DE3717913C2 - Trockenes analytisches Element für die Enzymanalyse - Google Patents
Trockenes analytisches Element für die EnzymanalyseInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein trockenes analytisches Element,
welches für die Bestimmung bzw. Analyse der enzymatischen
Aktivität in einer Flüssigkeit geeignet ist.
Es sind trockene analytische Elemente, insbesondere inte
grale mehrschichtige trockene analytische Elemente, bekannt
und werden beispielsweise in der US-Patentschrift 3 992 158
und in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 1643/81
beschrieben (der Ausdruck "OPI", wie er in der vorliegenden
Anmeldung verwendet wird, bedeutet "nichtgeprüfte veröffent
lichte Anmeldung"). In Analytical Chemistry, Bd. 55, Nr. 4,
498A-514A (1983) wird beschrieben, daß ein integrales mehr
schichtiges trockenes analytisches Element für die Analyse
von Enzymen in Serum verwendet werden kann.
Das integrale mehrschichtige trockene analytische Element
enthält im allgemeinen eine poröse, eine Flüssigkeit aus
breitende Schicht mit einer Flüssigkeitsmeßfunktion als
alleroberste Schicht. Wird eine Flüssigkeit in einer Menge
V in der flüssigkeitsausbreitenden Schicht entwickelt, ist
die entwickelte Fläche a proportional zu V (V = ka). Da die
Menge an Flüssigkeit per Einheitsfläche durch die Proportio
nalitätskonstante k zwischen der Ausbreitungsfläche a und der
Flüssigkeitsmenge V bestimmt wird, hängt die analytische
Empfindlichkeit von dem Proportionalitätskonstante k ab. Wenn
die Proportionalitätskonstante k geringer wird, wird die Men
ge an Flüssigkeit pro Einheitsfläche größer, so daß die
enzymatische Aktivität pro Einheitsfläche höher wird und
die Empfindlichkeit des analytischen Elements steigt.
Ein integrales mehrschichtiges trockenes analytisches Ele
ment, bei dem die poröse, die Flüssigkeit ausbreitende
Schicht Fasern, die Wasser nicht absorbieren, enthält, wird
in den japanischen Patentanmeldungen (OPI) Nrn. 164356/80
und 222769/85 beschrieben. Wasser nicht absorbierende, lange
Fasern, wie Polyester, Polyamide (beispielsweise Nylon)
etc., halten wenig Wasser zurück, und wenn sie gewebt oder
gestrickt oder gewirkt sind, ergeben sie eine einheitliche
Ausbreitungsschicht und können daher in trockenen analyti
schen Elementen verwendet werden, bei denen ein Verfahren
ausgenutzt wird, bei dem die Reaktionsgeschwindigkeit eine
Rolle spielt. Jedoch besitzt eine poröse, eine Flüssigkeit
ausbreitende Schicht, die aus Fasern, die Wasser nicht ab
sorbieren, besteht, eine große Proportionalitätskonstante
k, so daß man keine hohe analytische Empfindlichkeit er
hält.
Die US-A-4 258 001 betrifft ein analytisches Element, des
sen Ausbreitungsschicht ein wasserundurchlässiges Polyme
res, welches in Wasser auch nicht quellbar ist, aufweist
(vgl. Spalte 10, Zeilen 17-21 und Spalte 11, Zeilen 4-6 des
Dokuments).
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein
integrales mehrschichtiges trockenes analytisches Element
für die Analyse enzymatischer Aktivitäten zur Verfügung
zu stellen, wobei das Reaktionsgeschwindigkeitsverfahren
ausgenutzt wird. Das trockene analytische Element soll ei
ne hohe Empfindlichkeit und bevorzugt eine hohe Empfind
lichkeit zusammen mit einer hohen Reproduzierbarkeit auf
weisen.
Es wurde jetzt gefunden, daß die obige Aufgabe durch ein
trockenes analytisches Element für die Analyse einer enzy
matischen Aktivität in einer Flüssigkeit gelöst werden
kann, welches einen Träger und darauf mindestens eine porö
se, eine Flüssigkeit ausbreitende Schicht, die aus Fasern,
welche Wasser nicht absorbieren, besteht, umfaßt, wobei
die poröse, eine Flüssigkeit ausbreitende Schicht ein Substrat für das zu analysierende Enzym und ein wasserlösliches hydrophiles Polymeres in einer Menge enthält, die ausreicht, die Ausbreitungsfläche um mindestens 20% zu verringern, wobei
das wasserlösliche hydrophile Polymere ausgewählt wird aus der Gruppe eines Polymeren, welches eine sich wiederholende Einheit der Formel (I)
die poröse, eine Flüssigkeit ausbreitende Schicht ein Substrat für das zu analysierende Enzym und ein wasserlösliches hydrophiles Polymeres in einer Menge enthält, die ausreicht, die Ausbreitungsfläche um mindestens 20% zu verringern, wobei
das wasserlösliche hydrophile Polymere ausgewählt wird aus der Gruppe eines Polymeren, welches eine sich wiederholende Einheit der Formel (I)
enthält, worin R₁ ein Wasserstoffatom oder eine Niedrigalkylgruppe
bedeutet, und R² und R³ je ein Wasserstoffatom,
eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe, eine substituierte oder unsubstituierte aromatische Kohlenwasserstoffgruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte heterocyclische Gruppe
bedeuten, oder worin R² und R³ zusammen einen Ring bilden, und einem Polymeren, welches eine sich wiederholende Einheit der Formel (II)
eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische Kohlenwasserstoffgruppe, eine substituierte oder unsubstituierte aromatische Kohlenwasserstoffgruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte heterocyclische Gruppe
bedeuten, oder worin R² und R³ zusammen einen Ring bilden, und einem Polymeren, welches eine sich wiederholende Einheit der Formel (II)
enthält, worin R⁴ ein Wasserstoffatom oder eine Niedrigalkylgruppe
bedeutet und Q
worin q eine ganze Zahl von 2 bis 4 bedeutet,
-NR⁵-CO-R⁶, worin R⁵ eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und R⁶ ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten, oder
-NR⁵-CO-R⁶, worin R⁵ eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und R⁶ ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten, oder
bedeutet, worin Z¹ eine Atomgruppierung bedeutet,
welche einen Lactamring, einen Oxazolidonring oder
einen Pyridonring bildet.
In der Formel (I) enthält die durch R¹ dargestellte Alkyl
gruppe bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffatome und besonders be
vorzugt ist sie ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe.
Der durch R² oder R³ dargestellte aliphatische Kohlenwasser
stoffrest ist bevorzugt eine Alkyl- oder Cycloalkylgruppe
mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Der aliphatische Kohlenwas
serstoffrest kann mit einer Arylgruppe, beispielsweise ei
ner Phenylgruppe, einer Hydroxylgruppe, einer Alkoxygruppe
mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, beispielsweise einer Methoxy
gruppe, einem Halogenatom, beispielsweise einem Chloratom,
einer Alkylamino- oder Dialkylaminogruppe mit 1 bis 4 Koh
lenstoffatomen in dem Alkylmolekülteil davon, beispielswei
se einer Dimethylaminogruppe, und durch ähnliche Gruppen
substituiert sein. Wenn R² oder R³ einen aromatischen Koh
lenwasserstoffrest bedeuten, enthält dieser bevorzugt 6 bis
7 Kohlenstoffatome. Der aromatische Kohlenwasserstoffrest
kann durch eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen,
beispielsweise eine Methylgruppe, eine Hydroxylgruppe, eine
Alkoxygruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, beispielsweise
eine Methoxygruppe, ein Halogenatom, beispielsweise ein
Chloratom, eine Alkylamino- oder Dialkylaminogruppe mit
1 bis 4 Kohlenstoffatomen in dem Alkylmolekülteil davon,
beispielsweise eine Dimethylaminogruppe, und durch ähnliche
Gruppen substituiert sein. Wenn R² oder R³ eine heterocycli
sche Gruppe bedeuten, kann diese beispielsweise ein 5- oder
6gliedriger Ring sein, welche mindestens ein Stickstoff-,
Sauerstoff- oder Schwefelatom enthält. Spezifische Beispie
le von bevorzugten Gruppen für R² oder R³ sind ein Wasser
stoffatom, eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe, eine Ben
zylgruppe, eine Hydroxyethylgruppe, eine Cyclohexylgruppe,
eine Phenylgruppe, eine Piperidinogruppe und eine Morpho
linogruppe.
Die Gesamt-Kohlenstoffzahl, die in R² und R³ vorhanden ist,
beträgt bevorzugt bis zu 12 und besonders bevorzugt bis zu
6.
Das Polymere, welches die durch die Formel (I) dargestellte,
sich wiederholende Einheit enthält, kann ein Homopolymeres
mit der sich wiederholenden Einheit der Formel (I), ein Co
polymeres, welches mindestens zwei sich wiederholende Ein
heiten der Formel (I) enthält, und ein Copolymeres, welches
mindestens eine sich wiederholende Einheit der Formel (I)
und eine andere Monomereneinheit, die sich von einer unge
sättigten Verbindung, die durch Addition polymerisierbar
ist, ableitet, sein.
Spezifische Beispiele für Monomere, welche die sich wieder
holende Einheit der Formel (I) aufweisen, sind Acrylamid,
N-Methylacrylamid, N-Ethylacrylamid, N-(n-Propyl)-acrylamid,
N-Isopropylacrylamid, N-(n-Butyl)-acrylamid, N-(t-Butyl)-
acrylamid, N-(n-Octyl)-acrylamid, N-(Isoamyl)-acrylamid,
N-(t-Octyl)-acrylamid, N-Laurylacrylamid, N-Cyclo
hexylacrylamid, N-Benzylacrylamid, N-(β-Dimethylaminoethyl)-
acrylamid, N-Phenylacrylamid, N-(1,1-Dimethyl-3-hydroxy
butylacrylamid), N,N-Dimethylmethacrylamid, N,N-Diethyl
acrylamid, N,N-Dioctylacrylamid, N-(1,1-Dimethyl-3-oxobutyl)-
acrylamid, N-Acryloylmorpholin, N-Methyl-N′-acryloylpipera
zin, N-Ethyl-N′-acryloylpiperazin, N-Acryloylpiperidin,
N-(β-Morpholinoethyl)-acrylamid, N-(3,5-Difflethylmorpholino
ethyl)-acrylamid, Methacrylamid, N-Methylmethacrylamid,
N-Ethylmethacrylamid, N-(t-Butyl)-methacrylamid, N-(t-Octyl)-
methacrylamid, N-Benzylmethacrylamid, N-Cyclohexylmetha
crylamid, N-Phenylmethacrylamid, N,N-Dimethylmethacrylamid,
N,N-Diethylmethacrylamid, N,N-Dipropylmethacrylamid,
N-Methyl-N-phenylmethacrylamid, N-Methacryloyl-N′-methyl
piperazin, N-Methacryloylpiperidin, 4-Methacryloyl-2,6-di
methylmorpholin, N-Methacryloyl-N′-ethylpiperazin etc.
Die durch Addition polymerisierbaren ungesättigten Verbin
dungen, welche mit den Monomeren, die die sich wiederholen
de Einheit der Formel (I) ergeben, verwendet werden können,
sind Acrylsäure, Methacrylsäure, Maleinsäure, Fumarsäure,
Itaconsäure, Crotonsäure, Acrylester (beispielsweise Methyl
acrylat, Ethylacrylat, n-Propylacrylat, Isopropylacrylat,
n-Butylacrylat, Octylacrylat, 2-Chlorethylacrylat, 2-Cyano
ethylacrylat, N-(β-Dimethylaminoethyl)-acrylat, Benzyl
acrylat, Cyclohexylacrylat, Phenylacrylat etc.), Methacryl
ester (beispielsweise Methylmethacrylat, Ethylmethacrylat,
n-Propylmethacrylat, Isopropylmethacrylat, n-Butylmetha
crylat, Octylmethacrylat, Cyclohexylmethacrylat, Benzyl
methacrylat, 3-Sulfopropylmethacrylat etc.), Allylverbindun
gen (beispielsweise Allylbutylether, Allylphenylether etc.),
Vinylether (beispielsweise Methylvinylether, Butylvinyl
ether, Octylvinylether, Methoxyethylvinylether, 2-Chlorethyl
vinylether, 2-Hydroxyethylvinylether, (2-Dimethylamino
ethyl)-vinylether, Vinylphenylether, Vinyltollylether, Vi
nylchlorphenylether etc.), p-Vinylbenzoesäure, Vinylester
(beispielsweise Methyl-p-vinylbenzoat, etc.), heterocycli
sche Vinylverbindungen (beispielsweise Vinylpyridin, N-Vi
nylimidazol, N-Vinylcarbazol, N-Vinylpyrrolidon, N-Vinyl
oxazolidon etc.), Methylvinylketon, Phenylvinylketon,
Styrol oder Derivate davon (beispielsweise Chlormethyl
styrol, p-Methylstyrol etc.), Maleinsäureester (beispiels
weise Ethylmaleat, Butylmaleat, Dibutylmaleat, Octylmaleat
etc.), Fumarsäureester (beispielsweise Ethylfumarat, Di
butylfumarat, Octylfumarat etc.), Itaconsäureester (bei
spielsweise Methylitaconat, Ethylitaconat, Diethylitaconat
etc.), Crotonamid, Crotonsäureester (beispielsweise Butyl
crotonat, Glycerinmonocrotonat etc.), Methylsorbat, Ole
fine (beispielsweise Ethylen, Propylen, 1-Buten, Dicyclo
pentadien, 4-Methyl-1-hexen, 4,4-Dimethyl-1-penten etc.),
halogenierte Olefine (beispielsweise Vinylchlorid, Vinyli
denchlorid, Isopren etc.), ungesättigte Nitrile (beispiels
weise Acrylnitril, Methacrylnitril etc.) und ähnliche Ver
bindungen. Diese Comonomeren können einzeln oder als Ge
misch aus zwei oder mehreren verwendet werden.
In der Formel (II) kann, wenn Q -NR⁵-CO-R⁶ bedeutet, R⁵
eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und bevor
zugt eine Methylgruppe oder eine Ethylgruppe bedeuten. R⁶
bedeutet ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1
bis 4 Kohlenstoffatomen und bevorzugt ein Wasserstoffatom,
eine Methylgruppe oder eine Ethylgruppe.
Bevorzugt unter den sich wiederholenden Einheiten der For
mel (II) sind solche, worin R⁴ ein Wasserstoffatom bedeutet
und Q
bedeutet, worin R⁵ eine Methylgruppe oder eine Ethylgruppe
bedeutet und R⁶ ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder
Ethylgruppe bedeutet, oder
bedeutet, worin Z¹ eine Atomgruppierung bedeutet, welche
einen 5- oder 6gliedrigen Lactamring oder Oxazolidonring
bildet.
Die am meisten bevorzugte Einheit unter diesen ist eine
sich wiederholende Einheit, worin Q den Rest einer Pyrroli
dongruppe oder den Rest einer Oxazolidongruppe bedeutet.
Das Polymere, welches sich wiederholende Einheiten der For
mel (II) enthält, kann ein Homopolymeres oder ein Copolyme
res sein, welches mindestens zwei sich wiederholende Ein
heiten der Formel (II) enthält, oder es kann ein Copolyme
res sein, welches mindestens eine sich wiederholende Ein
heit der Formel (I) und eine weitere sich wiederholende
Einheit enthält, die sich von ungesättigten Verbindungen,
die durch Addition polymerisierbar sind, ableitet.
Monomere, welche die sich wiederholende Einheit der Formel
(II) ergeben, werden durch die Formel (III)
dargestellt, worin R⁴ und Q die zuvor gegebenen Definitio
nen besitzen.
Spezifische Beispiele für Monomere, die durch die Formel
(III) dargestellt werden, sind Vinylacetat, N-Vinylsuccin
imid, N-Vinylglutaramid, N-Vinyladipimid, N-Methyl-N-methyl-
N-vinylformamid, N-Methyl-N-vinylacetamid, N-Ethyl-N-vinyl
acetamid, N-Methyl-N-vinylpropionamid, N-Vinylpyrrolidon,
N-Vinylpiperidon, N-Vinyl-ε-caprolactam, N-Vinyloxazolidon,
N-Vinylmorpholin, N-Vinyl-2-pyridon etc. Bevorzugt unter
diesen sind Vinylacetat, N-Vinylsuccinimid, N-Vinylglutar
imid, N-Methyl-N-vinylacetamid, N-Ethyl-N-vinylacetamid,
N-Vinylpyrrolidon, N-Vinylpiperidon und N-Vinyloxazolidon.
Das darunter am meisten bevorzugte Monomere ist N-Vinyl
pyrrolidon.
Die durch Addition polymerisierbaren ungesättigten Verbin
dungen, die mit dem Monomeren der Formel (III) polymerisier
bar sind, schließen die Monomeren ein, die die wiederkehren
de Einheit der Formel (I) liefern und die damit copolymeri
sierbaren Monomeren ein. Bevorzugte Beispiele sind Acryl
säure, Methacrylsäure, Maleinsäureanhydrid, Acrylamid, N-
Methylacrylamid, N,N-Dimethylacrylamid, N-Ethylacrylamid,
N-(β-Hydroxyethyl)-acrylamid, Methacrylamid, N-Methylmeth
acrylamid und ähnliche Verbindungen. Vom Standpunkt der
hydrophilen Eigenschaften des gebildeten Polymeren aus sind
bevorzugte Comonomere unter diesen Acrylsäure, Methacryl
säure, 2-Hydroxyethylacrylat, 2-Methoxyethylacrylat, Sulfo
propylacrylat, Acrylamid, Dimethylacrylamid, 2-Acryloyl
amino-2-methylpropansulfonsäure, Hydroxyethylacrylamid, Meth
acrylamid, Methylvinylether, Natriumstyrolsulfonat, N-Vinyl-3,5-di
methyltriazol und Maleinsäureanhydrid.
Das Copolymerisationsverhältnis des Copolymeren, welches
die sich wiederholende Einheit der Formeln (I) oder (II) aufweist,
ist nicht besonders beschränkt, aber der Gehalt an sich wie
derholender Einheit der Formeln (I) oder (II) in dem Copoly
meren liegt bevorzugt im Bereich von 20 bis 100 Mol.-% und
besonders bevorzugt im Bereich von 50 bis 100 Mol.-%.
Das Polymere, welches eine sich wiederholende Einheit der
Formeln (I) oder (II) aufweist, kann nach den Verfahren
synthetisiert werden, wie sie in den britischen Patent
schriften 1 211 039 und 961 395, der japanischen Patent
publikation Nr. 29195/72, den japanischen Patentanmeldungen
(OPI) Nrn. 76593/73, 92022/73, 21134/75 und 120634/75,
den US-Patentschriften 2 681 897, 3 227 672, 3 290 417,
3 262 919, 3 245 932 und 3 230 275, John C. Petropoulosu
et al., Official Digest, Bd. 33, 719-736 (1961), Shunsuke
Murahashi et al. (ed.), Gosei Kobunshi, Bd. 1, 246-290,
ibid, Bd. 3, 1-108 etc. beschrieben werden. Die Polymeri
sation wird im allgemeinen bei einer Temperatur von 20 bis
180°C und bevorzugt von 40 bis 120°C unter Verwendung von
0,05 bis 5 Gew.-% eines Radikal-Polymerisationsinitiators,
bezogen auf die Monomeren, durchgeführt. Die Initiatoren,
die beispielsweise verwendet werden können, sind Azobis
verbindungen, Peroxide, Hydroperoxide, Redox-Katalysatoren,
wie Kaliumpersulfat, t-Butylperoctoat, Benzoylperoxid, Azobis
isobutylonitril etc.
Typische Beispiele für Polymere mit einer sich wiederholen
den Einheit der Formel (I) sind:
- (1) Poly(N-ethylacrylamid),
- (2) Polyacrylamid,
- (3) Poly(N,N-dimethylacrylamid),
- (4) Polymethacrylamid,
- (5) Acrylamid/Ethylacrylat-Copolymeres (40 : 60, ausgedrückt als Mol),
- (6) N-N-Dimethylacrylamid/Methylacrylat-Copolymeres (50 : 50, ausgedrückt als Mol),
- (7) Acrylamid/Butylacrylat-Copolymeres (60 : 40, ausgedrückt als Mol),
- (8) N-Acrylamid/Ethylacrylat-Copolymeres (50 : 50, ausge drückt als Mol),
- (9) N-N-Dimethylacrylamid/Maleinsäure-Copolymeres (70 : 30, ausgedrückt als Mol),
- (10) Acrylamid/Ethylacrylat-Copolymeres (40 : 60, ausgedrückt als Mol)
- (11) Acrylamid/Ethylacrylat-Copolymeres (50 : 50, ausgedrückt als Mol),
- (12) N-Methylacrylamid/Ethylacrylat-Copolymeres (50 : 50, ausgedrückt als Mol),
- (13) N-Ethylacrylamid/Acrylsäure-Copolymeres (30 : 70, aus gedrückt als Mol),
- (14) N-Methylmethacrylamid/Ethylacrylat-Copolymeres (50 : 50, ausgedrückt als Mol),
- (15) N-N-Dimethylmethacrylamid/Propylacrylat-Copolymeres (35 : 65, ausgedrückt als Mol),
- (16) N-Acryloylmorpholin/Ethylacrylat-Copolymeres (40 : 60, ausgedrückt als Mol),
- (17) Poly[N-(3-dimethylaminopropyl)acrylamid] und
- (18) Poly(N-methacryloylpiperazin).
Typische Beispiele für ein Polymeres, welche die sich wie
derholende Einheit der Formel (II) enthält, sind:
- (19) Poly(N-vinylpyrrolidon),
- (20) Poly(N-vinyloxazolidon),
- (21) Poly(N-vinylsuccinimid),
- (22) Poly(N-vinylglutarimid),
- (23) Poly(N-vinylpiperidon),
- (24) Poly(N-vinyl-ε-caprolactam),
- (25) Poly(N-methyl-N-vinylacetamid),
- (26) Poly(N-ethyl-N-vinylacetamid),
- (27) Vinylalkohol/N-Vinylpyrrolidon-Copolymeres (30 : 70, ausgedrückt als Mol),
- (28) N-Vinylpyrrolidon/Vinylacetat-Copolymeres (70 : 30, ausgedrückt als Mol),
- (29) N-Vinylpyrrolidon/2-Hydroxyethylacrylat-Copolymeres (80 : 20, ausgedrückt als Mol),
- (30) N-Vinylpyrrolidon/Acrylsäure-Copolymeres (90 : 10, ausgedrückt als Mol),
- (31) N-Vinylpiperidon/2-Methoxyethylacrylat-Copolymeres (70 : 30, ausgedrückt als Mol),
- (32) N-Vinylpiperidon/Methylvinylether-Copolymeres (90 : 10, ausgedrückt als Mol),
- (33) N-Vinyloxazolidon/Vinylalkohol-Copolymeres (65 : 35, ausgedrückt als Mol),
- (34) N-Vinyloxazolidon/Acrylsäure-Copolymeres (80 : 20, ausgedrückt als Mol),
- (35) N-Vinylpyrrolidon/N-Vinylpiperidon/Hydroxyethyl acrylat-Copolymeres (40 : 30 : 30, ausgedrückt als Mol),
- (36) Vinylalkohol/Vinylacetat/N-Vinyl-2-pyridon-Copoly meres (70 : 25 : 5, ausgedrückt als Mol),
- (37) N-Vinylpyrrolidon/2-Hydroxyethylacrylat/Vinylacetat Copolymeres (70 : 20 : 10) und
- (38) N-Vinylpyrrolidon/Vinylalkohol/Vinylpropionat/ Natriumstyrolsulfonat-Copolymeres (40 : 40 : 5 : 15, ausge drückt als Mol).
Spezifische Beispiele für Copolymere, die eine sich wieder
holende Einheit der Formel (II) und andere, durch Addition
polymerisierbare ungesättigte Comonomere enthalten, sind:
- (39) N-Vinylpyrrolidon/Acrylamid-Copolymeres (60 : 40, ausgedrückt als Mol),
- (40) N-Vinylpyrrolidon/2-Acryloylamino-2-methylpropan sulfonsäure-Copolymeres (75 : 25, ausgedrückt als Mol),
- (41) N-Vinylpyrrolidon/2-Methacrylamid-Copolymeres (60 : 40, ausgedrückt als Mol),
- (42) N-Vinyloxazolidon/N-(2-Hydroxyethyl)-acrylamid- Copolymeres (60 : 40, ausgedrückt als Mol),
- (43) N-Vinyloxazolidon/N-(2-Hydroxyethyl)-acrylamid- Copolymeres (70 : 30, ausgedrückt als Mol),
- (44) N-Vinylpyrrolidon/N-Vinylmorpholin/Acrylamid- Copolymeres (50 : 20 : 30, ausgedrückt als Mol),
- (45) N-Vinylsuccinimid/N-Vinyl-ε-caprolactam/Acrylamid- Copolymeres (40 : 20 : 40, ausgedrückt als Mol),
- (46) N-Vinyloxazolidon/Acrylamid/Acrylsäure-Copolymeres (60 : 20 : 20, ausgedrückt als Mol),
- (47) N-Vinylpyrrolidon/Acrylamid/Vinylacetat/Acrylsäure- Copolymeres (60 : 20 : 10 : 10, ausgedrückt als Mol) und
- (48) N-Vinylpyrrolidon/Dimethylacrylamid-Copolymeres (70 : 30, ausgedrückt als Mol).
Die Polymeren, welche die sich wiederholenden Einheiten,
die durch die Formeln (I) oder (II) dargestellt werden, ent
halten, besitzen normalerweise ein Molekulargewicht von
2000 oder mehr und bevorzugt von 8000 bis 700.000.
Jedes der Polymeren mit den sich wiederholenden Einheiten,
die durch die Formeln (I) oder (II) dargestellt werden,
besitzt relativ hohe hydrophile Eigenschaften. Die Einar
beitung dieser Polymeren in eine Ausbreitungsschicht kann
erfolgen, indem man das Polymere in Wasser oder in einem
mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel löst, die
wäßrige oder organische Lösungsmittellösung auf die Aus
breitungsschicht durch Aufstreichen oder Eintauchen auf
bringt und trocknet. Als organische Lösungsmittel kann man
beispielsweise Methylacetat, Ethylacetat, Butylacetat,
Methylisobutylketon, β-Ethoxyethylacetat, Methylcarbitol,
Dioxan, Cyclohexan, Cyclohexanon, Dipropylenglykol, N,N-
Dimethylformamid, Propanol, Isopropanol, Methanol, Butanol,
sec-Butanol, Ethylenglykolmonomethylether, Ethylenglykol
monobutylether und ähnliche Verbindungen verwenden.
Diese Polymeren werden zu der Ausbreitungsschicht in einer
Menge zugegeben, die ausreicht, um die Ausbreitungsfläche
um mindestens 20% zu verringern. Eine solche Menge liegt
bevorzugt im Bereich von 2 bis 15 g/m².
Das Substrat für ein Enzym ist ein solches, das irgendeine
Wirkung des spezifischen Enzyms aufnimmt, z. B. Alanin für
Alanin-Aminotransferase, Aspartat für Aspartat-Aminotrans
ferase, γ-Glutamyl-p-nitroanilid für γ-Glutamyltransferase,
Lactat für Lactat-Dehydrogenase, Pyrophosphat (ATP, ADP),
Monophosphat und p-Nitrophenylphosphate für alkalische Phos
phatase, Stärke für L-Amylase etc.
Die vorliegende Erfindung kann bei einer großen Vielzahl
bekannter trockener analytischer Elemente verwendet werden
und insbesondere bei Elementen, die einen festen Träger ent
halten, der sowohl gegenüber dem Nachweisreagenssystem als
auch der zu analysierenden Flüssigkeit permeabel ist. Die
Elemente enthalten im allgemeinen einen Träger, eine Nach
weisschicht und/oder eine reaktive Reagensschicht und eine
poröse Flüssigkeitsausbreitungsschicht. Die Elemente kön
nen weiter eine Reflexionsschicht, eine Klebstoffschicht,
eine Filterschicht, eine wasserabsorbierende Schicht, eine
Unterschicht und andere bekannte Schichten enthalten. Bei
spiele solcher analytischer Elemente werden in den US-Pa
tentschriften 3 992 158 und 4 042 335 und in der japani
schen Patentanmeldung (OPI) Nr. 164356/80 beschrieben.
Wenn das erfindungsgemäße trockene analytische Element ei
nen Träger enthält, sind praktische Ausführungsformen eines
solchen Elements (1) eine Struktur, die einen Träger umfaßt,
der darauf eine Nachweisschicht und weiter darauf eine eine
Flüssigkeit ausbreitende Schicht aufweist, (2) eine Struktur,
die einen Träger mit darauf einer reaktiven Reagensschicht
und weiter einer eine Flüssigkeit ausbreitende Schicht darauf
aufweist, (3) eine Struktur, die einen Träger und darauf
einer Nachweisschicht, einer reaktiven Reagensschicht und
einer eine Flüssigkeit ausbreitende Schicht, in dieser Rei
henfolge, aufweist und (4) eine Struktur, die einen Träger,
darauf eine Nachweisschicht, eine zweite reaktive Reagens
schicht, eine erste reaktive Reagensschicht und eine eine
Flüssigkeit ausbreitende Schicht, in dieser Reihenfolge,
aufweist.
In den Strukturen (1) bis (4) können eine Lichtabschirmungs
schicht und/oder eine Filterschicht zwischen der Nachweis
schicht und der reaktiven Reagensschicht oder der eine
Flüssigkeit ausbreitenden Schicht, zwischen der reaktiven
Reagensschicht und der die Flüssigkeit ausbreitenden Schicht
oder zwischen der zweiten reaktiven Reagensschicht und der
ersten reaktiven Reagensschicht vorhanden sein.
Bei der vorliegenden Erfindung können das hydrophile Poly
mere, welches die sich wiederholenden Einheiten der Formeln
(I) oder (II) enthält, nicht nur
in die Flüssigkeitsausbreitungsschicht, sondern ebenfalls
in andere Schichten, beispielsweise in einer Reagensschicht,
eingearbeitet sein.
Es ist bevorzugt, daß jede der zuvor erwähnten Schichten
und eine wasserabsorbierende Schicht auf einem Träger vor
gesehen sind, der gegenüber Licht permeabel ist, jedoch ge
genüber Wasser nicht permeabel ist, und der gegebenenfalls
eine Unterschicht etc. aufweist.
Die wasserabsorbierende Schicht ist eine Schicht, welche
gegenüber Wasser permeabel ist, die aber im wesentlichen
für die Verbindung, die schließlich nachgewiesen werden soll,
undurchlässig ist. Diese Schicht wird bevorzugt zwischen
dem Träger und einer Nachweisschicht oder einer Reagens
schicht in den Fällen vorgesehen, wo die Substanz, die
schließlich nachgewiesen werden soll, eine kaum diffusions
fähige hochpolymere Substanz ist. Eine solche wasserabsor
bierende Schicht enthält bevorzugt ein filmbildendes hydro
philes Polymeres, welches durch das absorbierte Wasser
quillt.
Die Nachweisschicht ist eine Schicht, welche im wesentlichen
für die Substanz, die schließlich nachgewiesen werden soll,
permeabel ist und die kein reaktives Reagens enthält. Diese
Schicht enthält ein hydrophiles Polymeres als Hauptbestand
teil und gegebenenfalls ein oberflächenaktives Mittel
(kationisch, amphoter oder nichtionisch), einen Härter, ein
Puffermittel etc.
Das hydrophile Polymere, welches für die wasserabsorbierende
Schicht oder Nachweisschicht verwendet werden kann, ist ein
natürliches oder synthetisches hydrophiles Polymeres, welches
normalerweise einen Quellgrad von etwa 1,5 bis etwa 20 und
bevorzugt von etwa 2,5 bis etwa 15 aufweist, wenn es in
Wasser absorbiert. Beispiele solcher hydrophiler Polyme
ren sind Gelatine (beispielsweise mit Säure verarbeitete
bzw. behandelte Gelatine, entionisierte Gelatine etc.), ein
Gelatinederivat (beispielsweise mit Phthalsäure oder einem
ihrer Derivate umgesetzte Gelatine etc.), Agarose, Pluran,
Pluranderivate, Polyacrylamid, Polyvinylalkohol, Polyvinyl
pyrrolidon etc.
Eine geeignete Trockendicke der Nachweisschicht oder der
wasserabsorbierenden Schicht liegt im Bereich von etwa 1
bis etwa 100 µm und bevorzugt von etwa 3 bis etwa 30 µm.
Eine Klebstoffschicht kann gebildet werden, um die Ausbrei
tungsschicht an die Nachweisschicht oder die wasserabsor
bierende Schicht entweder direkt oder über eine Lichtab
schirmungsschicht, eine Filterschicht, eine reaktive Rea
gensschicht etc. anzuheften. Die Klebstoffschicht enthält
vorzugsweise ein hydrophiles Polymeres, welches bei der Be
netzung oder Quellung mit Wasser an der Ausbreitungsschicht
haftet. Ein solches hydrophiles Polymeres kann eines von
denen sein, die für die wasserabsorbierende Schicht oder
für die Nachweisschicht aufgezählt wurden. Bevorzugt von
diesen sind Gelatine, Gelatinederivate, Polyacrylamid und
ähnliche. Die Klebstoffschicht besitzt üblicherweise eine
Trockendicke von etwa 0,5 bis etwa 20 µm und bevorzugt von
etwa 1 bis etwa 10 µm. Die Klebstoffschicht kann nicht nur
auf der Nachweisschicht oder wasserabsorbierenden Schicht
vorgesehen sein, sondern sie kann ebenfalls zwischen ande
ren benachbarten Schichten, beispielsweise zwischen einer
reaktiven Reagensschicht, welche eine benachbarte Schicht
ist, vorgesehen sein, um eine Haftung zwischen den Schich
ten sicherzustellen. Die Klebstoffschicht kann durch Be
schichten einer wäßrigen Lösung, welche das zuvor erwähnte
hydrophile Polymere und gegebenenfalls ein oberflächenak
tives Mittel etc. enthält, auf der Nachweisschicht, der
reaktiven Reagensschicht etc. nach irgendeinem gut bekann
ten Beschichtungsverfahren hergestellt werden.
Die reaktive Reagensschicht des erfindungsgemäßen trockenen
analytischen Elements enthält ein reaktives Reagens, das
eine erfaßbare Komponente, z. B. eine Substanz, die eine
Farbe bildet oder verändert, eine fluoreszierende Substanz
erzeugt, was z. B. durch Umsetzung mit einem Produkt ge
schehen kann, das durch eine Enzymreaktion mit einem Sub
strat gebildet wird und das erforderlichenfalls ein hydrophiles
Polymeres, ein Puffermittel, lichtabschirmende feine
Teilchen (entweder reflektierend oder absorbierend) und
dergleichen enthalten kann.
Beispiele für hydrophile Polymere, welche in der reaktiven
Reagensschicht verwendet werden können, sind Stärke, Cellu
lose, Agarose, Gelatine und ihre Derivate (beispielsweise
die hydroxymethylierten Derivate, hydroxypropylierten Deri
vate etc.), Acrylamid-Polymere, Copolymere von Acrylamid
und verschiedenen Vinylmonomeren, Polyvinylalkohol, Copoly
mere von Vinylpyrrolidon und verschiedenen Vinylmonomeren,
Acrylat-Polymere, Copolymere von Acrylaten und verschiede
nen Vinylmonomeren und ähnliche. Von diesen hydrophilen
Polymeren sind Polyvinylalkohol, Vinylpyrrolidon-Polymere,
Acrylamid-Polymere und Cellulosederivate bevorzugt.
Die Puffermittel, welche in der reaktiven Reagensschicht
verwendet werden können, sind übliche, und Beispiele hier
für sind Carbonate, Borate, Phosphate, Good′s-Puffermittel
etc. Die Auswahl des Puffermittels, welches verwendet wird,
kann entsprechend der Literaturstelle, beispielsweise
Takeichi Horio et al., Tanpakushitsu Kiso no Kisojikkenho,
Nankodo (1981), erfolgen.
Die Lichtabschirmungsschicht ist bevorzugt eine wasserpermeab
le Schicht, welche ein hydrophiles Polymeres als Bindemit
tel und darin dispergiert lichtreflektierende feine Teil
chen enthält. Wenn in der Nachweisschicht eine nachweis
bare Änderung erzeugt wird, wie eine Farbänderung, Farbent
wicklung usw., wird diese durch Reflexionscolorimetrie von
der Seite des Trägers, der Lichtdurchlässigkeitseigenschaf
ten besitzt, gemessen, wobei die Lichtabschirmungsschicht,
welche feine reflektierende Teilchen enthält, dazu dient,
die Farbe eines wäßrigen Flüssigkeitsflecks, der aufgetra
gen wurde und in der Ausbreitungsschicht entwickelt wurde,
abzuschirmen. Dieses wäre die rote Farbe des Hämoglobins
bei der Analyse von Gesamtblut. Diese Schicht wirkt ebenfalls
als Lichtreflexionsschicht oder als Hintergrundschicht.
Beispiele für feine lichtreflektierende Teilchen, die in
der Lichtabschirmungsschicht verwendet werden können, sind
feine Pigmentteilchen, wie feine Titandioxidteilchen (des
Rutiltyps, Anatastyps oder Brookit-Typs, feine Kristallkör
ner mit einer Korngröße von etwa 0,1 bis etwa 1,2 µm), feine
Bariumsulfatteilchen, feine Aluminiumteilchen etc., wobei
feine Titandioxidteilchen und feine Bariumsulfatteilchen
bevorzugt sind.
Die oben beschriebenen feinen Lichtabschirmungsteilchen kön
nen ebenfalls in der reaktiven Reagensschicht oder in der
Ausbreitungsschicht verwendet werden.
Das hydrophile Polymere, das als Bindemittel in der Lichtab
schirmungsschicht verwendet wird, kann beispielsweise eines
von denen sein, wie sie für die Nachweisschicht aufgezählt
wurden, und zusätzlich kann man schwach hydrophile regene
rierte Cellulose, Celluloseacetat und ähnliche Verbindungen
verwenden. Unter diesen sind Gelatine, Gelatinederivate und
Polyacrylamid bevorzugt. Von diesen können Gelatine und
Gelatinederivate an sich bekannte Gelatinehärter enthalten.
Die oben beschriebene Lichtabschirmungsschicht kann herge
stellt werden, indem man eine wäßrige Dispersion, die die
feinen Lichtabschirmungsteilchen und das hydrophile Polymere
enthält, auf die Nachweisschicht, die reaktive Reagens
schicht oder eine ähnliche Schicht in an sich bekannter Wei
se aufträgt und anschließend trocknet.
Als Fasern, welche Wasser nicht absorbieren, können in der
erfindungsgemäßen Ausbreitungsschicht Polyesterfasern, wie
Polyethylenterephthalat, Polyamidfasern, wie Nylon, Acryl
fasern, Polyethylenfasern, Polypropylenfasern, Cellulose
acetatfasern und ihre Gemische verwendet werden. Die Aus
breitungsschicht kann aus irgendeinem nichtgewebten bzw.
nichtgewirkten Flächengebilde bzw. Textilmaterial aus ge
webtem bzw. gewirktem Textilmaterial und gestricktem bzw.
gewirktem Textilmaterial bzw. Flächengebilden, die aus die
sen Fasern hergestellt worden sind, bestehen. Das Flächen
gebilde oder Textilmaterial, welches verwendet wird, wird
bevorzugt einer Entwachsungsstufe unterworfen, wie einem
Waschen mit Wasser, damit im wesentlichen die Fette und Öle,
die an ihm, bedingt durch die Herstellung der Garne oder
des gewebten oder gestrickten bzw. gewirkten Textilmaterials,
haften, entfernt werden. Erfindungsgemäß wird ein hydrophi
les Polymeres, ausgewählt unter den Polymeren, welche die
sich wiederholenden Einheiten der Formeln (I) oder (II) ent
halten, in die Hohlräume bzw.
Leerstellen der faserhaltigen Ausbreitungsschicht in Form
eines Gels eingearbeitet.
Das trockene analytische Element für die Analyse enzymati
scher Aktivitäten gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt
eine hohe analytische Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit.
Diese Effekte sind insbesondere in analytischen Elementen
mit einer Ausbreitungsschicht ausgeprägt, die ein
selbstentwickelbares Substrat enthält, welches eine gefärb
te Substanz bei der enzymatischen Reaktion freisetzt, wie
bei einem Element für die Analyse der GGT-Aktivität unter
Verwendung von γ-Glutamyl-p-nitroanilid, bei der Analyse der
Amylaseaktivität unter Verwendung von p-Nitrophenyloligo
saccharid, bei der Analyse der ALP-Aktivität unter Verwen
dung von p-Nitrophenylphosphat und bei ähnlichen Analysen.
Das analytische erfindungsgemäße Element ist ebenfalls in
Analysesystemen mit anderen Substraten, wie bei der Analy
se von ALT, AST, LDH etc., unter Verwendung von Alanin,
Asparaginsäure, α-Ketoglutarsäure, Milchsäure etc. als Sub
strat nützlich.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. In diesen
Beispielen sind, sofern nicht anders angegeben, alle Prozent
gehalte durch das Gewicht ausgedrückt.
Eine wäßrige Lösung mit der Zusammensetzung (a-i), die im
folgenden angegeben wird, wird auf einen 180 µm dicken farb
losen transparenten und glatten Polyethylenterephthalat-
Film, der eine Gelatineunterschicht aufweist, bis zu einer
Trockendicke von 7 µm aufgetragen. Anschließend wird unter
Bildung einer Nachweisschicht getrocknet.
Zusammensetzung (a-i) | |
Gelatine|300 g | |
Oberflächenaktives Mittel 10G (oberflächenaktives Mittel, hergestellt von der Olin Corp.; p-Nonylphenoxypolyglycidol; Polymerisationsgrad: etwa 10) | 5 g |
15%ige Latexlösung von Poly-co(styrol-N-methylmorpholinium-methylstyrol-divinylbenzol) (55 : 43 : 2, ausgedrückt als Mol) | 280 g |
Wasser | 2150 g |
Wäßrige verdünnte Natriumhydroxidlösung zur Einstellung des pH-Werts für | pH=7,0 |
Eine wäßrige Lösung mit der folgenden Zusammensetzung (b-i)
wird dann auf die so gebildete Gelatineschicht bis zu einer
Trockendicke von 5 µm aufgetragen und unter Bildung einer
reaktiven Reagensschicht getrocknet.
Zusammensetzung (b-i) | |
Gelatine|200 g | |
Oberflächenaktives Mittel 10G | 5 g |
α-Glucosidase | 3.500.000 IU |
Wasser | 2600 g |
Verdünnte wäßrige Natriumhydroxidlösung zur Einstellung des pH-Werts | pH=7,0 |
Eine wäßrige Lösung mit der Zusammensetzung (c-i), die im
folgenden angegeben ist, wird weiterhin darauf bis zu einer
Trockendicke bis zu 3 µm aufgetragen und dann wird unter
Bildung einer Lichtabschirmungsschicht getrocknet.
Zusammensetzung (c-i) | |
Gelatine|30 g | |
Oberflächenaktives Mittel 10G | 4 g |
Titanoxid (Anatastyp) | 20 g |
Wasser | 950 g |
Verdünnte wäßrige Natriumhydroxidlösung zur Einstellung des pH-Werts | pH=7,0 |
Die Lichtabschirmungsschicht hatte eine spiegelnde Dichte
von etwa 1,3 (vgl. The Theory of the Photographic Process
(Third Edition), S. 421, veröffentlicht von der The Mac
milian Company).
Danach werden etwa 30 g/m² Wasser einheitlich auf die Licht
abschirmungsschicht zur Quellung der Schicht aufgetragen
und dann wird ein gestricktes bzw. gewirktes Polyester-
Flächengebilde (40 Gauge) unter geringem Druck darauf lami
niert und anschließend wird getrocknet. Eine wäßrige Lösung
mit der Zusammensetzung (d-i), die im folgenden angegeben
ist, wird einheitlich auf das Flächengebilde in einer Menge
von 150 ml/m² aufgetragen und dann wird zur Entfernung des
Lösungsmittels unter Bildung einer Ausbreitungsschicht ge
trocknet. Man erhält so ein integrales mehrschichtiges ana
lytisches Element für die Analyse von Amylase.
Zusammensetzung (d-i) | |
p-Nitrophenyl-α-D-maltopentaosid|34 g | |
Wasser | 1600 g |
Kaliumphosphat | 60 g |
Polyvinylpyrrolidon (durchschnittliches Molekulargewicht: 100 000) | 140 g |
Verdünnte wäßrige Natriumhydroxidlösung zur Einstellung des pH-Werts | pH=7,3 |
10 µl von jeweils im Handel erhältlichem Kontrollserum (Kon
trollserum I) und einem Kontrollserum mit Amylaseaktivität,
welche durch Zugabe von humaner Speichelamylase variiert
wurde (Kontrollserum II) , wurden in einem Flecken auf das
entstehende analytische Element aufgetragen. Das Element
wurde bei 37°C stehengelassen und die Reflexionsdichte des
Elements wurde jede Minute zwischen 3 bis 6 min vom Beginn
des Stehenlassens bei einer Wellenlänge von 400 nm geprüft.
Die Amylasekonzentration der Kontrollsera I und II werden
aus der Änderung in der Reflexionsdichte unter Verwendung
einer zuvor hergestellten Eichkurve bestimmt. Die erhalte
nen Ergebnisse sind in Tabelle I angegeben.
Kontrollserum | |
Erfindungsgemäß | |
I|72 U/l | |
II | 238 U/l |
Es wurde der gleiche Polyethylenterephthalat-Film wie in
Beispiel 1 verwendet. Er wurde mit einer wäßrigen Lösung
der Zusammensetzung (a-ii) beschichtet. Dann wurde eine wäß
rige Lösung der Zusammensetzung (b-ii) aufgetragen. Beide
Zusammensetzungen sind im folgenden angegeben. Die Auftra
gung erfolgte in einer Trockendicke von 10 µm bzw. 3 µm.
Nach jedem Auftragen wurde getrocknet.
Zusammensetzung (a-ii) | |
Gelatine (alkalibehandelte entionisierte Gelatine)|100 g | |
Oberflächenaktives Mittel 10G | 5 g |
1,2-Bis(vinylsulfonylacetamido)-ethan | 1,5 g |
Wasser | 1000 g |
Verdünnte wäßrige Natriumhydroxidlösung zur Einstellung des pH-Werts | pH=7,0 |
Zusammensetzung (b-ii) | |
Gelatine|120 g | |
Oberflächenaktives Mittel (Nonylphenoxypolyglycidol) | 13 g |
Wasser | 2600 g |
Verdünnte wäßrige Natriumhydroxidlösung zur Einstellung des pH-Werts | pH=7,0 |
Danach wurde die Gelatineschicht mit 30 g/m² einer 0,4%igen
wäßrigen Lösung von Nonylphenoxypolyglycidol gequollen,
ein 230 µm dickes gestricktes bzw. gewirktes Polyester-
Flächengebilde (36 Gauge, 50 Denier) wurde darauf unter ge
ringem Druck laminiert und anschließend wurde getrocknet.
Getrennt wurden vier Arten einer wäßrigen Lösung (c-ii)
hergestellt, indem man eine Lösung von 22,8 g γ-Glutamyl-
p-nitroanilid in 10 ml 2N Chlorwasserstoffsäure und 10 ml
Ethanol in einer homogenen Lösung der folgenden Zusammen
setzung dispergierte und dann den pH-Wert mit verdünnter
Chlorwasserstoffsäure auf 8,3 einstellte.
Tris(hydroxyethyl)aminomethan|30,3 g | |
Gylcylglycin | 6,5 g |
Cetyltrimethylammoniumbromid | 5 g |
Oberflächenaktives Mittel (Nonylphenoxypolyglycidol) | 0,8 g |
Wasser | 200 g |
Polyacrylamid (Viskosität: 2500 cps bei 25°C) | angegeben in Tabelle II |
Die entstehende wäßrige Lösung (c-ii) wird einheitlich auf
ein Flächengebilde in einer Menge von 120 ml/m² aufgetragen
und unter Herstellung integraler mehrschichtiger analyti
scher Elemente A, B, C und D getrocknet.
Jedes der Elemente wurde zu einem 15 × 15 mm²-Quadrat ge
schnitten und an einem Kunststoffrahmen befestigt, wie es
in der japanischen Patentanmeldung (OPI) Nr. 63452/62 be
schrieben wird. Man erhält einen Objektträger für die GGT-
Analyse.
10 µl von 7%igem humanem Serum Albumin (HSA), die 197, 382
oder 889 IU/l GGT enthalten, werden auf einem Flecken auf
den entsprechenden Objektträger aufgetragen. Der Objekt
träger wurde in einem geschlossenen Behälter bei 37°C
stehengelassen und die optische Reflexionsdichte wurde bei
410 nm nach 2 und 5 min gemessen und die Änderung ist in
der folgenden Tabelle II angegeben.
10 µl einer 0,83 mM Lösung von Rot Nr. 106 (Nahrungsmittel
farbstoff) werden auf das Element aufgetragen, und das Ele
ment wird bei 37°C stehengelassen. Die Ausbreitungsfläche auf
der Ausbreitungsschicht nach 6 min Stehenlassen ist in der
folgenden Tabelle III angegeben.
Probe | |
Entwickelte Fläche | |
(cm²) | |
A | |
1,50 | |
B | 1,34 |
C | 1,18 |
D | 1,90 |
Es wurde wie im Beispiel 2 verfahren, um ein trockenes ana
lytisches Element zur Bestimmung von GGT herzustellen, je
doch mit der Ausnahme, daß der aus der Lösung (a-ii) her
gestellte getrocknete Film eine Dicke von 15 µm hatte,
daß die Wassermenge in der Lösung (b-ii) 2900 g betrug,
daß 2,5 g Polyacrylamid in die Lösung (c-ii) anstelle des
oberflächenaktives Mittels eingearbeitet wurden und daß
eine Lösung (d-ii) mit folgender Formulierung zusätzlich
nach dem Aufschichten der Lösung (c-ii) in einer Menge von
112 ml/m² aufgeschichtet wurde.
Hydroxyethylcellulose 100 ml
TiO₂ 5 g.
TiO₂ 5 g.
10 µl von 7%igem Human-Serum-Albumin (HSA), enthaltend
1900 IU/l GGT, wurden als Fleck auf das resultierende ana
lytische Element aufgebracht. Das Element wurde in einem
geschlossenen Behälter bei 37°C stehengelassen und die re
flektierende optische Dichte wurde bei 400 nm 2 und 5 min
nach dem Beginn des Stehenlassens gemessen. Die Veränderung
zwischen den zwei Dichten wurde als 0,223 festgestellt.
Wie im Beispiel 3 wurde ein trockenes analytisches Element
für die GGT-Bestimmung hergestellt, jedoch mit der Ausnahme,
daß aus der Zusammensetzung (c-ii) das Polyacrylamid wegge
lassen wurde.
10 µl HSA, enthaltend 1900 IU/l GGT, wurden als Fleck auf
das resultierende analytische Element aufgebracht. Das
System wurde bei 37°C in einem geschlossenen Behälter ge
halten. 2 min und 5 min nach dem Beginn des Stehenlassens
wurde die Veränderung der optischen Dichte gegessen. Sie
wurde als 0,164 festgestellt.
Ein 180 µm dicker transparenter Polyethylenterephthalat-
Film wurde einer Behandlung unterworfen, um seine Oberfläche
hydrophil zu machen. Auf die hydrophile Oberfläche des Films
wurde eine Beschichtungslösung mit folgender Zusammenset
zung aufgeschichtet und getrocknet, um eine Farbentwick
lungsschicht mit einer Trockendicke von 10 µm zu bilden.
Zusammensetzung | |
Gelatine|100 g | |
Wasser | 900 g |
Nitroblau-Tetrazolium (3,3′-(3,3′-Dimethoxy-4,4′-biphenylen)-bis[2-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-tetrazoliumchlorid]) | 6 g |
Nachdem die Farbentwicklungsschicht mit etwa 30 g/m² Wasser
befeuchtet worden war, wurde ein gewebter Stoff, bestehend
aus einem versponnenen Polyethylenterephthalat-Garn (36 Gau
ge, 50 Denier), unter Druck aufgebracht, um eine Ausbrei
tungsschicht zu bilden.
Auf die Ausbreitungsschicht wurde eine Beschichtungslösung
mit folgender Zusammensetzung zu einer Bedeckung von
120 ml/m² aufgeschichtet und getrocknet.
Wasser|180 g | |
Imidazol | 4 g |
Dinatriumcreatinphosphat | 6 g |
Adenosin-diphosphat | 2,4 g |
Adenosin-5′-phosphat | 4 g |
Dinatrium-ethylendiamintetraacetat | 1,6 g |
Magnesiumacetat | 4 g |
Glucose | 2 g |
NAD | 2 g |
N-Acetylcystein | 0,6 g |
Diadenosin-pentaphosphat | 80 mg |
Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase | 30 000 U |
Hexokinase | 40 000 U |
Diaphorase | 30 000 U |
Ascorbinsäure-Oxidase | 30 000 U |
Polyacrylamid (20%ige wäßrige Lösung, durchschnittliches Molekulargewicht: 37 000) | 200 g |
10 µl 70%iges HSA (37°C), enthaltend 0, 149, 383, 656 oder
1560 IU/l von CPK (Creatin-Kinase), wurden als Fleck auf
die Ausbreitungsschicht des so hergestellten analytischen
Elements aufgebracht. Das System wurde auf einer thermosta
tierten Platte mit 37°C stehengelassen, wobei das Verdampfen
von Wasser in genügender Weise verhindert wurde. Nach 2 und
5 min wurden die reflektierenden optischen Dichten bei
540 nm gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle
IV zusammengestellt.
Ein 180 µm dicker transparenter Polyethylenterephthalat-
Film wurde einer Behandlung unterworfen, um seine Oberfläche
hydrophil zu machen. Auf die hydrophile Oberfläche des Films
wurde eine Beschichtungslösung mit folgender Zusammensetzung
aufgeschichtet und getrocknet, um eine Farbentwicklungs
schicht mit einer Trockendicke von etwa 10 µm zu bilden.
Zusammensetzung | |
Gelatine|100 g | |
Wasser | 900 g |
Oberflächenaktives Mittel (Octylphenylpolyglycidol) | 4 g |
Nitroblau-Tetrazolium | 6 g |
Bisvinylsulfon (2,7%ige Lösung | 74 g |
in Wasser : Aceton = 1 : 1, auf das Volumen bezogen) | (pH=6,5) |
Nach dem Befeuchten der Farbentwicklungsschicht mit etwa
30 g/m² Wasser wurde ein gewirkter Stoff, bestehend aus
versponnenem Polyethylenterephthalat-Garn (36 Gauge,
50 Denier), unter Druck darauf aufgebracht, um eine Aus
breitungsschicht zu bilden.
Auf die Ausbreitungsschicht wurde eine Substratlösung mit
folgender Zusammensetzung zu einer Bedeckung von 110 ml/m²
aufgeschichtet und getrocknet, um ein integrales vielschich
tiges analytisches Element zur Bestimmung von CPK zu bil
den.
Zusammensetzung | |
Wasser|180 g | |
Dinatriumcreatinphosphat | 4 g |
Dinatriumcreatinphosphat | 6 g |
Adenosin-diphosphat | 2,4 g |
Adenosin-5′-phosphat | 4 g |
Dinatrium-ethylendiamintetraacetat | 1,6 g |
Magnesiumacetat | 4 g |
Glucose | 2 g |
NAD | 2 g |
N-Acetylcystein | 0,6 g |
Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase | 14 000 U |
Hexokinase | 14 000 U |
Diaphorase | 14 000 U |
Oberflächenaktives Mittel (Triton X-100; p-t-Octylphenoxypolyethoxyethanol; Polymerisationsgrad: etwa 10) | 3 g |
Acrylamid/Vinylpyrrolidon-Copolymeres (Molverhältnis: 50 : 50, 15%ige wäßrige Lösung) | 100 ml/100 ml der obigen Zusammensetzung |
10 µl 7%iges HSA, enthaltend 10 oder 950 IU/l (37°C), wur
den auf die Ausbreitungsschicht fleckförmig aufgebracht.
Das System wurde auf einer thermostatierten Platte bei
37°C stehengelassen, wobei das Verdampfen von Wasser in ge
nügendem Maße verhindert wurde. Die reflektierenden opti
schen Dichten wurden bei 510 nm nach 2 und 5 min gemessen.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle V zusammenge
stellt. Die optische Dichte des analytischen Elements vor
der Aufbringung der CPK enthaltenden Lösung war 0,43.
Der gleiche Polyethylenterephthalat-Film, wie in Beispiel 1
verwendet, wurde mit einer wäßrigen Lösung mit der Zusam
mensetzung (a-iii) und sodann mit einer wäßrigen Lösung
mit der Zusammensetzung (b-iii) beschichtet. Beide Zusam
mensetzungen werden nachstehend angegeben. Die Aufbringung
erfolgte zu einer Trockendicke von 10 µm bzw. 3 µm und
jeweils anschließendem Trocknen.
Zusammensetzung (a-iii) | |
Gelatine (alkalibehandelte deionisierte Gelatine)|100 g | |
Oberflächenaktives Mittel 10G | 5 g |
1,2-Bis(vinylsulfonylacetamido)-ethan | 1,5 g |
Wasser | 1000 g |
Wäßrige verdünnte Natriumhydroxidlösung zur Einstellung | pH=7,0 |
Zusammensetzung (b-iii) | |
Gelatine|120 g | |
Oberflächenaktives Mittel (Nonylphenoxypolyglycidol) | 13 g |
Wasser | 2600 g |
Wäßrige verdünnte Natriumhydroxidlösung zur Einstellung | pH=7,0 |
Nachdem die Gelatineschicht mit 30 g/m² einer 0,4%igen wäß
rigen Lösung von Nonylphenoxypolyglycidol aufgequollen war,
wurde darauf unter geringem Druck ein 230 µm dicker gewirk
ter Polyester-Stoff (36 Gauge, 50 Denier) auflaminiert.
Danach wurde getrocknet.
Es wurden gesondert vier Arten einer wäßrigen Lösung (c-iii)
hergestellt, indem eine Lösung von 2,28 g γ-Glutamyl-p-nitro
anilid in 10 ml 2N Chlorwasserstoffsäure und 10 ml
Ethanol in homogener Lösung mit folgender Zusammensetzung
dispergiert wurden. Der pH-Wert wurde mit verdünnter Chlor
wasserstoffsäure auf 8,3 eingestellt.
Zusammensetzung (c-iii) | |
Tris(hydroxyethyl)aminomethan|30,3 g | |
Glycylglycin | 6,5 g |
Cetyltrimethylammoniumbromid | 5 g |
Oberflächenaktives Mittel (Nonylphenoxypolyglycidol) | 0,8 g |
Wasser | 200 g |
Hydroxypropylmethylcellulose | gemäß Tabelle IV |
Die resultierende wäßrige Lösung (c-iii) wurde gleichförmig
auf den Stoff in einer Menge von 100 ml/m² aufgeschichtet
und getrocknet, um integrale vielschichtige analytische
Elemente E, F, G und H zur Bestimmung der GGT-Aktivität
herzustellen.
Ein Streifen für die GGT-Analyse wurde unter Verwendung
der einzelnen analytischen Elemente E bis H in der gleichen
Weise wie im Beispiel 2 hergestellt.
10 µl 7%iges HSA, enthaltend 172 oder 1110 IU/l GGT, wur
den fleckförmig auf den resultierenden Streifen aufgebracht.
Der Streifen wurde in einem geschlossenen Behälter bei
37°C stehengelassen und die reflektierende optische Dichte
wurde bei 640 nm nach 2 und 5 min gemessen. Ihre Verände
rung ist in Tabelle VI-1 angegeben.
Die entwickelte Fläche auf jedem der GGT-Analyseelemente
wurde in der gleichen Weise wie im Beispiel 2 gemessen. Die
Ergebnisse sind in Tabelle VI-2 zusammengestellt.
Probe | |
Entwickelte Fläche | |
(cm²) | |
E | |
2,30 | |
F | 1,61 |
G | 1,27 |
H | 1,10 |
Claims (6)
1. Trockenes analytisches Element für die Analyse einer
enzymatischen Aktivität in einer Flüssigkeit, dadurch gekenn
zeichnet, daß es einen Träger und darauf minde
stens eine poröse, eine Flüssigkeit ausbreitende Schicht,
die aus Fasern, welche Wasser nicht absorbieren, besteht,
umfaßt, wobei die poröse, eine Flüssigkeit ausbreitende
Schicht ein Substrat für das zu analysierende Enzym und
ein wasserlösliches hydrophiles Polymeres in einer Menge
enthält, die ausreicht, die Ausbreitungsfläche um
mindestens 20% zu verringern, wobei
das wasserlösliche hydrophile Polymere ausgewählt wird aus der Gruppe eines Polymeren, welches eine sich wiederholende Einheit der Formel (I) enthält, worin R¹ ein Wasserstoffatom oder eine Niedrig alkylgruppe bedeutet, und R² und R³ je ein Wasserstoffatom, eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische Koh lenwasserstoffgruppe, eine substituierte oder unsubsti tuierte aromatische Kohlenwasserstoffgruppe oder eine sub stituierte oder unsubstituierte heterocyclische Gruppe bedeuten, oder worin R² und R³ zusammen einen Ring bilden, und einem Polymeren, welches eine sich wiederholende Ein heit der Formel (II) enthält, worin R⁴ ein Wasserstoffatom oder eine Niedrig alkylgruppe bedeutet und Q worin q eine ganze Zahl von 2 bis 4 bedeutet,
-NR⁵-CO-R⁶, worin R⁵ eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlen stoffatomen und R⁶ ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl gruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten, oder bedeutet, worin Z¹ eine Atomgruppierung bedeu tet, welche einen Lactamring, einen Oxazolidonring oder einen Pyridonring bildet.
das wasserlösliche hydrophile Polymere ausgewählt wird aus der Gruppe eines Polymeren, welches eine sich wiederholende Einheit der Formel (I) enthält, worin R¹ ein Wasserstoffatom oder eine Niedrig alkylgruppe bedeutet, und R² und R³ je ein Wasserstoffatom, eine substituierte oder unsubstituierte aliphatische Koh lenwasserstoffgruppe, eine substituierte oder unsubsti tuierte aromatische Kohlenwasserstoffgruppe oder eine sub stituierte oder unsubstituierte heterocyclische Gruppe bedeuten, oder worin R² und R³ zusammen einen Ring bilden, und einem Polymeren, welches eine sich wiederholende Ein heit der Formel (II) enthält, worin R⁴ ein Wasserstoffatom oder eine Niedrig alkylgruppe bedeutet und Q worin q eine ganze Zahl von 2 bis 4 bedeutet,
-NR⁵-CO-R⁶, worin R⁵ eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlen stoffatomen und R⁶ ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl gruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten, oder bedeutet, worin Z¹ eine Atomgruppierung bedeu tet, welche einen Lactamring, einen Oxazolidonring oder einen Pyridonring bildet.
2. Trockenes analytisches Element nach Anspruch 1, da
durch gekennzeichnet, daß R¹ ein Wasser
stoffatom oder eine Methylgruppe bedeutet und R² und R³
je ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe, eine Ethylgrup
pe, eine Benzylgruppe, eine Hydroxyethylgruppe, eine Cyclo
hexylgruppe, eine Phenylgruppe, eine Piperidinogruppe oder
eine Morpholinogruppe bedeuten, wobei die Gesamt-Kohlen
stoffzahl in R² und R³ bis zu einschließlich 12 beträgt.
3. Trockenes analytisches Element nach Anspruch 1, da
durch gekennzeichnet, daß R⁴ ein Wasser
stoffatom bedeutet und Q
bedeutet, worin R⁵ eine Methylgruppe oder eine Ethylgruppe
und R⁶ ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder eine
Ethylgruppe bedeuten, oder
bedeutet, worin Z¹ eine Atomgruppierung bedeutet, welche
einen 5- oder 6gliedrigen Lactamring oder einen Oxazolidon
ring bildet.
4. Trockenes analytisches Element nach Anspruch 3, da
durch gekennzeichnet, daß Q den Rest einer
Pyrrolidongruppe oder den Rest einer Oxazolidongruppe be
deutet.
5. Trockenes analytisches Element nach Anspruch 1, da
durch gekennzeichnet, daß das Polymere,
welches die sich wiederholende Einheit der Formeln (I)
oder (II) enthält, mindestens 20 Mol-% der sich wiederho
lenden Einheit der Formeln (I) oder (II) enthält.
6. Trockenes analytisches Element nach Anspruch 1, da
durch gekennzeichnet, daß das Polymere,
welches die sich wiederholende Einheit der Formeln (I)
oder (II) enthält, in einer Menge von 2 bis 15 g/m² der
flüssigkeitsausbreitenden Schicht vorhanden ist.
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JPS6329246A (ja) * | 1986-07-10 | 1988-02-06 | イ−ストマン コダツク カンパニ− | 展開調節域を有する分析要素 |
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- 1987-05-26 US US07/054,432 patent/US4889797A/en not_active Expired - Lifetime
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