DE3686645T2

DE3686645T2 - Pharmazeutische zusammensetzungen zur verbesserung von wundheilung.

Info

Publication number: DE3686645T2
Application number: DE8686117762T
Authority: DE
Inventors: Dov Michaeli
Original assignee: Marion Merrell Dow Inc
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1985-12-24
Filing date: 1986-12-19
Publication date: 1993-04-15
Anticipated expiration: 2006-12-20
Also published as: AU6672086A; AU607690B2; ATE80038T1; DE3686645D1; CA1292185C; IL81081A; EP0230023A3; PH24823A; ES2005852A6; EP0230023B1; NZ218732A; EP0230023A2; IL81081A0

Description

Diese Erfindung betrifft die Verwendung von polysulfatierten Mono-, Di-, Tri- oder Tetrasacchariden, vorzugsweise Mono- und Disacchariden und ganz besonders bevorzugt Sucroseoctasulfat oder dessen Salzen, als Mittel zur Verbesserung der Heilung von Wunden in Collagen enthaltenden Geweben, einschließlich Haut und Knochen, und pharmazeutische Zusammensetzungen, umfaßend diese Saccharide, Collagen und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Polysulfatierte Saccharide und ihre therapeutische Verwendung, wie zur Behandlung von Patienten, die an immunologischen Krankheiten leiden, als antipeptisches Ulkusmittel oder als Mittel zur Behandlung von Arteriosclerose, sind aus FR-A-2 358 418, GB-A-1 110 939 und GB-A-1 381 426 bekannt.
Die Haut bildet eine Barriere zwischen dem Körper und der Umgebung, wobei eine ihrer Hauptfunktionen der Schutz des Körpers gegen das Eindringen potentiell gefährlicher Materialien und Organismen ist. Die Unversehrtheit der Haut ist daher äußerst wichtig für das fortdauernde Wohlbefinden des Individuums und jede Verletzung oder jeder Riß stellt eine Bedrohung dar, der der Körper entgegentreten muß, um seine fortdauernde Existenz zu schützen.
Unter normalen Umständen stellt der Körper Mechanismen zur Heilung eines Risses oder einer Verletzung bereit, um die Unversehrtheit der Hautbarriere wiederherzustellen. Der Reparaturprozeß selbst für unbedeutende Verletzungen und Risse benötigt einen Zeitraum, der von Stunden und Tagen bis zu Wochen reicht; und in einigen Fällen, wie bei der Ulzeration, kann die Verletzung oder der Riß für ausgedehnte Zeitspannen, d. h. für Monate oder sogar Jahre, fortbestehen. Zu jeder Zeit, ob kurz oder ausgedehnt, besteht die Möglichkeit des Eindringens pathogener Organismen oder fremder Substanzen fort, bis neues Gewebe erzeugt worden ist, um den Riß oder die Verletzung vollständig zu schließen.
Der Heilungsprozeß wird durch komplexe biologische Mechanismen zustandegebracht, an denen im allgemeinen mehrere Gruppen spezieller Zellen und Proteine beteiligt sind. Leukozyten, wie neutrophile Leukozyten und Makrophagen, drängen sich an der Verletzungsstelle und verdauen fremde Krankheitserreger und Detritus. Solche Zellen senden auch chemische Signale aus, die Fibroblasten in der Nähe der Wunde anordnen und schließlich verbindende Strukturen, hauptsächlich Collagen, erzeugen, die einen Großteil der neuen Gewebe ausmachen. Endothel-Zellen erzeugen neue Blutkapillaren, die in die wiederhergestellten Gewebebereiche hineinwachsen, wo ihre Anwesenheit notwendig ist, um den neu wachsenden Gewebezellen Nährstoffe zuzuführen und Abbauprodukte zu entfernen. Mit dem Wachsen der neuen Kapillaren kommt es gleichzeitig zu Vervielfältigung und Einwärtswachsen der Zellen an dem Rand der Wunde. Das fibröse Gewebe, das aus diesem Zellwachstum hervorgeht, füllt schließlich die Wundhöhle mit einem Netz von ineinander verflochtenen Collagenfäden, die sich selbst zur rechten Zeit in festen Bändern anordnen und das permanente neue Gewebe bilden.
Die Oberfläche der Wunde wird anschließend durch einen Prozeß der Ausdehnung, Abflachung und Vervielfältigung der Oberfläche oder Epithel-Zellen an dem Wundrand bedeckt. Diese Epithel-Zellen breiten sich als Tücher in die Wunde unter dem Schorf aus. Schließlich verbinden sich die wuchernden Epithel-Zellen-Tücher, die von den Wundseiten ausgehen, um die Wunde an der Außenseite zu bedecken und zu schließen.
Alle der oben beschriebenen Heilungsprozesse benötigen beträchtliche Zeit. Die Heilungsrate wird durch die Infektionsfreiheit der Wunde, die allgemeine Gesundheit des Individuums oder die Anwesenheit von Fremdkörpern beeinflußt. Auch für gesunde Individuen ohne Komplikationen kann die Heilung eine beträchtliche Zeitspanne, d. h. Tage oder Wochen, dauern. In einigen Fällen kann der Heilungsprozeß durch konstitutionelle Mängel oder durch Krankheitsprozesse beeinträchtigt werden und es ist möglich, daß die Heilung nie wirksam stattfindet.
Bis zu dem Zeitpunkt, zu dem zumindest oberflächliche Heilung stattgefunden hat, besteht für das Individuum die Gefahr fortgesetzter oder neuer Infektion weiter. Es gibt daher einen Zeit/Rate bezogenen Risikofaktor, der alle Wundsituationen begleitet. Je schneller die Wunde heilen kann, desto eher wird das Risiko entfernt. So wäre jedes Verfahren, das die Wundheilungsrate beeinflussen kann oder vorteilhaft die Heilung von schlecht heilenden Wunden beeinflußt, von großem Wert.
Diese Erfindung betrifft die Verwendung von synthetischen, polysulfatierten Mono-, Di-, Tri- und Tetrasacchariden (hierin zusammengefaßt als "Oligosaccharide" bezeichnet) und ihren pharmazeutisch annehmbaren Salzen zur Herstellung eines Pharmazeutikums zur Steigerung der Wundheilung in Geweben mit einer Collagenmatrix, wie Haut und Knochen. Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung von Mono- und Disacchariden, vorzugsweise Sucrose, und die Verwendung von Sacchariden mit drei oder mehr Sulfatgruppen (bezogen auf das ganze Saccharid), vorzugsweise persulfatierten Sacchariden. Die persulfatierten Mono- und Disaccharide werden als besonders brauchbar zur Wundheilung angesehen, wobei am meisten das persulfatierte Disaccharid Sucroseoctasulfat, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,28 mg/ml, und optimalerweise Kaliumsucroseoctasulfat, bevorzugt ist.
Insbesondere betrifft diese Erfindung die Verwendung von polysulfatierten Oligosacchariden zur Herstellung eines Pharmazeutikums, das bei topischer Anwendung auf der Wunde die Wundheilung durch Anziehung von Reparaturzellen zu der Wundstelle fördert. Die Oligosaccharide können auf verschiedene Weise verwendet werden, einschließlich eines Collagen-Verbundstoffes oder in flüssiger Form, wie beispielsweise in einer wäßrigen Lösung oder Suspension in einer Konzentration von 0,1 bis 1,0 mg/ml oder eingekapselt in langsam freisetzenden Polymeren. Bevorzugt ist die Verwendung eines polysulfatiertem Disaccharids in Wasser oder einer isotonischen Salzlösung in Kombination mit Collagen. Ganz besonders bevorzugt werden 7 bis 10 mg/ml Collagen und 0,1 bis 1,0 mg/ml Kaliumsucroseoctasulfat suspendiert in phosphatgepufferter Salzlösung verwendet.
Diese Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend eine Verbindung, ausgewählt aus synthetischen polysulfatierten Mono-, Di-, Tri- oder Tetrasacchariden und ihre pharmazeutisch annehmbaren Salze, Collagen und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger zur Steigerung der Wundheilung in Körpergeweben mit einer Collagenmatrix. Wundheilung wie hierin verwendet schließt die Heilung von durch Krankheit, Trauma oder irgendwelche anderen Mittel hervorgerufenen Haut- oder Knochenwunden ein. Sie betrifft insbesondere Hautgeschwüre, wie Dekubitalgeschwüre oder venöse Stauungsulzera, ebenso wie andere Wunden, bei denen der natürliche Heilungsprozeß des Körpers versagt. Es wird angenommen, daß es sich bei dem Mechanismus, nach dem die Zusammensetzungen arbeiten, um die Stimmulation der Migration von Reparaturzellen, wie Fibroblasten, in die Wundstelle handelt. Es wird angenommen, daß sowohl die Fähigkeit einer Wunde zu heilen als auch die Heilungsrate vorteilhaft durch die Zusammensetzungen beeinflußt werden.
Die Wirksamkeit der die Wundheilung steigernden Zusammensetzungen war überraschend im Hinblick auf die Tatsache, daß Sucralfat, ein für die Behandlung von gastrointestinalen Geschwüren verkauftes kommerzielles Produkt, Eigenschaften hat, die es unerwünscht zur Wundheilung machen. Wo Sucralfat einer Wunde verabreicht wird, wird nur dem Entzündungseffekt der Verbindung untergeordnete Gefäßbildung beobachtet. Wundheilung mit Neovaskularisierung und Fibroblast-(eher als Makrophagen-) Migration wurden mit Sucralfat nicht beobachtet. Im Hinblick auf die Eigenschaften von Sucralfat war die Produktion solcher wundheilender Effekte einschließlich Revaskularisierung und Fibroblast-Migration mit den Zusammensetzungen der Erfindung in der Tat überraschend.
Die in den Zusammensetzungen der Erfindung brauchbaren Oligosaccharide enthalten vorzugsweise Zuckereinheiten, die natürlicherweise im menschlichen Stoffwechsel auftreten. Bevorzugte Oligosaccharide sind Mono- und Disaccharide, vorzugsweise Sucrose. Von solchen Sacchariden zeigen diejenigen mit drei oder mehr Sulfatgruppen (bezogen auf das ganze Saccharid) signifikante Wundheilungseffekte in Tests, die Wundheilungsmodelle verwenden. Es scheint, daß Persulfatierung die größte Wundheilungswirksamkeit ergibt. Ganz besonders bevorzugt enthalten die Zusammensetzungen der Erfindung ein persulfatiertes Oligosaccharid, insbesondere ein persulfatiertes Disaccharid, optimalerweise Sucroseoctasulfat (SOS). Die pharmazeutisch annehmbaren Salze der Oligosaccharide sind von dem Schutzbereich der Erfindung umfaßt. Alkalimetallsalze, wie Kalium- und Natriumsalze, sind insbesondere bevorzugt. Die Verwendung von Salzen, die einer Entzündung untergeordnete Gefäßbildung hervorrufen, sollte vermieden werden. Es wird angenommen, daß lösliche Salze für eine optimale Wundheilung erforderlich sind.
Das Oligosaccharid wird zusammen mit Collagen auf eine Hautwunde in einer wirksamen Menge appliziert, die die hämorrhagische Antwort oder Entzündung auf ein Minimum reduziert. Es kann in flüssiger Form, wie einer Wasserlösung oder einer isotonischen Salzlösung, als eine wäßrige Geldispersion oder in einer Polymermatrix, aus der es nach der Applikation freigesetzt wird, appliziert werden.
Das Oligosaccharid wird in Kombination mit Collagen und einem pharmazeutisch annehmbaren Träger appliziert. Im allgemeinen wird eine isotonische Salzlösung, wie eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PGK), als das Vehikel für das Oligosaccharid verwendet. Das Oligosaccharid kann in der Lösung in Konzentrationen von 0,1 mg/ml bis 10,0 mg/ml vorhanden sein. Levels von 0,1 mg/ml bis 1,0 mg/ml sind jedoch bevorzugt, um ausreichend Oligosaccharid sicherzustellen, um die Wundreparatur zu stimulieren, während ein Überschuß an Oligosaccharid, der eine lokale Hämorrhagie oder Entzündung an der Wundstelle hervorrufen kann, vermieden wird. Ein bevorzugterer Bereich ist 0,25 bis 0,35 mg/ml. Mit Sucroseoctasulfat, insbesondere Kaliumsucroseoctasulfat wurden Levels von 0,28 mg/ml als optimal gefunden.
Diese Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Alkalimetallsucroseoctasulfat durch Reaktion von Pyridin-Schwefeltrioxid mit Sucrose und Zugabe von Alkalimetallhydroxid zu dem Reaktionsprodukt.
Um einen Collagen- und Oligosaccharid-Verbundstoff zu bilden, können das Oligosaccharid und das Collagen in Lösung suspensiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Collagen in dem Verbundstoff in Konzentrationen von 1 bis 15 mg/ml, insbesondere 7 bis 10 mg/ml und ganz besonders bevorzugt in 0,75-mg/ml-Konzentrationen vorhanden. Bei zu hohen Levels tritt eine Inhibierung der Fibroblast-Zellmigration ein.
Das Collagen kann reines natürliches, aus Säugetierquellen durch Entfernung von proteinhaltigen Fremdmaterialien isoliertes Collagen sein. Das verwendete Collagen ist jedoch vorzugsweise Collagen mit durch enzymatische Spaltung von Peptidenden des natürlichen Collagens reduzierter Antigenität.
Reduziert antigenes, enzymbehandeltes Collagen ist ein Handelsprodukt. Es kann von der Collagen Corporation aus Palo Alto, Kalifornien, unter dem Warenzeichennamen "Zyderm"® bezogen werden. Obwohl solch gereinigtes Collagen in den vorliegenden Zusammensetzungen bevorzugt ist, ist es für die Zwecke dieser Erfindung nur notwendig, daß das Collagen in einer für den Humangebrauch geeigneten Form hergestellt wird. Eine bevorzugte Form ist ein Collagen im sterilen Zustand in einer wäßrigen Suspension. Ein gewisser Einschluß von im allgemeinen mit Collagen verbundenen Materialien, z. B. Polysacchariden, kann toleriert werden und beeinträchtigt nicht die Vorteile der Wundheilungszusammensetzungen.
Vorzugsweise sind die Collagen- und Oligosaccharidkonzentrationen direkt proportional. Das heißt, daß mit höherer Oligosaccharidkonzentration mehr Collagen verwendet wird. Vorzugsweise ist die Collagenkonzentration, die 25- bis 30-fache der Oligosaccharidkonzentration.
Die Verbundstoffe können aus Dispersionen der einzelnen Komponenten hergestellt werden. Collagen ist als eine Kochsalzsuspension in einer Konzentration von 35 mg/ml erhältlich. Das Handelsprodukt wird mit steriler physiologischer Kochsalzlösung auf die oben angegebenen Konzentrationslevels, z. B. 8,75 mg/ml, verdünnt. Sucroseoctasulfatlösung wird unter gutem Mischen zu der verdünnten Collagensuspension zugegeben, um die gewünschte Konzentration, z. B. 0,28 mg/ml, zu erhalten.
Für einige Zwecke kann es wünschenswert sein, die Zusammensetzungen der Erfindung in einen viskoseren oder halbfesten gelierten Zustand einzudicken. Falls solches gewünscht ist, können medizinisch verträgliche Standardgelierstoffe, z. B. Cellulose, den Zusammensetzungen beigefügt werden. Es ist auch möglich, geringe Mengen eines normalerweise für topische Anwendungen verwendeten Antibiotikums (z. B. Neomycinsulfat, Sulfadiazin-Silver) hinzuzufügen. Ein topisches Antibiotikum ist nicht notwendig, um die Wundheilung durch die vorliegenden Zusammensetzungen zu fördern, sondern wird vielmehr nur vorteilshalber für die allgemeine Behandlung der Wunden hinzugefügt.
Die hergestellten Zusammensetzungen sollten unter Kühlung aufbewahrt, aber nicht gefroren oder bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. Einfrieren wird die Suspensionseigenschaften stören. Umgebungstemperaturen können das Wachstum jeder beliebigen winzigen Menge von Schadstoffen zulassen, ebenso wie sie Änderungen in der fibrillären Struktur des Collagens hervorrufen können.
Die Wundheilungszusammensetzungen werden in direktem Kontakt mit der Wunde angebracht. (Wenn hierin verwendet bedeutet Applikation auf eine Wunde, daß die Wunde direkt mit der Zusammensetzung in Berührung gebracht wird). Typischerweise kommt es zu dem direkten Kontakt mit der Wunde unmittelbar zu der Zeit, zu der der Patient behandelt wird, eher als anschließend daran, als ein Resultat von Körperfunktionen, wie Verdauung oder zirkulatorischen Funktionen, die später zum Kontakt mit einer Wunde führen.) Die Zusammensetzungen können wie folgt verwendet werden. Die Wunde wird zunächst nach medizinischer Standardpraktik gründlich gereinigt und dekontaminiert, und jegliches nekrotisches Gewebe wird entfernt, damit eine möglichst saubere und sterile Wundoberfläche zurückbleibt. Ein Quantum der Oligosaccharid-Collagen-Suspension oder des -Verbundstoffes wird reichlich auf alle Oberflächen der Wunde aufgetragen. Ein Gazeverband, gründlich befeuchtet mit der Suspension, wird über der Wunde plaziert. Von Zeit zu Zeit, z. B. einmal oder zweimal am Tag, wird der Verband entfernt und die Wundoberflächen nach medizinischer Standardpraktik gereinigt. Die Wundheilungszusammensetzung wird dann wieder auf die Wundoberflächen aufgebracht, und die Wunde wird mit neuen feuchten Gazeverbänden, wie oben angegeben, bedeckt. Dieses Verfahren wird üblicherweise fortgesetzt, bis der Heilungsprozeß vollständig ist, d. h. bis neues Epithel- Gewebe die Wundoberfläche vollständig schließt, wobei zu diesem Zeitpunkt die Verabreichung der Wundheilungszusammensetzung eingestellt wird. Die Wundheilungszusammensetzung kann ebenso auf andere geeignete Weisen verabreicht werden.
Zusätzlich zur Unterstützung der Hautheilung können die Wundheilungszusammensetzungen der Erfindung auch verwendet werden, um Knochenheilung zu fördern. Aufgrund ihrer Heilungseffekte werden die Zusammensetzungen als geeignet angesehen für die Verwendung in oder als prothetische(n) Geräte(n), für die Behandlung von Periodontitis und in künstlichen Häuten. Es soll verstanden werden, daß die Verwendung der Wundheilungsvorteile der Zusammensetzungen sowohl für die Human- als auch die Veterinärmedizin durch diese Erfindung beabsichtigt ist.
Es wird angenommen, daß das Oligosaccharid die Vaskularisierung der Wunde fördert, Fibroblasten und Endothel-Zellen durch Chemotaxis anzieht und eine Umgebung schafft, die günstig ist für Zellen, die am Heilungsprozeß teilnehmen. Die in den Beispielen unten beschriebenen Experimente veranschaulichen die biologische Wirksamkeit von Sucroseoctasulfat zur Steigerung der Wundreparatur. Sie legen auch den Mechanismus nahe, der diesem Effekt zugrundeliegen kann.

BEISPIELE

Beispiel 1 (Herstellung von Ausgangsmaterial)

Herstellung von Kaliumsucroseoctasulfat

Pyridin-Schwefeltrioxid (359,70 g, 2,26 mol) wurden in 1800 ml Pyridin aufgeschlämmt, auf 45ºC erwärmt, und Sucrose (95,84 g, 0,28 mol) wurden zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde auf 65ºC erwärmt und bei dieser Temperatur für 4 Stunden gehalten. Nach Abkühlen wurde das Pyridin abdekantiert, der Feststoff wurde in entionisiertem Wasser gelöst, Methanol wurde zugegeben und der pH-Wert wurde auf 8-9 durch Zugabe von 20% KOH erhöht. Der weiße Niederschlag wurde gesammelt, getrocknet und aus entionisiertem Wasser/Methanol umkristallinisiert, um 195,0 g (52,6% Ausbeute) weiße, körnige Kristalle, Schmelzpunkt 143-147ºC unter Zersetzung, zu liefern.

Beispiel 2 (Herstellung von Ausgangsmaterial)

Synthese von Kaliumsucroseoctasulfat

Das Folgende ist ein bevorzugtes Verfahren um Sucroseoctasulfat zu synthetisieren. In einem flammengetrockneten 12-Liter Dreihalsdestillierkolben wurden Pyridin (5000 ml) und Pyridin-Schwefeltrioxid (989,23 g, 6,22 mol) vereinigt. Unter Rühren wurde Sucrose (265,96 g, 0,77 mol) vorsichtig zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde auf 65ºC erwärmt und bei dieser Temperatur für 4 Stunden gehalten. Mit fortschreitender Reaktion schied sich das Produkt als ein dickes Öl ab. Während die Reaktionsmischung noch heiß war, wurde das Pyridin abdekantiert und der Rückstand in entionisiertem Wasser (2500 ml) gelöst. Unter Rühren wurde die Lösung in einem Eisbad gekühlt, und der pH-Wert wurde durch die vorsichtige Zugabe von 20% wäßriger KOH auf 8-9 eingestellt. Vervollständigung der Fällung des Produktes wurde durch die langsame Zugabe von Methanol (5000 ml) bewerkstelligt. Der Feststoff wurde filtriert und mit 1:1 entionisiertem Wasser/Methanol (2000 ml) gefolgt von Methanol (2000 ml) gewaschen. Der nasse Filterkuchen wurde bei 45ºC unter Vakuum für 15 Stunden getrocknet.
Das Rohprodukt wurde bei 45ºC in entionisiertem Wasser (2700 ml) gelöst, der pH-Wert mit 10% wäßriger KOH auf 9,7 eingestellt, die Lösung heiß durch ein Filterhilfsmittel filtriert und das Produkt unter Rühren mit Kühlung durch ein Eisbad ausfallen gelassen. Der Niederschlag wurde gesammelt, mit 1:1 entionisiertem Wasser/Methanol (2000 ml) und Methanol (2000 ml) gewaschen und bei Umgebungstemperatur unter Vakuum für 15 Stunden getrocknet. Der Niederschlag wurde vier weitere Male wie oben umkristallisiert, um 453,2 g (45,3%) Kaliumsucroseoctasulfat als weiße Kristalle, Schmp. 146-152ºC (Zersetzung), zu liefern. HPLC-Untersuchung (30 cm u Bondapak NH&sub2;, 1 M Ammoniumsulfat, pH-Wert des Fließmittels 3,5, 1 ml/min Durchflußgeschwindigkeit, 0,25 cm/min Schreibergeschwindigkeit, Refraktometer mit 8-facher Empfindlichkeitsregelung, Refraktometertemperatur 30ºC, Säulentemperatur 30ºC) zeigte, daß das Produkt 98,6% Kaliumsucroseoctasulfat enthält, wobei der Rest niedriger sulfatierte Sucrosearten ist. ¹H-NMR-Verschiebungen in ppm gegen TMS: 4,26-4,55 (10H,m), 4,77-4,88 (2H,m), 5,17 (1H,d), 5,80 (1H,d). ¹³C-NMR-Verschiebungen in ppm gegen TMS: 66,3 (CH&sub2;), 66,4 (CH&sub2;), 68,3 (CH&sub2;), 69,5 (CH), 73,7 (CH), 74,2 (CH), 75,6 (CH), 79,0 (CH), 79,3 (CH), 79,3 (CH), 90,4 (CH), 103,1 (C). Elementaranalysen (berechnet, gefunden): C (11,19, 10,91), H (1,10, 1,60), S (19,92, 18,56), K (23,70, 23,67)

Beispiel 3 (Herstellung von Ausgangsmaterial)

Synthese einer Kaliumsucrosepenta-/-hexasulfat-Mischung

Auf gleiche Weise wie für die Synthese von Kaliumsucroseoctasulfat beschrieben wurde eine Mischung von Kaliumsucrosepenta- und -hexasulfat aus Sucrose (17,12 g, 0,05 mol) und Pyridin-Schwefeltrioxid (19,90 g, 0,125 mol) in Pyridin (300 ml) synthetisiert. Das so erhaltene Produkt wurde in entionisiertem Wasser gelöst, durch ein Filterhilfsmittel filtriert, mit einem gleichen Volumen Methanol verdünnt und für 20 Minuten unter Kühlung mit einem Eisbad gerührt. Der Niederschlag wurde filtriert, mit Methanol gewaschen und bei 50ºC unter Vakuum für drei Stunden getrocknet, um die Penta/Hexa-Mischung als einen weißen Feststoff, Schmp. 209-210,5ºC (Zersetzung), zu liefern.
HPLC-Untersuchung, wie für Kaliumsucroseoctasulfat, zeigte, daß das Produkt 45% Kaliumsucrosehexasulfat und 45% Kaliumsucrosepentasulfat enthält, wobei der Rest Sucrosetri-, -tetra- und -heptasulfate ist.

Beispiel 4 (Herstellung von Ausgangsmaterial)

Synthese von Kaliumsucrosetrisulfat

In einem Dreihals-5-Liter-Destillierkolben (getrocknet bei 110ºC für 1 Stunde) wurden unter Rühren Tritylchlorid (423,0 g, 1,52 mol), Pyridin (1800 ml) und Sucrose (153 g, 0,45 mol) vereinigt. Nach Rühren bei Umgebungstemperatur für 60 Stunden wurde Essigsäureanhydrid (657 g, 6,44 mol) zugegeben, das Rühren wurde für 1 Stunde fortgesetzt und dann der Kolben über Nacht in einen Kühlschrank gestellt. Der Feststoff, der sich bildete, wurde durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde in Eiswasser (18 l) gegossen, für 30 Minuten gerührt, und der Feststoff, der sich bildete, wurde filtriert und mit entionisiertem Wasser gewaschen. Der nasse Filterkuchen wurde in Methanol (4 l) für 30 Minuten aufgeschlämmt, filtriert, mit Methanol gewaschen und bei 45ºC unter Vakuum für 15 Stunden getrocknet. Das Rohprodukt wurde umkristallinisiert durch Auflösen in THF (800 ml), Filtrieren, um unlösliche Substanzen zu entfernen, und Verdünnen des Filtrats mit Methanol. Nach Stehen in einem Kühlschrank über Nacht wurde der Niederschlag, der sich bildete, filtriert, mit Methanol gewaschen und bei 40ºC unter Vakuum für 18 Stunden getrocknet, um 324 g (56,6%) Tri-O-trityl-penta-O-acetylsucrose als weiße, körnige Kristalle, Schmp. 232-233,5ºC, zu liefern. Die Verbindung zeigte einen Punkt bei DSC (1:1) Dichlormethan:Toluol, Rf-Wert = 0,04; 2:1 Ether:Toluol Rf-Wert = 0,79).
In einem Dreihals-2-Liter-Destillierkolben wurden unter Rühren Tri-O-trityl-penta-O-acetylsucrose (60,0 g, 0,047 mol) und Essigsäure (1500 ml) vereinigt. Die Reaktionsmischung wurde zum Rückfluß erhitzt und entionisiertes Wasser (30 ml) wurde hinzugegeben. Nach 30 Minuten unter Rückfluß, ließ man die Reaktionsmischung auf Umgebungstemperatur abkühlen, und die Essigsäure wurde unter reduziertem Druck auf ein niedriges Volumen eingeengt. Die Triphenylmethanolkristalle, die sich bildeten, wurden abfiltriert und mit Essigsäure nachgespült, und das Filtrat wurde unter Hochvakuum eingeengt, um einen klebrigen Feststoff zu liefern, der in Dichlormethan gelöst und auf Kieselgel chromatographiert wurde. Elution mit 2:1 Ether:Toluol entfernte das verbleibende Triphenylmethanol und das Silicagel wurde in Methanol aufgeschlämmt, um das Produkt zu erhalten. Entfernung des Methanols, gefolgt von Umkristallinisierung aus Dichlormethan/Petrolether lieferte 6,02 g (21,9%) Penta-O-Acetylsucrose als weiße, körnige Kristalle, Schmp. 153-155ºC. Das Produkt zeigte einen Punkt bei DSC (2:1 Ether:Toluol, Rf-Wert = 0,05 unter Verwendung eines H&sub2;SO&sub4;-Sprays).
In einem 500-ml-Destillierkolben (getrocknet bei 110ºC für 3 Stunden) wurden trockenes Pyridin (90 ml), Penta-O- acetylsucrose (7,59 g, 0,013 mol) und Pyridin-Schwefeltrioxid (14,31 g, 0,09 mol) vereinigt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt, mit entionisiertem Wasser (210 ml) verdünnt, und Bariumhydroxid- Lösung wurde zugegeben, bis der pH-Wert 8,00 war. Das Bariumsulfat, das sich bildete, wurde durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde zur Trockene eingeengt. Der blaßgelbe Feststoff, der sich ergab, wurde bei 50ºC unter Vakuum für 1,5 Stunden getrocknet, um 10,21 g (77%) Bariumpenta-O-acetylsucrosetrisulfat als einen fast weißen, körnigen Feststoff zu liefern. Das IR des Feststoffs war konsistent.
In einem 500 ml-Destillierkolben wurden unter Rühren Bariumpenta-O-acetylsucrosetrisulfat (10,21 g, 0,01 mol) und Methanol (250 ml), das durch eine mit Aluminiumoxid gefüllte Säule durchgeleitet worden war, vereinigt. Die Mischung wurde mit einem Eisbad gekühlt, und Ammoniakgas wurde für 4 Stunden zugegeben, wobei die Reaktionstemperatur nahe 10ºC gehalten wurde. Man ließ die Reaktionsmischung sich auf Umgebungstemperatur erwärmen und rührte über Nacht. Der Feststoff, der sich bildete, wurde abfiltriert, mit Aluminiumoxid behandelten Methanol nachgewaschen und bei 50ºC unter Vakuum für 1 Stunde getrocknet, um 5,98 g (74%) Bariumsucrosetrisulfat als einen körnigen, fast weißen Feststoff zu liefern. Das IR zeigte keine Carbonylbande.
Nur hoch reines Wasser wurde für diese Reaktion verwendet. Ungefähr 35 g eines Amberlite® IR 120 H - Harzes wurden für 20 Minuten in einer 1 N Kaliumhydroxidlösung (200 ml) aufgeschlämmt, der Großteil der Flüssigkeit wurde abdekantiert, und das Harz wurde in eine 450 mm·15 mm-Glassäule mit einem Sinterglasträger eingefüllt. Das Harz wurde mit Wasser gewaschen, bis der pH-Wert nahe 7 war. Bariumsucrosetrisulfat (8,31 g, 0,01 mol) wurde in 150 ml Wasser aufgeschlämmt, unlösliche Feststoffe wurden durch Filtration entfernt, und man ließ das Filtrat bei einer mäßigen Durchflußgeschwindigkeit die Säule hinab fließen. Die Säule wurde mit Wasser (100 ml) nachgespült, und die Eluenten wurden vereinigt, das Wasser wurde unter reduziertem Druck abgedampft, und der sich ergebende fast weiße Feststoff wurde in einem Exsikkator über CaCl&sub2; bei Umgebungstemperatur unter Vakuum für 1 Stunde getrocknet, um 5,91 g (85%) Kaliumsucrosetrisulfat, Schmp. 215ºC (Zersetzung), zu liefern. ¹H-NMR-Verschiebungen in ppm gegen TMS: 3,62-3,68 (1H,m), 3,87 (2H,s), 3,92-3,99 (2H,m) 4,07-4,31 (8H,m), 5,64 (1H,d). ¹³C-NMR-Verschiebung in ppm gegen TMS: 61,8 (CH&sub2;), 68,0 (CH&sub2;), 70,7 (CH&sub2;), 72,6 (CH), 72,7 (CH), 73,0 (CH), 75,5 (CH), 77,8 (CH), 78,5 (CH), 81,0 (CH), 94,1 (CH), 104,4 (C). Elementaranalysen (berechnet, gefunden): C (20,69, 20,98), H (2,75, 2,83), S (13,80, 13,04), K 16,84, 15,93)

Beispiel 5 (Herstellung von Ausgangsmaterial)

Synthese von Kalium-β-lactoseoctasulfat

Auf gleiche Weise wie für die Synthese von Kaliumsucroseoctasulfat beschrieben wurde Kalium-β-lactoseoctasulfat aus β-Lactose (27,7 g, 0,078 mol) und Pyridin- Schwefeldioxid (105,5 g, 0,663 mol) in Pyridin (530 ml) synthetisiert. Der so hergestellte Feststoff wurde dreimal auf folgende Weise umkristallisiert: Der Feststoff wurde in einer minimalen Menge entionisiertem Wasser gelöst, der pH- Wert wurde durch Zugabe von verdünnter wäßriger KOH auf 9-10 eingestellt, und die Lösung wurde mit einem Eisbad gekühlt. Der Feststoff, der sich abschied, wurde durch Filtration isoliert, mit 1:1 Methanol/Wasser gewaschen und in einem Exsikkator über CaCl&sub2; bei Umgebungstemperatur unter Vakuum über 15 Stunden getrocknet, um Kalium-β-lactoseoctasulfat als einen weißen Feststoff, Schmp. 147-152ºC (Zersetzung), in 3,6%iger Ausbeute zu liefern. HPLC-Untersuchung wie für Kaliumsucroseoctasulfat zeigte, daß das Produkt 91,5% Kalium-β-lactoseoctasulfat enthält, wobei der Rest niedriger sulfatierte β-Lactosearten ist. ¹H-NMR- Verschiebungen in ppm gegen TMS: 3,91 (1H,m), 4,04 (2H,m), 4,16-4,29 (4H,m), 4,39-4,46 (4H,m), 4,73 (1H), 4,98 (1H,s) 5,45 (1H,d). ¹³C-NMR-Verschiebungen in ppm gegen TMS: 64,7 (CH&sub2;), 66,3 (CH&sub2;), 71,0 (CH), 72,1 (CH), 74,4 (CH), 74,5 (CH), 74,8 (CH), 74,8 (CH), 74,8 (CH), 76,3 (CH), 95,6 (CH) 100,3 (CH). Elementaranalysen (berechnet, gefunden): C (11,19, 11,38), H (1,10, 1,31), S (19,92, 19,73), K (24,29, 23,25).

Beispiel 6 (Herstellung von Ausgangsmaterial)

Synthese von Kaliummaltoseoctasulfat

Auf gleiche Weise wie für die Synthese von Kaliumsucroseoctasulfat beschrieben wurde Kaliummaltoseoctasulfat aus Maltose (26,70 g, 0,074 mol) und Pyridin-Schwefeltrioxid (105,5 g, 0,663 mol) in Pyridin (530 ml) synthetisiert. Der so erhaltene Feststoff wurde auf die folgende Weise umkristallisiert: Der Feststoff wurde in einer minimalen Menge entionisiertem Wasser bei 30ºC gelöst, und eine kleine Menge Methanol wurde zugegeben; der Feststoff, der sich bildete, wurde durch Filtration isoliert, und das Filtrat wurde abgekühlt, um einen zweiten Ertrag zu erhalten; die Feststoffe wurden vereinigt, und das Verfahren wiederholt, bis ausreichende Reinheit erzielt war. Nach Trocknen in einem Exsikkator über CaCl&sub2; bei Umgebungstemperatur unter Vakuum über 15 Stunden lieferte dies Kaliummaltoseoctasulfat als einen weißen Feststoff, Schmp. 140-148ºC (Zersetzung), in 4%iger Ausbeute. HPLC-Untersuchung wie für Kaliumsucroseoctasulfat zeigte, daß das Produkt 78,3% Kaliummaltoseoctasulfat enthält, wobei der Rest niedrieger sulfatierte Maltosearten ist. Elementaranalysen (berechnet, gefunden): C (11,19, 11,38), H (1,10, 1,41), S (19,92, 19,46), K (24,29, 23,24).

Beispiel 7 (Herstellung von Ausgangsmaterial)

Synthese von Kaliumtrehaloseoctasulfat

Auf gleiche Weise wie für die Synthese von Kaliumsucroseoctasulfat beschrieben wurde Kaliumtrehaloseoctasulfat aus Trehalose (30,64 g, 0,081 mol) und Pyridin- Schwefeltrioxid (110,0 g, 0,691 mol) in Pyridin (550 ml) synthetisiert. Der so erhaltene Feststoff wurde zweimal durch Auflösen bei 40ºC in einer minimalen Menge entionisiertem Wasser und dann Kühlen in einem Eisbad umkristallisiert. Nach Trocknen in einem Exsikkator über CaCl&sub2; bei Umgebungstemperatur unter Vakuum für 15 Stunden lieferte dies Kaliummaltoseoctasulfat als einen weißen Feststoff, Schmp. 160-166ºC (Zersetzung), in 12,5%iger Ausbeute. HPLC- Untersuchung wie für Kaliumsucroseoctasulfat zeigte, daß das Produkt 91,5% Kaliumtrehaloseoctasulfat enthält, wobei der Rest niedriger sulfatierte Trehalosearten ist. ¹H-NMR- Verschiebungen in ppm gegen TMS: 4,35-4,49 (6H,m), 4,56-4,66 (4H,m), 4,93 (2H,t), 5,67 (2H,d). ¹³C-NMR-Verschiebungen in ppm gegen TMS: 65,7 (CH&sub2;), 68,6 (CH), 72,3 (CH), 74,1 (CH), 75,6 (CH), 91,7 (CH). Elementaranalysen (berechnet, gefunden) : C (11,19, 11,04), H (1,10, 1,53), S (19,92, 19,26), K (24,29, 22,26)

Beispiel 8 (Herstellung von Ausgangsmaterial)

Synthese von Kaliumglucosepentasulfat

Auf gleiche Weise wie für die Synthese von Kaliumsucroseoctasulfat beschrieben wurde Kaliumglucosepentasulfat aus Glucose (11,71 g, 0,065 mol) und Pyridin-Schwefeltrioxid (51,6 g, 0,324 mol) in Pyridin (250 ml) synthetisiert. Das so erhaltene Produkt wurde achtmal auf die folgende Weise umkristallisiert: Der Feststoff wurde in entionisiertem Wasser gelöst, der pH-Wert wurde mit 10%iger wäßriger KOH auf 9,8 eingestellt, die Lösung wurde warm durch ein Filterhilfsmittel filtriert, und Methanol wurde zugegeben, bis die Lösung schwach getrübt war; nach Abkühlen in einem Eisbad unter Rühren wurde der Feststoff, der sich abschied, gesammelt, mit Methanol gewaschen und bei Umgebungstemperatur unter Vakuum für 15 Stunden getrocknet. Dies lieferte 2,4 g (4,8%) Kaliumglucosepentasulfat als einen weißen Feststoff, Schmp. 110-135ºC (Zersetzung). HPLC- Untersuchung wie für Kaliumsucroseoctasulfat zeigte, daß das Produkt 96% Kaliumglucosepentasulfat enthält, wobei der Rest niedriger sulfatierte Glucosearten ist. ¹H-NMR-Verschiebungen in ppm gegen TMS: 4,23-4,30 (2H,m), 4,52-4,61 (3H,m), 4,81 (1H,t), 5,62 (1H,d). ¹³C-NMR-Verschiebungen in ppm gegen TMS: 67,5 (CH&sub2;), 71,9 (CH), 73,5 (CH), 74,4 (CH), 74,9 (CH), 96,3 (CH). Elementaranalysen (berechnet, gefunden) : C (9,35, 9,32), H (0,92, 0,78), S (20,79, 20,68), K (25,36, 25,59)

Beispiel 9 (Herstellung von Ausgangsmaterial)

Synthese von Kaliummannosepentasulfat

Auf gleiche Weise wie für die Synthese von Kaliumsucroseoctasulfat beschrieben wurde Kaliummannosepentasulfat aus Mannose (46,6 g, 0,259 mol) und Pyridin-Schwefeltrioxid (206,1 g, 1,298 mol) in Pyridin (1000 ml) synthetisiert. Das so erhaltene Produkt wurde dreimal auf dieselbe wie für Kaliumglucosepentasulfat verwendete Weise umkristallisiert, um 40,3 g (20,2%) Kaliummannosepentasulfat als einen fast weißen Feststoff, Schmp. 168-173ºC (Zersetzung), zu liefern. HPLC-Untersuchung wie für Kaliumsucroseoctasulfat zeigte, daß das Produkt 88,3% Kaliummannosepentasulfat enthält, wobei der Rest niedriger sulfatierte Mannosearten ist. ¹H-NMR-Verschiebungen in ppm gegen TMS: 4,17-4,22 (2H,m), 4,38-4,49 (2H,m), 4,64-4,68 (1H,m), 4,89-4,90 (1H,m), 5,87 (1H,d). ¹³C-NMR-Verschiebungen in ppm gegen TMS: 67,1 (CH&sub2;), 71,5 (CH), 71,6 (CH), 73,8 (CH), 75,2 (CH), 96,0 (CH). Elementaranalysen (berechnet, gefunden) : C (9,35, 9,50), H (0,92, 1,23), S (20,79, 20,28) K (25,36, 23,86)

Beispiel 10 (Herstellung von Ausgangsmaterial)

Synthese von Kaliummelecitosepersulfat

Auf gleiche Weise wie für die Synthese von Kaliumsucroseoctasulfat beschrieben wurde Kaliummelecitosepersulfat aus Melecitose (50,00 g, 0,096 mol) und Pyridin-Schwefeltrioxid (175,08 g, 1,10 mol) in Pyridin (1225 ml) synthetisiert. Das so erhaltene Produkt wurde zweimal auf dieselbe wie für Kaliummaltoseoctasulfat verwendete Weise umkristallisiert. Dies lieferte das Produkt als einen weißen Feststoff, Schmp. 151-157ºC (Zersetzung), in 3,7%iger Ausbeute. HPLC-Untersuchung wie für Kaliumsucroseoctasulfat zeigte, daß das Produkt 92,5% Kaliummelecitosenonasulfat enthält, wobei der Rest höher oder niedriger sulfatierte Melecitosearten ist. Elementaranalysen (berechnet, gefunden): C (11,98, 12,60), H (1,17, 1,45), S (19,55, 19,12), K (23,84, 22,43).

Beispiel 11 (Herstellung von Ausgangsmaterial)

Synthese von Kaliumstachyosepersulfat

Auf gleiche Weise wie für die Synthese von Kaliumsucroseoctasulfat beschrieben wurde Kaliumstachyosepersulfat aus Stachyose (30,00 g, 0,041 mol) und Pyridin-Schwefeltrioxid (92,09 g, 0,579 mol) in Pyridin (960 ml) synthetisiert. Das so erhaltene Produkt wurde dreimal auf dieselbe wie für Kaliummaltoseoctasulfat verwendete Weise umkristallisiert. Dies lieferte das Produkt als einen weißen Feststoff, Schmp. 146-148ºC (Zersetzung), in 4,4%iger Ausbeute. HPLC-Untersuchung wie für Kaliumsucroseoctasulfat zeigte, daß das Produkt eine Mischung von 15,9% Kaliumstachyosedecasulfat, 13,8% -undeca-, 15,2% -dideca-, 32,4% -trideca- und 22,7% -tetradeca- enthält. Elementaranalysen (berechnet, gefunden): C (12,42, 12,92), H (1,22, 1,62), S (19,34, 18,23), K (23,59, 21,22)

Beispiel 12

a) Herstellung eines Collagen-Kaliumsucroseoctasulfat- Verbundstoffes

Gemäß Beispiel 1 hergestelltes Sucroseoctasulfat wurde in phosphatgepufferter Kochsalzlösung gelöst und zu Zyderm® (Collagen Corp., Palo Alto, Kalifornien), einem gereinigten Collagen mit reduzierter Antigenität, zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,28 mg/ml Sucroseoctasulfat und 8,75 mg/ml Collagen zu erreichen. Alle Verdünnungsmittellösungen wurden durch einen 0,22 uM Polyvinylidendifluorid (PVDF)- Filter (Millipore, Bedford, Mass.) hindurchgeleitet. Die Verbundstoffe wurden durch den Durchlauf von Collagen und Sucroseoctasulfat zwischen zwei über einen Hahn verbundenen Spritzen gebildet.

b) Herstellung von Mikrokapseln mit verzögerter Freisetzung

Hydron (Hydron Corp., New Brunswick, N.J.), ein Polymer, das die verzögerte Freisetzung von Makromolekülen erlaubt, wurde mit einem gleichen Volumen phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 0,28 mg/ml Kaliumsucroseoctasulfat enthält, oder reiner phosphatgepufferter Kochsalzlösung gemischt. 20 Aliquoten wurden auf eine Polyethylenfolie getropft und unter reduziertem Druck getrocknet.

c) Herstellung von Schwammimplantaten

Ivalon-(Polyvinylalkohol)-Schwämme wurden in Zylinder mit einem Durchmesser von 4 mm und einer Länge von 6 mm geschnitten. Die Zylinder wurden für eine Stunde in Leitungswasser eingeweicht, für eine Stunde in einem Ofen bei 50ºC getrocknet und gewogen. Schwämme mit einem Gewicht von 6,5 ± 0,4 mg wurden verwendet. Vor der Implantation wurden sie extensiv in destilliertem Wasser gewaschen, in Gegenwart von Leucin sterilisiert, extensiv in destilliertem Wasser gewaschen, wieder sterilisiert und schließlich in steriler PGK gewaschen. Sie wurden in steriler PGK bei 4ºC bis vier Stunden vor der Implantation aufbewahrt, wobei man zu diesem Zeitpunkt die Puffertemperatur Raumtemperatur erreichen ließ.

Beispiel 13

Auswirkung von Collagen/Sucroseoctasulfat auf die Bildung von Granulationsgewebe

Durch subkutane Implantation von Ivalon-Schwämmen kann die Phase der Granulationsgewebebildung in dem Reparaturprozeß untersucht werden. Nach einem kräftigen Reinigungsverfahren ruft das Schwammaterial nur eine minimale inflammatorische Reaktion hervor.
Das Granulationsgewebe, das in die Schwammzwischenräume eindringt, stellt daher sehr wahrscheinlich nicht ein Granulom, das als Antwort auf einen Fremdkörper gebildet wird, sondern eher einen normalen Reparaturprozeß dar. Die relativ geringe Anzahl von akut und chronisch inflammatorischen Zellen und das Fehlen von Riesenzellen, die charakteristisch für eine Fremdkörperreaktion während der unten beschriebenen Tests sind, unterstützt diese Schlußfolgerung.

Implantationsverfahren

Sterile Schwämme, hergestellt wie im Beispiel 12 dargelegt, wurden mit einer 50-ul-Suspension einer Collagen/Sucroseoctasulfatsuspension, hergestellt wie im Beispiel 12, injiziert. Die Collagenkonzentration war 8,75 mg/ml während die Sucroseoctasulfatkonzentrationen 0,01, 0,2, 1,0 oder 10 mg/ml waren. Die Schwämme wurden chirurgisch in männliche 350-500-g-Sprague-Dawley-Ratten implantiert. Vor dem Implantationsverfahren wurden 3 Ratten anästhesiert und ihre dorsalen Oberflächen rasiert und mit Predodyne (West Chemical Products, Lynbrook, N.Y.) gereinigt. Sechs 6-mm- Einschnitte wurden in Zweiergruppen (eine auf jeder Seite rostral, zentral und kaudal der Wirbelsäule) eingeschnitten, räumlich im gleichen Abstand voneinander zwischen den Schulter- und Beckengürteln auf der dorsalen Oberfläche angeordnet. In jeden Einschnitt wurde zwischen der Panniculus carnosus und der Lederhaut eine Tasche gemacht, und zwei Schwämme wurden in sie eingeführt, einer rostral und der andere kaudal; eine Gesamtanzahl von 12 Schwämmen wurde somit in jedes Tier implantiert. Die Position jedes Testpräparats wurde zwischen den rostralen, zentralen und kaudalen Positionen abgewechselt, um die durch die anatomische Lage bedingte Variation zu kontrollieren. Die Einschnitte wurden mit 11-mm-Michel-Wundklammern (Propper, Long Island City, N.Y.) verschlossen. Sieben Tage nach der Implantation wurden die Tiere getötet und die Schwämme mit ihren anhaftenden Bindegewebekapseln chirurgisch entfernt. Kontrollen, Schwämme injiziert mit entweder PGK oder nur Collagen, wurden auf ähnliche Weise behandelt. Insgesamt wurden ungefähr 120 Schwämme pro Gruppe in der Studie verwendet und wahllos für die biochemische und histologische Analyse ausgewählt.

Histologische Analyse

Die Schwämme wurden in Formal in fixiert und nach Dehydratisierung entweder in Kunststoff oder Paraplast eingebettet. Schnitte wurden mit Hemotocylin und Eosin, Trichrom, Silber oder PAS angefärbt. Eine Skala von 0-4+ (es wurden nur ganze Zahlen durch jeden einzelnen Beobachter zugeordnet) wurde im Blindversuch durch vier unabhängige Beobachter verwendet, um den Grad der inflammatorischen Reaktion und der Mesenchym-Zellinfiltration im Inneren des Schwammes qualitativ zu registrieren. Bei Entzündung weist die Rangstufe Null keine Leukozyten, Lymphozyten oder Riesenzellen auf während die Rangstufe 4+ extensive Leukozyten-Infiltration, nekrotische Zelltrümmer und Riesenzellen anzeigt. Mesenchym-Zellinfiltration wurde ebenfalls nach einer vorbestimmten Skala von 0-4 bewertet. Reaktion Null zeigte, wenn überhaupt, wenige, undifferenzierte Fibroblasten, wandernde Endothel-Zellen und Histiozyten, die nicht von anderen wandernden Mesenchym-Zellen differenziert werden konnten, während die Reaktion 4+ ein extensives Infiltrat dieses Typs manifestierte. Neovaskularisation wurde ebenso nach einer 0-4-Skala bewertet, wobei 0 keine Vaskularisation bedeutet und 4, daß ungefähr 1/10 der Wundfläche durch Kapillaren besetzt ist. Obwohl die gesamte Schwammfläche für die Analyse verwendet wurde, stellten wir fest, daß die auffallendsten Unterschiede zwischen den verschiedenen Behandlungen in dem Zentrum des Schwammes klar zu sehen waren. Daher wurde das histologische Aussehen der zentralen Zone für die Präsentation ausgewählt.
Ein Schwamm, der einen Collagen/Sucroseoctasulfat- Verbundstoff (8,75/1,0 mg/ml) enthält, zeigt Granulationsgewebe, reich an Fibroblasten und an neovaskulärem Wachstum. Bei einem Zehntel der Konzentration des Sucroseoctasulfats (Collagen/Sucroseoctasulfat von 8,75/0,1 mg/ml) gab es noch eine starke fibroblastische und neovaskuläre Reaktion. Reduzierung der Konzentration des Sucroseoctasulfats in dem Verbundstoff auf 0,01 mg/ml führte zu einem deutlichen Verlust des gefäßbildenden Effekts. Andererseits führte die Injektion eines Verbundstoffes mit Collagen/Sucroseoctasulfat von 8,75/10,0 mg/ml sowohl zu makroskopischer als auch mikroskopischer Hämorrhagie.
Andere Verbindungen wurden auf ähnliche Weise getestet. Die Ergebnisse dieser Tests sind in Tabelle V dargelegt, die im Beispiel 16 dargelegt ist. Ähnliche Tests mit Sucralfat zeigten eine starke inflammatorische Reaktion ohne Neovaskularisation oder Fibroblast-Migration.

Biochemische Analyse

Die Schwämme wurden am siebten Tag nach der Implantation chirurgisch entfernt und die anhaftende Bindegewebekapsel vorsichtig von ihren Oberflächen entfernt. Der DNS- Gehalt wurde durch die Diphenylamin-Methode (Grossmann L., Moldane K. (Hrsg.) Methods in Enzymology, 1, Part B, Academic Press, New York, S. 163-166, 1968) bestimmt. Die DNS-Synthese wurde durch die 24-Stunden-Inkubation von fein zerkleinerten Schwämmen in Dulbecco's modifiziertem Eagle's- Medium (DMEM) ergänzt mit 10%igem fötalem Kälberserum, 2 mM Glutaminsäure und 10 uCi/ml H3-Thymidin (Amersham, Arlington Heights, Il.) gemessen. Bei Abschluß der Inkubationsperiode wurden das Medium und ein gleiches Volumen 20%iger Trichloressigsäure (TCA) gemischt und bei 1000 g für 15 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Der Niederschlag wurde dreimal mit 10%iger TCA gewaschen, in 1 M Perchloressigsäure suspendiert und für 30 Minuten auf 100ºC erhitzt. Aliquoten wurden dann mit einer Fluorlösung (PCS, Amersham) vereinigt, und die Radioaktivität in einem Flüssigkeitsszintillationszähler (Tricarb, Packard Instrument Co., Downer Grove, Il.) gemessen.
Untersuchungen zur Proteinsynthese wurden mit separaten Schwämmen durchgeführt. Die zerkleinerten Schwämme wurden wie oben beschrieben inkubiert, mit der Ausnahme, daß 1 uCi ¹&sup4;C-Prolin (Amersham) zugesetzt wurde. Nach 24 Stunden wurde das Medium mit einem gleichen Volumen einer 20%igen TCA gemischt und bei 1000 g für 5 Minuten zentrifugiert. Der Niederschlag wurde mit chromatographisch gereinigter Collagenase (Worthington, Freehold, N.Y.) verdaut, und der ¹&sup4;C-Prolin- und Hydroxyprolin-Gehalt gemäß der Methode von Peterkofsky et al. (Furthmyer H. (Hrsg.), Immunochemistry of the Extracellular Matrix, Band II, CRC Press, Boca Raton, Florida, S. 19-47, 1982) bestimmt.
Biochemische Analysen der Gesamt-DNS, der DNS-Synthese und der Collagen-Synthese sind in Tabelle I zusammengefaßt. Sowohl der Anstieg der Gesamt-DNS als auch die Rate der DNS- Synthese bestätigen das histologische Bild eines hohen Grades von Fibroblastinfiltration. Keine signifikante Änderung der Collagen-Synthese wurde bei den Kontrollen beobachtet. TABELLE I Zugegeben zu dem Schwamm DNS (ug/Schwamm) DNS-Synthese (% der Kontrolle) Collagensynthese Zählungen pro Minute im Collagen % der Gesamtproteinsynthese PGK Collagen Collagen/Sucroseoctasulfat (8,75/1,0 mg/ml)
Die Rate und das Ausmaß der Fibroplasie und der Neovaskularisation, hervorgerufen durch den Collagen/Sucroseoctasulfat-Verbundstoff, ist bemerkenswert. Bei Verhältnissen von 8,75/1,0 und 8,75/0,1 mg/ml bildete sich innerhalb von 7 Tagen Granulationsgewebe, das extrem reich an Fibroblasten und Kapillaren war. Mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder mit Collagen allein injizierte Kontrollschwämme zeigten nur eine spärliche zelluläre Infiltration und eine sehr schlechte neovaskuläre Reaktion. Verbundstoffe, die 10,0 mg/ml Sucroseoctasulfat enthielten, riefen eine lokale hämorrhagische Reaktion hervor. Andererseits zeigten 0,01 mg/ml Sucroseoctasulfat in den Verbundstoffen nur eine geringe Steigerung der Reparatur.

Effekt von in Hydron eingekapseltem Sucroseoctasulfat

Imprägnierung von Schwämmen mit in Hydron eingekapseltem Sucroseoctasulfat ergab Resultate ähnlich denen, die durch Collagen/Sucroseoctasulfat-Verbundstoffe erhalten wurden. So rief die Injektion von 50 ul Hydron, das entweder 1,0 mg/ml oder 0,1 mg/ml Sucroseoctasulfat enthielt, die Bildung von dicht mit Fibroblasten bevölkertem und stark mit neuem Kapillarwachstum vaskularisiertem Granulationsgewebe hervor. Wie in mit Collagen/Sucroseoctasulfat mit 8,75/10,0 mg/ml imprägnierten Schwämmen, riefen 10,0 mg/ml Sucroseoctasulfat in Hydron lokale Hämorrhagie hervor.
Die Tatsache, daß die Zugabe von Sucroseoctasulfat in Hydron, ohne die Zugabe von Collagen, Ergebnisse lieferte, ähnlich denen, die durch die Zugabe von Collagen-/Sucroseoctasulfat-Schwammverbundstoffen erhalten wurden, kann auf verschiedene Weise interpretiert werden. Es sei darauf hingewiesen, daß die einzige Funktion des Collagens, die Ermöglichung der verzögerten Freisetzung von Sucroseoctasulfat ist. Alternativ kann Sucroseoctasulfat entweder mit dem exogen zugegebenen oder dem endogen synthetisierten Collagen wechselwirken, so daß eine fibrilläre Anordnung geschaffen wird, die der Fibroblast- und Endothel-Zellen-Infiltration förderlich ist.

Beispiel 14

Effekt von Sucroseoctasulfat auf die Reparatur von Knochenbrüchen

Ein weiteres Reparatur-Modellsystem ist das des Knochenbruches, aber, anders als die Schwammimplantationsstellen, ist das vorige in jeder Hinsicht mit der klinischen Situation identisch.
Die Ellen von 18 Meerschweinchen wurden chirurgisch freigelegt und dann beim Mittelschaft gebrochen unter Verwendung eines sehr feinen Zahnbohrers als Säge. Die intakte Speiche diente als eine Immobilisierungsschiene. Die Tiere wurden in sechs Gruppen, drei in jede Gruppe, gemäß der Behandlung der Bruchstelle, die wie folgt war, aufgeteilt:
Gruppe 1. Unbehandelte Kontrollen
Gruppe 2. Sucroseoctasulfat, 1,0 mg/ml, instilliert mit einer Spitze auf die Bruchstelle
Gruppe 3. Sucroseoctasulfat, 4,0 mg/ml
Gruppe 4. Collagen (eine native 0,25%ige neutrale Salzlösung)
Gruppe 5. Collagen plus Sucroseoctasulfat, 1,0 mg/ml
Gruppe 6. Collagen plus Sucroseoctasulfat, 4,0 mg/ml
Die Tiere wurden 10 Tage nach der Operation getötet, und die gebrochenen Knochen wurden sowohl für die histologischen als auch für die biochemischen Analysen seziert und bearbeitet.
Die Ergebnisse zeigten unzweideutig, daß die mit Collagen plus Sucroseoctasulfat, 1,0 mg/ml, behandelten Frakturen sich, verglichen mit entweder den unbehandelten Kontrollen oder mit irgendeiner anderer Behandlungsweise, in einem deutlich fortgeschrittenen Heilungsstadium befanden. Dies wurde offenkundig durch relativ mehr peri- und endostalen neuen Knochen, ausgeprägte Umgestaltung und das völlige Fehlen von Fibrin, das in den anderen Gruppen (ein früheres Heilungsstadium anzeigend) noch vorhanden war. Biochemisch war ein signifikanter relativer Anstieg der Mineralisation das wichtigste Ergebnis, gleichzeitig mit einem Rückgang sowohl der DNS als auch des Hydroxyprolins pro Milligramm Gewebe. Wenn der Prozentverlust der Mineralien als Folge des Calciumentzugs der gebrochenen Knochen berechnet wurde, wurde der höchste Prozentsatz (77%) in den mit Collagen/Sucroseoctasulfat, 1,0 mg/ml, behandelten Frakturen gefunden. TABELLE II Vor Calciumentzug Nach Calciumentzug Rückgang mg % Unbehandelte Kontrolle Collagen Sucroseoctasulfat (1 mg/ml) Collagen + Sucroseoctasulfat (1 mg/ml)
Wie oben gezeigt verursachten Collagen/Sucroseoctasulfat-Verbundstoffe innerhalb von 10 Tagen sowohl endostale als auch periostale neue Knochenbildung. Normalerweise enthalten solche Frakturen noch Fibrin und nekrotisches Gewebe und ist kein neuer Knochen gebildet. Soweit wir wissen, ist solch ein früher Beginn von kräftigen Reparatur-Prozessen noch nicht berichtet worden.

Beispiel 15

Kaninchencorneaversuch zur Gefäßbildung

Sucroseoctasulfat stellte sich, wie durch den Kaninchencorneaversuch gezeigt, als extrem gefäßbildend heraus. Dies mag eine Erklärung bieten für das dichte vaskuläre Bett, das das Granulationsgewebe in den in vivo-Experimenten charakterisierte. Sucroseoctasulfat in Konzentration von 0,1 bis 100 ug/ml wurde in Hydron eingekapselt und in Kaninchencorneae implantiert. Die verwendete Methode war die in Surgery 96:48-54, 1984 beschriebene. Die Testlösung (Sucroseoctasulfat oder PGK) wurde mit einem gleichen Volumen Hydron gemischt und man ließ sie unter reduziertem Druck polymerisieren. Pellets des hydroneingekapselten Testmaterials wurden in 2 mm proximal zu dem oberen Limbus in den Corneae geschaffenen Taschen implantiert. Die Augen wurden an den Tagen 1 bis 14 nach der Implantation auf makroskopische Entzündung und, wie durch Hunt et al. in Surgery 96:48-54, 1984, beschrieben, auf Gefäßbildung untersucht. Corneaneovaskularisation wurde auf einer Skala von 0-4+ eingestuft (es wurden nur ganze Zahlen zugeordnet). Null bedeutet ein normales Auge ohne Einwuchs auf limbische Gefäße in das Corneastroma, 1+ bis zu 1 mm Kapillareinwuchs in einen lokalisierten Bogen angrenzend an die Injektionsstelle, 2+ 1-2 mm Einwuchs, 3+ 2-3 mm Einwuchs und 4+ 3 mm oder mehr Einwuchs in einem weiten Bogen entlang dem limbischen Saum zu der Injektionsstelle hin. Augen, die eine positive Gefäßbildung zeigten, wurden entfernt, fixiert und mit Hematoxylineosin (H & E) angefärbt. Um festzustellen, daß die beobachtete Gefäßbildung nicht einem inflammatorischen Prozeß untergeordnet war, wurden einige Augen mit einer positiven Reaktion entfernt und mit H & E und einem nicht spezifischen Esterase-Farbstoff bereits zwei Tage nach der Implantation angefärbt.
Implantation von 10 und 100 ug/ml ergab die stärkste gefäßbildende Reaktion. Das Maß der Gefäßbildung nahm als Antwort auf niedrigere Sucroseoctasulfatkonzentrationen (1,0 ug/ml) ab und war negativ bei einer Konzentration von 0,1 ug/ml. Tabelle III zeigt die Resultate des Versuchs. TABELLE III Konz. Anzahl der implantierten Cornease Anzahl der positiven Reaktionen
Ergebnisse des Gefäßbildungstests für verschiedene Verbindungen der Erfindung sind in Tabelle V im Beispiel 16 dargelegt.

Beispiel 16

Zellmigrationsversuch

Der Boydenkammer-Versuch zeigt, daß Sucroseoctasulfat die Fibroblast-Bewegung stimuliert, was die starke Fibroblast-Migration, die histologisch beobachtet wurde, erklären könnte. Stimulation direkter Bewegung der Fibroblasten wurde untersucht wie von Banda M.J., Knighton D.R., Hunt T.K., Werb A., Isolation of a nonmitogenic angiogenesis factor from wound fluid, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:7773-7777, 1982 beschrieben. Kurz gesagt wurden Sucroseoctasulfatlösungen in PGK in Konzentrationen, die Endkonzentrationen im Bereich von 10&supmin;² bis 10&supmin;&sup7; g/ml ergeben, verdünnt auf ein Endvolumen von 300 ul in DMEM, ergänzt mit 10%igem blutplättchenarmen Kaninchenplasmaserum, auf den Boden der mit einer Vertiefung versehenen Boyden-Kammern gegeben. Mit Polylysin beschichtete Polycarbonatfilter (Nucleopore) mit 5 u-Porendurchmesser wurden über die Testlösung gelegt, und 1,75-3,0·10&sup6; Fibroblasten suspendiert in DMEM zum oberen Teilraum gegeben. Die Kammern wurden für zwei und eine halbe Stunde bei 37ºC inkubiert. Am Ende der Inkubation wurde der Deckelfilter fixiert, angefärbt und durch Zählen der Anzahl der Zellen, die zu der Unterseite des Filters gewandert waren, ausgewertet. Für jedes Experiment wurden 5 Zufallsfelder pro Filter und zumindest 15 Filter für jede Sucroseoctasulfat-Konzentration untersucht. Tabelle IV fast die Ergebnisse zusammen. TABELLE IV Sucroseoctasulfatkonzentration (g/ml) Zelle/große Vergrößerung (-facher Anstieg über die negative Kontrolle)
Die Ergebnisse zeigen, daß 10&supmin;&sup5; bis 10&supmin;&sup7; g/ml Sucroseoctasulfat eine Bewegung der Zellen entlang eines chemischen Gradienten hervorrufen.
Ergebnisse des Zellmigrationsversuchs in der Boydenkammer für verschiedene Verbindungen der Erfindung sind unten in der Tabelle V dargestellt. Dieselben Verbindungen wurden synthetisiert, wie in den Beispielen 1 bis 12 aufgezeigt. Einige wurden von gewerblichen Quellen erworben. Insbesondere Kaliumdextransulfat, hoches MG, und Kalium-D- Glucose-6-sulfat (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO), Kaliumdextransulfat, niedriges MG (Calbiochem-Behring, Div. of American Hoechst Corp., La Jolla, CA), und Natriumcellulosesulfat (Aldrich Chemical Company, Inc. Milwaukee, WI). TABELLE V Verbindung (Kaliumsalze) Schwamm Gefäßbildung Chemokinese Sucroseoctasulfat Maltoseoctasulfat Trehaloseoctasulfat Beta-Lactoseoctasulfat Melezitoseundecasulfat Stachyosetetradecasulfat Sucrosepenta/hexasulfat Sucrosetrisulfat Mannosepentasulfat Glucose-6-Sulfat Glucosepentasulfat Cellulosepersulfat Dextransulfat (hohes MG) Dextransulfat (niedrigeres MG)
Gestützt auf das Vorangegange erscheint es, daß der Grad der Sulfatierung wichtig für die Wundheilung ist, wobei signifikante Effekte beobachtet werden, wenn drei oder mehr Sulfatgruppen vorhanden sind. Optimale Ergebnisse scheinen mit Persulfatierung erreicht zu werden. Ähnlich beeinflussen der Zuckerrest und die Anzahl der Zucker auch den Grad der Wundheilungsaktivität. Mono- und Disaccharide zeigten gute Aktivität, vorausgesetzt, daß genügend Sulfatgruppen in dem Molekül vorhanden waren.

Beispiel 17

Sucroseoctasulfat induzierte Collagenfibrillogenese

Sucroseoctasulfat induzierte Collagenfibrillen- Bildung wurde in einem, mit einer Vorrichtung zur Unterbrechung des Durchflusses ausgerüsteten Spektrometer studiert. Sucroseoctasulfat in Konzentrationen, die bis zu 0,2 mg/ml reichen, wurde mit 0,5 mg/ml Collagen bei einem pH-Wert von 7,4 gemischt, und die Trübung wurde bei 450 mu in vorbestimmten Zeitintervallen untersucht.
Die Wechselwirkung zwischen Sucroseoctasulfat (0,2 mg/ml) und Collagen (0,5 mg/ml) führte zu einer rapiden (60-70 msec) Bildung von Collagenfibrillen. Die kritische Sucroseoctasulfatkonzentration, nämlich die untere, für die Einleitung der Fibrillogenese des Collagens (eine Konzentration von 0,5 mg/ml) notwendige Konzentration war 0,01 mg/ml. Bei dieser Konzentration wurde die Fibrillogenese ausgelöst, aber der Komplex war unbeständig und dissoziierte innerhalb von 100 msec. Protaminsulfat (0,5 mg/ml), ein spezifischer Heparininhibitor, verursachte ungefähr 90 Prozent Inhibierung der Reaktion zwischen Sucroseoctasulfat (0,2 mg/ml) und Collagen.
Das vorausgegangene Experiment wurde wiederholt, wobei man das Sucroseoctasulfat und das Collagen bei einem pHWert von 3,0 reagieren ließ. Identische Ergebnisse wurden erhalten.
Das Vorangegangene liefert den schlüssigen Beweis, daß Sucroseoctasulfat in der Tat mit Collagen wechselwirkt und dabei rapide Änderungen in des letzteren organisatorischen Zustand verursacht. Die Reaktion ist schnell (60-75 msec) und resultiert in der Bildung typischer, im Elektronenmikroskop beobachteter Collagenfibrillen. Weiterhin zeigt die Tatsache, daß die Reaktion durch fünf mol Sucroseoctasulfat pro mol Collagen initiiert werden konnte, daß eine spezifische Wechselwirkung involviert ist. Die alternative Hypothese, nämlich daß die Fibrillenbildung durch Ladungsneutralisation gesteuert wurde, ist weniger plausibel, da die Reaktion bei einem pH-Wert von 7,4 ablief. Diese Hypothese ist auch weniger plausibel, wenn die Größe des Collagenmoleküls (MG 300 000, 1000 Reste pro Polypeptidkette) relativ zu Sucroseoctasulfat berücksichtigt wird.

Beispiel 18

Klinische Beurteilung von Sucroseoctasulfat

Fünf Patienten wurden einem Dosis-Antwort-Versuch unter Verwendung von Sucroseoctasulfat in Wasser unterworfen. Der Test war ein Doppelblindversuch mit 4 Behandlungsästen, 0,1, 1,0 oder 10 mg/ml oder Placebo (steriles Wasser zur Irrigation). Die Patientenbehandlung wurde nach Wundtoilette des Untersuchungs-Druck-Ulkus begonnen mit einem Gazeschwamm, der mit Sucroseoctasulfatlösung (d. h. Sucroseoctasulfat in sterilem Wasservehikel) oder Placebo gesättigt war, und mit dem der Ulkuskrater tamponiert und dann mit Biobran-Verband bedeckt wurde, um den Bereich feucht zu halten. Die Behandlungen wurden zweimal täglich für ein 30-Tageintervall für vier Patienten angewandt und für drei Wochen für den fünften Patienten.
Die Patientenpopulation waren bettlägrige, komatöse Erwachsene mit chronischen Ulzera, deren vorherige Behandlung(en) in irgendeiner Form gescheitert war(en). Die Patienten wurden auf derselben Station, auf der sie während Monaten vor den Versuchen waren, belassen, so daß die Krankenpflege vor und während der Studie gleich war. Irgendeine Reaktion ist daher vorteilhaft. Die ersten vier Fälle sind nahezu gleich, indem daß drei der vier Behandlungsulzera trochanterisch waren.
Insbesondere beobachteten die Forscher nicht eine Abnahme des Oberflächenbereichs, sondern eher der Ulkustiefe, was konsistent ist mit Heilung angesichts der Theorie, daß Ulzera von dem Krater an aufwärts heilen, eher als durch Zusammenziehen der Wundränder. Sie meinten, daß es gesundes Granulationsgewebe bei den Patienten 001-003 gab. Die Ergebnisse des Patienten 001 waren jedoch nicht so vorteilhaft wie für die anderen, da der Ulkus unterhöhlt war und es nicht möglich war, das Material direkt auf die Ulkusoberflächen zu applizieren. 004 zeigte keine Reaktion auf die Behandlung. Sie waren mehr beeindruckt von der Reaktion bei 002 und 003 als bei 001. Die Ergebnisse des Patienten 005 waren enorm eindrucksvoll. Die Ulkustiefe hatte von 2,8 cm vor der Studie auf 1,6 cm nach drei Wochen Behandlung abgenommen.
Nur Ulkustiefe und -volumen änderte sich mit der Therapie. Die Forscher hatten Verfahrensprobleme mit der Volumenbestimmung, so daß nur die Tiefe als ein Aktivitätskriterium für die Analyse dieser Patienten verwendet wird. Keine Ulzera heilten (schlossen sich) vollständig. Die Forscher gaben an, daß das regenerierte Gewebe gutes, gesundes, rose Gewebe war.
Tiefenergebnisse waren wie folgt: TABELLE VI Patient Dosis Resultate Tiefe keine Reduzierung der Ulkustiefe Reduzierung der Ulkustiefe eine gewisse Reduzierung der Ulkustiefe

Claims

1. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfaßend eine Verbindung ausgewählt aus synthetischen polysulfatierten Mono-, Di-, Tri- oder Tetrasacchariden und ihren pharmazeutisch annehmbaren Salzen, Kollagen und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

2. Die Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Saccharid ein Monosaccharid oder ein Disaccharid, vorzugsweise Sucrose, ist.

3. Die Zusammensetzung nach den Ansprüchen 1 oder 2, worin das Mono-, Di-, Tri- oder Tetrasaccharid drei oder mehr Sulfatgruppen (bezogen auf das ganze Saccharid) enthält.

4. Die Zusammensetzung nach Anspruch 3, worin das Mono-, Di-, Tri- oder Tetrasaccharid persulfatiert ist.

5. Die Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das polysulfatierte Saccharid Sucroseoctasulfat ist.

6. Die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Mono-, Di-, Tri- oder Tetrasaccharid in flüssiger Form vorhanden ist.

7. Die Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das Mono-, Di-, Tri- oder,Tetrasaccharid in einer Konzentration von 0,1 bis 1,0 mg/ml vorhanden ist.

8. Die Zusammensetzung nach Anspruch 5, worin Sucroseoctasulfat in einer Konzentration von 0,28 mg/ml vorhanden ist.

9. Die Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Mono-, Di-, Tri- oder Tetrasaccharid in einem Polymeren oder anderen Träger eingekapselt ist, die imstande sind, eine verzögerte Freisetzung des Mono-, Di-, Tri- oder Tetrasaccharids zu bewirken.

10. Verwendung eines synthetischen polysulfatierten Mono-, Di-, Tri- oder Tetrasaccharids oder seines pharmazeutisch annehmbaren Salzes zur Herstellung eines Pharmazeutikums zur Wundheilung.

11. Die Verwendung nach Anspruch 10 zusammen mit Kollagen.

12. Die Verwendung nach den Ansprüchen 10 oder 11, worin das Saccharid ein Monosaccharid oder ein Disaccharid, vorzugsweise Sucrose, ist.

13. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, worin das Mono-, Di-, Tri- oder Tetrasaccharid drei oder mehr Sulfatgruppen (bezogen auf das ganze Saccharid) enthält.

14. Die Verwendung nach Anspruch 13, worin das Mono-, Di-, Tri- oder Tetrasaccharid persulfatiert ist.

15. Die Verwendung nach den Ansprüchen 10 oder 11, worin das polysulfatierte Saccharid Sucroseoctasulfat ist.

16. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 15, worin das Mono-, Di-, Tri- oder Tetrasaccharid in flüssiger Form vorhanden ist.

17. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 16, worin das Mono-, Di-, Tri- oder Tetrasaccharid in einer Konzentration von 0,1 bis 1,0 mg/ml vorhanden ist.

18. Die Verwendung nach Anspruch 15, worin Sucroseoctasulfat in einer Konzentration von 0,28 mg/ml vorhanden ist.

19. Die Verwendung nach Anspruch 10, worin das Mono-, Di-, Tri- oder Tetrasaccharid in einem Polymeren oder anderen Träger eingekapselt ist, die imstande sind, eine verzögerte Freisetzung des Mono-, Di-, Tri- oder Tetrasaccharids zu bewirken.