DE3448007C2 - Reaction vessel for immunological analysis - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Reaktionsgefäß für die immunologi­ sche Analyse mit den Merkmalen des Oberbegriffes des Patentan­ spruches 1.

Ein solches Reaktionsgefäß ist aus der US-PS 42 10 418 bekannt.

Aufgrund des Fortschritts in der medizinischen Behandlung kön­ nen heutzutage äußerst kleine Mengen biologischer Substanzen in Proben analysiert werden. Das erleichtert die Frühdiagnose der verschiedensten Krankheiten. So können z. B. bösartige Tu­ moren, α-Fetoprotein und karzinoembryonisches Antigen, Störun­ gen der Hormonausscheidung, z. B. von Insulin und Thyroxin und immunologisches Fehlverhalten beispielsweise von Immunglobulin in einem frühen Stadium diagnostiziert werden. Ferner kann die Behandlung dieser Störungen und Krankheiten nachträglich zuver­ lässig überwacht werden. Darüber hinaus ermöglicht die Messung von Partialantigenen, wie niedermolekularem Hapten die Erstel­ lung von Behandlungsplänen für medizinische Substanzen.

Viele biologische Substanzen werden dadurch immunologisch ana­ lysiert, daß eine Antigen-Antikörper-Reaktion (A. A. R.) hervor­ gerufen wird, wofür verschiedene Verfahren zur immunologischen Analyse entwickelt worden sind. So wird beispielsweise das Vor­ handensein oder Nichtvorhandensein von durch die A. A. R. hervor­ gerufener zusammengeballter, koagulierter Antigen-Antikörper- Komplexe durch die Agglutinationsmethode, die Präzipitations­ methode, durch Nephelometrie usw. festgestellt, um die gewün­ schten biologischen Substanzen zu bestimmen. Da jedoch bei die­ sen bekannten Verfahren die Empfindlichkeit gering ist, muß eine große Menge des Antigen-Antikörper-Komplexes benutzt wer­ den, und es können nur qualitative oder quasi-quantitative Analysen vorgenommen werden. Um diesen Nachteil zu vermeiden, sind weitere Verfahren entwickelt worden, von denen bei einem vorgesehen ist, ein Antigen oder einen Antikörper an feine Kohlenstoff- oder Kunstharzteilchen zu binden, die dann der A. A. R. mit den zu bestimmenden biologischen Substanzen unter­ worfen werden, wobei die Substanzen im Agglutinationsverfahren oder mittels Nephelometrie festgestellt werden. Bei einem wei­ teren bekannten Verfahren werden Antigen-Antikörper-Komplexe mit hoher Empfindlichkeit durch die Benutzung von Antigenen oder Antikörpern festgestellt, die mit Markierungsmaterial, beispielsweise Radioisotopen, fluoreszierendem Material, lu­ mineszierendem Material oder Enzymen markiert sind. Hinsicht­ lich der Empfindlichkeit ist das zuerst genannte Verfahren der zuletzt genannten Methode unterlegen, so daß man neuerdings vor­ wiegend das zuletzt genannte Verfahren mit Verwendung hochem­ pfindlicher Markierungssubstanzen anwendet.

Analytische Methoden unter Verwendung von Markierungssubstanzen werden in folgende Gruppen unterteilt: Radioimmunotests unter Verwendung von Radioisotopen als Markierungsmaterial, Fluores­ zenzimmunotests unter Verwendung von fluoreszierendem Markie­ rungsmaterial und Enzymimmunotests unter Verwendung von Enzymen als Markierungsmaterial. Hiervon ist insbesondere der Enzym­ immunotest weiterentwickelt worden, weil hierfür keine besondere Einrichtung und kein besonderes Meßverfahren erforderlich ist, sondern der Test ganz einfach unter Verwendung der üblichen Kolorimeter durchgeführt werden kann. Bei dem Enzymimmunotest wird ferner unterschieden nach homogenem Enzymimmunotest und heterogenem Enzymimmunotest. Bei der homogenen Bestimmung wird die Schwankung der Aktivität des Markierungsenzyms auf­ grund des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins einer immu­ nologischen Reaktion unmittelbar gemessen, um die zu analy­ sierenden Substanzen festzustellen. Bei der heterogenen Be­ stimmung werden unlösliche Träger, wie Glasperlchen oder Syntheseharzteilchen verwendet, an denen ein Antigen oder Antikörper fixiert wurde, die mit Enzym markierten Antigene oder Antikörper, die mit den an den Trägern fixierten Antikör­ pern oder Antigenen verbunden sind, und freie, mit Enzym mar­ kierte Antigene oder Antikörper, die nicht mit den Antikörpern oder Antigenen an den Trägern verbunden sind, durch eine Spül­ behandlung voneinander getrennt, und dann die Aktivität des Markierungsenzyms festgestellt, um die Menge der zu analysier­ enden Substanzen zu messen. Aus Gründen der Einfachheit wird das Verfahren zum Trennen des gebundenen Antigens oder Anti­ körpers vom freien Antigen oder Antikörper als "B-F-Trennung" bezeichnet. Die homogene Analyse kann zwar in einfachen Ver­ fahren durchgeführt werden, eignet sich aber nur zum Analysie­ ren des niedermolekularen Haptens, also beispielsweise von me­ dizinischen Substanzen aber nicht zum Analysieren hochmoleku­ larer biologischer Substanzen. Im Gegensatz dazu ist die he­ terogene Analyse, obwohl sie ein Spülverfahren für die B-F- Trennung erfordert, für alle Arten von nieder- und hochmole­ kularen Substanzen geeignet. Deshalb wird neuerdings im allge­ meinen der heterogene Enzymimmunotest angewandt.

Für den heterogenen Enzymimmunotest ist die sogenannte kompe­ titive, direkte Methode und die indirekte "Sandwich"-Methode entwickelt worden. Diese beiden Methoden sollen anhand von Fig. 1 und 2 näher erläutert werden.

In Fig. 1 sind die bei der direkten Methode angewandten, auf­ einanderfolgenden Schritte gezeigt. Ein gegebenes Antigen oder ein gegebener Antikörper, der mit einer Antikörper- oder Anti­ gensubstanz 2 einer Probe reagiert, ist im voraus an der Außen­ fläche eines unlöslichen Trägers 1 fixiert worden. Zunächst er­ folgt die A. A. R. zwischen dem am Träger 1 fixierten Antigen oder Antikörper und dem Antikörper oder Antigen 2 in der Probe so­ wie einem markierten Reagens 3, welches mit den gleichen Mar­ kierungssubstanzen zubereitet wurde, wie die zu analysierenden Antikörper- bzw. Antigensubstanzen 2, nämlich mit einem Enzym. Dann wird ein Spülverfahren durchgeführt, um die B-F-Trennung zwischen den durch die A. A. R. an den Träger 1 gebundenen Sub­ stanzen 2 und dem markierten Reagens 3 sowie freien Substanzen 2 und dem Reagens 3, die nicht an den Träger 1 gebunden sind, durchzuführen. Als nächstes wird ein Farbreagens hinzugefügt, welches selektiv mit dem Markierungsenzym reagiert, und die Reaktionsflüssigkeit wird kolorimetrisch gemessen, um die Enzym­ aktivität des zur Markierung benutzten Enzyms festzustellen.

In Fig. 2 sind die aufeinanderfolgenden Schritte für die Sand­ wich-Methode gezeigt. Hier wurde ein unlöslicher Träger 5 ver­ wendet, an welchem ein Antikörper oder Antigen fixiert ist, welches mit den in der zu untersuchenden Probe enthaltenen An­ tigen- oder Antikörpersubstanzen umsetzbar ist. Zunächst wird der Träger 5 mit einer Probe 6 gemischt, damit zwischen den Substanzen der Probe 6 und dem an den Träger 5 fixierten An­ tikörper oder Antigen die A. A. R. stattfinden kann. Dann wird die B-F-Trennung mittels des Spülverfahrens durchgeführt. Da­ nach wird ein markiertes Reagens 7 hinzugefügt, um eine A. A. R. hervorzurufen. Das markierte Reagens wird dadurch zubereitet, daß es mit einer Enzymsubstanz markiert wird, die selektiv mit den zu analysierenden Substanzen der Probe 6 umsetzbar ist. An­ schließend wird nach erneuter B-F-Trennung ein Farbreagens hin­ zugefügt, welches mit dem Markierungsenzym in dem markierten Reagens 7 umsetzbar ist, und die dadurch erhaltene Prüfflüssig­ keit wird einer kolorimetrischen Messung unterzogen, um die Aktivität des Markierungsenzyms festzustellen.

Aus der DE-OS 17 73 584 ist ein Reaktionsgefäß für die Analyse von Substanzen in Proben bekannt, bei dem Fenster für das Reak­ tionsgefäß passierende Strahlung gegenüber den Seitenwänden nach innen versetzt sind. Die Fenster sind aber nicht gegen ein Verkratzen beim Hantieren mit dem Reaktionsgefäß geschützt. Kommt es aber insbesondere beim Einfügen und Herausnehmen des Reaktionsgefäßes in die bzw. aus der Reaktionsbahn zu Ver­ kratzungen des Fensters, so wird der Durchgang des Lichtes durch das Fenster gestört und das Meßergebnis kann verfälscht werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Reaktionsgefäß für die immunologische Analyse von Substanzen in Proben zu schaffen, bei dem Verfälschungen des Meßergebnisses durch Be­ schädigung oder Verschmutzung der Fenster weitgehend vermieden sind.

Die erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe ist im Patentan­ spruch 1 gekennzeichnet.

Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindungen sind in den Un­ teransprüchen beschrieben.

Nachfolgend wird ein Ausführungsbeispiel der Erfindung anhand der Zeichnung näher beschrieben. Es zeigt

Fig. 3 ein automatisches Analysiergerät, in dem ein erfindungsgemäßes Reaktionsgefäß verwendet wird;

Fig. 4A-4I Zeittabellen zur Erläuterung des Betriebs des in Fig. 3 gezeigten Analysiergerätes;

Fig. 5A-5C perspektivische bzw. geschnittene Darstellungen eines Reaktionsgefäßes;

Fig. 6 einen Schnitt durch eine Lichtmeßvorrichtung, in der ein Reaktionsgefäß gemäß den Fig. 5A-5C verwendet wird; und

Fig. 7 eine perspektivische Ansicht eines Magazins für Reak­ tionsgefäße.

In Fig. 3 ist ein Ausführungsbeispiel eines auto­ matischen Analysiergeräts gezeigt, mit dem der Enzymimmunotest gemäß der kompetitiven oder direkten Me­ thode unter Verwendung von Küvetten durchgeführt wird, an de­ ren Innenwänden ein gegebener Antikörper oder ein gegebenes Antigen fixiert ist. Bei der kompetitiven Methode wird der Spülvor­ gang zweimal durchgeführt, so daß in dem Drehteller 211 2n + 1 Küvettenhalter 213 vorgesehen sind. Die Probenabgabe, Reagens­ abgabe, Küvettenzufuhr und -abfuhr sowie die Farbmessung wird jeweils einmal durchgeführt, wenn der Drehteller um zwei Tei­ lungen weitergedreht wird. An der Station S ₃ wird eine Küvette mittels eines hier nicht gezeigten Detektors festgestellt und mittels der Waschvorrichtung 216 der Spülvorgang durchgeführt. An der Station S ₅ wird mittels der ersten Reagensabgabevorrich­ tung 221 eine gegebene Menge eines ersten Reagens 222, d. h. eines mit Enzym markierten Reagens in die Küvette gegossen und gleichzeitig mittels der Probenabgabevorrichtung 223 eine ge­ gebene Menge einer Probe hinzugefügt. Es werden mittels der Probenzustelleinrichtung 224, die eine Anzahl von Gestellen 224 a für Probenbecher aufweist, nacheinander in Probenbechern 225 enthaltene Proben in die Pro­ benabsaugstellung weitergeschaltet. An der Station S ₆ wird der Küvette mittels der zweiten Reagensabgabevorrichtung 219 eine gegebene Menge eines zweiten Reagens 220 hinzugefügt, d. h. die Küvette enthält das Farbreagens. An der Station S ₃₂ wird mittels der dritten Reagensabgabevorrichtung 226 eine gegebene Menge eines dritten Reagens 227, nämlich das Reaktionsstopreagens in die Küvette gegossen. An der Station S ₃₄ wird die in der Kü­ vette enthaltene Prüfflüssigkeit mittels eines Kolorimeters 228 durch die Küvette gemessen, und an der Station S ₃₆ wird die gebrauchte Küvette 212 mittels der Küvettenabfuhrvorrich­ tung 229 aus dem Küvettenhalter 213 entfernt. Die leere Kü­ vette und die Prüfflüssigkeit sind in getrennten Behältern ent­ halten.

Fig. 4A bis 4I sind Zeittabellen für verschiedene Arbeits­ gänge, die mit dem in Fig. 3 gezeigten Analysiergerät durch­ geführt werden. An der Station S ₁ wird einem Küvettenhalter 213 des Drehtellers 211 eine Küvette 212 zugeführt. Wenn der Drehteller um zwei Teilungen weitergedreht worden ist, wird die Küvette an der Station S ₃ mittels der Spülvorrichtung 216 gespült. Nach zwei weiteren Teilungen erhält die Küvette 212 an der Station S ₅ das mit Enzym markierte Reagens 222 und die Probe, um die A. A. R. auszulösen. Während der zweiten Umdrehung des Drehtellers 211 wird an der Station S ₃ mittels der Spül­ vorrichtung 216 die B-F-Trennung bewirkt. Dann wird zum Aus­ lösen der Farbreaktion mittels der Abgabevorrichtung 219 das Farbreagens 220 in die Küvette 212 gegossen. Diese Reaktion wird beendet, wenn die Abgabevorrichtung 226 der Küvette das Reaktionsstopreagens 227 zuführt. Als nächstes wird an der Sta­ tion S ₃₄ die Prüfflüssigkeit mittels des Kolorimeters 228 durch die Küvette 212 gemessen. Schließlich wird an der Sta­ tion S ₃₆ die Küvette mittels der Küvettenabfuhrvorrichtung 229 vom Drehteller 211 entfernt. In Fig. 4B bis 4I sind die an der jeweiligen Probe vorgenommenen Arbeitsgänge durch Schraf­ fierung kenntlich gemacht, während die Kreuzschraffierung die Arbeitsgänge für die nächste Probe wiedergibt. In der beschrie­ benen Weise können die jeweiligen Proben während jeweils zwei Umdrehungen des Drehtellers analysiert werden. Die einzelnen Arbeitsgänge, beispielsweise die Probenabgabe, die Reagensab­ gaben, die Küvettenzufuhr und -abfuhr sowie die Farbmessung wird jeweils einmal pro Weiterschaltung des Drehtellers um zwei Teilungen durchgeführt, so daß eine Kontrolle des Analysierge­ rätes auf einfache Weise durchführbar ist. Es sei noch erwähnt, daß der Spülvorgang mittels der Spülvorrichtung 216 jedesmal vorgenommen werden muß, wenn der Drehteller 211 um eine Teilung weitergedreht wird.

Nachfolgend werden konkrete Konstruktionen der verschiedenen Teile der in Fig. 3 gezeigten automatischen Ana­ lysiergeräte im einzelnen erläutert.

Fig. 5A ist eine perspektivische Ansicht eines Ausführungs­ beispiels eines Reaktionsgefäßes gemäß der Erfindung in Form einer Küvette, während Fig. 5B und 5C Schnittansichten der Küvette gemäß Fig. 5A längs Linien I-I bzw. II-II darstellen. Die Küvette 212 gemäß diesem Ausführungsbeispiel ist aus durchsichtigem Kunstharz geformt und hat insgesamt die Gestalt einer flachen Schachtel oder eines flachen Kastens. Die Kü­ vette 212 hat an der Oberseite eine Öffnung 212 a, zwei Haupt­ wände 212 b und 212 c, zwei Seitenwände 212 d und 212 e sowie ei­ nen Boden 212 f. An mindestens einem Teil der Innenwand der Kü­ vette ist ein gegebener Antikörper oder ein gegebenes Antigen fixiert, welches mit der zu analysierenden Substanz selektiv umsetzbar ist. Die eine Hauptwand 212 b ist mit einem T-förmi­ gen Vorsprung 212 g ausgebildet, der aufgrund von Elastizität zum Festhalten der Küvette in einem Küvettenhalter dient, wie im einzelnen noch erläutert wird. Die Seitenwände 212 d und 212 e der Küvette sind rechtwinklig zu einer optischen Meßachse angeordnet und haben ein Eingangs- und Ausgangsfenster 212 h bzw. 212 i für einen Meßlichtstrahl. Wie am besten in Fig. 5B erkennbar ist, sind die Fenster 212 h und 212 i gegenüber den Seitenwänden 212 d und 212 e sowie den Seitenkanten der Haupt­ wände von innen versetzt. Das bedeutet, daß die für die Mes­ sung vorgesehenen Fenster 212 h und 212 i von den Hauptwänden 212 b und 212 c sowie dem Boden 212 f umgeben sind, so daß sie vor Verfärbungen und Verletzungen wirksam geschützt sind, was eine hohe Meßgenauigkeit sicherstellt. Ferner ist die Innen­ fläche des Bodens 212 f halbzylindrisch gestaltet. Das hat zur Folge, daß die Photometrie auch an einer sehr geringen Menge Prüfflüssigkeit durchgeführt werden kann.

Der Antikörper oder das Antigen kann an der Innenfläche der aus Kunststoff hergestellten Küvette durch die bekannte physika­ lische Absorption oder durch chemische Verbindung fixiert werden. Für den Fall, daß Proteine vorliegen, könnte die Photo­ metrie durch das Antigen, den Antikörper oder das der Markie­ rung dienende Enzym beeinflußt werden. Deshalb sind die Fenster 212 h und 212 i von Antikörper oder Antigen freigehalten.

Fig. 6 zeigt ein Ausführungsbeispiel einer Photometerstation, in der das Absorptionsvermögen der in der Küvette 212 enthal­ tenen Prüfflüssigkeit gemessen wird. Ein von einer Lampe 228 a abgestrahlter Lichtstrahl wird mittels einer Linse 228 b kolli­ miert und fällt durch eine Blende 228 c in das Eingangsfenster 212 h der Küvette 212 ein. Der aus dem Ausgangsfenster 212 i aus­ tretende Lichtstrom passiert eine Blende 228 d und einen Licht­ filter 228 e und trifft dann auf einen Lichtdetektor 228 f auf. Die Küvette 212 wird dabei aufgrund ihrer Elastizität in einer Ausnehmung 213 a des längs des Umfangs in dem Drehteller 211 aus­ gebildeten Küvettenhalters 213 gehalten.

Wie Fig. 7 zeigt, ist eine große Anzahl von Küvetten 212 in einem Küvettenmagazin 230 angeordnet. Die Bedienungsperson des Analysiergeräts braucht die Küvetten nicht in das Magazin ein­ zusetzen, da bereits Magazine mit Küvetten zur Verfügung ste­ hen. Das bietet weiteren Schutz der Küvetten vor Verfärbungen und Verletzungen. Das Küvettenmagazin 230 kann aus Kunststoff oder Metall geformt sein. Beim vorliegenden Ausführungsbeispiel hat das Magazin in Richtung des Pfeiles A gesehen eine solche Länge, daß zehn Küvetten nebeneinander angeordnet werden kön­ nen, und eine solche Breite in Richtung des Pfeiles B gemessen, daß gleichfalls zehn Küvetten nebeneinander angeordnet werden können. Das Magazin kann also hundert Küvetten in einer Matrix­ form enthalten. In einer Seitenwand 231 a des Küvettenmagazins 230 ist ein Auslaß 231 b ausgebildet, dessen Breite in wesent­ lichen der Breite der Küvette 212 h entspricht und dessen Höhe etwa der Höhe der Küvette 212 gleicht. Um sicherzustellen, daß die Küvette 212 in richtiger Stellung durch den Auslaß 231 b aus dem Küvettenmagazin 230 abgegeben werden kann, ist in der vor­ deren Wand des Magazins in der Nähe des Auslasses 231 b durch eine Aussparung in dieser Wand ein federnd nachgiebiger Strei­ fen 231 c geschaffen. In der oberen und unteren Wand 231 d und 231 e des Küvettenmagazins sind drei Ausnehmungen 231 f ausge­ bildet. In der oberen Wand 231 d reichen diese Ausnehmungen 231 f allerdings nicht bis zur Vorderkante, so daß die Küvetten in einer ersten Säule nicht unter den Ausnehmungen angeordnet sind. Das gewährleistet eine glatte Bewegung der Küvetten. In das Magazin ist zwischen der Anordnung der Küvetten und der hinteren Wand 231 e eine Schubplatte 232 eingesetzt. Durch Be­ wegen dieser Schubplatte 232 b in Richtung des Pfeiles B kann die Küvettenreihe in Richtung des Pfeiles B bewegt werden. Längs der rechten Seitenkante der Seitenwand 231 a ist eine Stufe 231 g ausgebildet, die verhindert, daß das Magazin umge­ kehrt in eine automatische Küvettenbeschickungseinrichtung eingesetzt wird, welche zu diesem Zweck mit einem entsprechen­ den Vorsprung versehen ist.

Claims (5)

1. Reaktionsgefäß für die immunologische Analyse von Sub­ stanzen in Proben mittels eines an zumindest einem Teil der In­ nenwand des Reaktionsgefäßes fixierten Antikörpers oder Anti­ gens und eines enzymmarkierten Reagens, zur Verwendung in der Reaktionsbahn eines Analysegerätes, in dem die Substanz in der Probe mittels Strahlung gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgefäß (212) mit zumindest einem Fenster (212 h, 212 i) versehen ist, welches gegenüber den Seitenwänden (212 d, 212 e) des Reaktionsgefäßes nach innen zurückversetzt und durch vorstehende Kanten des Reaktionsgefäßes geschützt ist.

2. Reaktionsgefäß nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß an zumindest einer Wand (212 b) des Reaktionsgefäßes ein T-förmiger Vorsprung (212 g) ausgebildet ist.

3. Reaktionsgefäß nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Innenfläche des Bodens (212 f) des Reaktionsgefäßes halbzylindrisch gestaltet ist.

4. Reaktionsgefäß nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Wände (212 b, 212 c, 212 d, 212 e), der Boden (212 f) sowie die Fenster (212 h, 212 i) des Reaktionsgefäßes einstückig aus­ gebildet sind.

5. Reaktionsgefäß nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fenster (212 h, 212 i) von der Antikörper- oder Antigen­ schicht frei sind.