verwirklicht worden; eine Ausführungsform hiervon ist ein pharmazeutisches Gemisch, das eine antineoplastisch wirksame Menge der Verbindung N¹,N&sup4;-Diäthylspermin enthält mit der Formel
  • CH&sub3;CH&sub2;-N¹H-(CH&sub2;)&sub3;-N²H-(CH&sub2;)&sub4;-N³H-(CH&sub2;)&sub3;-N&sup4;H-CH&sub2;CH&sub3;
  • oder ein pharmazeutisch akzeptables, durch Säurezugabe gewonnenes Salz hiervon und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger hierfür.
  • Die vorliegende Erfindung liefert auch N¹,N&sup4;-Diäthylspermin und pharmazeutisch akzeptable Salze hiervon für den Therapiegebrauch.
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch das Anwenden der Verbindung N¹,N&sup4;-Diäthylspermin mit der Formel
  • CH&sub3;CH&sub2;-N¹H-(CH&sub2;)&sub3;-N²H-(CH&sub2;)&sub4;-N³H-(CH&sub2;)&sub3;-N&sup4;H-CH&sub2;CH&sub3;
  • oder eines durch Säurezugabe gewonnenen Salzes hiervon für die Herstellung eines Medikamentes zur antineoplastischen therapeutischen Behandlung.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • N¹,N&sup4;-Diäthylspermin ist wirksam gegen bösartige Zellen in vitro und in vivo bei menschlichen und nichtmenschlichen Lebewesen.
  • Die Verbindung wird bevorzugterweise dadurch synthetisiert, daß zuerst ein Sulfonamid des Polyamins bei allen Aminostickstoffen gebildet wird, um (1) die Primäramine für Monoäthylation zu aktivieren, und um (2) andere Sekundärstickstoffe vor Äthylation zu schützen. Passende Sulfonierungsmittel sind Alkyl, Aryl und Arylalkyl-Sulfonierungsmittel der allgemeinen Struktur RSO&sub2;X, wobei R das Alkyl, Aryl oder Arylalkyl darstellt, und X für eine Restgruppe wie z. B. Cl&supmin;, Br&supmin; usw. steht. Die Sulfonisierung wird durchgeführt, indem das Polyamin mit einem der Stickstoffmenge entsprechenden Anteil an Sulfonisierungsmittel in Anwesenheit einer Base wie z. B. Tertiäramin oder einem Hydroxyd reagiert. Die Reaktion wird insbesondere durchgeführt, indem wäßriges Natriumhydroxyd als Base und p-Toluensulfonylchlorid (TsCl) als Sulfonierungsmittel benutzt wird in einem zweiphasigen Lösungssystem, das aus einem organischen Lösungsmittel, wie z. B. Methylenchlorid, und Wasser besteht. Das Sulfonierungsmittel wird im Methylenchlorid einer wäßrigen Lösung aus Amin und Natriumhydroxyd zugegeben; die Reaktion läuft gemäß der folgenden Gleichung ab, wobei Spermin als Basisverbindung benutzt wird:
  • mit Ts = p-Toluensulfonyl.
  • Nach erfolgtem Reinigen wird zunächst das Sulfonamid äthyliert. Die Äthylierung beinhaltet das Bilden von N-Anionen bei den Primäraminosulfonamiden mit Hilfe einer Base, wie z. B. NaH, anschließend die Reaktion des N-Anions mit einem Äthylierungsmittel C&sub2;H&sub5;X, wobei X eine Restgruppe, wie z. B. I&supmin;, Cl&supmin;, Br&supmin;, p-CH&sub3;C&sub6;H&sub4;SO&sub3; oder CH&sub3;SO&sub3;&supmin; ist.
  • Die Äthylierung kann durchgeführt werden in verschiedenen dipolaren aprotischen Lösungsmitteln, bevorzugterweise in N,N-Dimethylformamid (DMF). Die Reaktion läuft entsprechend der folgenden Gleichung ab:
  • Nach der Äthylierung des Sulfonamids werden die das Sulfonyl schützenden Gruppen unter Reduzierungsbedingungen entfernt. Obwohl verschiedene Standardreduzierungsbedingungen verwendet werden können (LiAlH&sub4;, Li/NH&sub3; und katalytische Reduktion), arbeitet man optimalerweise mit Na und NH&sub3;.
  • Die Reduktion läuft nach der folgenden Gleichung ab:
  • Die Verbindung wird abgeschieden als freies Amin und dann umgewandelt in und benutzt als das entsprechende Hydrochloridsalz durch Behandlung mit konzentriertem HCl Jedoch kann sie außerdem benutzt werden als Salz mit irgendeiner pharmazeutisch akzeptablen Säure, wie z. B. HBr, CH&sub3;CO&sub2;H, CH&sub3;SO&sub3;H usw.
  • Die Erfindung wird durch das folgende, nicht beschränkende Beispiel verdeutlicht.
    • Beispiel Herstellung von N¹,N&sup4;-Diäthylspermin
  • N¹,N²,N³,N&sup4;-Tetra-p-Tosylspermin.
  • Es wird zu Spermintetrahydrochlorid (4,53 g, 13,0 mmol) und 10%wäßrigem NaOH (200 ml, 132 mmol) bei 0º tropfenweise p-Toluensulfonylchlorid (9,98g, 52,3 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; unter schnellem Rühren beigefügt. Nach einer Stunde wird die Mischung auf Raumtemperatur aufgewärmt und zwei Tage umgerührt. Die organische Phase wird abgeschieden und mit 0,5 N HCl, H&sub2;O und Salzsole gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und auf Kieselgel (450 g 3 % MeOH/CHCl&sub3;) geklärt, um 9,69 g, 91% Tetratosylspermin hervorzubringen.
  • NMR (CDCl&sub3;) δ 7,1.7.9 (m, 16 H), 5.34 (t, 2H, J=7), 2.9-3.3 (m, 12H), 2.43 (s, 12H), 1.5-2.0 (m, 8H).
  • N¹,N&sup4;-Diäthyl-N¹,N²,N³,N&sup4;-Tetra-p-Tosylspermin.
  • Zu Tetratosylspermin (1,75 g, 2,14 mmol), das wie oben in trockenem DMF (12 ml) zubereitet wurde, wurde vorsichtig 80%iges Natriumhydrid (0,25 g, 8,33 mmol) und danach Äthyljodid (1,0 ml, 12,5 mmol) zugefügt. Nach Aufheizen unter Stickstoff (10 Stunden, 55º C) wurde die Mischung mit Eiswasser abgeschreckt und mit Chloroform (dreimal) extrahiert. Die organische Phase wurde mit 5% Na&sub2;SO&sub3;, 5% NaOH, 1N HCl und Wasser gewaschen und dann mit Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Das Entfernen von DMF durch Flash-Destillation und das Reinigen des Rohproduktes auf Kieselgel (4% EtOH/CHCl&sub3;) ergab 1,63 g (87%) des gewünschten Produktes.
  • NMR (CDCl&sub3;) δ 7.2-7,8 (m, 16H), 3.0-3.3 (m, 16H), 2.43 (s, 12H), 1.5-2.1 (m, 8H), 1.08 (t, 6H, J=7). Analytisch errechnet für C&sub4;&sub2;H&sub5;&sub8;N&sub4;O&sub8;S&sub4;; C 57.64; H, 6.68; N, 6.40 ergab C, 57.69; H, 6.74; N, 6.20.
  • N¹,N&sup4;-Diäthylspermin (DES).
  • In eine Lösung aus N¹,N&sup4;-Diäthyl-N¹,N²,N³N&sup4;-Tetratosylspermin (2,78 g, 3,18 mmol), das wie oben in trockenem, bei -78º C destilliertem THF (200 ml) zubereitet wurde, wurden 300 ml NH&sub3; mit Hilfe eines Trockeneisverdichters kondensiert. Natriumkugeln (3,0 g, 0,13 mol) wurden dann in kleinen Portionen beigefügt, und das Reaktionsgemisch vier Stunden lang bei -78º C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht auf Raumtemperatur erwärmt, und das NH&sub3; verdampfte. Diäthyläther wurde der Mischung beigefügt. Hierauf wurde Äthanol vorsichtig zugefügt, danach H&sub2;O, um schließlich die Reaktion zu löschen. Die Lösungsmittel wurden verdampft und das Produkt mit Diäthyläther und danach mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, gefiltert und hierdurch konzentriert. Die resultierende Flüssigkeit wurde in einer Kugelrohrvorrichtung (150º C, 0,1 mm) destilliert. Konzentrierte hydrochlorische Säure wurde zu einer Äther/Äthanol (1 : 1) Lösung des Destillates zugefügt, um hydrochlorisches Salz zu bilden, das aus heißem wäßrigen Äthanol rekristallisiert wurde, um 790 mg (63%) DES zu liefern.
  • NMR (D&sub2;O) δ 1,4 (t, 6H); 1,9 (m, 4 H); 2,25 (m, 4H); 3,25 (m, 16H); 4,80 (s, HOD, Ref.).
  • Die folgenden Niederschriften wurden befolgt, um die ID&sub5;&sub0;-Werte für DES zu bestimmen gegenüber gebildeten L1210-Zellen, Daudi-Zellen und HL-60-Zellen.
    • Zellkulturen
  • Murine (d. h. von Mäusen) L1210-Leukämiezellen, menschliche Burkitt-Lymphomazellen (Daudi) und menschliche promyelozytische Leukämiezellen (HL-60) wurden in logarithmischem Wachstum als Suspensionskulturen gehalten in einem RPMI-1640-Medium aus 2% 4-(1-Hydroxyäthyl)- 1-piperazinäthansulfonische Säure-3(N-Morpholino)propansulfonische Säure, 100 uM Aminguanidin und 10% Fetalbovinserum. Die Zellen wurden in 25 cm² großen Gewebekulturkolben in einem Gesamtvolumen von 10 ml unter einer befeuchteten 5% CO&sub2;-Atmosphäre bei 37º C angepflanzt.
  • Während des logarithmischen Wachstums (L1210-Zellen mit 0,3·10&sup5; Zellen/ml; Daudi und HL-60 Zellen mit 1·10&sup5; Zellen/ml) wurden die Zellen mit den Polyaminderivaten behandelt, die in sterilem Wasser verdünnt und durch ein 0,2 Mikron Filter unmittelbar vor dem Gebrauch gefiltert wurden. Nach einer 48-stündigen Inkubation der L1210-Zellen und einer 72stündigen Inkubation der Daudi- oder HL-60-Zellen, wurden die L1210-Zellen bei 0,3·10&sup5; Zellen/ml, die Daudi- und HL-60-Zellen bei 1·10&sup5; Zellen/ml wieder eingepflanzt, und alle Zellen in Anwesenheit des Polyaminderivates für weitere 48 bzw. 72 Stunden inkubiert.
  • Bei den angegebenen Zeitperioden wurden Zellproben zum Zählen entfernt. Die Anzahl der Zellen wurde durch elektronisches Teilchenzählen bestimmt und periodisch mit Hilfe von Hämozytometermessungen bestätigt. Die Zellenlebensfähigkeit wurde durch Trypanblau-Farbstoffausschluß geschätzt.
  • Der Bestandteil an Kontrollwachstum wurde wie folgt bestimmt:
  • % Kontrollwachstum =
  • Anzahl der behandelten Zellen - Anfangsimpfstoff/Anzahl der unbehandelten Zellen - Anfangsimpfstoff · 100.
  • Der IC&sub5;&sub0;-Wert ist definiert als die Konzentration der benötigten Verbindung, um das Zellwachstum auf 50% kontrolliertes Wachstum zu reduzieren.
  • Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt. Tabelle 1 - L1210-Zellen Tabelle 2 Daudi-Zellen HL-60-Zellen größer
    • Tierversuche
  • Die murinen L1210-Leukämiezellen wurden in DBA/2J-Mäusen gehalten. L1210-Zellen wurden von einer einzelnen Maus, die fünf Tage vorher mit 10&sup6;-Zellen intraperitonal injiziert wurde, entnommen und mit kaltem Salin verdünnt, so daß 10&sup5; oder 10&sup6;-Zellen in 0,25 cm² vorlagen. Für jede Untersuchung wurden Mäuse mit 106 L1210-Zellen oder mit 10&sup5; L1210-Zellen am Tag Null intraperitonal injiziert (siehe Tabelle 3). Die analogen Polyamine wurden nach 24 Stunden Gebrauch in sterilem Salin verdünnt und der unbenutzte Anteil bei 5º C gelagert.
  • DES wurde durch intraperitonale Injektion mit 15 mg/kg oder 20 mg/kg alle 8 Stunden drei Tage lang (Tage 1-3), vier Tage lang (Tage 1-4) oder sechs Tage lang (Tage 1-6) behandelt (siehe Tabelle 3).
  • Mit Salininjektionen behandelte Mäuse dienten als Kontrollen.
  • Als Parameter zum Abschätzen der Behandlung wurde die mittlere Überlebenszeit verwendet (Prozent angewachsene Lebensspanne, % ILS).
  • % ILS =
  • mittl.Überl.zeit beh.Tiere-mittl.Überl.Zeit Kontr.tiere/mittlere Überlebenszeit d. Kontrolltiere · 100.
  • Das murine-Lungenkarzinom wurde als subkutaner Tumor in C57B1/6 Mäusen gehalten. Die Linie vermehrte sich alle vierzehn Tage. Ein 2-4 mm Fragment eines subkutanen Spendertumors wurde subkutan in die Achselgegend mit einem Einstich in der Leistengegend am Tag Null eingepflanzt.
  • DES wurde durch intraperitonale Injektion von 20 mg/kg fünf Tage lang alle acht Stunden - beginnend mit Tag 5 (Tage 5-9) - eingegeben. Die gleiche Anzahl an mit Salininjektionen behandelten Mäusen diente als Kontrolle. Als Parameter zur Beurteilung der Behandlung wurde die mittlere Überlebenszeit (% ILS) benutzt.
  • Die Parameter der tierischen Tests und Ergebnisse sind unten in den Tabellen 3 und 4 aufgeführt. Tabelle 3 Bewertung von DES in DBA/2J Männliche Mäuse mit L1210-Leukämie (intraperitonal=i.p.) Dosierungsplan Anzahl Tiere Tag des Todes mittl. Überlebenszeit ± Stand abweich. Tage Kontrolltiere Tage Kontrolltiere a Mäuse mit i.p.-Injektion von 10&sup5; L1210-Zellen am Tag 0; b Mäuse mit i.p.-Injektion 10&sup6; L1210-Zellen am Tag 0; c Tod von nicht in der Statistik enthaltenen Tieren . . . . . größer oder kleiner als die mittlere Überlebenszeit ±2· Standardabweichung; d Das Experiment endete nach 33 Tagen. Das Überleben der Tiere wurde an diesem Tag bewertet, wobei diese Tiere ohne jegliche Anzeichen eines Tumors am Leben waren. Tabelle 4 Bewertung von N¹,N&sup4;-Diäthylspermin (DES) in C57B1/6J männl. Mäusen mit Lewis Lungenkarzinom (subkutan=s.c.) Heilmittel Dosis Abbrechungsplan Überlebenswerte Mittelwerte ± Standardabweichung (Tage) Kontrolltiere (Saline)
  • Die oben aufgeführten Ergebnisse begründen eindeutig die Effektivität der Verbindungen der Erfindung als ein antineoplastisches Mittel.
  • DES kann mit jedem geeigneten pharmazeutisch akzeptablen Träger, wie z. B. Phosphat-gepufferte Saline, Saline, Wasser, Ringerlaktatlösung, Dextrose (5% in Wasser), verbunden und einem dies benötigenden Patienten intravenös, intraperitonal, subkutan, intramuskulär oder oral verabreicht werden.
  • Geeignete ,Dosierungen hängen natürlich von der Beschaffenheit der zu behandelnden bösartigen Zellen ab, jedoch rangieren sie allgemein von ungefähr 1 bis ungefähr 200 mg/kg pro Tag.

Claims (3)

1. Ein pharmazeutisches Gemisch, das eine anti-neoplastisch wirksame Menge der Verbindung N¹,N&sup4;-Diethylspermin enthält mit der Formel:
CH&sub3;CH&sub2;-N¹H-(CH&sub2;)&sub3;-N²H-(CH&sub2;)&sub4;-N³H-(CH&sub2;)&sub3;-N&sup4;H-CH&sub2;CH&sub3;
oder ein pharmazeutisch akzeptables, durch Säurezugabe gewonnenes Salz hiervon und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger hierfür.
2. Anwendung der Verbindung N¹,N&sup4;-Diethylspermin mit der Formel
CH&sub3;CH&sub2;-N¹H-(CH&sub2;)&sub3;-N²H-(CH&sub2;)&sub4;-N³H- (CH&sub2;)&sub3;-N&sup4;H-CH&sub2;CH&sub3;
oder eines durch Säurezugabe gewonnenen Salzes hiervon für die Herstellung eines Medikamentes zur anti-neoplastischen Therapie bei einem menschlichen oder nichtmenschlichen tierischen Körper.
3. N¹,N&sup4;-Diethylspermin der allgemeinen Formel:
CH&sub3;CH&sub2;-N¹H-(CH&sub2;)&sub3;-N²H-(CH&sub2;)&sub4;-N³H-(CH&sub2;)&sub3;N&sup4;H-CH&sub2;CH&sub3;
und pharmazeutisch akzeptable Salze hiervon für den Therapiegebrauch.
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