JPS6329246A - 展開調節域を有する分析要素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は臨床化学に関する。

（従来技術） 増大する多数の分析試験、操作及び分析（即ち、検定）
は、血液、血清、尿、脳を髄液及び類似物の様な生物学
的流体を含む多種類の水性液体試料について毎日行わな
くてはならない。効率的に操作し、臨床検査の要求に合
致させるために、これらの分析に使用される「乾式化学
」分析要素は、最小人数のオ梗レータ−で操作できるこ
とが要求され、迅速、正確且つ再現性のある結果金山す
ことが必要である。

多くの遣類の分析が、「乾式化学」分析要素全使用して
行うことが出来る。これらには、米国特許第４，０９８
．５７４号に記載されているようなグルコース分析など
の終点（ｅｎｄ）分析、米国特許第４．５４７，４６５
号に記載されている反応速度（ｒａｔｅ　）分析、及び
結合（又は複合）及び非結合ラベル化（又は標識）リガ
ンドの要素中での分離を含む不均一系免疫分析、並びに
、ラベル化リガンドがレセプターに結合したとき検出し
得る差異を示す均一系免疫分析などが含まれる。

試料液体が要素中に均一に展開（又は拡散）することは
、特に、試料中の被検体の検出に於て正確な定量結果が
望まれているときに、極めて望ましい。この様な均一な
展開は、（ラベル化リガント１アナログ、例えば酵素ラ
ベル化抗原、レセプター、例えば固定化抗体、又は指示
薬組成物、例えば酵素基質のような）他の被検体を含む
か、又は含まない、展開又は移送域を包含させることに
よって得られる。このような展開又は移送域は当該技術
に於て公知であり、例えば、繊維状展開層及び非繊維状
等方性多孔質展開層などが含まれる。

このような展開又は移送域は、例えば、米国特許第３．
９９２，１５８号及び同第４，２５８，００１号に記載
されている。

液体試料が多層分析要素の層内で横方向に展開するとき
、酵素基体のようなラベル化抗原又は小さな分子は、希
釈され、信号が読み取られる場所から洗浄除去されるま
でにすることができる。従って、多層分析要素の層内で
の試料液体の展開、特に横方向の展開を最小にすること
が望ましい。

結合ラベル化リガンドと遊離のものと全分離させるのに
十分な横方向への展開が生じなければならないが、試料
の横方向の展開をゆっくりさせて、水平方向での分離が
生ずる前に競合的な免疫学的反応が十分に行われる機会
を与えることも、ある種の免疫分析に於ては望ましい。

横方向の展開は、界面活性剤を使用するか、又は、分析
要素の展開層の微小孔構造もしくは孔径分布を調整する
ことによってのみ調節できた。

（解決すべき問題点） しかしながら、界面活性剤はその表面張力及び湿潤性に
対する効果と競合するかたちで、展開層における流体流
動特性を同時に変える。例えば、湿潤性が増大するほど
展開速度は増大するが、同時に起きる表面張力の減少は
展開速度を減少させる。かくして、正味の効果は当初望
んだものとは逆になる。更に、少量の界面活性剤は、流
動特性に劇的な変化をもたらすこともある。従って、界
面活性剤だけで流動特性を調節することは困難である。

別の問題は、要素の展開層の多孔度を減少させると試料
の展開の均一性が失われる結果となシ、多孔度の減少が
あまシ大きいと、液体試料中にしばしば存在するよシ大
きい分子及び細胞が展開層中を移動することを妨げると
いう問題があるために、その応用が制限されるというこ
とである。

（問題点を解決するための手段） 本発明の要素には、本質的に（又は固有的に）水溶性で
あるポリマー物質を有する展開調節層が含まれる。この
ポリマー物質は、水性試料と接触して溶解し、要素中の
水性試料の展開が減少するように水性試料の粘度を増大
させる。本発明には分析要素の使用を含む水性試料中の
被検体の分析方法も含まれる。本発明は、検出されるべ
き被検体に対応して検出できる変化を与える指示薬組成
物の存在下に、要素の定められた領域を水性試料と接触
させること、及び指示薬組成物における検出できる変化
の機能として被検体の存在又は量を測定することを含む
被検体の改良された分析方法を提供する。

（操作の様式） 本発明の要素は、生物学的流体（例えば、全血液、血清
、血漿、尿、を椎液、人又は動物組織の懸濁液、糞便、
唾液、リンパ液、及び類似物）の様な水性液体中の多数
の被検体を定量的又は定性的に分析するために使用でき
る。本発明の要素は、グルコース、アスノ臂ルテートア
ミノトランスファラーゼ、アラニンアミノトランスファ
ラーゼ及びラクテートデヒドロゲナーゼ、並びに、治療
薬（例えば、ジフェニルヒダントイン、フェノパルビタ
ール、テオフィリン、ノボキシン、ゲンタマイシン、キ
ニジン、グロパノルオール、トブラマイシン、リドカイ
ン、グロカインアミド、及び類似物）、天然又は合成ス
テロイド（例えば、コルチゾール、アルドステロン、テ
ストステロン、プロゲステロン、エストリオール、等）
、ホルモン（例えば、甲状腺ホルモン、ペプチッドホル
モン、インシュリン、等）、蛋白質（例えば、アルブミ
ン、ＩｇＧ、　ＩｇＭ、等）、抗原、抗体、及びレセプ
ターと本質的に反応する他の種のようなリガンドのよう
な、生物学的流体中に存在する種々の被検体を試験する
ために使用できる。

本発明の展開調節域は、本質的に水溶性であるポリマー
物質からなる。「水に本質的に（又は固有的に）可溶性
」とは、水と接触してポリマー物質が均一な液体又は溶
液になることを意味する。

単に水を吸収するか又は水と接触して膨潤する物質は、
「水圧本質的に可溶性」である物質の範囲には含まれな
い。このような物質は、水膨潤性又は水分散性としてよ
シ適当に分類される。不溶性、水膨潤性又は水分散性と
は反対に、本発明において使用するポリマーは、溶液粘
度を増大させるために、水に本質的に可溶性でなくては
ならない。

これらの本質的に溶解性のポリマーを使用する有利性は
、標準的被覆溶剤を使用する標準的被覆方法によって、
ポリマーを支持体もしくは他の層の上に又は展開層中に
容易に被覆することができることである。

本発明で有用である水に本質的に可溶なポリマー物質は
、その少なくとも０．５〜２５μ厚さの層が、４０℃以
下の温度で該層の片面が水と接触したとき、５分間未満
で溶解する程度に迅速に溶解するものである。特に好ま
しいポリマー物質は、３７℃で該層の片面が水と接触し
たとき、１２０秒間未満で溶解するものである。本発明
の水溶性ポリマー物質は、水性試料と接触して溶解し、
それによって、要素中での試料の展開又は拡散が減少す
るように水性試料の粘度を増大させる。ポリマー物質は
、好ましくは、この粘度増加が少なくとも２〜２０のフ
ァクターであるように選択される。本発明で有用である
このようなポリマー物質の例には、ヒドロキシグロビル
セルロース（飄−６０，０００〜１，０００，０００）
、ヒドロキシエチルセルｏ−ｘ（ＭＷ−１００，０００
〜１，０００，０００）、カルボキシメチルセルロース
及びカルがキシ！ａピルセルａ−スが含まれる。他の有
用なポリマー物質には、未硬化ゼラチン、ポリ（アクリ
ルアミド）、ポリ（ビニルピロリドン）及びポリ（ビニ
ルアルコール）、又はこの第２グループの任意の混合物
もしくは共重合体が含まれる。要素の展開域は、希釈又
は未希釈の試験試料（例えば、１〜２００μｌ）を収容
するための適当な多孔度を有する。有用な展開域は、紙
、多孔性粒状構造体、多孔性ポリマーフィルム、セルロ
ース、木材、ガラス繊維、織布及び不織布（合成及び非
合成）並びにこれらの類似物から調製することができる
。この様な展開域を作るための材料及び方法は、当該技
術で公知である。有用な展開域は、例えば、米国特許明
細書第４．２９２，２７２号、同第３，９９２，１５８
号、同第４，２５８．００１号、同第４，４３０，４３
６号及び特開昭５７−１０１７６０号公報に記載されて
いる。これらの開示は、これらを全部引用することによ
って、本明細書に組み入れる。

一つの好ましい展開域は、上記米国特許第４．２５８．
００１号明細書に記載されているような有機ポリマー粒
子及び、ｊｅ　ＩＪママ−着剤から成る。

前記ポリマー粒子は、要求される性質を有し、天然及び
合成ポリマーの両者を含む広範囲の種々の有機ポリマー
から構成することができる。しかしながら、好ましくは
、それらは１種又はそれ以上のエチレン性不飽和重合性
七ツマ−から形成された、例えば単一モノマーの付加単
重合体又は２種又はそれ以上のこの様なモノマーから形
成された共重合体のような１種又はそれ以上の付加ポリ
マーから構成されるものである。これらのポリマ−は、
種々の一般的重合方法（例えば、溶液、エマルジョン、
分散液、懸濁液等）によって製造できる。所望ならば、
本発明をこれに限定されるわけではないが、特別のポリ
マーは、種々の相互作用組成物を粒子につなぐための１
個又はそれ以上の反応サイトラ含有し得る。

米国特許第４，２５８，００１号明細書のポリマー接着
剤は、有機ポリマー粒子を互いに結合して密着した三次
元格子を展開層に与える。この接着剤の詳細は、上記米
国特許第４，２５８，００１号明細書に記載されている
。ごく普通には、接着剤は粒子のポリマー組成物に存在
するものと同一か又は類似である多くの繰シ返し単位を
含有するポリマーを表すが、この接着剤は一般的には前
記ポリマー粒子に含有される特定のポリマーとは異なる
有機ポリマーから成る。

好ましくは、前記ポリマー接着剤は、１棟又はそれ以上
のエチレン性不飽和重合性七ツマ−から形成された１ｍ
又はそれ以上の付加重合体例えば前記七ツマー２種又は
それ以上から形成された付加コポリマーから構成される
。これらの接着剤は、種々の一般的重合方法によって製
造することができる。

上記展開調節及び展開域に加えて、本発明の要素は、試
験すべき被検体の存在又は量全定性的又は定量的に分析
するために必要な多数の公知の帯域又はそれらの組合せ
から構成することができる。

種々の帯域の実際の選択及び配置は、実施される特定の
分析に依存して変わシ、当業者によって容易に決定する
ことができる。例えば、要素は、試験される被検体に対
応して検出できる変化を与えるための指示薬組成物を含
有する試薬域、及び、指示薬組成物のための記録域、放
射線遮蔽域、下塗シ層等のような、他の公知の任意の帯
域から成る。免疫分析をする際には、要素は好ましくは
、例えばバクテリアまたは有機ポリマー粒子上に固定化
された被検体用の抗体を含む。

本発明の要素の種々の試薬域、展開域、記録域等の実際
の選択及び配置又は配列は、実施される分析によって変
えることができ、当業者のよく知るところである。分析
用の種々の要素は、上に引用した米国特許第３，９９２
，１５８号及び同第４，２５８，００１号並びにヨーロ
ッ・母特許第６６，６４８号明細書に記載されている。

本発明を利用できる。広範囲の分析に有用な、異なった
配列を有する他の要素も当該技術で良く知られている。

（実施態様） 本発明の要素は多数の公知の分析を実施するために有用
などんな配列でも良いが、いくつかの典型的な配列を示
すことは本発明を記述する上で有用である。第１図及び
第２図は例えばグルコースの分析に有用な本発明の要素
を示し、各要素は展開調節域及び展開域がそれぞれ多層
分析要素の別の層を構成する展開調節域及び展開域を有
する。

第１図に於て、展開域１０、展開調節域２０及び試薬域
３０が支持体４０上に担持されている。展開域１０は、
好ましくは上で引用した米国特許第３．９９２，１５８
号又は同第４，２５８，００１号明細書に記載されてい
るようなプラッシュポリマー（ｂｌｕｓｈｅｄｐｏｌｙ
ｍ＠ｒ）又は微粒子構造の展開域である。展開調節域２
０は、水に本質的に可溶なポリマー物質からなる。試薬
域３０は、ゼラチンのような・ぐインダー及び被検体と
相互反応性の指示薬組成物からなる。支持体４０は、ポ
リエステル又はセルロースアセテートのような多くの公
知の支持体物質の何れでもよい。

第２図は、支持体４０　ａ’上に担持された、展開調節
域１０ａ、展開域２０ｍ及び試薬域３０ｍを有する分析
要素の別の実施態様を示す。展開調節域１０ｍは、水溶
性ポリマー物質からなる。展開域２０ｍは、好ましくは
米国特許第３，９９２，１５８号又は同第４，２５８，
００１号明細書に記載されているようなプラッシュプリ
マー又は微粒子構造のものである。試薬域３０ｍは、ゼ
ラチンのようなバインダー及び指示薬組成物からなる。

支持体４０ａは、公知の支持体物質の何れでもよい。

第３図は、展開域及び展開調節域が要素の単一層に含ま
れている、展開域及び展開調節域を有する本発明の多層
分析要素を示す。第３図に於て、展開域及び展開調節域
は、（例えば米国特許第４．２５８，００１号明細書に
記載されえような）有機ポリマー坦体粒子５５を有する
微粒子構造の層５０中に含まれる。試薬域８０は、ゼラ
チンのようなバインダー及び被検体と相互反応性の指示
薬組成物からなる。支持体９０は、ポリエステル又はセ
ルロースアセテートのような多くの公知の支持体物質の
何れでもよい。

本発明による上記要素は、競合免疫分析、終点分析又は
反応速度（ｒａｔ・）分析に使用するために適合できる
。

免疫分析は、適当なラベル、例えば、放射性アイソトー
プ、螢光間、酵素、酵素インヒビター及び酵素コファク
ターを利用できる。グルコースオキシダーゼ、ペルオキ
シダーゼ及びアルカリフォスファターゼのような酵素で
標識するのが好ましい。

要素を、競合免疫分析、終点分析又は反応速度分析に適
合するとき、指示薬組成物は、ある場合には液体試料中
に、又は別の試料として、添加することかできるが、一
般には要素中に存在せしめる。この指示薬組成物は、被
検体と反応でき、被検体又はラベルの反応生成物が検出
できる変化を生ずる試薬の、単一成分又は組合せ成分で
ある。

本発明の一実施態様に於て、要素はラクテートデヒドロ
ゲナーゼ（ＬＤＨ）を測定するために使用される。ＬＤ
Ｈ要素で有用な指示薬組成物は、ＮＡＤＨにコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチソＰ）及びナトリウムピルベー
トである。

本発明の展開域及び展開調節域が多層分析要素中の分離
した層であるとき、該要素は、上記引用した米国特許第
３，９９２，１５８号及び同第４，２５８，００１号明
細書に記載されたような、当該技術分野で公知の技術に
よって製造することができる。水溶性ポリマー物質の層
は、公知の手段によって要素中の層として被覆できる。

本発明の展開域及び展開調節域が分析要素の単一層に含
まれるとき、この層を調製する好ましい方法は、先ず、
（例えば米国特許第４，２５８，００１号明細書に記載
されたような）微粒子展開層を調製することである。こ
の層の上に、水溶性ポリマー物質の溶液を被覆する。

この被覆工程は、好ましくは、水溶性、ｉｆ　リマーが
、展開層中に展開し、ポリマー粒子の表面を被覆するよ
うに実施する。もし、粒子がその上に固定化された抗体
を有し、展開調節域が抗体と相互反応性であるラベル化
抗原を含む場合には、この被覆は抗体とラベル化抗原と
が反応しないような方法で行なう。これは、本発明の水
溶性ポリマーを使用する標準的被覆操作によシ達成され
る。

本発明の要素は、多数の公知の分析、特に、終点分析、
速度分析、並びに均−及び不均一免疫分析のような生物
学的流体の分析を実施するのに有用である。本発明の要
素を使用する方法は、実施する分析の形式に依存する。

この様な方法は当該技術分野で公知であシ、一般に、要
素の特定範囲、好ましくは要素の展開域を、水性液体試
料（例えば、１〜２００μｉ）と物理的に接触させ、こ
の液体試料を要素中の本質的に水溶性であるポリマー物
質と接触させることを含む。接触は、ポリマー物質が水
性試料と接触して溶解し、粘度を増大させ要素中の水性
試料の展開を減少させるような方法でおこなう。接触は
、測定すべき被検体の存在に対応して検出し得る変化を
与える指示薬組成物の存在下でなされる。接触の後、被
検体の存在及び量は検出し得る変化の機能として分析さ
れる。

試薬はまた、液体試料と同時に又は続いて添加される。

接触は、ピペット又は試験試料を分与するための他の適
当な分与手段を使用して、手又は機械で行うことが出来
る。もし不均一系免疫分析を行うならば、液体試料を要
素に適用した後、洗浄液体を添加することが望ましい。

この洗浄は、非結合物質（例えば、被検体及びラベル化
抗原）を結合物質から取り去る。かかる洗浄液体として
は、緩衝剤及び上記の他の試薬、例えば酵素基質を含ん
でいてもよい。

試料を適用した後、要素は、培養、加熱又は類似のよう
な試験結果を得るのを速めるか又は容易にする状態にお
く。

刀、下余白 実施例 以下実施例に従って本発明を更に詳しく説明するが、本
発明の技術的範囲管これらの実施例に限定するものでな
いことはいうまでもない。

本明細書において使用するとき、１．Ｕ、は、Ｉｌ、Ｕ
、　　が酵素のための標準的−及び温度条件下で、１分
間当り１ミクロモルの基質の転化を触媒作用するために
必要な酵素活性の量であると定義される、酵素活性の国
際単位を表す。

ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）　ｉ測定する試
験要素は、１９８５年６月３日に出願されたＳｍｉ　ｔ
ｈ−Ｌｅｗｉ　ｍの米国出願第７４０，１６３号明細書
に記載されているようにして製造した。他に示さない限
り、量はカッコ内に９７ｍ”で与えられる。

ポリ（エチレンテレフタレート）支持体を、硬化ゼラチ
ン（５〜２０）、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００界面活性剤
（０，０５〜１）、Ｎ−）リス（ヒドロキシメチル）メ
チル−２−アミノエタンスルフォン酸（０，５〜２．５
）及びＮＡＤＨ（０，１〜０．８）から成る記録層並び
にぼり（ビニルトルエン−共−ｐ−ｔ−ブチルスチレン
−共−メタクリル酸）（６１：３７：２重量比）ビーズ
（１００〜２００）、ポリ（Ｎ−イソグロビルアクリル
アミド）（０，１〜２）、ピルビン酸ナトリウム（０，
０１〜２）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−
２−アミノエタンスルフォン酸（０，０５〜０．５）、
５ＵＲＦＬＯＮＢ−１３２フッ素化界面活性剤（０，１
〜１０）及びポリ（ビニル−２−ピロリドン）（ｏ、ｉ
〜２）から成る展開層で被覆される。

これらの層を適用した後、Ｋｌｕｅｅｌ　Ｌヒドロキシ
ゾロビルセルロース（０，０５〜５）の被覆剤ｔ−展開
層の上に適用し、被覆剤を展開層の中に浸入させた。乾
燥後、要素に、４株の異なる濃度のＬＤＨ（５１，Ｕ、
／ｌ　；　１０１４　１．Ｕ、／）：　　１４２６１、
Ｕ、／ノ；及び１９０４　１．Ｕ、／Ａ’）を含有する
対照液試料１０μノを点注する。次いで、ＬＤＨの量を
、標準分光光度計を使用して３４０　ｎｍでの反射密度
における時間の経過に伴う減少を測定することによって
分析した。

ヒドロキシゾロビルセルロースを含まない対照要素も、
上記のようにして製造し、試験した。

増大した反応速度が、ヒドロキシゾロビルセルロースを
使用して優れた展開調節、即ち、少ない横方向展開及び
少量の試薬の少ない洗出（ＷｊＬｌｈ−ｏｕｔ　）　′
ｆ！：示す試験要素によって観察される。

（発明の効果） 本発明は１分析要素中における試料の展開を調節する、
水性液体中の被検体の分析のための要素及び方法を提供
する。大きい分子または細胞の移動は影響されない。よ
シ大きい孔サイズが、よシ均一な展開及び全血液との調
和性のために使用できる。展開時間及び吸収速度への蛋
白質の影響による蛋白質偏Ｊ）　（ｂｉａｓ）は、減少
できる３、この要素は、要素中の水性試料の展開を調節
するために、本質的に水溶性であるポリマー物質ｔ−要
素に含有させることによって改良される。この展開調節
は、試料がポリマー物質と接触し、それによってポリマ
ー物質が溶解し試料の粘度を増大させ、要素中の試料の
展開を減少させるとき達成される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、要素で別々の層になっている展開域及び展開
調節域を有する本発明の多層要素を示す。 第２図は、分離した層で展開域及び展開調節域を有する
他の態様を示す。 第３図は、要素の単一層に含まれる展開域及び展開調節
域を有する本発明の多層要素を示す。 ｌＯは展開域、２０は展開調節域、３０は試薬域、４０
は支持体、１０１は展開調節域、２０ｍは展開域、３０
ｍは試薬域、４０ｍは支持体、５０は微粒子構造層、５
５は有機ポリマー担体粒子、８０は試薬域、９０は支持
体である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、本質的に水溶性であるポリマー物質を含む展開調節
   域を含んでなり、このポリマー物質が水性試料と接触し
   て溶解し、それによって要素中における水性試料の展開
   が減少するように水性試料の粘度を増大させる、水性試
   料中の被検体を分析するための分析要素。