DE3544867A1

DE3544867A1 - Reagens zur quantitativen cytometrischen bestimmung von reticulocyten

Info

Publication number: DE3544867A1
Application number: DE19853544867
Authority: DE
Inventors: Takahito Kakogawa Hyogo Fukuhara; Tomoyuki Kuroda
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1985-06-06
Filing date: 1985-12-18
Publication date: 1986-12-11
Also published as: JPS61280565A; DE3544867C2; US4985174A; JPH0464429B2

Description

TOA MEDICAL ELECTRONICS CO., LTD., KOBE-SHI, HYOGO-KEN / JAPAN

Reagens zur quantitativen cytometrischen Bestimmung von Reticulocyten

Die Erfindung betrifft ein Reagens zur quantitativen Bestimmung von roten Blutzellen, insbesondere von reifen Erythrocyten und Reticulocyten, welches für die optische Messung von Blut mittels Fliesscytometrie geeignet ist.

Unreife Erythrocyten im Blutsystem werden als Reticulocyten bezeichnet und machen im allgemeinen 0,7 bis 2,2 % der gesamten roten Blutzellenpopulation aus. Reticulocyten sind in modernen klinischen Versuchen von lebenswichtiger Bedeutung, weil durch deren quantitative Bestimmung die Diagnose von akuten inneren Blutungen,

hämolytischer Anämie und aplastischer Anämie ermöglicht wird.

Abstriche, die mit einem basischen Farbstoff, wie neuem Methylen Blau oder Brillant Cresyl Blau, gefärbt sind, werden verwendet, um quantitativ Reticulocyten als Prozentsatz der gesamten roten Blutzellen zu bestimmen, wobei man die gefärbten Reticulocyten unter einem Mikroskop untersucht. Das Anfärben mit einem Farbstoff der vorerwähnten Art ist jedoch zeitaufwendig und mühsam, hinsichtlich der Vorbehandlung der Blutproben und der visuellen Zählung der Reticulocyten, nachdem diese gefärbt sind. Aus diesem Grund sind diese Methoden dann ungeeignet, wenn man eine grosse Anzahl von Versuchen durchführen muss. Infolgedessen wurde ein Bluttest entwickelt, bei dem man eine Fliesscytometrie anwendet und dadurch kann erfolgreich die Geschwindigkeit und die Genauigkeit einer solchen Messung erhöht werden. Dennoch bleiben zahlreiche Probleme bei der quantitativen Be-Stimmung von Reticulocyten bisher ungelöst.

Zum Stand der Technik werden die US-PSen 4 336 029, 4 325 706 und 4 284 412 genannt, bei denen Acridin Orange zum Färben von Reticulocyten verwendet wird.

Acridin Orange ergibt bei der Adsorption durch die Reticulocyten-RNA-Komponente eine rote Fluoreszenz und ermöglicht die quantitative Bestimmung der Reticulocyten, indem man die rote Fluoreszenz unterscheidet von der grünen Fluoreszenz, die durch reife Erythrocyten verursacht wird und welche die Mehrheit in der roten Blutzellenpopulation ausmachen. Die Verwendung

von Acridin Orange ergibt jedoch folgende Probleme:

(A) Die Färbelösung selbst weist eine starke Hintergrundfluoreszenz auf, die beim Messen der Intensität der aus den Blutzellen stammenden Fluoreszenz als Hintergrundstorung bemerkbar wird. Dadurch erhöht sich die Möglichkeit eines Messfehlers.

(B) Da die Fluoreszenz ausserhalb des roten Bereiches von 630 nm liegt, ist eine hochempfindliche fluorimetrische Vorrichtung erforderlich.

(C) Da eine nicht-spezifische Färbung in hohem Masse erfolgt, und eine rote Fluoreszenz in den reifen Erythrocyten verursacht wird, ist es schwierig, ohne Fehler für verschiedene Blutproben eine Färbezusammensetzung herzustellen.

(D) Die Plättchen werden stark gefärbt und sowohl die Plättchen als auch die roten Blutzellen passieren die Zählöffnung in dem Fliesscytometer gleichzeitig während der Messung. Dabei wird die Intensität des Lichtes, welches von den reifen Erythrocyten gestreut wird und die Intensität der Rotfluoreszenz aus den Plättchen gleichzeitig gemessen. Dadurch ergibt sich ein Signalniveau für die Reticulocyten und somit eine Fehlerquelle.

(E) Die Acridin Orange-Lösung ist stark umgebungsabhängig, so dass die Intensität der Fluoreszenz dazu neigt, zu variieren.

In der JP-OS 59-142 465 wird die Verwendung von Thioflavin T als Farbstoff offenbart. Nimmt man eine RNA-Färbung einer Blutprobe mit dem vorgeschlagenen Farbstoff vor, so wird die Hintergrundfluoreszenz und eine nichtspezifische Fluoreszenz von reifen roten Blutzellen

durch Verdünnen und Waschen vermindert, dann wird die Reticulocyten-RNA-Fluoreszenz abgetastet und in einem Fliesscytometer gemessen. Der Nachteil einer solchen Massnahme ist der folgende:
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(F) Die spezifische Fluoreszenz, die durch den Farbstoff für die RNA-Bindung verursacht wird, wird durch die Verminderung der nicht-spezifischen Fluoreszenz während der Verdünnung gleichfalls vermindert.

Dies macht eine fotometrische Ausrüstung erforderlich, die hochempfindlich gegenüber Fluoreszenz ist.

(G) Da der Abfall der Intensität der Fluoreszenz im Laufe der Zeit nach der Verdünnung sehr plötzlich auftritt, kann man keine Daten mit einer hohen Reproduzierbarkeit erzielen.

(G¹) Das Färben macht einen verhältnismässig langen Zeitraum erforderlich.

Auch Pironine Y wird als Farbstoff verwendet. Fixierte rote Blutzellen werden nach dem RNA-Färben gewaschen, um die nicht-spezifische Fluoreszenz und die Hintergrundfluoreszenz vollständig zu entfernen und dann wird die spezifische Fluoreszenz, die durch den Farbstoff für die RNA-Bindung verursacht wird, gemessen.

Folgende Nachteile treten dabei auf:

(H) Die Verfahrensstufen, die Blutzellen zuvor zu fixieren, zu färben und zu waschen, sind zeitaufwendig und benötigen wesentlich mehr Zeit als die anderen Methoden. Deshalb ist diese Methode nicht geeignet, wenn man mit einer grossen Anzahl von Proben arbeiten muss.

(I) Pironine Y selbst hat eine sehr niedrige Fluoreszenzquanteneffizienz und daher ist eine Messung nur möglich, wenn man eine Laserquelle mit einem grossen Output hat.

(J) Da Pironine Y Bindungen nur mit RNA und DNA niedrigen Polymerisationsgrades eingeht, ist die . Effizienz des RNA-Färbens zum Erhalt einer spezifischen Fluoreszenz schlecht.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die vorerwähnten Probleme, die bei den üblichen quantitativen Bestimmungen von Reticulocyten durch Fliesscytometrie auftreten, zu lösen. Insbesondere wird durch die Erfindung ein Reagens verwendet, welches einen Farbstoff enthält, durch den die Probleme (A) bis (E), wie sie bei der Verwendung von Acridin Orange vorliegen, und die Probleme (F) bis (G¹)/ wie sie bei der Verwendung von Thioflavin T auftreten, und die Probleme (H) bis (J), wie sie bei der Verwendung von Pironine Y auftreten, vermieden werden und wodurch die Stärke der Reticulocyten-Fluoreszenz in einer gefärbten Probe intensiviert wird, während gleichzeitig die Hintergrundfluo-

reszenz der Probenlösung vermindert wird, um das S/N-Verhältnis beim Messen der Fluoreszenz zu erhöhen. Das Hauptziel der Erfindung besteht also darin, eine wirksame Verbesserung bei der quantitativen Bestimmung von Reticulocyten aufzuzeigen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass man ein Reagens verwendet, welches Auramin 0 für die Fluoreszenzfärbung der Reticulocyten enthält, und dieses Reagens in einer Probe des Gesamtblutes einsetzt, wodurch eine quantitative Bestimmung der Reticulocyten mittels eines Fliesscytometers möglich wird.

Fig. 1(a) und 1(b) sind Histogramme, in denen die Intensität der Rotfluoreszenz gegen die Intensität des gestreuten Lichtes bei einer Fliesscytometrie unter Verwendung des erfindungsgemässen Reagenses aufgetragen ist;

Fig. 2 ist eine grafische Darstellung,

basierend auf den Fig. 1(a) und 1(b), und zeigt die Beziehung zwischen Messdaten unter Anwen

dung einer quantitativen Reticulocytenbestimmung gemäss der vorliegenden Erfindung und Daten, bei denen eine quantitative Be-Stimmung der Reticulocyten mit

tels eines üblichen Mikroskops erfolgt;

Fig. 3(a), 3(b), 4(a) und 4(b) sind ähnliche Histogramme wie bei den Fig. 1(a) und 1(b) und beschreiben verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung;

Fig. 5(a), 5(b) und 5(c) sind Histogramme, ähnlich denen der Fig. 1, 3 und 4 und beschreiben weitere Ausführungsformen der Erfindung; und

Fig. 6 ist eine grafische Darstellung,

welche eine ähnliche Beziehung zeigt wie Fig. 2, aber der Fig. 5 zugeordnet ist.

Die roten Blutzellen in einer Probe von Gesamtblut schliessen reife rote Blutzellen, nämlich die Erythrocyten, und junge rote Blutzellen oder Reticulocyten, die einen hohen RNA-Gehalt aufweisen, ein. Gemäss der vorliegenden Erfindung kann man die Erythrocyten von den Reticulocyten voneinander unterscheidbar machen und zwar mit einem hohen Genauigkeitsgrad, indem man die Reticulocyten einer Fluoreszenzfärbung unterwirft, durch welche eine starke und lebhafte Fluoreszenz erfolgt, ohne dass der Prozentsatz der Reticulocyten oder die Konzentration der roten Blutzellen beeinflusst wird. Die vorliegende Erfindung stellt somit ein Reagens zur Verfügung, das dadurch gekennzeichnet ist, dass Auramin für die Fluoreszenzfärbung der Reticulocyten verwendet wird, wodurch deren quantitative Bestimmung durch

Fluoreszenz unter Anwendung der Fliesscytometrie ermöglicht wird. Um die Form der Blutzellen zu stabilisieren, gibt man vorzugsweise ein Alkalisalz, wie Natriumchlorid, hinzu, um die Färbelösung isotonisch zu machen. Ebenso kann man einen Puffer hinzufügen, um dadurch die Anfärbungseffizienz der roten Blutzellen zu erhöhen.

Auramin 0, das erfindungsgemäss als Fluoreszenzfarbstoff verwendet wird, hat die Formel

oder

(CH₃)

N(CH₃)2

(CH₃J₂N

N(CH₃)2

Auramin G kann ebenfalls angewendet werden und hat die Formel

(CH₃)NH' ^T γ NH(CH₃) CH₃ CH₃

Ein anderes Auramin, das verwendet werden kann, ist

Bis-(4-N,N-diethylaminophenol) iininomethan der nachfolgenden Formel, das aus Diethylanilin oder dergleichen hergestellt wird

Diese Auramine ergeben gefärbte Blutzellen mit einer lebhaften Tönung und sie weisen eine starke Färbewirkung auf.

Verwendet man Auramin als Fluoreszenzfärbung, so wird durch die Zugabe einer Spurenmenge eines oberflächenaktiven Mittels, wie Triton-X, die Vereinheitlichung der gefärbten reifen Erythrocyten und der Reticulocyten wirksam verbessert und dadurch die Intensität des gestreuten Lichtes und der Fluoreszenz von jeder Blutzelle erhöbt. Diese letztere Wirkung kann noch durch die Zugabe von Glutaraldehyd verstärkt werden. Als Endergebnis erhält man eine relative Verminderung, der Hintergrundfluoreszenz der Lösung. Man kann infolgedessen eine konsolidierte Reticulocytenverteilung erhalten und eine verminderte Filmviskosität, wodurch man eine hoch unterscheidbare Aufzählung der Reticulocy— ten erzielt. Dies trägt bei der quantitativen Bestimmung zu einer erhöhten Genauigkeit bei.

_ ι ι _

Vorzugsweise beträgt die Menge des Auramins 20 bis 2.500 mg/ml des Reagenses und die Menge des Alkalisalzes, wie Natriumchlorid, 5 bis 20 mg/ml des Reagenses. Der pH-Wert wird vorzugsweise auf 6 bis 10 eingestellt.

Eine isotonische gepufferte Färbelösung, welche die obigen Bestandteile enthält, stellt somit ein Reagens für die quantitative Bestimmung von Blutzellen, insbesondere von Reticulocyten dar und wird mit einer Gesamtblutprobe, die mit EDTA oder dergleichen zur Verhinderung der Koagulation behandelt wurde, vermischt.

Beim Vermischen der vorgenannten Zusammensetzung für die qualitative Bestimmung von Blutzellen mit einer Probe von zur Verhinderung der Koagulation behandeltem Gesamtblut, färbt der Auramin-rF.arb stoff alle Blutzellen, einschliesslich der Reticulocyten und nimmt eine gelbe Fluoreszenz in weniger als 1 Stunde an. Die gefärbten Blutzellen werden einer Bestrahlungslichtquelle von 490 bis 500 nm, z.B. einer Quecksilber- oder Xenonbogenlampe oder einem Laser (He-Cd-Laser oder AR-Laser) ausgesetzt und man verwendet ein Fliesscytome— ter, um die gelbe Fluoreszenz von etwa 520 bis 700 nm oder mehr nachzuweisen.

Unter Verwendung des erfindungsgemässen Reagenses wird es ermöglicht, einfach und deutlich reife Erythrocytenansammlungen von unreifen Reticulocyten und darüber hinaus von Plättchengruppierungen zu unterscheiden.

BEISPIEL 1

Ein erfindungsgemässes Reagens wurde hergestellt, indem man 0,01 M/l einer Phosphorsäure-Pufferlösung und Wasser zu 1 g Auramin 0 und 9 g Natriumchlorid gab, wobei man 1 Liter der Lösung erhielt. Der pH-Wert wurde auf 7,20 eingestellt. Zu 5 ml des erhaltenen Reagenses wurden 10 μΐ EDTA-behandeltes frisches Rinderblut gegeben. Nach 10-minütigem Inkubieren bei Raumtemperatur wurde die Mischung in ein Fluoreszenz-Fliesscytometer eingeführt. Als Lichtquelle wurde eine Quecksilberbogenlampe mit einem Lichtstrahl von bis zu 480 nm verwendet. Die Fluoreszenz oberhalb 520 nm wurde nachgewiesen. Fig. 1(a), 1(b) und 2 zeigen die Ergebnisse der Messungen von 30 Proben von 0,1 bis 26 % Reticulocyten, worin die Gruppe der Reticulocyten, die durch Vorwärtsstreuung-Rückwärts-Fluoreszenz nachgewiesen wurde, in dem Rechteck eingeschlossen ist. Fig. 2 zeigt die ausgezeichnete übereinstimmung zwischen den Messdaten (auf der Y-Achse aufgetragen) und den Daten, die durch eine visuelle Zählung der Reticulocyten erhalten wurden (auf der X-Achse aufgetragen). Der erhaltene Beziehungskoeffizient r ist 0,995. Die Regressionslinie Y lag bei 1,14 χ -0,05.

BEISPIEL 2
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Seitlich gestreutes Licht, bei dem es verhältnismässig schwer

ist, zwischen roten Blutzellenanordnungen und Plättchen zu unterscheiden, weil . dies nicht einfach das Zellvolumen anzeigt, wurde zusammen mit Rückwärts-Fluoreszenz gemessen und die reifen Erythrocyten, Reticulocyten und Plättchen wurden einzeln ausgezählt.

Ein Reagens gemäss der vorliegenden Erfindung wurde hergestellt, indem man 0,02 M/l einer Phosphorsäure-Pufferlösung und Wasser zu 400 mg Auramin Θ, 9 g Natriumchlorid und 30 mg Glutaraldehyd unter Ausbildung von 1 Liter Lösung gab. Der pH-Wert wurde auf 8,00 eingestellt. Das erhaltene Reagens wies eine gelbe Farbe auf. Zu 5 ml des Reagenses wurden 10 μΐ eines EDTA-behandelten Blutes oder einer Probe, in welcher die Reticulocyten aus dem Blut durch eine Dichtegradientenmethode konzentriert worden war, gegeben. Nach 10-minütigem Inkubieren bei Raumtemperatur wurde die Mischung mit einem Fluoreszenz-Fliesscytometer, wie in Beispiel 1 untersucht und die Fluoreszenz oberhalb 580 nm und seitengestreutes Licht wurden nachgewiesen und gemessen. Die Übereinstimmung mit den visuell erhaltenen Daten war ausgezeichnet bei niedrigen und hohen Werten des Reticulocyten-Prozentsatzes und das von den roten Blutzellen gestreute Licht war verhältnismässig gleichmässig. Die Ergebnisse werden in Fig. 3(a) und 3(b) gezeigt.

BEISPIEL 3

Reticulocyten wurden quantitativ bestimmt durch eine Seitenstreuung/Rückwärts-Fluoreszenz unter Verwendung von ähnlichen Proben wie in Beispiel 2, wobei aber die Auramin-Konzentration geändert und auch die Zahlenwerte der Zusammensetzung verändert wurden.

Ein Reagens gemäss der vorliegenden Erfindung wurde hergestellt durch Zugabe von 0,02 M/l einer Borsäure-Pufferlösung und Wasser zu 30 mg Auramin O, 13 g Natriumchlorid und 100 mg Glutaraldehyd unter Ausbildung von 1 Liter einer Lösung. Der pH-Wert wurde auf 9,00 eingestellt. Das erhaltene Reagens wies eine gelbe Farbe auf. Zu 5 ml des Reagenses wurden 10 μΐ einer Probe gegeben, in welcher die Reticulocyten mittels einer Dichtegradientenmethode von EDTA-behandeltem Blut konzentriert worden waren. Nach 10-minütigem Inkubieren bei Raumtemperatur wurde die Mischung zur quantitativen Bestimmung der Blutzellen einer Fliesscytometrie unterworfen. Die Ergebnisse werden in Fig. 4(a) und 4(b) gezeigt. Man erkennt dabei, dass zwar eine gewisse Ausbreitung der durch die Blutzellen erfolgte Streuung vorliegt, dass die Messwerte aber nahezu unverändert blieben.

BEISPIEL 4
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Ein erfxndungsgemässes Reagens wurde hergestellt durch

Zugabe von 0,01 M/l einer Phosphorsäure-Pufferlösung und Wasser zu 400 mg Auramin O und dann wurden 8 g Natriumchlorid zugegeben unter Ausbildung einer Lösung mit einem pH-Wert von 8,00. Zu 2 ml des erhaltenen Reagenses wurden 10 μΐ frisches Rinderblut, enthaltend als Antikoagulationsmittel EDTA, zugegeben. Nach 30-sekündigem Inkubieren bei Raumtemperatur wurde die Mi-SGhung in ein Fluoreszenz-Fliesscytometer eingeführt. Als Lichtquelle wurde ein Argonionen-Blau-Laser verwendet. Die Probe wurde mit niedriger Energie von 10 mw und einer Wellenlänge von 488 nm bestrahlt und das vorwärts gestreute Licht und die Seitenfluoreszenz oberhalb 520 nm wurden mittels eines fotoelektrischen Messwandlers bestimmt.

Trotz der niedrigen Bestrahlungsenergie, wie sie...beim bisherigen Stand der Technik nicht möglich war, wurde bei 30 Proben als Übereinstimmungskoeffizient mit der üblichen visuellen Methode ein Wert von 0,97 erreicht und die Regressionslinie Y betrug 1,145 χ -0,007 (%). Die erhaltenen Daten stimmen somit mit den visuellen Daten bei niedrigen und hohen Werten der Reticulocytenzählung überein.

Fig. 5(a), (b) und (c) sind Histogramme, in welchen die Fluoreszenzintensität auf der horizontalen Achse und die Intensität des gestreuten Lichtes auf der vertikalen Achse aufgetragen sind, wobei jeder Punkt in dem Histogramm eine Zelle bedeutet. Die Zahlenwerte auf der rechten Seite des Histogramms geben die gemessenen und visuell beobachteten Werte der Anzahl der in

dem Quadrat eingeschlossenen Reticulocyten an.

Fig. 6 ist eine grafische Darstellung und zeigt die vorerwähnte Übereinstimmung. Die Messwerte, die unter Verwendung von Auramin 0 erhalten wurden, wurden auf der Horizpntalachse aufgetragen und die Werte, die auf der visuellen Methode beruhen, wurden auf der vertikalen Achse aufgetragen.

Wenn man somit das erfindungsgemässe Reagens mit einer Blutprobe vermischt und durch ein Fliesscytometer passieren lässt, kann man nicht nur die roten Blutzellengruppierungen deutlich von den Plättchen unterscheiden, sondern es lässt sich eine Unterscheidung zwischen reifen, üblichen Erythrocyten und unreifen Reticulocyten, die in den roten Blutzellengruppierungen enthalten sind, deutlich durch die lebhafte Färbung treffen. Eine ausgezeichnete Obereinstimmung der Messdaten mit den Daten, die bei einer visuellen Beobachtung erhalten wurden, wurde festgestellt. Da die Hintergrundfluoreszenz der Lösung nach dem Vermischen mit einer Blutprobe erheblich vermindert werden kann, kann man die Gesamtheit der Fluoreszenz, die den Blutzellen zuzuordnen ist, spezifisch aufnehmen. Dies steht im Gegensatz zu der üblichen Methode, bei der Acridin Orange verwendet wird und bei welcher ein Teil der Fluoreszenz selektiv mittels eines Filters herausgenommen wird. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es auch, eine Messung durchzuführen unter Verwendung einer Bestrahlungslichtquelle mit niedriger Energie. In solchen Fällen hat die gebildete Fluoreszenz häufig eine sehr schwache

Intensität, selbst wenn das Auramin, das als Farbstoff verwendet wurde, nicht selektiv mittels eines Films der reifen Erythrocyten adsorbiert wird. Die den Reticulocyten zuzuschreibende Fluoreszenz ist andererseits stark und intensiv und leicht zu unterscheiden. Darüber hinaus findet die Färbung schnell statt und ermöglicht eine befriedigende Färbung von Proben mit einer grossen Anzahl von Reticulocyten in weniger als 1/10 der Zeit, die man benötigen würde, wenn man mit Acridin Orange färbt. Bei der Fliesscytometrie wird eine Probelösung, in welcher Blutzellen suspendiert sind, durch die Zellöffnung fHessen gelassen, wobei die Plättchen und die reifen Erythrocyten durch die Öffnung gleichzeitig hindurchgehen. Wenn dies stattfindet, dann ergibt sich ein Irrtum, weil die reifen Erythrocyten wie Reticulocyten gezählt werden. Verwendet man jedoch das erfindungsgemässe Reagens, dann wird die Intensität der Reticulocytenfluoreszenz auf ein extrem hohes Niveau erhöht und dadurch wird es ermöglicht, reife Erythrocyten und Reticulocyten genau zu zählen, ohne dass die Zählung der Erythrocyten und Reticulocyten durcheinander kommt. Wird die Auramin-Konzentration auf ein gewisses Niveau erhöht, dann werden die Aggregation und der gleichzeitige Durchgang dieser Blutzellen verhindert und zwar aufgrund der Abstossung des nicht-spezifischen adsorbierten Farbstoffs auf den Zellen.

Da Auramin durch Erhöhung des pH-Wertes leicht aufgebrochen werden kann, ist das Reinigen der Durchgänge in dem Fliesscytometer eine einfache Sache, selbst

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wenn das Aurmain dort anhaftet. Bei der Verwendung von Auramin ist die Verteilung der Vorwärtsstreuintensität der roten Blutzellen stärker kohärent bzw. konsolidiert, aufgrund der Eigenschaften des Farbstoffs selbst/ so dass die bisher beim Stand der Technik festgestellte breite Streuung vermindert wird. Dadurch wird die Abtrennung der Plättchen und der roten Blutzellen durch Vorwärtsstreuung erleichtert, wodurch die beiden genauer gezählt werden können. Obwohl die nicht-spezifischen Färbebedingungen bei der Verwendung von Auramin erhöht werden, führt dies zu einer stärkeren spezifischen Färbung, wodurch die Intensität der Reticulocytenfluoreszenz erhöht wird, ohne dass die Intensität der Fluoreszenz der reifen Erythrocyten erhöht wird. Man kann infolgedessen den Färbungsgrad erhöhen, um dadurch die Empfindlichkeit des Fliesscytometers gegenüber der Fluoreszenz zu verstärken und die Eignung eines Fliesscytometers für Proben mit einem niedrigen Prozentsatz an Reticulocyten kann verbessert werden, während man gleichzeitig die Genauigkeit erhöht, mit welcher die Reticulocyten gezählt werden.

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Claims

H O FFM ANN-".EJTLtE * PARTNER Q C / / Q C PATEN'· 1JNC RECHTSANWALTS' (J O 4 4 O U / PATENTANWÄLTE WERNER EITLE, DIPL.-ING. - KLAUS HOFFMANN, DR., DIPL.-ING. ■ WERNER LEHN, DIPL.-ING. KLAUS FÜCHSLE, DIPL.-ING. · BERND HANSEN, DR., DIPL.-CHEM. · HANS-A. BRAUNS, DR., DIPL.-CHEM. · KLAUS GDRG, DIPL.-ING. KARL KOHLMANN, DIPL-ING. · HELGA KOLB, DR., DIPL.-CHEM. · BERNHARD VON FISCHERN, DIPL.-ING. RECHTSANWALT ALEXANDER NETTE 43 114 o/wa TOA MEDICAL ELECTRONICS CO., LTD., KOBE-SHI, HYOGO-KEN / JAPAN Reagens zur quantitativen cytometrischen Bestimmung von Reticulocyten PATENTANSPRÜCHE

1. Reagens zur Bestimmung von Blutzellen für die Flxesscytometrie, dadurch gekennzeichnet, dass es Auramin 0 als Fluoreszenzfarbstoff für die Reticulocyten enthält.

2. Reagens gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass es . 20 bis 2.500 μg/ml Auramin, 0,5 bis 20 mg/ml eines Alkalisalzes und eine geeignete Menge eines Puffers zug esetzt enthält und der pH auf einen Wert von 6 bis 9,5 eingestellt ist.

POSTFACH SI 04 2O · ARABELLA3TRA3SE 4/VIII · 8000 MÖNCHEN 31 TELEFON: fOS9") 911ORe-BS · TPI SX· fiOQfiio /-datt-ic-v . TfTI Cl=AV. r,or> ,01 cio -;«s mo ·■ . .11^