SU789747A1

SU789747A1 - Способ определени состава изолированных клеток на гистологическом препарате

Info

Publication number: SU789747A1
Application number: SU772510437A
Authority: SU
Inventors: Борис Николаевич Кудрявцев; Маргарита Васильевна Кудрявцева; Елена Эдуардовна Завадская; Тамара Минажевна Шалахметова
Original assignee: Институт Цитологии
Priority date: 1977-07-25
Filing date: 1977-07-25
Publication date: 1980-12-23

Description

1

Изобретение относитс .к цитологии и может быть использовано в цитохимии дл количественной оценки содержани компонентов клетки.

Известен способ определени состава изолированных клеток на гистологическом препарате путем введени меченого предиественника ДНК окрашивани по Фельгену, нанесени фотоэмульсии, подсчета меченой ДНК и ее цитофотометрии 1.

Однако известный способ не позвол ет точно определить состав изо .лиррванных клеток на одном препарате.

Цель изобретени - повышение точности способа за счет определени состава изолированных клеток на одHQM препарате.

iTa цель достигаетс тем, что до окрашивани по Фельгену став т PAS ,реакцию и определ ют содержание гликогену , после чего препарат обрабатывают 0,020%-0,025% борогидридом натри в течение от 20 до 30 мин при температуре от 2 до 5-с.

Способ осуществл ют следующим Образом.

Вначале на предметном стекле приготавливают препарат-мазок изолированных клеток (например, дл приготовлени мазков изо Лированных клеток печени используют следующую методику: после декапитации животного печень- перфузируют в течение

5 10 минут смесью равных объемов фосфатного буфера (,0) и 5%-го раствора сахарозы, измельченные кусочки печени помещают на 8 мин в фосфатный буфер (,3) и затем

10 приготавливают-мазки от живoтнoгo, которому предварительно ввод т меченый предшественник ДНК ЗН-тимидин (из расчета 1 микрокюри на грамм веса животного) и фиксируют его танолом. Затем на препарате выбирают неподвижные клетки на основе морфологических критериев и картируют препарат, т.е. замечают на нем положение каждой выбранной клетки

20 и нумеруют ее. После этого предметное стекло покрывают покровным, использу при этом в качестве заключающей среды глицерин, и измер ют сухой вес отмеченных клеток с по-

25 мощью интерференционнного микроскопа . Снимают по.кровное стекло, с помощью этанола удал ют глицерин, провод т флуоресцентную PAS-реакцию т.е. оксление клеток периодатом ка30 ЛИЯ (0,8%-ый раствор К10 на 0,3%-ой

азотной кислоте, ,2, температура комнатна , продолжительность окислени 90 мин) и окрашивание их затем реактивом типа Щ1ффа аурамиHOM-SO (2, (свежеприготовленный О , водный раствор аурамина О +0,2 мл хлористого тионила) в течение 90 ми при комнатной температуре (5-7), заключают препарат в вазелиновое масло и измер ют содержание гликогена в тех же клетках с помощью цитофлуориметра . Снимают покровное стекло , с помощью этанола или ксилола удал ют с препарата вазелиновое масло и обрабатывают его 0,025%-ным водным раствором борогидрида натри в течение 30 мин при температуре 2-5с. Така обработка приводит к полному удалению положительной PASреакции в клетках и блокированию альдегидных групп гликогена, образовавшихс ранее при окислении препарата периодатом содержание ДНК при этой обработке не затрагиваетс . Споласкивают препарат в 3-х сменах дистиллированной воды (по 1 мин. в каждой), вновь фиксируют его метанолом и высушивают на воздухе. Окрашивают препарат на ДНК с помощью обычной или флуоресцентной реакции Фёльгена, т.е. провод т гидролиз препарата в сол ной кислоте (наприме 6NHC1 в течение 8-10 мин при комнатной температуре).окрашивают его соответственно обычным реактивом Шиффа или реактивом типа Шиффа аурамином - S02 (свежеприготовленный 0,3%-ый водный раствор аурамина 0+0,2 мл хлористого тионила,температуре 2,5с) в течение 90 мин, дифференцируют в сернистых водах и спиртах возрастающей крепости, высушивают на воздухе и заключают в вазелиновое масло. Содержание ДНК в отмеченных клетках, окрашенных с помощью обычной реакции Фёльгена, измер ют на абсорбцио 1ном цитофотометре , а окрашенных с помощью флуоресцентной реакции Фёльгена на . цитофлуориметре. Снимают покровное стекло, удал ют с препарата вазелиновое масло с помощью этанола или ксилола, обычным способом нанос т фотоэмульсию на препарат, экспонируют его и затем определ ют число зерен серебра над драми тех же клеток визуально или с помощью подход щей аппаратуры.

В результате проведени всех операций достигаетс точное определение в клетке каждого компонента. В качестве примера применени предлагаемого способа привод т результаты определени содержани гликогена и , сухого веса в синтезирующих и несентезирующих ДНК гепатоцитах крысы различной плоидности. Распределение клеток по содержанию ДНК следующее: диплоидные - 4,9%, тетраплоидные 85 ,8%, октаплоидные - 9,3%. Данные сведены в таблицу.

Ь.1,2,, Примечание: + Н-Т - клетки, включившие Н-тимидин

- клетки, не включившие Н-тимидин

Предлагаемый способ обеспечивает высокую точность за .счет определени соцтава изолированных клеток на одном препарате, он позвол ет исследовать 3a.L.HOMepHOCTH соотношени содержани гликогена.. и сухого веса в попул ци х «различных типов клеток, в частности в клетках к различной степени плоидности, клетках, наход щихс на разных стади х митотического цикла. Предлагае№лй способ мочсет быть использован не .только в ; теоретических работах, но и непосредственно в медицинской практике, где на диопсийном или хирургичаском материале можно исследовать соотношение содержани гликогена и сухого веса в клетках различной плоидности дл диагностических целей . При этом содержание гликогена и сухой вес могут быть измерены даже в попул ци х, которые содержат 1-5 % клеток с данной степенью плоидности .

Claims

1. Папа н Г.В.,Агроскин Л.С., Бродский В.Я., Раутиан Л,П, Одновременное измерение количества вещества и интенсивности метки на окрашенных автографах.- Цитологи , 1973,15,9, с, 1184-1190.