DE3618561A1 - Nasal verabreichbare arzneimittel zur behandlung von anaemie - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft nasal verabreichbare Arzneimittel zur Behandlung von Anämie.

Menschliches Erythropoietin (nachstehend kurz als "menschliches EPO" bezeichnet) ist ein Glykoprotein, das hauptsächlich in der Niere gebildet wird. Es ist als humoraler hemopoietischer Faktor bekannt, der die Differenzierung von Erythroblasten-Stammzellen im Knochenmark zu Erythrocyten bewirkt. Dem menschlichen Erythropoietin wird eine große Bedeutung für die Verwendung als Therapeutikum zur Behandlung von verschiedenen Anämiearten beigemessen.

Die meisten Proteine werden entweder kaum resorbiert oder sie werden verdaut und abgebaut, bevor sie im Magen oder Darm resorbiert werden können. Daher werden sie normalerweise durch Injektion in Blutgefäße oder Gewebe verabreicht. Injektionen sind jedoch schmerzhaft und lästig, so daß sich viele Patienten über Injektionsbehandlung beklagen.

Als Alternative für die Verabreichung durch Injektion wurde kürzlich die Verabreichung von Proteinen in das Rektum, die Bronchien, Augen oder die Nasenhöhle vorgeschlagen. Die Tatsache, daß bei der nasalen Verabreichung eine wirksame Resorption von Insulin und Calcitonin erreicht wurde, deutet die Möglichkeit einer neuen Behandlungsmethode mit Proteinen an.

Menschliches EPO wird zur Kategorie der Proteine gerechnet, und es liegt ein starkes Bedürfnis vor, ein Verfahren zur Verabreichung von menschlichem EPO anders als durch Injektion zu entwickeln. Bis jetzt wurde jedoch noch nicht über die erfolgreiche Verabreichung von menschlichem EPO anders als durch Injektion berichtet.

Daher wurden Versuche unternommen, bei denen anämischen Tieren menschliches EPO in die Nasenhöhle verabreicht wurde. Überraschenderweise wurde das so verabreichte menschliche EPO in hohen Dosen resorbiert und erwies sich als wirksam in der Behandlung von Anämie.

Die vorliegende Erfindung stellt daher ein neues nasal verabreichbares Arzneimittel zur Behandlung von Anämie zur Verfügung.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein nasal verabreichbares Arzneimittel zur Behandlung von Anämie, das gekennzeichnet ist durch einen Gehalt an menschlichem EPO als Wirkstoff. Insbesondere betrifft die Erfindung ein derartiges Arzneimittel, bei dem das menschliche Erythropoietin und ein grenzflächenaktives Mittel in einem wäßrigen und/oder nicht-wäßrigen Medium vorliegen.

Das in dem erfindungsgemäßen Arzneimittel enthaltene menschliche EPO ist als ein in Spuren vorkommender physiologisch wirksamer Stoff definiert, der das Wachstum, die Differenzierung und die Reifung von Erythroblasten-Stammzellen zu Erythrozyten steuert. Daher umfaßt der hier verwendete Begriff "menschliches EPO" nicht nur natürlich vorkommende Formen des menschlichen EPO, sondern auch seine Derivate und Analoga, die die vorgenannte biologische Wirkung aufweisen.

Das im erfindungsgemäßen Arzneimittel als Wirkstoff enthaltene menschliche EPO kann auf verschiedene Weise hergestellt werden. Beispielsweise kann menschliches EPO aus normalem menschlichen Urin oder aus dem Urin oder Plasma (einschließlich Serum) von an aplastischer Anämie leidenden Patienten erhalten werden (T. Miyake et al., J.B.C., 252 (1977) Seite 5558; J.P. Lewin et al., J. Lab. Clin. Med., 66 (1965), Seite 987). Menschliches EPO kann beispielsweise auch aus Gewebekulturen von menschlichen Nierenkrebszellen (JA-OS Nr. 55790/1979), aus menschlichen Lymphoblasten- Zellen, die die Fähigkeit zur Bildung von menschlichem EPO aufweisen (JA-OS Nr. 40411/1982) und aus einer durch Zellfusion einer menschlichen Zellinie erhaltenen Hybridomakultur gewonnen werden. Menschliches EPO kann auch durch gentechnologische Verfahren hergestellt werden, indem man mit einer messenger RNA (mRNA), die für die Aminosäuresequenz des menschlichen EPO codiert, eine rekombinante DNA herstellt und diese DNA in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert, beispielsweise einem Bakterium (z.B. E. coli), einer Hefe, oder einer Pflanzen- oder Tierzellinie (siehe beispielsweise Sylvia, L. H.; Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81 (1984) Seite 2708). Es stehen verschiedene tierische Zellinien als Wirtszellen zur Verfügung, aber von Menschen oder Säugetieren stammende kultivierte Zellinien sind bevorzugt. Beispiele sind COS-Zellen, Chinese-Hamster-Ovary (CHO)- Zellen und Maus-C-127-Zellen. Jede Art von menschlichem EPO, das nach diesen Verfahren hergestellt wurde, ist für die vorliegende Erfindung wertvoll, solange es die Entwicklung zu reifen Erythrozyten mit genügendem Sauerstofftransport ermöglicht, welche dann zur Behandlung von malignen Anämien eingesetzt werden können.

Die verabreichte Menge des menschlichen EPO's hängt vom Zustand des Patienten ab. Bei parenteraler Gabe (i.v. oder i.m.) können Präparate mit einem Gehalt von 0,1 bis 500 µg menschlichem EPO, vorzugsweise 5 bis 100 µg, 1 bis 7 mal pro Woche verabreicht werden. Bei der intranasalen Verabreichung liegt die verabreichte Menge menschlichen EPO's jedoch etwas höher als bei der Injektion.

Erfindungsgemäß verwendbare grenzflächenaktive Mittel sind solche, die die Resorption von menschlichem EPO durch die Nasenschleimhaut verbessern. Zu solchen grenzflächenaktiven Mitteln gehören Gallensalze, wie Natriumcholat oder Natriumtaurocholat; kationische Mittel, wie Benzalkoniumchlorid oder Benzethoniumchlorid; anionische Mittel, wie Polyoxyäthylenalkyläthersulfate (beispielsweise Natriumpolyoxyäthylenlauryläthersulfat) und Alkylsulfate (beispielsweise Natriumlaurylsulfat); nicht-ionische Mittel, wie Sorbitanfettsäureester (beispielsweise Sorbitanmonostearat, Sorbitanmonooleat und Sorbitansesquioleat), Glycerinester von fettsäuren (beispielsweise Glycerylmonostearat, Sorbitanmonooleat und Sorbitansesquioleat), Glycerinester von Fettsäuren (beispielsweise Glycerylmonostearat und Glycerylmono9oleat) oder Polyoxyäthylensorbitanfettsäureester (beispielsweisePolyoxyäthylensorbitanmonooleat); amphotere Mittel, wie Imidazolinbetaine, und Phospholipide, wie Phosphatidylcholin.

Die Menge des grenzflächenaktiven Mittels liegt gewöhnlich im Bereich von 0,001 bis 10 % Gewicht/Volumen und vorzugsweise bei 0,01 bis 1 % Gewicht/Volumen, wobei die Menge von dem jeweils verwendeten grenzflächenaktiven Mittel abhängt. Die Menge wird im allgemeinen so niedrig wie möglich gehalten, da oberhalb eines bestimmten Spiegels keine weitere Verbesserung der Resorption erreicht wird und auch ein zu hoher Spiegel des grenzflächenaktiven Mittels eine Reizung der Nasenschleimhaut verursachen kann.

Beispiele von erfindungsgemäß verwendeten wäßrigen Medien sind Wasser, physiologische Kochsalzlösung oder Pufferlösungen. Zu den Beispielen für nicht-wäßrige Medien gehören höhere aliphatische Säurester, wie Äthyloleat; Alkohole, wie Äthanol, Benzylakohol, Propylenglykol, Polyäthylenglykol oder Glycerin; Pflanzenöle, wie Olivenöl, Sesamöl, Sojabohnenöl, Kamelienöl, Maisöl, Rapsöl oder Erdnußöl; Mineralöle, wie Paraffin, Lanolin oder Petrolatum; Dimethylformamid (DMF) oder Dimethylsulfoxid (DMSO).

Solche wäßrigen oder nicht-wäßrigen Medien können entweder allein oder im Gemisch in Form einer Lösung, einer Suspension, einer Emulsion oder einer Salbe verwendet werden, wenn sie zur Verabreichung auf die Nasenschleimhaut geeignet sind.

Die erfindungsgemäßen Präparate können auch andere Zusätze, wie Stabilisatoren, adsorptionsverhindernde Mittel und Konservierungsmittel enthalten. Zu den Beispielen solcher Stabilisatoren und adsorptionsverhindernder Mittel gehören Proteine, wie Albumine oder Gelatine; Monosaccharide, wie Tetrosen (beispielsweise Erythrose oder Threose), Pentosen (beispielsweise Arabinose, Xylose, Ribose, Lyxose, Ribulose oder Xylulose), Hexosen (beispielsweise Glucose, Galactose, Mannose, Talose, Fructose, Sorbose, Tagatose oder Psicose), Heptanosen oder Octanosen; Oligosaccharide, wie Disaccharide (beispielsweise Maltulose, Maltose, Cellobiose, Gentiobiose, Melibiose, Lactose, Turanose, Sophorose, Trehalose, Isotrehalose, Saccharose oder Lactulose), Triosen (beispielsweise Maltatriose, Cellotriose, Manninotriose, Panose, Planteose oder Raffinose) und Tetraosen (beispielsweise Stachyose, Cellotetraose oder Scorodose); Desoxysaccharide, wie Desoxyribose, Rhamnose, Fucose, Quinovose, Tyvelose ocer Colitose; Aminozucker, wie Glucosamin, Galactosamin, Mannosamin, Gulosamin oder Kanosamin; Uronsäuren, wie Glucuronsäure, Galacturonsäure, oder Mannuronsäure, Lactone solcher Uronsäuren; Cyclite wie Inosit, Quercit oder Bornesit; Zuckeralkohole, wie Glycerin, Erythrit, Adonit, Arabit, Mannit, Sorbit, Galactit, Sedoheptit oder Perseit, und deren Derivate, beispielsweise Anhydride; Polysaccharide, wie Dextran oder Cellulose; anorganische Salze wie Natriumchlorid oder Kaliumphosphat; organische Salze, wie Citrate oder Acetate; Aminosäuren, wie Glycin oder Alanin; schwefelhaltige Reduktionsmittel, wie Glutathion oder Natriumthiosulfat und Polyäthylenglykol. Zu den Beispielen für Konservierungsmittel gehören Benzoesäure, Natriumbenzoat, p-Hydroxybenzoesäureester, Chlorbutanol, Kresol oder Phenol.

Gewünschtenfalls können die erfindungsgemäßen Präparate in Gelform formuliert werden, indem man Gel-Grundstoffe, wie Cellulosederivate, natürliche Gummi, Vinyl-Polymere oder Acrylsäure-Polymere, zusetzt.

Die erfindungsgemäßen Präparate können in verschiedener Weise auf die Nasenschleimhaut aufgebracht werden. Bei einer geringen Viskosität können die erfindungsgemäßen Präparate durch Träufeln oder Versprühen auf die Nasenschleimhaut aufgebracht werden. Bei einer höheren Viskosität können sie direkt aus einer Tube oder mit Hilfe einer Applikationsvorrichtung, die in die Nasenhöhle eingeführt wird, und die eine bestimmte Menge des Präparates enthält, verabreicht werden.

Referenzbeispiel 1

Herstellung von menschlichem Erythropoietin aus Urin

Schritt 1: Teilreinigung aus menschlichem Urin

Urin von an aplastischer Anämie leidenden Patienten wird gemäß dem Verfahren von T. Miyake et al. (J.B.C., 252 (1977) S. 5558) behandelt: 1. Entsalzen an einer Sephadex® G50 Säule, 2. Adsorption an DEAE-Cellulose in einem Batch-Verfahren, 3. Ausfällen mit Äthanol und 4. Chromatographie an einer DEAE-Agarose-Säule. Mit Hilfe dieser Verfahren wird eine teilweise gereinigte Form des menschlichen EPO aus Urin erhalten.

Das teilweise gereinigte menschliche EPO aus Urin wird in einer 24 % Propanol enthaltenden (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0,1prozentigen Trifluoressigsäure (TFA) (Alderich Chemical Co., Inc.)-Lösung gelöst und die Lösung durch HPLC an einem Hitachi Modell 638-50 gereinigt. Die Absorption im UV-Bereich bei 280 nm und 220 nm wird zur Bestimmung verwendet.

Schritt (2): Umkehrphasenchromatographie

Die erhaltene Probe wird auf eine YMC-C8 Säule (6 mm × 30 cm, hergestellt von Yamamura Chemical Co., Ltd.) aufgetragen, mit einer 24% n-Propanol enthaltenden 0,1prozentigen TFA-Lösung equilibriert und die Säule dann mit der gleichen Equilibrierungslösung eluiert. Nach der Elution der nicht absorbierten Fraktionen wird zur Elution der aktiven Fraktionen die Konzentration an n-Propanol auf 26 % erhöht. Die die EPO-Aktivität enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und durch Ultrafiltration mit Centricon-100 (Handelsname vom Amicon) auf 0,1 bis 0,2 ml konzentriert.

Schritt (3): Hochleistungs-Molekularsieb-Chromatographie

Die konzentrierte Probe wird auf eine TSK-G3000 SW-Säule (7,8 mm × 60 cm, hergestellt von Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.) aufgetragen, mit einer 26% n-Propanol enthaltenden 0,1prozentigen TFA-Lösung equilibriert und die Säule dann mit der gleichen Equilibrierungslösung eluiert. Die EPO- Aktivität enthaltende Peaks werden bei Positionen erhalten, die Molekulargewichten von 25 000 bis 30 000 entsprechen. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und gefriergetrocknet. Die Fraktionen haben eine spezifische Aktivität von etwa 9 × 10⁴ Einheiten/mg.

Die spezifischen Aktivitäten der in den Schritten (1) bis (3) erhaltenen Proben sind in Tabelle I enthalten.

Testverfahren: Gemäß dem Verfahren von N.N. Iscove et al., J. Cell. Physiol. 83 (1974), S. 309.

Referenzbeispiel 2

Herstellung von aus CHO-Zellen stammendem menschlichem EPO

Ein Plasmid mit der für die Aminosäuresequenz von menschlichem EPO codierenden DNA-Sequenz wird in Chinese-Hamster-Ovary- Zellen (CHO-Zellen) exprimiert; vgl. japanische Patentveröffentlichung Nr. 281862/1984 (angemeldet am 27. Dezember 1984) mit dem Titel "Vektor harboring accessory DNA for the transformation of eukaryotic cells" beschrieben. Nachstehend folgt eine Zusammenfassung der Verfahren.

Die DNA eines lambda-HEPOFL-13 Clons mit der für die Aminosäuresequenz von menschlichem EPO codierenden DNA-Sequenz, die aus menschlichen fötalen Leberzellen stammt, wird mit EcoRI verdaut. Das kleine EcoRI-Fragment, das die für die Aminosäuresequenz von menschlichem EPO codierende DNA-Sequenz enthält, wird in die EcoRI-Stelle des Plasmids RKI-4 eingefügt. Mit dem Plasmid werden dann DHFR-negative CHO-Zellen transformiert. Die transformierten CHO-Zellen werden in einem alpha-Medium ohne Nucleinsäuren gezüchtet. Zellen, die minestens ein DHFR-Gen enthalten, werden selektioniert und für die Herstellung von menschlichem EPO eingesetzt. Die Konzentration von Methotrexat im Medium wird dabei in steigendem Maße erhöht. Das menschliche EPO im Überstand der am Schluß erhaltenen Kultur weist eine Aktivität von 20 Einheiten/ml auf. Die das menschliche EPO enthaltende Kulturlösung wird gegen physiologische Kochsalzlösung mit 0.1 % BSA dialysiert und für den folgenden Versuch verwendet.

Die in den Referenzbeispielen 1 und 2 erhaltenen menschlichen Erythropoietine werden intranasal 1 Woche lang in unterschiedlichen Dosen pro Tag Ratten mit Shibata-Nierenentzündung und Mäusen mit einem Lewis-Lungenkarzinom verabreicht. Die Zahl der Erythrozyten steigt an und kehrt dann auf den normalen Spiegel zurück. Im Verlauf der Verabreichung von menschlichem EPO sind keine toxischen Symptome bei den Tieren zu beobachten.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Claims (3)

1. Nasal verabreichbare Arzneimittel zur Behandlung von Anämie, gekennzeichnet durch einen Gehalt an menschlichem Erythropoietin als Wirkstoff.

2. Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das menschliche Erythropoietin und ein grenzflächenaktives Mittel in einem wäßrigen und/oder nichtwäßrigem Medium vorliegen.

3. Arzneimittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich einen Gel-Grundstoff enthält.