DE3687467T2

DE3687467T2 - Komplexe von technetium-99m mit propylen-amin-oximen.

Info

Publication number: DE3687467T2
Application number: DE8686301708T
Authority: DE
Inventors: Lewis Rueben Canning; Rudi Dominique Neirinckx; David Peter Nowotnik; Ian Michael Piper
Original assignee: Amersham International PLC
Current assignee: GE Healthcare Ltd
Priority date: 1985-03-11
Filing date: 1986-03-10
Publication date: 1993-04-29
Anticipated expiration: 2006-03-11
Also published as: AU577931B2; EP0194843A3; EP0194843A2; DE3687467D1; HK97997A; CA1243329A; CA1252481C; JP2547515B2; US4789736A; AU5460986A; JPH0676363B2; EP0194843B1; JPS61225159A; JPH06184078A

Description

Technetium-99m (Tc-99m) ist das bevorzugte Radionuklid zur Organabbildung und für andere Formen der in-vivo- Diagnose. Tc-99m-Komplexe wurden zur Untersuchung der meisten Körperteile herangezogen.
Die Erfindung betrifft einen als diagnostisches Pharmazeutikum verwendbaren Technetium-99m-Komplex, der in der Lage ist, die Blut-Hirn-Schranke zu durchqueren und der für einen Zeitraum, der eine Diagnose zuläßt, im Hirn verbleibt.
Die Europäische Patentbeschreibung 123504 stellt einen lipophilen makrozyklischen Technetium-99m-Komplex bereit, der als diagnostisches Radiopharmazeutikum verwendbar ist. Dieser kann durch Komplexierung von Tc-99m-Pertechnetat in wässeriger Lösung unter reduzierenden Bedingungen mit einem 2 oder 3 Kohlenstoffatome im substituierten oder unsubstituierten Alkylenrest enthaltenden Alkylen-Amin-Oxim gebildet werden, wobei der Komplex ein Netto-Nulladungs- Zentrum mit einer O-H-O-Ringschlußbindung besitzt und ausreichend stabil ist für eine parenterale Verabreichung und für die Herstellung von Abbildungen durch Szintillationsabtastungen und wobei beliebige Alkylensubstituenten solcher Art vorliegen, wie sie für die Anpassung von Radionuklidliganden für Körperaufnahmen verwendbar sind. Von bevorzugten Komplexen wird die Formel angenommen:
in der jeweils R¹, R&sup4; und R&sup5; Wasserstoff oder C1 bis C12-Alkyl bedeuten und R² und R³ jeweils Wasserstoff, Hydroxyl, C1 bis C12-Alkoxyl, C1 bis C22-Kohlenwasserstoffreste, die Alkyl, Alkenyl, Alkaryl, Aralkyl oder Aryl sein können, oder tertiäres Amin mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen bedeutet, oder R² und R³ zusammengenommen mit dem Kohlenstoffatom, an dem sie gebunden sind, eine cycloaliphatische Gruppe bilden, die aminsubstituiert sein kann.
Eine Verbindung der vorstehenden Formel, die in der Europäischen Patentbeschreibung 123504 besonders erwähnt ist, ist die nachstehende Verbindung 2:
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Komplex und den assoziierten Liganden, die in den Schutzbereich der vorstehend genannten Europäischen Patentbeschreibung fallen, jedoch nicht ausdrücklich darin beschrieben wurden, wobei der Komplex interessante Eigenschaften, insbesondere in Bezug auf das Rückhaltevermögen im Hirn, aufweist. Der Komplex ist ein als diagnostisches Radiopharmazeutikum verwendbarer lipophiler makrocyclischer Komplex von Technetium-99m mit einem Propylen-Amin-Oxim-Liganden der Formel 1:
Die Verbindung der Formel 1 besitzt zwei asymmetrische Kohlenstoffatome und liegt daher in Form von drei Stereoisomeren vor. Ein anderer wichtiger Aspekt der Erfindung ergibt sich aus dem überraschenden Auffinden von signifikanten Unterschieden zwischen den in-vivo-Eigenschaften der Tc-99m-Komplexe dieser Stereoisomeren.
Alle diese Stereoisomere sind in der Lage, Komplexe mit radioaktiven und nichtradioaktiven Isotopen mit von Technetium verschiedenen Metallen zu bilden, zum Beispiel Palladium und Platin, deren Komplexe brauchbare Eigenschaften in Therapie und Diagnose aufweisen. Das nachstehende Diagramm zeigt, wie Verbindung 1 in Form eines optisch inaktiven meso- Diastereoisomers und als optisch aktive d- und l-Enantiomere vorliegt.
Diastomere der Verbindung 1
Die Isomerie entsteht, da das 3- und das 9-Kohlenstoffatom asymmetrisch sind. Das meso-Diastereoisomer weist deutlich unterschiedliche Eigenschaften zum dl-Diastereoisomer (einem racemischen Gemisch aus d- und l-Enatiomeren) auf. Zum Beispiel besitzen sie unterschiedliche Schmelzpunkte und ihre HPLC-Retentionszeiten können ebenfalls voneinander abweichen. Die Tc-99m-Komplexe aus den zwei Diastereoisomeren besitzen deutlich unterschiedliche in-vivo-Eigenschaften (96 i.d. Aufnahme im Hirn von Ratten).
Weiterhin wurde ermittelt, daß die d- und l-Enantiomere der Verbindung 1 Eigenschaften aufweisen (physikalische und biologische), die sich voneinander und von einem racemischen Gemisch der zwei Enantiomeren und von dem meso- Diastereoisomer unterscheiden.
Die unterschiedlichen in-vivo-Eigenschaften von Tc- 99m-Komplexen der zwei Diastereoisomeren ist überraschend. Von diesen Komplexen wird angenommen, daß sie die Blut-Hirn- Schranke über einen passiven Diffusionsmechanismus durchqueren. Die Fähigkeit von Molekülen, durch Membranen zu diffundieren, hängt in positiver Weise von der Lipophilie und in negativer Weise vom Molekulargewicht ab. Auf dieser Grundlage würden nur relativ geringe Unterschiede in der Stärke der Radioaktivität im Hirn angenommen, da die Molekulargewichte der zwei Isomeren identisch sind und die Lipophilie der Tc-99m-Komplexe als recht ähnlich angenommen wird. Folglich ist die Höhe des Unterschieds der Aufnahme der zwei Isomeren im Hirn, nämlich ein Faktor von 2,3, überraschend. Das Bessere der zwei Isomeren ist das dl- Isomer.
In ähnlicher Weise gibt es einen überraschenden Unterschied bei der Aufnahme der d- und l-Enantiomeren der Verbindung 1 im Hirn. Bei Untersuchungen an Ratten wurde ein Faktor von 1,6 ermittelt.
Jedes der soweit erwähnten drei Stereoisomeren kann seinerseits aufgrund der eingeschränkten Rotation um die C=N- Bindungen der zwei Oximgruppen in drei unterschiedlichen isomeren Formen vorliegen. Die Isomere können unterschiedliche physikalische Eigenschaften (Schmelzpunkt, Siedepunkt) aufweisen und können mit chromatografischen Verfahren (DC und HPLC) getrennt werden. Ihre Umwandlung ineinander ist im allgemeinen leicht möglich und wird durch Mineral- oder Lewissäuren, Basen oder Metallionen katalysiert.
Verbindung 1 besitzt zwei Oximgruppen, so daß drei Isomere möglich sind:
Es ist anzumerken, daß EZ mit ZE identisch ist. Die gleichen Überlegungen können auf beide "d"- und "l"-Isomere angewendet werden, d. h. jedes besitzt drei (EE, ZZ und EZ) Oximisomere. Es ist zu erwarten, daß das thermodynamisch bevorzugte Isomer das EE-Isomer ist, da die umfangreicheren Gruppen dort die größte Trennung voneinander aufweisen. Die HPLC-Analyse von Verbindung 1 (Beispiel 3) zeigt zwei Hauptpeaks, die als die EE-Oximisomere der meso- und d,l-Diastereomeren identifiziert wurden, sowie vier kleinere Peaks, die vorläufig als die EZ- und ZZ-Isomere jedes Diastereoisomers bezeichnet wurden. Es ist wahrscheinlich, daß die EE-, EZ- und ZZ-Isomere Tc-99m-Komplexe mit unterschiedlichen Bioverteilungseigenschaften bilden können.
Die Propylen-Amin-Oxim-Liganden (d. h. Verbindungen 1 und 2) können über chemische Standardvorschriften hergestellt werden, wie sie allgemein in der vorstehend genannten Europäischen Patentbeschreibung 123504 beschrieben werden. Ein bevorzugter Herstellungsweg ist nachstehend in Beispiel 1 angegeben.
Die Verbindungen werden im allgemeinen in Form eines Gemisches aller drei Isomeren erhalten. Das meso-Isomer kann aus dem dl-Gemisch durch Standardverfahren, wie wiederholte fraktionierte Kristallisation, aus einem Lösungsmittel, in dem ihre Löslichkeiten unterschiedlich sind, gewonnen werden. Wir benutzten erfolgreich Acetonitril und Essigsäureethylester. Die analytische oder präparative Trennung der Isomere kann ebenfalls durch HPLC erfolgen. Die d- und l-Enantiomere können mit Standardverfahren einschließlich der Verwendung von optischen Isomeren einer organischen Säure wie Weinsäure getrennt werden. Die Trennverfahren sind im einzelnen in den nachstehenden Beispielen 3 bis 8 angegeben.
Die Komplexierungsreaktion zwischen den Propylen- Amin-Oxim-Liganden und Pertechnetat (TcO&sub4;&supmin; aus einem Generatoreluat) kann in wässeriger oder wässerig/organischer Lösung unter reduzierenden Bedingungen durchgeführt werden. Zinn(II)salze sind zweckmäßige Reduktionsmittel, jedoch können auch andere für diesen Reaktionstyp bekannte Reduktionsmittel verwendet werden. Da der erfindungsgemäße Komplex ziemlich stark gebundenes Tc-99m enthält, kann er alternativ dazu über ein Ligandenaustauschverfahren hergestellt werden. Die Herstellung von Tc-99m-Komplexen durch Reduktion von Pertechnetat in Gegenwart eines komplexierenden Liganden ist bekannt. Die Bedingungen für solche allgemeinen Reaktionen sind ebenfalls bekannt und können in dem besonderen Fall der Erfindung verwendet werden. Gegenwärtig wird angenommen, daß der Tc-99m-Komplex der Verbindung 1 die Struktur 3 aufweist:
Der Tc-99m-Komplex der Verbindung 1 (ein ungetrenntes dl/meso-Gemisch) zeigt:
1) Eine gute Aufnahme im Hirn von Ratten und Menschen.
2) Eine langsame Entfernung der Radioaktivität aus dem Hirn von Menschen, die mit einer üblichen rotierenden Gammakameraausrüstung durchgeführte tomografische Bildaufnahmen erlaubt.
Seine Vorteile über den Tc-99m-Komplex der Verbindung 2 sind:
1) Eine weit bessere in-vitro-Stabilität (siehe nachstehendes Beispiel 9).
2) Besseres Blut- und Gewebe Hintergrund-Clearance der Aktivität beim Menschen.
3) Der Komplex der Verbindung 2 mag aufgrund des raschen in vitro-Zerfalls für radiopharmazeutische Anwendungen nicht geeignet sein, jedoch ist der Komplex der Verbindung 1 in idealer Weise dafür geeignet, da er nur einen langsamen in vitro-Zerfall aufweist. (Siehe Beispiel 9 nachstehend).
Der Komplex der Verbindung 1 (dl-Isomer) ist in überraschender Weise, soweit es die Rückhaltung im Hirn und die Hirnabbildung betrifft, dem Komplex des meso-Isomers überlegen. Im Gegensatz dazu zeigen die Komplexe der Verbindung 2 (dl-Isomer) und Verbindung 2 (meso-Isomer) keine bedeutenden Unterschiede in der Aufnahme im Hirn (siehe Beispiel 12, nachstehend).
Die Komplexe der Verbindung 1 (sowohl das ungetrennte dl/meso-Gemisch als auch das dl-Isomer) zeigen ebenfalls interessante und unerwartete Eigenschaften.
- Sie sind gute Tumordurchblutungsmittel (unveröffentlichter Artikel von V.R. McCready et al. übersandt zum Journal of Nuclear Medicine).
- Sie sind gute Mittel zum Markieren von Blutzellen, insbesondere von Leukozyten. (Siehe Beispiel 15, nachstehend).
Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Herstellung von Verbindung 1

1A. 4,8-Diaza-3,6,6,9-tetramethyl-3,8-undecadien-2,10- dionbisoxim

11,66 g 2,3-Butandionmonoxim (115,4 mMol) wurden in 50 cm³ 75 ul Essigsäure enthaltendem Benzol gelöst und die Lösung wurde in einer mit einer Dean-Stark-Falle ausgerüsteten Apparatur und in einer Stickstoffatmosphäre zum Rückfluß gebracht. Hierzu wurde eine Lösung aus 5,00 g 2,2- Dimethyl-1,3-propandiamin (5,88 cm³, 49 mMol) in 100 cm³ Benzol über einen Zeitraum von 5 Stunden gegeben. Die erhaltene gelb-braune Lösung wurde für weitere 16 Stunden unter Stickstoff und Rückfluß erhitzt und dann auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Der erhaltene Feststoff wurde durch Absaugen abfiltriert und mit einer geringen Menge kaltem (-40ºC) Acetonitril gewaschen unter Erhalt des Produktes als ein feines weißes Pulver. Nach Hochvakuumtrocknen für 2 Stunden wurden 7,9 g (60% Ausbeute) des Produktes erhalten, Fp. 131ºC-134ºC. Das so erhaltene Produkt enthält eine Spur (ca. 2%-5%) des Ausgangsketooxims (wie durch ¹H NMR ersichtlich); dieses kann aber vollständig durch einmaliges Umkristallisieren aus Benzol entfernt werden unter Erhalt eines Produkts mit einem Schmelzpunkt von 132ºC -135ºC. NMR (¹H, 60 MHz, CDCl&sub3;): 3,3 (4H, brs, CH&sub2;N), 2,1 (6H, s, CH&sub3;-C=N), 2,0 (6H, s, CH&sub3;-C=N), 1,1 (6H, s, (CH&sub3;)&sub2;C) ppm.

1. 4,8-Diaza-3,6,6,9-tetramethylundecan-2,10-dionbisoxim

75 g des Diimins (287 mMol) wurden in 690 cm³ 95% igem wässerigem Ethanol bei 0ºC gelöst. 10,9 g Natriumborhydrid (287 mMol) wurden portionsweise über einen Zeitraum von einer ½ Stunde zugegeben und das Gemisch für 2 Stunden bei 0ºC gerührt. 230 cm³ Wasser wurden hinzugegeben und das Gemisch für weitere 2 Stunden gut gerührt. Das Ethanol wurde im Vakuum entfernt und 140 cm³ weiteres Wasser wurden hinzugegeben. Der pH-Wert wurde auf etwa 11 eingestellt und der so erhaltene weiße Feststoff wurde abfiltriert, mit einer geringen Wassermenge gewaschen und im Vakuum unter Erhalt des Rohprodukts getrocknet. Zweimaliges Umkristallisieren aus heißem Acetonitril ergab das reine Produkt 62,5 g (80%) Fp. 144ºC-145ºC. NMR (¹ H, 200 MHz, DMSO): 10,24 (2H, s, OH), 3,13 (2H, q, CHMe), 2,12 (14, m, CH&sub2;N), 1,65 (6H, s, MeC=N), 1,07 (6H, d, CHMe), 0,78 (6H, s, CMe&sub2;) ppm.

Beispiel 2

Herstellung von 2,3-Pentandion-3-oxim

Methylnitrit wurde mit einer Geschwindigkeit, die einen starken Rückfluß aufrechthält, in ein gut gerührtes Gemisch aus 102 g 2-Pentanon, 400 cm³ Ether und 15 cm³ konzentrierter Salzsäure geblasen. Das Methylnitritgas wurde durch tropfenweise Zugabe eines Gemisches aus 100 cm³ konzentrierter Schwefelsäure und 95 cm³ Wasser auf eine gerührte Aufschlämmung aus 112 g Natriumnitrit, 66 g Methanol und 75 cm³ Wasser erzeugt. Nach vollständiger Zugabe wurde das Gemisch mit gesättigter wässeriger Natriumbicarbonatlösung (32 g in 300 cm³) neutralisiert. Die Etherschicht wurde abgetrennt und die wässerige Schicht mit weiterem Ether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden getrocknet und im Vakuum unter Erhalt eines gelben Öls eingeengt, das beim Stehen auskristallisierte. Umkristallisieren aus heißem Hexan ergab ein reines Produkt (67 g), Fp. 54-5ºC.
Die nachstehenden Verbindungen wurden in ähnlicher Weise hergestellt (Ausbeute und Schmelzpunkt sind angegeben):
2,3-Pentandion-2-oxim (46%, Fp. 59-61ºC)
2,3-Hexandion-3-oxim (64%, Fp. 42-3ºC)
1,2-Propandion-1-oxim (18%, Fp. 61-5ºC)
2-Methyl-3,4-pentandion-3-oxim (45%, Fp. 72-75ºC).

Herstellung von Verbindung 2A

Das nachstehende Diimin wurde in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt (Ausbeute und Schmelzpunkt sind angegeben):
4,8-Diaza-3,9-dimethyl-3,8-undecadien-2,10- dionbisoxim (2A), (51%, Fp. 91-2ºC).

Herstellung von Verbindung 2

Der nachstehende Ligand wurde in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt (Ausbeute, Schmelzpunkt und NMR- Daten sind angegeben):
4,8-Diaza-3,9-dimethylundecan-2,10-dionbisoxim (2), (18%, Fp. 119-122ºC).
NMR (¹H, 200 MHz, d&sub6;-DMSO): 10,2 (2H, s, OH), 3,2 (2H, q, CH), 2,3 (4H, t, CH&sub2;N), 1,65 (6H, s, N=CMe), 1,44 (2H, m, CH&sub2;), 1,04 (6H, d, CH) ppm.

Beispiel 3

Trennung von meso- und d,l-Stereoisomeren der Verbindung 1

A. HPLC

Die analytische Trennung der meso- und d,l-Diastereoisomeren wurde mit Normalphasen-HPLC unter Verwendung einer mit 5 um großen Kieselgelkügelchen gefüllten rostfreien Stahlsäule (250·4,6 mm), verbunden mit einem handelsüblichen chromatografischen Doppelpumpensystem, durchgeführt. Die Detektion erfolgte mit einem variablen UV-Detektor, eingestellt auf 210 nm und der Detektorausgang wurde an einen Kompensationsschreiber und einen für die Peakintegration programmierten Mikrocomputer angeschlossen.
Das durchgehend verwendete Lösungsmittelsystem bestand aus einem Gemisch aus 85% Methanol und 15% 0,4 M wässerigem Ammoniak (Vol./Vol.). Um die Möglichkeit der Zersetzung der Säule bei Verwendung dieses Lösungsmittelsystems auszuschließen, wurde eine Vorsäule mit 15 um-25 um großen Kieselgelteilchen gefüllt und in die Lösungsmittelleitung vor dem Probeneinlaß eingefügt. Die Fließgeschwindigkeit betrug durchgängig 1 ml min&supmin;¹.
Proben, bestehend aus einem Gemisch aus Diastereoisomeren der Verbindung 1, wurden in Methanol zu einer Konzentration von 10 mg ml&supmin;¹ gelöst und 10 ul aliquote Mengen wurden analysiert. Die Grundlinienauflösung wurde ohne Auftreten von Tailing erhalten und die Rententionszeiten von 8,90 min und 9,87 min wurden für die meso-E,E- bzw. d,l-E,E- Isomere aufgezeichnet.

B. Fraktionierte Kristallisation

meso-4,8-Diaza-3,6,6,9-tetramethylundecan-2,10-dionbisoxim

38 g eines direkt nach der Aufarbeitung aus der wässerigen Phase erhaltenen Rohprodukts (Verhältnis 60:40, meso : dl) wurden viermal nacheinander aus heißem Acetonitril unter Erhalt des reinen meso-Isomers als feine weiße Nadeln umkristallisiert (10,5 g) Fp. 149,5-150ºC.

dl-4,8-Diaza-3,6,6,9-tetramethylundecan-2,10-dionbisoxim

9,8 g einer Probe des Rohprodukts (Verhältnis 50:50) wurden zweimal aus heißem Acetonitril unter Erhalt dl-angereicherten Materials umkristallisiert (4,6 g, Verhältnis 47:53, meso : dl). Das Filtrat der zweiten Kristallisation wurde bei Raumtemperatur abgestellt. Eine geringe Menge an Kristallen (220 mg, Verhältnis 20:80, meso : dl) wurde entfernt und dann das Filtrat im Vakuum unter Erhalt dl-angereicherten Materials (1,41 g, Verhältnis 22:78, meso : dl) eingeengt. Langsames Umkristallisieren aus Essigsäureethylester ergab das reine dl-Isomer als große klare Kristalle (82 mg) Fp. 129-130ºC.

Beispiel 4

Röntgenstrahlkristallografie

Zur Röntgenstrahlkristallografie geeignete Kristalle wurden durch Kristallisieren der getrennten Diastereoisomeren aus Methanol erhalten. Einzelheiten der Strukturbestimmung sind nachstehend angeführt. Die Bestimmungen zeigen, daß das Diastereoisomer mit einer HPLC-Retentionszeit von 8,90 Minuten (Beispiel 3A) das meso-Diastereoisomer ist, während das Diastereoisomer mit einer Retentionszeit von 9,87 Minuten das dl-Diastereoisomer ist. In beiden Fällen ist die Konfiguration der Oximfunktionalitäten EE.

a) meso-Isomer

C&sub1;&sub3;H&sub2;&sub8;N&sub4;O&sub2;·½H&sub2;O, M=281, orthorhombisch, Raumgruppe P2&sub1;2&sub1;2, a = 16,946, b = 15,565, c = 6,318 Å, V = 1666,46 Å³, Z = 4, Dc = 1,119 gcm&supmin;³, F(000) = 618, u(Mo-Kx) = 0,47 cm&supmin;¹ 1716 Intensitäten wurden aufgezeichnet (3 < 0 < 250) auf einem Philips PW1100 Diffraktometer. R 0,064 für 1036 Reflektionen mit F > 6αF.

b) dl-Isomer

C&sub1;&sub3;H&sub2;&sub8;N&sub4;O&sub2;, M = 272, monoklin, Raumgruppe C2/C, a = 6,763, b = 10,92, c = 23,863 Å, V = 1600,79 Å³, Z = 4, Dc = 1,128 gcm&supmin;³, F(000) = 600, (Mo-K) = 0,49 cm&supmin;¹. 1448 Intensitäten wurden aufgezeichnet (3 < 0 < 250) auf einem Philips PW1100 Diffraktometer. R 0,071 für 861 Reflektionen mit F > 6αF.

Beispiel 5

Die ¹H und ¹³C NMR-Spektren der meso- und d,l- Diastereoisomeren der Verbindung 1

1. ¹H NMR-Spektren

¹H NMR-Spektren wurden in d&sub6;-DMSO bei 500 MHz unter Verwendung eines Bruker AM-500 FT NMR-Spektrometers durchgeführt. Es erfolgten die folgenden Zuweisungen. (Für die Kohlenstoffatombezifferung siehe vorstehendes Diagramm bezeichnet mit "Diastereoisomere der Verbindung 1"): Chemische Verschiebung Multiplizität Zuordnung
In dem d,l-Diastereoisomer befinden sich die am C&sub6;gebundenen Methylgruppen in gleicher Umgebung und sollten so ein einziges Signal liefern. Dieses wurde dem Singulett bei 0,7835 ppm zugeordnet. In dem meso-Diastereoisomer sind die Methylgruppen, die am C&sub6; gebunden sind, in unterschiedlichen Umgebungen, so daß zwei Singuletts auftreten sollten. Diese wurden den Singuletts bei 0,7748 und 0,7779 ppm zugeordnet.

2.¹³C NMR-Spektren

¹³C NMR-Spektren wurden in d&sub6;-DMSO oder d&sub4;-MeOH unter Verwendung eines Bruker AM-250 FT NMR-Spektrometers oder eines Jeol FX-200 FT NMR-Spektrometers ausgeführt. Die folgenden Zuordnungen erfolgten: Chemische Verschiebung/ppm Zuordnung
Die Zuordnungen wurden gestützt durch off-Resonanz (Rauschentkopplung) und selektive Protonenentkopplungsversuche.
Wie beim Protonenspektrum sind die Signale für die geminalen Dimethylgruppen am C&sub6; für die zwei Isomere unterschiedlich. Der deutlichste Unterschied zwischen den Isomeren kann bei den Signalen für die Kohlensoffatome C&sub5; und C&sub7; gefunden werden, wobei das Signal für das d,l-Diastereoisomer bei etwa 0,55 ppm feldabwärts des entsprechenden Signals für das meso-Diastereoisomer zu sehen war. Die relativen Integrationen für diese Signale entsprachen stark den Werten, die für das Isomerenverhältnis durch HPLC für eine große Reihe von Proben erhalten wurden.

Beispiel 6

Trennung von d- und l-Enantiomeren der Verbindung 1

Das Diastereoisomer der Verbindung 1 wurde mit einem Äquivalent L-(+)-Weinsäure in heißer ethanolischer Lösung behandelt. Die Lösung wurde Abkühlen lassen, der weiße Feststoff abfiltriert und dreimal unter Erhalt des (+ )-Tartratsalzes des einen Enantiomers umkristallisiert [α]D²&sup5;= 28,08º (c=2,5, H&sub2;O). Fp 173-175ºC.
Das Filtrat aus der vorstehenden Herstellung wurde eingeengt und das Salz wurde unter Erhalt der Verbindung 1 durch Lösen in Wasser, Alkalisieren auf pH 9 zersetzt (in unbekannten Enantiomerverhältnissen) und der weiße Feststoff abfiltriert. Dieser wurde aus Essigsäureethylester unter Erhalt weißer Kristalle umkristallisiert. Diese Probe wurde mit einem Äquivalent an D-(-)-Weinsäure in heißer ethanolischer Lösung behandelt und der erhaltene weiße Feststoff wurde dreimal unter Erhalt des (-)-Tartrats des anderen Enantiomers umkristallisiert, [α]D²&sup5; = 27,67º (c=2,5, H&sub2;O). Fp 167,5-168ºC.
Die Proben der so erhaltenen Tartratsalze wurden durch das vorstehend angeführte Verfahren in die freien Basen umgewandelt unter Erhalt von Proben der d- und l-Verbindung 1. Das (+)-Tartratsalz ergab 1-Verbindung 1, [α]D²&sup5; = -2,52º (c=4, MeOH), und das (-)-Tartratsalz ergab d-Verbindung 1, [α]D²&sup5; = +2,51º (c=4, MeOH).

Beispiel 7

Trennung der Verbindung 2 in deren meso und d,l-Formen

Die meso- und d,l-Formen der Verbindung 2 wurden durch HPLC unter Abwandlung der HPLC-Bedingungen, wie sie in Beispiel 3 angewendet wurden, getrennt. Der einzige Unterschied bestand darin, daß die Lösungsmittelzusammensetzung 98% MeOH und 2% (0,4 M) wässerigen Ammoniak, anstelle von 85% bzw. 15%, und die Fließgeschwindigkeit mit einer präparativen Säule 2 ml min&supmin;¹ betrug. Unter diesen Bedingungen besaß das schneller durchlaufende Isomer eine Retentionszeit von etwa 24 Minuten und das langsamer laufende Isomer etwa 26 Minuten. Die Isomere wurden durch präparative HPLC getrennt und gaben Proben mit etwa 90% Reinheit, geschätzt durch HPLC. Aus den ¹H NMR-Spektren wurde das zuerst eluierte Diastereoisomer als meso-Form bezeichnet und die Fraktion ist die d,l-Form.

Beispiel 8

Trennung und Markierung der Oximisomere der Verbindung 1

Aufgrund des raschen Gleichgewichtseffekts war es unmöglich, daß (E,Z)-Oximisomer der Verbindung 1 als isolierten Bestandteil zu charakterisieren. Die Markierung des (E,Z)-Isomeren wurde jedoch durch Isolierung des dem (E,Z)-Dioximisomer entsprechenden HPLC-Peaks mit sofortiger Markierung der erhaltenen Lösung untersucht. Die Versuche unter Verwendung des (E,E)-Isomers zeigten, daß die Markierung unter diesen Bedingungen glatt verläuft. Bei Verwendung des (E,Z)-Isomers war es nicht möglich, eindeutige Ergebnisse zu erhalten, teilweise aufgrund des nichtreproduzierbaren HPLC-Verfahrens und teilweise aufgrund des sich einstellenden Gleichgewichts; jedoch wurde eine Reihe von Komplexen erhalten, einschließlich einer lipophilen Art (gewöhnlich 20% und wahrscheinlich abgeleitet von dem (E,E)-Isomer bei Wiedereinstellung des Gleichgewichts des (E,Z)-Isomers) und einer Reihe weiterer hydrophiler Arten.

Beispiel 9

Herstellung des Tc-99m-Komplexes der Verbindung 1

Eine sterile gefriergetrocknete Formulierung aus 1,0 mg der Verbindung 1 (ein dl-/meso-Gemisch) und 15 mg Zinn(II)tartrat, dicht verschlossen in einem 10 ml Glasfläschchen in Stickstoffatmosphäre, wurden mit 3-8 ml des Eluats von Tc-99m-Pertechnetat wiederhergestellt, erhalten aus einem Mo-99/Tc-99m-Generatorsystem. Die Analyse des erhaltenen Gemisches zeigte an, daß die Reduktion des Pertechnetats (zu einer niederen Oxydationsform des Technetiums) und Komplexierung des reduzierten Technetiums durch den Liganden nach Stehen bei Umgebungstemperaturen für 1 Minute vollständig ist.
Der Tc-99m-Komplex der Verbindung 2 und der einzelnen Isomeren und Enantiomeren davon wurde in ähnlicher Weise gebildet.
Eine Alternative und gegenwärtig bevorzugte Formulierung besteht aus 0,5 mg der Verbindung 1 (dl-Isomer), 4,5 mg Natriumchlorid und 7,6 mg Zinn(II)chloriddihydrat.

Analyse des Tc-99m-Komplexes

Dünnschichtchromatografie

Mit Kieselgel imprägnierte Glasfaserstreifen bilden die stationäre Phase eines schnellen und genauen analytischen Systems. Zwei Streifen, jeweils mit den Abmessungen 20 cm· 2 cm wurden für jede Analyse verwendet. Etwa 5 ul der Lösung des Komplexes wurden 1 cm vom unteren Streifenrand aufgegeben und ein Streifen mit Salzlösung und der andere mit Methylethylketon (MEK) entwickelt.
Die Bestimmung der Verteilung der Radioaktivität längs jeden Streifens wurde mit Hilfe eines 100 Kanalanalysensystems verbunden mit einem Nova-Computer, der zur Peakintegration programmiert wurde, durchgeführt. Die nachstehende Tabelle zeigt die RF-Werte der Hauptbestandteile der Tc-99m-Lösungen. Die beobachtete radiochemische Reinheit der Tc-99m-Komplexe war im allgemeinen größer als 80%. Kieselgel-auf-Glasfaser-Chromatografie beobachtete RF-Werte Tc-99m-Kolloid Eluent MEK Salzlösung Tc-99m-Pertechnetat Tc-99m-Komplexe

Stabilität der Komplexe

Die Bestimmung der radiochemischen Reinheit durch Dünnschichtchromatografie wurde zu verschiedenen Zeitpunkten der Bildung der Technetiumkomplexe der Verbindungen 1 und 2 folgend (in jedem Fall ein dl-/meso-Gemisch) durchgeführt, um die Stabilität der Komplexe zu ermitteln. Typische Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle aufgezeigt. % des gewünschten Tc-99m-Komplexes Zeit der Nachbildung Verbindung
Die in-vitro-Stabilität des Komplexes von Verbindung 2 ist viel schlechter als die des Komplexes der Verbindung 1. Diese Unterschiede sind bedeutsam. Der prozentuale Anteil an Tc-99m, der nicht in Form des Komplexes vorliegt, ist mit Verbindung 2 in allen Fällen mehr als doppelt so hoch als mit Verbindung 1. Diese radiochemische Verunreinigung würde die Hintergrundstrahlung in vivo zu einem Ausmaß erhöhen, bei dem brauchbare Informationen schwieriger oder sogar unmöglich erhältlich wären.

Beispiel 10

Bioverteilungsdaten im Tier

0,1 ml der Tc-99m-Komplexlösung wurden durch intravenöse Injektion (seitliche Schwanzvene) jeder von fünf oder sechs Ratten (140-220 g) verabreicht. Die injizierte Dosis entsprach etwa 1 mCi von Tc-99m. Drei Ratten wurden 2 Minuten nach Injektion und 3 bei 1 Stunde oder 2 bei 2 Stunden nach Injektion getötet. Bei der Sektion wurden die in der nachstehenden Tabelle ausgewiesenen Organe und Blutproben entnommen und hinsichtlich Radioaktivität untersucht. Die Entnahme bei jedem Organ oder Gewebe wurde als ein Prozentsatz der erzielten Gesamtaktivität berechnet.
Das Diastereoisomerenverhältnis in den in diesem Versuch verwendeten Tc-99m-Komplexen ist unbekannt. Bioverteilungsdaten von Tc-99m-Komplexen von Liganden (ohne Trennung von Stereoisomeren) Tc-99m-Komplex des Liganden %id/Organ in Ratten Hirn Herz Leber Blut
Die Ergebnisse bei 2 Minuten und 1 Stunde p.i. sind der Durchschnitt von 3 Tieren.
Die Ergebnisse bei 2 Stunden p.i. sind der Durchschnitt von 2 Tieren.

Beispiel 11

Der Versuch von Beispiel 10 wurde unter Verwendung der getrennten Distereoisomeren der Verbindung 1 wiederholt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle angeführt und sollten mit jenen von Verbindung 1 (das Gemisch) in der Tabelle von Beispiel 10 verglichen werden. Bioverteilungsdaten von Tc-99m-Komplexen aus d,l- und meso- Diastereoisomeren der Verbindung 1 Tc-99m-Komplexe von % id/Organ in Ratten Hirn Leber Blut d/l-meso-
Die Gründe für die Unterschiede in der Aufnahme vom Hirn und die Zurückhaltung sind nicht verständlich, scheinen jedoch nicht das Ergebnis irgendwelcher Unterschiede in der Lipophilie zwischen den Tc-99m-Komplexen der zwei Isomeren zu sein. Wir haben die Lipophilie der zwei Komplexe durch ein spezielles HPLC-Verfahren, das von uns zu diesem Zweck entwickelt wurde, untersucht und haben festgestellt, daß diese nicht unterscheidbar sind. Beispiel 12 Bioverteilungsdaten der Tc-99m-Komplexe von isolierten Stereoisomeren in Ratten a) dl- und meso-Distereoisomere % id/Organ in Ratten Verbindung Nr. Stereoisomer Hirn Herz Leber Blut b) d und l Enantiomere von Verbindung Enantiomer
Die Daten in den Tabellen (a) und (b) sind der Durchschnitt von 3 Tieren zum jeweils gleichen Zeitpunkt. Sie wurden erhalten bei einer unterschiedlichen Zeit unter Verwendung verschiedener Formulierungen von den Daten in Beispiel 11.

Beispiel 13

Klinische Untersuchungen

Alle klinischen Untersuchungen, die Vergleiche zwischen den Tc-99m-Komplexen von dl- und meso- und d,l- und dl-Stereoisomeren der Verbindung 1 einschließen, wurden an normalen Probanden am Königlichen Krankenhaus von Aberdeen durchgeführt.
a) Vergleich von dl- und meso-Diastereoisomeren der Verbindung l
Diese Untersuchung wurde veröffentlicht:
"99mTc HM-PAO-Stereoisomere als potentielle Mittel zur Abbildung der regional zerebralen Durchblutung - Versuchspersonenuntersuchungen". Sharp PF, Smith FW, Gemmell HG et al. J.Nucl.Med. 1986, 27, Seiten 171-177.
Die nachstehende Tabelle zeigt den durchschnittlichen Prozentsatz der Gesamtaktivität injiziert pro Organ 20 Minuten p.i.. Die Daten werden dann aus dem Gebiet der interessierenden Untersuchungen unter Anwendung einer Ganzkörperabtastvorrichtung gewonnen. Tc-99m-Komplex des Stereoisomers von Verbindung % injizierte Aktivität Hirn Leber Nieren Blase+Urin meso dl Gemisch
b) Vergleich von d,l- und dl-Stereoisomeren von Verbindung 1
Die nachstehende Tabelle gibt für jedes Stereoisomer den Durchschnitt von drei Untersuchungen in Prozent der injizierten Dosis bei normalen Probanden 30 Minuten p.i. an. Hirn Leber Niere

Beispiel 14

Klinische Untersuchungen bei Normalprobanden

Die nachstehenden Daten erlauben den Vergleich der relativen Leistung der Komplexe der Verbindungen 1 und 2 (in jedem Fall als nicht getrenntes dl-/meso-Gemisch) bei menschlichen Probanden. i) Blutclearence Zeit nach der Injektion (Minuten) % id in Blut Verbindung ii) Ganzkörperverteilung Hirn Leber Blase

Tomografische Bilduntersuchung beim Menschen

Tomografische Bilder des Hirns wurden unter Verwendung derselben Komplexe bei Normalprobanden bestimmt. Die verwendete Vorrichtung war eine rotierende Gamma-Einkopf- Kamera und ein Minicomputersystem. 64 25-Sekunden-Bilder wurden von der Gammakamera während einer kreisförmigen 360º- Rotation von Kopf und Schultern des Probanden akkumuliert.
Es wurden von dem Hirn unter Verwendung des Komplexes von Verbindung 1 nach der Rekonstruktion mit dem Minicomputer tomografische Bilder guter Qualität erhalten. Die erhaltenen Bilder unter Verwendung des Komplexes von Verbindung 2 waren weniger gut, aufgrund des hohen Anteils an Hintergrundstrahlung, hervorgerufen durch eine höhere Aufnahme in den Weichteilregionen.

Beispiel 15

In vitro-Markierung von Leukozyten

Eine Lösung des Technetium-99m-Komplexes der Verbindung 1 wurde wie nachstehend hergestellt. Ein Fläschchen mit 0,5 mg Verbindung 1; 7,5 mg Zinn(II)chloriddihydrat; und 4,5 mg Natriumchlorid; wurde gefriergetrocknet und unter Stickstoff dicht verschlossen. Dazu wurden 5,0 ml Natriumpertechnetateluat aus einem 135 mCi Technetiumgenerator gegeben.
Gemischte Leukozyten wurden aus 34 ml aus saueranticoaguliertem Citratblut durch Dextran-Sedimentierung erhalten. Diese wurden zweimal gewaschen und in 2,0 ml phosphatgepufferter Salzlösung mit ungefähr 0,25 mg/ml Prostaglandin El wieder suspendiert. Die Suspension wurde mit 0,2 ml der Lösung des Technetium-99m-Komplexes der Verbindung 1 inkubiert. Die Inkubation wurde bei Umgebungstemperatur durchgeführt und die Proben wurden in Intervallen zur Analyse entnommen. Nach zwei Minuten waren 60% der Radioaktivität mit den Blutzellen in Verbindung gebracht; nach fünf Minuten 83% und nach 10 Minuten 89%.
Tc-99m-markierte Leukozyten, die gemäß diesem Verfahren hergestellt wurden, wurden in Ratten injiziert, die Abszesse trugen, die durch Implantation eines mit fekalem Extrakt imprägnierten Schwamms hervorgerufen worden waren. Die Aufnahme des Abszeß war identisch mit der für mit In-111- markierten Leukozyten.

Claims

1. Lipophiler, als diagnostisches Radiopharmazeutikum verwendbarer, makrocyclischer Komplex von Technetium-99m mit einem Propylen-Amin-Oxim-Liganden der Formel:

wobei der Komplex in Form eines einzelnen Stereoisomers oder eines Gemisches von Stereoisomeren vorliegt.

2. Komplex nach Anspruch 1, wobei der Ligand das dl-Diastereoisomer ist.

3. Komplex nach Anspruch 1, wobei der Ligand das l-Enantiomer ist.

4. Komplex nach Anspruch 1, wobei der Ligand das d-Enantiomer ist.

5. Propylen-Amin-Oxim-Ligand der Formel:

6. Ligand nach Anspruch 5, nämlich das dl-Diastereoisomer.

7. Ligand nach Anspruch 5, nämlich das l-Enantiomer.

8. Ligand nach Anspruch 5, nämlich das d-Enantiomer.

9. Komplex nach Anspruch 1 der Formel: