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Die vorliegende Erfindung betrifft L-Di- oder -tripeptide
mit biologischen Eigenschaften; sie betrifft auch ein Verfahren
zur Herstellung von L-Di- oder -tripeptiden, die die genannten
Eigenschaften aufweisen, und schließlich betrifft sie
Medikamente mit antibakterieller Wirksamkeit, die ein Di- oder Tripeptid
dieses Typs enthalten.
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Es wurden bereits, beispielsweise im US-Patent 4 016 148
und in der Französischen Patentanmeldung 7 916 924, Polypeptide,
insbesondere Di- und Tripeptide, beschrieben, die besonders
interessante antibakterielle Eigenschaften aufweisen. Diese
antibakteriellen Polypeptide haben eine L-Konfiguration.
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Die Herstellung von Verbindungen ausschließlich mit
L-Konfiguration ist schwierig und mühevoll, wenn klassische chemische
Verfahren verwendet werden. Es wurde vorgeschlagen, für
bestimmte, von Aminocarbonsäuren erhaltene Polypeptide eine
enzymatische Katalyse zu verwenden, wobei das verwendete Enzym
beispielsweise vom Chymotrypsin-Typ ist.
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Es wurde gefunden und es ist ein Ziel der vorliegenden
Erfindung, daß die Synthese von phosphonischen Di- oder
Tripeptiden der L-Konfiguration mit hohen Reaktionsgeschwindigkeiten und
Ausbeuten vorteilhaft bewirkt werden kann, indem eine
enzymatische Katalyse mit Hilfe einer Thiolproteinase, die aus Papain,
Bromelain und Ficin ausgewählt ist, verwendet wird.
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Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur
Synthese von phosphonischen Di- oder Tripeptiden der
L-Konfiguration durch Umsetzen einer α-Aminosäure oder eines
Carboxyldipeptids mit einer α-Aminophosphonsäure oder einer
α-Aminocarbonsäure mit einem phosphonischen Dipeptid der L-Konfiguration,
welches Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß:
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in einem wässerigen Lösungsmittelmedium ein Reagens,
ausgewählt aus einer α-Aminosäure oder einem Carboxyldipeptid der
L-Konfiguration, gebildet durch die Kondensation zweier L- oder
DL-α-Aminocarbonsäuren, mit einem Reagens, ausgewählt aus
α-Aminophosphonsäuren der DL-Konfiguration oder phosphonischen
Dipeptiden der L-Konfiguration, gebildet durch die Kondensation
eines Moleküls dieser α-Aminophosphonsäure mit einer
α-Aminocarbonsäure, in Kontakt gebracht wird, welcher Kontakt unter
Verwendung von mindestens 2 Mol der α-Aminosäure mit
Phosphonfunktion der L-Konfiguration pro 1 Mol der α-Aminocarbonsäure
oder eines Dipeptids der L-Konfiguration in Gegenwart eines
Enzyms, ausgewählt aus Papain und Chymopapain, stattfindet, und
daß die Reaktion in einem sauren Medium bei einer Temperatur
zwischen etwa 10 und etwa 70ºC durchgeführt wird, um eine
Phasentrennung zwischen dem Reaktionsmedium und dem gebildeten
Polypeptid zu erzielen.
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Chymopapain, das derzeit der Hauptbestandteil von
industriellem Papain ist, bildet das Enzym der Wahl zum Bewirken der
Reaktion.
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Als wässeriges Lösungsmittel wird eine Flüssigkeit
angegeben, die Wasser enthält und in der die Ausgangsreagentien
löslich sind. Dieses Lösungsmittel kann insbesondere und
vorzugsweise reines Wasser sein, kann jedoch auch aus einem mit Wasser
mischbaren Lösungsmittel bestehen, dem die erforderliche
Wasssermenge zugesetzt wurde, um die Durchführung der enzymatischen
Katalyse zu ermöglichen.
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Als Ausgangsreagens kann eines der Produkte jeder der
folgenden Klassen verwendet werden:
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A) eine Aminocarbonsäure, die entweder ein Produkt der
L-Konfiguration oder eine Mischung von Produkten der L- und
D-Konfiguration ist;
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ein Dipeptid, das aus der Vereinigung zweier
Aminocarbonsäuren besteht, wobei dieses Dipeptid die L-Konfiguration hat;
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B) eine α-Aminophosphonsäure der Formel
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worin R&sub1; H oder einen Alkylrest (insbesondere den Rest CH&sub3;) oder
Aryl bedeutet; wobei die Säure, wenn sie ein asymmetrisches
Kohlenstoffatom enthält, entweder in der L-Form ist oder aus einer
Mischung der L- und D-Form besteht;
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ein phosphonisches Dipeptid, das aus der Vereinigung einer
α-Aminophosphonsäure, wie oben definiert, mit einer
α-Aminocarbonsäure besteht, wobei klar ist, daß dieses phosphonische
Dipeptid die L-Konfiguration aufweist.
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Die Aminosäuren der Klasse A werden mit einer Blockierung
ihrer Aminfunktion verwendet, und die Aminosäuren der Klasse B
werden in Form von Estern (insbesondere Ethylestern) verwendet.
Die in der Erfindung durchgeführte Reaktion besteht daher in der
Bildung einer Amidfunktion durch Umsetzen der Säurefunktion der
Aminosäure der Klasse A mit der Aminfunktion der Aminosäure der
Klasse B.
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Die Konzentration der Aminosäure vom Typ B der L-Struktur
kann in Mol zumindest das zweifache jener der Aminosäure des
Typs A und der L-Struktur betragen.
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Die Reaktion wird bei einer Temperatur zwischen etwa 10 und
etwa 70ºC durchgeführt; tatsächlich entspricht die untere
Grenze der Temperatur einer Temperatur, bei der die Reaktion,
insbesondere im industriellen Stadium, zu langsam ist, und die
oberste Grenze der Temperatur entspricht der Stabilitätstemperatur
des verwendeten Enzyms.
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Es ist zu beachten, daß im Gegensatz zu zahlreichen
enzymatischen Reaktionen die Reaktion gemäß der Erfindung in einem
sauren Medium bei einem pH zwischen etwa 4 und etwa 5,5
stattfindet.
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Die Menge an verwendetem Enzym kann variabel sein; es wurde
gefunden, daß die Geschwindigkeit und die Endausbeute der
Reaktion progressiv in dem Maß zunehmen, in dem sich die verwendete
Enzymmenge von 10 auf etwa 100 % der Menge der Aminocarbonsäure
oder des Carboxyldipeptids (Klasse A) der L-Konfiguration, die
als Ausgangsprodukt verwendet wurde, erhöht. Über dieser Menge
von 100 % variieren die Geschwindigkeit und die Ausbeute der
Reaktion wenig.
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Wie oben angegeben, muß die Reaktion unter Bedingungen
bewirkt werden, unter denen das gebildete Produkt (Di- oder
Tripeptid) eine Phase bildet, die von jener des wässerigen
Ausgangslösungsmittels verschieden ist. Diese Bildung der
unterschiedlichen Phase kann spontan auftreten, wenn das gebildete
Produkt aus dem Medium in Form eines Feststoffs oder eines Öls
ausfällt (wobei das letztere sich beispielsweise an den Wänden
des Gefäßes ablagert, in dem die Reaktion durchgeführt wird);
die Reaktion kann jedoch auch in Anwesenheit eines zweiphasigen
Mediums durchgeführt werden, das einerseits aus dem erwähnten
wässerigen Lösungsmittel und andererseits aus einer Flüssigkeit
besteht, die mit dem wässerigen Lösungsmittel nicht mischbar
ist, in der das gebildete Produkt jedoch leicht löslich ist.
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Die folgenden nicht einschränkenden Beispiele erläutern die
Erfindung hinsichtlich des Verfahrens zur Herstellung von
phosphonischen Di- oder Tripeptiden der L-Konfiguration.
Beispiel 1: Synthese von
L-Alanyl-L-(1-amino)-ethylphosphonsäure
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Dieses Beispiel dient als Bezug, die folgenden Vorgänge
sind darin detailliert beschrieben.
I. Synthese und asymmetrische Induktion des Ethylesters von
(N-Benzyloxycarbonyl)-L-alanyl-L-(1-amino)-ethylphosphonsäure
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In ein 50 l Reaktionsgefäß, ausgerüstet mit einem wirksamen
Rührwerk, werden nacheinander:
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- 2760 g (2,76 Mol) normales Natriumcarbonat,
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- 615 g (2,76 Mol) (N-Benzyloxycarbonyl)-L-alanin,
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- 2000 g (11,05 Mol)
DL-(1-Amino)-ethylphosphonsäureethylester,
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- 32 g L-Cysteinchlorhydrat und
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- 3,3 l Zitratpufferlösung bei pH 4,5
eingebracht.
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Das klare Reaktionsmedium, dessen pH 6,92 beträgt, wird auf
50ºC gebracht.
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Bei dieser Temperatur wird eine Lösung von 600 g (50 nkat/
mg) Papain in 0,8 l Wasser zugesetzt. Der pH entwickelt sich
langsam und stabilisiert sich bei 6,84.
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Durch Zusetzen von pulverförmiger Zitronensäure (m =
1100 g) wird der pH auf 4,53 (pH zwischen 4,5 und 4,6) gebracht.
In diesem Zustand ist die Lösung klar.
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Dann werden unter starkem Rühren 19 l Tetrachlorkohlenstoff
eingebracht.
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Das Fortschreiten der Reaktion und die Kinetik werden durch
HPLC verfolgt, indem jede Stunde 1 ul organische Lösung auf eine
Säule O.D.S. Hypersil, 5 u (S.F.C.C.), aufgebracht wird, wobei
durch eine Mischung (MeOH: 67; H&sub2;O : 30; NH&sub4;OH Konz.: 3) eluiert
wird - (VR= 7,2 - 7,4 ml).
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Nach 15 h (Reaktionszeit zwischen 10 und 15 h) ist die
Synthese beendet; in diesem Stadium beträgt die Konzentration
des Produktes ungefähr 0,14 M in der organischen Phase.
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Das Reaktionsmedium wird abgekühlt, die beiden Phasen
werden dekantiert, und die organische Phase wird mit Wasser
gewaschen und dann nach Trocknen auf Natriumsulfat zur Trockene
eingedampft:
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m = 1250 g.
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Der Rückstand wird in 14 l Methylenchlorid aufgenommen;
nach aufeinanderfolgenden Wäschen mit 4 l 5 %iger Salzsäure, 4 l
Wasser, 4 l 0,1n Natriumcarbonat und dann- 6 l Wasser bis auf pH
6,5 wird er im Vakuum zur Trockene eingedampft.
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Es werden 1020 g (2,65 Mol) des gewünschten Produktes, d.h.
eine Ausbeute von 96 %, erhalten; das erhaltene Produkt zeigt in
Methanol ein Drehvermögen von [α]D20 =- 30º ± 2º, (c = 1).
II. Synthese von optisch reiner
L-Alanyl-L-(1-amino)-ethylphosphonsäure
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Das erhaltene Öl wird in fünf Volumina einer 33 %igen
Lösung von Bromwasserstoffsäure in 5 l Essigsäure gelöst. Die
Lösung wird 5 h bei Umgebungstemperatur rühren gelassen, dann auf
20 l Isopropylether gegossen. Nach Kristallisation des
Bromhydrats der L-Alanyl-L-(1-amino)-ethylphosphonsäure an den
Wänden des Gefäßes wird die Etherphase dekantiert und der
Rückstand in 5 l Methanol aufgenommen.
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Dieser klaren Lösung werden 0,6 l Propylenoxid, gelöst in
1 l Methanol, zugesetzt. Ein Niederschlag tritt rasch auf und
wird 2 h bei 0ºC kristallisieren gelassen. Er wird filtriert,
mit Methanol gewaschen und in einem Heizschrank im Vakuum bei
60ºC getrocknet.
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Es werden 502 g (2,56 Mol) Produkt, d.h. eine Ausbeute von
97 %, erhalten; das Produkt zeigt in Wasser ein Drehvermögen von
[a]D20 = -22º ± 2º, (c = 1).
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Der erhaltene Feststoff wird in 1,3 l kochendem Wasser
gelöst, und der durch Knochenschwarz 2 SA entfärbten Lösung werden
unter starkem Rühren 3,5 l Ethanol bei 70ºC zugesetzt.
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Ein kristalliner Niederschlag tritt bei Abkühlen auf
Umgebungstemperatur auf. Nach 2 h bei 0ºC wird das Produkt filtriert
und in einem Heizschrank im Vakuum bei 60ºC getrocknet.
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Es werden 351 g (1,79 Mol) gewünschtes Produkt, d.h. eine
Ausbeute von 70 %, erhalten; das Produkt zeigt eine
Schmelztemperatur von 289-292ºC und ein Drehvermögen in Wasser von
[α]D20 = -45º ± 2º, (c = 1).
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Die Gesamtausbeute an optisch reiner L-Alanyl-L-(1-amino)-
ethylphosphonsäure, ausgedrückt in bezug auf
(N-Benzyloxycarbonyl)-L-alanin, beträgt 65 %.
III. Rückführung des Ethylesters der
(1-Amino)-ethylphosphonsäure nach Epimerisierung
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Zur Durchführung der Rückführung des Ethylesters der
(1-Amino)-ethylphosphonsäure kann eines der folgenden Verfahren
verwendet werden:
A- Verfahren auf saurem Weg
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Die wässerige Phase des enzymatischen Reaktionsmediums (die
1520 g (8,41 Mol) (1-Amino)-ethylphosphonsäureethylester
enthält), d.h. ungefähr 9,5 l, wird mit Salzsäure angesäuert, die
bis zur Endnormalität von 6n konzentriert wurde.
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Diese Lösung wird 5 h am Rückfluß gehalten; nach Abkühlen
wird sie durch Leiten durch Schwarz 2 SA entfärbt, und die
mineralischen und organischen Verunreinigungen werden durch
Perkolieren auf einer Harzsäule S 861 (Duolite) entfernt.
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Die sauren Eluate werden im Vakuum zur Trockene
eingedampft. Der Rückstand wird in 2,7 l Methanol gelöst, dem unter
starkem Rühren trockenes Pyridin bis auf pH 4,5 zugesetzt wird.
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Der reichhaltig auftretende Niederschlag wird 2 h bei 0ºC
belassen.
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So werden 1020 g (8,17 Mol) DL-(1-Amino)-ethylphosphonsäure
erhalten.
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Das erhaltene Produkt hat einen Schmelzpunkt von mehr als
260ºC und ein Drehvermögen in Wasser von [α]D20 = 0º, (c = 1).
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Diese Verbindung wird durch übliche Verfahren verestert,
und nach Destillation werden 1207 g (6,67 Mol) DL-(1-Amino)-
ethylphosphonsäureethylester erhalten, der rückgeführt werden
kann.
B. Verfahren auf basischem Weg
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Die wässerige Phase des enzymatischen Reaktionsmediums (die
1520 g (8,41 Mol) (1-amino)-ethylphosphonsäureethylester
enthält), d.h. ungefähr 9,5 l, wird bis auf pH 7,5 durch Zusatz von
ungefähr 2 l 4n Natriumcarbonat basisch gemacht.
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Diese Lösung wird mit 3 x 8 l Dichlormethan extrahiert, und
die vereinigten organischen Phasen werden über Natriumsulfat
getrocknet und zur Trockene eingedampft.
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m = 1420 g Ausbeute: 93 %.
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Das erhaltene blaßgelbe Öl wird unter vermindertem Druck
destilliert, um die Epimerisierung des überschüssigen
D-Enantiomers zu vollenden.
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m # 1400 g Bp.0,5mm Hg = 70-72ºC.
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Nach Trifluoracetylierung und Trennung auf einer chiralen
Säule (L) SP 300 (5 %, 1 m) (Inj. = Zers. = 250ºC; Isotherme bei
140ºC) wird verifiziert, daß der gewonnene Ester 50 % des
L-Isomers (tR = 4,4 min) und 50 % des D-Isomers (tR = 5,2 min)
enthält. [αD20 = 0º ± 0,5º, c = 100].
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Das erhaltene Produkt mit einer Gesamtausbeute von etwa
93 % wird so gemäß Punkt I rückgeführt.
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(Die Epimerisierung wird ebenfalls durch Lagerung der
organischen Extraktionslösung während 24 h festgestellt).
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Gemäß dem derzeitigen Wissensstand scheint es, daß das
Verfahren auf basischem Weg zu bevorzugen ist.
Beispiel 2: Synthese von
(L)-Phenylalanylaminomethylphosphonsäure
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In einen 500 ml Erlenmeyerkolben, ausgerüstet mit einem
Thermometer und einem Magnetrührer, werden:
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- 33 ml (0,033 Mol) normales Natriumcarbonat,
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- 10 g (0,033 Mol) (N-Benzyloxycarbonyl)-DL-phenylalanin,
und
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- 5,51 g (0,033 Mol) Aminomethylphosphonsäureethylester
eingebracht.
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Dieser klaren Lösung werden 0,420 g Cysteinchlorhydrat,
42,5 ml Zitratpuffer bei pH 4,5 und 60 ml Wasser zugesetzt.
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Die Konzentration des Substrats beträgt 0,22 M, der pH
liegt zwischen 7,3 und 7,6.
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Die Mischung wird auf 40ºC gebracht, und 5 g Papain
(70 nkat/mg), gelöst in 45 ml Wasser, werden zugesetzt. Der pH
wird durch Zusetzen von pulverförmiger Zitronensäure (m = 10 g)
auf 5,5 gebracht.
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Das Reaktionsmedium trübt sich leicht, und ein Öl, das
langsam kristallisiert, lagert sich an den Wänden ab. Die
Reaktion wird 8 h bei 50ºC fortschreiten gelassen.
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Die chromatographische Analyse zeigt, daß von Anfang an die
Ablagerung das Dipeptid ist.
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Nach Kühlen und Extrahieren mit 3 x 50 ml Chloroform werden
die vereinigten organischen Phasen mit Wasser, 0,1n
Natriumcarbonat und dann Wasser gewaschen.
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Sie werden über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene
eingedampft. Der Ethylester der (N-Benzyloxycarbonyl)
-L-phenylalanylaminomethylphosphonsäure kristallisiert.
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Es wurden 6,23 g (0,0139 Mol) Ester, d.h. eine Ausbeute von
84 %, erhalten; das erhaltene Produkt zeigt eine
Schmelztemperatur (Koflersche Heizbank) von 102-104ºC und ein Drehvermögen in
Ethanol von [a]D20 = -9,8º ± 2º, (c = 1).
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Das vorhergehende Produkt wird in 35 ml einer 33 %igen
Lösung von Bromwasserstoffsäure in Essigsäure aufgenommon; die
Reaktionsmischung wird 5 h rühren gelassen, dann auf 260 ml
Schwefelether gegossen. Nach Kristallisation des Bromhydrats der
L-Phenylalanylaminomethylphosphonsäure an den Wänden des Gefäßes
wird die Etherphase dekantiert und der Rückstand in 30 ml
Methanol aufgenommen. Es werden 4 ml Propylenoxid, gelöst in 8
ml Methanol, zugesetzt. Ein kristalliner Niederschlag bildet
sich rasch: nach 2 h bei 0ºC wird er filtriert und in einem
Heizschrank im Vakuum bei 60ºC getrocknet. So werden 3,2 g
optisch reine L-Phenylalanylaminomethylphosphonsäure erhalten.
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Die erhaltene Säure (Ausbeute 89,2 %) hat einen
Schmelzpunkt von 265-268ºC und ein Drehvermögen in Wasser von [a]D20 =
+74,8º ± 2º, (c =1).
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Auf gleiche Weise kann aus der wässerigen enzymatischen
Phase der Überschuß des Aminomethylphosphonsäureethylesters
gewonnen und rückgeführt werden (vergl. Beispiel 1).
Beispiel 3: Synthese von
(L)-Leucylaminomethylphosphonsäure
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In einen 500 ml Erlenmeyerkolben, ausgestattet mit einem
Thermometer und einem Magnetrührer, werden:
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- 20 ml (0,020 Mol) normales Natriumcarbonat,
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- 5,3 g (0,020 Mol) (N-Benzyloxycarbonyl)-L-leucin und
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- 6,2 g (0,037 Mol) Aminomethylphosphonsäureethylester
eingebracht.
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Der klaren Lösung werden 240 mg Cysteaminchlorhydrat,
gelöst in 5,7 ml Wasser, dann 24 ml Zitratpuffer bei pH 4,5 und
100 ml Wasser zugesetzt. Die Lösung hat einen pH von 7,53.
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Mit Hilfe eines thermostatisierten Wasserbades wird sie auf
40ºC erhitzt, und es werden 1,71 g Papain (26 nkat/mg), gelöst
in 21 ml Wasser, zugesetzt; der pH beträgt 7,25.
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Durch Zusatz von Zitronensäure (m = 8 g) wird der pH auf
5,6 gebracht. Sehr rasch scheidet sich ein Öl an den Wänden des
Gefäßes ab und kristallisiert langsam.
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Nach 8 h wird der gebildete Niederschlag abgekühlt und mit
120 ml Methylenchlorid extrahiert. Nach aufeinanderfolgenden
Wäschen mit 30 ml Wasser, 30 ml 5 % iger Salzsäure, 30 ml
Wasser, 30 ml 0,1n Natriumcarbonat und 30 ml Wasser (pH 6,5) wird
die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und zur
Trockene eingedampft.
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So werden 6,9 g
(L)-Leucylaminomethylphosphonsäureethylester erhalten. Dieser Ester hat einen Schmelzpunkt (Koflersche
Heizbank) von 82-83ºC und ein Drehvermögen in Methanol von
[≥]D20 = -25º ± 2º, (c = 1).
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Dieses Produkt wird in 33 ml 33 %iger Lösung von
Bromwasserstoffsäure in Essigsäure aufgenommen und 6 h rühren gelassen.
Es werden 250 ml Schwefelether zugesetzt, und der dekantierte
Rückstand wird in 30 ml Methanol gelöst. Es werden 6 ml Methanol
und 3,5 ml Propylenoxid zugesetzt.
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Es tritt ein Niederschlag auf, der 2 h bei 0ºC
kristallisieren gelassen wird. Er wird filtiert und im Vakuum bei 60ºC
getrocknet.
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So werden 3,54 g (L)-Leucylaminomethylphosphonsäure
erhalten.
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Die erhaltene Säure hat eine Schmelztemperatur von 243-
247ºC und ein Drehvermögen in Wasser von [α]D20 = +60,5º ± 2º,
(c = 1).
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Im Fall der Verwendung eines organischen chlorierten
Lösungsmittels beträgt die Reaktionszeit 6 h und die Ausbeute etwa
85 %.
Beispiel 4: Synthese von L-Alanyl-L-alanyl-L-(1-amino)-
ethylphosphonsäure
I. Synthese von (N-Benzyloxycarbonyl)-L-alanyl-L-alaninsäure
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a) Synthese des Ethylesters von (N-Benzyloxycarbonyl)-L-
alaninsäure
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In einen 500 ml Erlenmeyerkolben, ausgerüstet mit einem
Magnetrührer, einem Thermometer und einer Wasserkühlung, werden:
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- 20 g (0,0897 Mol) (N-Benzyloxycarbonyl)-DL-alanin,
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- 45 ml 2n Natriumcarbonat,
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- 0,27 g L-Cysteinchlorhydrat und
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- 27 ml Zitratpufferlösung bei pH 4,5
eingebracht.
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Die Lösung wird auf 50ºC gebracht; bei dieser Temperatur
beträgt der pH 5,6. 10 g Papain (70 nkat/mg) werden zugesetzt;
nach einigen Minuten fällt der pH auf 5,3.
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Durch Zusatz pulverförmiger Zitronensäure (m = 1,5 g) wird
der pH auf 4,53 gebracht.
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Dem Reaktionsmedium wird eine Lösung von 10,3 g (0,223 Mol)
Ethanol in 330 ml Chloroform zugesetzt.
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Die Veresterungsreaktion wird durch HPLC verfolgt (Säule
O.D.S. Hypersil, 5 u (S.F.C.C.); Lösungsmittel: MeOH/H&sub2;O/NH&sub4;OH
Konz. = 67/30/3; VR = 5,3 - 5,4 ml). Nach 3 h entwickelt sich
die Reaktion nicht weiter.
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Die Phasen werden abgekühlt und dekantiert; die wässerige
Phase wird mit 2 x 100 ml Chloroform extrahiert; die vereinigten
Chloroformphasen werden mit 100 ml Wasser, 100 ml 5 %igem
Natriumbicarbonat und dann 2 x 100 ml Wasser bis auf pH 6,5
gewaschen.
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Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird zur Trockene
eingedampft.
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So werden 0,028 Mol des Ethylesters der
(N-Benzyloxycarbonyl ) -L-alaninsäure erhalten.
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Der erhaltene Ester ist ein Öl, dessen Drehvermögen in
Methanol: [α]D20 = -31,9º ± 2º, (c = 1) beträgt.
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b) Synthese des Ethylesters der (N-Benzyloxycarbonyl)-L-
alanin-L-alaninsäure
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Nach Entschützen des vorhergehenden Produktes durch eine
37 %ige Lösung von Bromwasserstoffsäure in Essigsäure (gemäß
J.R. Coggins, N.L. Benoiton, Can. J. Chem. (1971), 49, 1968)
werden 3,16 g (0,027 Mol, Ausbeute 90 %) L-Alaninethylester
erhalten.
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In einen 250 ml Erlenmeyerkolben werden:
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- 9,62 g (0,043 Mol) (N-Benzyloxycarbonyl)-DL-alanin,
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- 21,5 ml 2n Natriumcarbonat,
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- 3,16 g (0,027 Mol) L-Alaninethylester,
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- 0,26 g Cysteaminchlorhydrat und
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- 26 ml Zitratpufferlösung bei pH 4,5
eingebracht.
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Die Lösung wird auf 50ºC erhitzt, und bei dieser Temperatur
werden 4,8 g Papain (70 nkat/mg) zugesetzt; der pH entwickelt
sich langsam auf 5,9.
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Durch Zusatz pulverförmiger Zitronensäure wird der pH auf
4,52 eingestellt, dann werden unter starken Rühren 120 ml
Chloroform eingebracht.
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Die durch HPLC, wie in den vorhergehenden Beispielen,
verfolgte Reaktion ist in 6 h abgeschlossen.
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Die organische Phase, behandelt wie in Beispiel 4-I-a,
ergibt 6,23 g
(N-Benzyloxycarbonyl)-L-alanyl-L-alaninsäureethylester.
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m = 6,23 g (0,01935 Mol) Öl.
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c) Synthese von
(N-Benzyloxycarbonyl)-L-alanyl-L-alaninsäure
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Die vorhergehende Verbindung, behandelt mit einer
methanolischen Lösung von 2n Natriumcarbonat (gemäß J.R. Coggins, N.L.
Benoiton, Can. J. Chem. (1971) 49, 1968) ergibt 5,4 g
(N-Benzyloxycarbonyl) -L-alanyl-L-alanin.
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Es wurden 5,4 g (0,0184 Mol) eines Produktes erhalten,
dessen Schmelzpunkt 152-154ºC und dessen Drehvermögen in
Methanol [α]D20 = -35º ± 2º, (c = 0,5) beträgt.
II. Synthese des Ethylesters der (N-Benzyloxycarbonyl)-L-alanyl-
L-alanyl-L-( 1-amino)-ethylphosphonsäure
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In einen 100 ml Erlenmeyerkolben werden nacheinander:
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- 5,29 g (0,018 Mol) (N-Benzyloxycarbonyl)-L-alanyl-L-
alanin,
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- 9 ml 2n Natriumcarbonat,
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- 13 g (0,072 Mol)
DL-(1-amino)-ethylphosphonsäureethylester,
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- 0,28 g L-Cysteinchlorhydrat,
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- 28 ml Zitratpuffer bei pH 4,5 und
-
- 5 g Papain (70 nkat/mg)
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eingebracht.
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Gemäß dem in Beispiel 1-I beschriebenen Verfahren und nach
einer Reaktion von 10 h wird der Ethylester der
(N-Benzyloxycarbonyl)-L-alanyl-L-alanyl-L-(1-amino)-ethylphosphonsäure
erhalten [Fp: 127-129ºC; [α]D20 = -53º ± 2º, (1, Methanol)], der
gemäß dem in 1-II beschrieben Verfahren entschützt wird, wobei
nach Umkristallisation 2,73 g optisch reine L-Alanyl-L-alanyl-L-
(1-amino)-ethylphosphonsäure erhalten werden.
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Das erhaltene Produkt hat einen Schmelzpunkt von 277-279ºC
und ein Drehvermögen in Wasser von [α]D20 = -68,5º ± 2º,
(c = 1).
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Der Überschuß an phosphoniertem Substrat wird gemäß
Beispiel 1-III aus der wässerigen Phase des enzymatischen
Reaktionsmediums rückgewonnen und rückgeführt (m = 7,24 g, Ausbeute
74 %).
Beispiel 5: Synthese des Salzes von
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol mit
L-Alanyl-L-(1-amino)-ethylphosphonsäure
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In einen 100 ml Erlenmeyerkolben werden nacheinander:
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- 15 ml destilliertes Wasser,
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- 5 g (25,5 mMol)L-Alanyl-L-(1-amino)-ethylphosphonsäure
und
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- 3,1 g (25,6 mMol)2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol
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eingebracht.
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Die homogene Salzlösung wird 2 h unter Rühren bei 40ºC
gehalten.
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Nach Eindampfen zur Trockene in einem Rotationsverdampfer
wird der Rückstand in 20 ml 100 %igem Ethanol aufgenommen und
erneut zur Trockene eingedampft.
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Der viskose Rückstand wird durch Rühren in 50 ml 100 %igem
Ethanol, abgekühlt auf 0-5ºC, kristallisiert.
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Das erhaltene kristallisierte Produkt wird filtriert, auf
dem Filter mit 100 %igem Ethanol gewaschen und in einem
Exsikkator im Vakuum in Anwesenheit eines Dehydratisierungsmittels
(Silikagel) getrocknet.
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m = 8 g Ausbeute 99 %.
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Diese Verbindung hat einen Schmelzpunkt von
255-260ºC/Zersetzung und ein Drehvermögen in Wasser von:
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[α]D20 = -17,9º ± 2,6º, (c = 1).
Beispiel 6: Synthese des Additionsproduktes eines
Polystyrolsulfonharzes mit L-Alanyl-L-( 1-amino)-ethylphosphonsäure
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Auf einer Glassäule (L = 30 cm, Durchmesser 12,5 cm), die
100 ml Harz (konditioniert im sauren Zyklus) enthält, wird bei
einer Geschwindigkeit von 5 ml/min eine wässerige Lösung von
L-Alanyl-L- ( 1-amino)-ethylphosphonsäure perkoliert. Durch einen
Ninhydrintest wird das Nichtaustreten der Phosponverbindung
verifiziert.
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Nach Wäschen mit Wasser wird bei Sättigung das mit dem
aktiven Stoff beladene Harz zentrifugiert und in einem Heizschrank
im Vakuum bei 40ºC getrocknet.
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m = 83 g % Säure (P): 19,5 %.
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Die quantitative Analyse der auf dem Harz fixierten
Verbindung wird durch eine Perkolierung einer 5 %igen Ammoniaklösung
auf einer Chromatographiesäule und eine Kolorimetrie der Eluate
nach Zusatz von Ninhydrin durchgeführt
Beispiel 7:
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Bei Vorgehen wie oben konnten insbesondere die folgenden
Produkte erhalten werden.
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a) Durch Kondensieren von (N-Benzyloxycarbonyl)-L-leucyl-L-
leucinsäure mit DL-(1-Amino)-ethylphosphonsäureethylester wurde
L-Leucyl-L-leucyl-L-(1-amino)-ethylphosphonsäure mit einer
Gesamtausbeute von 64,5 % erhalten.
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Das erhaltene Produkt hat einen Schmelzpunkt von 265-268ºC
und ein Drehvermögen in 0,1n Natriumcarbonat von [α]D20 = -35º ±
2º, (c = 1).
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b) Sarcosyl-L-alanyl-L-(1-amino)-ethylphosphonsäure, die
einen Schmelzpunkt von 243-247ºC und ein Drehvermögen in Wasser
von [α]D20 = -83,5º + 2º, (c = 1), aufweist.
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c) Glycyl-L-tyrosylaminomethylphosphonsäure mit einem
Schmelzpunkt von etwa 300ºC (mit Zersetzung) und einem
Drehvermögen in Wasser von [α]D20 = +15º ± 2º, (c = 1).
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d) L-(3-Nitro)-tyrosylaminomethylphosphonsäure mit einem
Schmelzpunkt von 255-257ºC und einem Drehvermögen in 0,1n
Natriumcarbonat von [α]D20 = +9,7º ± 1º, (c = 0,25).
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e) Glycyl-L-valylaminomethylphosphonsäure mit einem
Schmelzpunkt von 278-281ºC und einem Drehvermögen in Wasser von
[α]D20 = -35º ± 2º, (c = 0,5).
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f) L-Argininsalz mit
L-Alanyl-L-(1-amino)-ethylphosphonsäure mit einem Schmelzpunkt von 200-202ºC und einem
Drehvermögen in Wasser von [α]D20 = -9,6º ± 2º, (c = 1).
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g) Sarcosyl-L-leucyl-L-(1-amino)-ethylphosphonsäure mit
einem Schmelzpunkt von 270-274ºC und einem Drehvermögen in
Wasser von [α]D20 = -58º ± 2,5º, (c = 1).
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h) L-Alanylsarcosylaminomethylphosphonsäure mit einem
Schmelzpunkt von 252-255ºC und einem Drehvermögen in Wasser von
[α]D20 = +17,4º ± 2,5º, (c = 1).
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i) Das Additionsprodukt eines stark basischen
Polystyrolharzes mit L-Alanyl-L-(1-amino)-ethylphosphonsäure, das 12 % der
angegebenen Säure enthält.
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j) Das Additionsprodukt eines schwach basischen
Polyaminphenolharzes mit L-Alanyl-L-(1-amino)-ethylphosphonsäure, das
10 % der angegebenen Säure enthält.