DE4416640A1

DE4416640A1 - Objektträger für die mikroskopische Diagnose aus Kunststoffmaterial, Herstellungsverfahren und Verwendung

Info

Publication number: DE4416640A1
Application number: DE19944416640
Authority: DE
Inventors: Volkmar Dr Schoellhorn
Original assignee: A I D AUTOIMMUN DIAGNOSTIKA GM
Current assignee: A I D AUTOIMMUN DIAGNOSTIKA GM
Priority date: 1994-05-11
Filing date: 1994-05-11
Publication date: 1995-11-16

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Objektträger für die mikroskopische Diagnose, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung.

Zur Unterstützung der Diagnose in der Veterinär- und Human medizin werden in der klinischen Analytik chemische, bioche mische und immunologische Verfahren wie beispielsweise Kolo rimetrie, enzymatische Analyse, Radioimmunoassay, Enzymim munoassay, Serodiagnostik, Chromatographie, Elektrophorese etc. bei Proben von Körperflüssigkeiten, wie z. B. Blut, Harn, Liquor oder Sekreten, oder von Gewebe angewendet. Damit die Untersuchungsergebnisse einfach, schnell und mit optima ler Zuverlässigkeit erhältlich sind, werden Analyseverfahren automatisiert und mit Hilfe der Datenverarbeitung ausgewer tet. Bekannt sind beispielsweise automatische Verfahren der Chromatographie, Elektrophorese, Spektrophotometrie und Bild analyse (Imageanalysis).

Probleme ergeben sich jedoch bei Analyseverfahren, wenn Pro ben über mehrere Verfahrensschritte vorbereitet, gegebenen falls mit Reagenzien umgesetzt, gereinigt, mit Hilfe von Meß geräten bestimmt und die Ergebnisse ausgewertet werden müs sen. Hier sind nur teilweise automatisierte Prozeßschritte möglich. Bekannt ist beispielsweise die Verwendung von auto matisierten Pipettieranlagen und Wascheinrichtungen. Vor allem mikroskopische Untersuchungen, bei denen das zu analy sierende Material nach Aufbereitung auf einen Objektträger präpariert, dieser mit einem geeigneten Deckglas versehen und zur optischen Untersuchung auf einen Mikroskopiertisch pla ziert werden muß, waren bisher nicht automatisierbar.

Die Notwendigkeit, von Hand zu arbeiten, verursacht hohen Personalaufwand, längere Wartezeit bis zum Erhalt des Analy senergebnisses, Probleme bei labilem (leicht veränderlichem) Probenmaterial, Fehler durch den menschlichen Faktor, hohe Kosten und Einschränkungen bei der Anwendung der Analysever fahren zu Routine- oder Reihenuntersuchungen.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Ob jektträger für die mikroskopische Diagnose zur Verfügung zu stellen, der einfach zu handhaben ist und die Präparierung und Untersuchung einer Reihe von Proben in kurzer Zeit ermög licht. Der Objektträger soll ferner auf einfache Weise und kostengünstig herstellbar sein.

Die Aufgabe wird gelöst durch einen Objektträger für die mikroskopische Diagnose in Form einer 96-Loch-Platte aus Kunststoffmaterial, wobei seine Bodenwanddicke in der Größen ordnung eines mikroskopischen Deckglases liegt und der Loch boden mit einer Zellbeschichtung versehen ist.

96-Lochplatten aus dünnwandigem Kunststoff sind an sich be kannt. Sie werden als Einweg-Lochplatten anstelle der massi ven 96-Lochplatten verwendet. Es wurde nun gefunden, daß bei der mikroskopischen Diagnose auf einen üblichen Objektträger mit Deckglas verzichtet werden kann, indem der Lochboden die Funktion des Deckglases übernimmt und gleichzeitig als Ob jektträger dient. Dadurch läßt sich die Diagnose beschleuni gen und weitgehend automatisieren.

Eine erfindungsgemäß vorgesehene Zellenbeschichtung kann aus für die beabsichtigte Untersuchung geeigneten Zellen gebildet sein. Beispielsweise können infizierte Zellen, insbesondere virusinfizierte Zellen, oder adhärente Zellen, insbesondere eukaryontische Zellen (z. B. HEp2-Zellen) oder prokaryonti sche Zellen, vorgelegt sein. Die im Objektträger gemäß der Erfindung vorgesehene Zellenbeschichtung kann insbesondere als Monolayer, d. h. als Einzellschichtkultur, vorliegen. Darüber hinaus kann die vorgesehene Zellenschicht bevorzugt in getrocknetem Zustand vorliegen.

Der erfindungsgemäße Objektträger eignet sich besonders gut für Immunofluoreszenztechniken, aber auch für Biolumineszenz verfahren und Reaktionen in sichtbarem Licht.

Der erfindungsgemäße Objektträger kann aus einem geeigneten Kunststoff durch thermoplastische Verformung nach einem Tief ziehverfahren hergestellt sein. Bevorzugt kann das zur Her stellung des Objektträgers verwendete Kunststoffmaterial farblos und transparent sein. Mit Vorteil kann der Kunststoff für den Objektträger halogenfreies, tiefziehbares, thermopla stisches Polymermaterial, insbesondere Polystyrol sein. Poly styrol hat sich aufgrund seiner Eigenschaften und physiolo gischen Unbedenklichkeit als besonders geeignet für die Her stellung von Hilfsmitteln und Geräten für das Laboratorium und den klinischen Bedarf, beispielsweise Reaktionsgefäße, Schläuche etc., erwiesen.

Die Technologie des Tiefziehens zählt in der Kunststoffverar beitung zu den Standardtechniken. Tiefziehverfahren werden mit Vorteil bei der Formung von Teilen aus Folienmaterial oder zur Bildung von dünnwandigen Strukturen angewendet. Die Formung einer 96-Loch-Platte aus einem geeigneten thermopla stischen Polymer durch Tiefziehen ermöglicht auf einfache Weise die Herstellung des erfindungsgemäßen Objektträgers in Serienproduktion. Der auf diese Weise ausgebildete Kunst stoffobjektträger zeichnet sich durch eine dünnwandige Kon struktion, insbesondere seiner Vertiefungen aus. Ein solcher Objektträger besitzt ein geringes Gewicht und weist ferner vorteilhafte mechanische Eigenschaften auf, beispielsweise Formstabilität und Elastizität, was eine erhöhte Bruchsicher heit ergibt. Ferner ermöglicht die dünnwandige Kunststoffo lie, eine 96-Loch-Platte auf einfache Weise, zum Beispiel mit Hilfe einer Schere, in kleinere Abschnitte zu teilen. Dadurch kann der erfindungsgemäße Objektträger problemlos dem jewei ligen Analysenaufkommen angepaßt werden.

Bevorzugt kann die Schichtdicke der Kunststoffolie so gewählt sein, daß durch diese hindurch Mikroskopieren möglich ist. Insbesondere kann durch die Kunststoffolienschicht des erfin dungsgemäßen Objektträgers hindurch mit einem 40er oder 50er Objektiv, bevorzugt bei einer Vergrößerung von 400- bis 500- fach, mikroskopisch untersucht werden. Eine solche Vergröße rung ist für die Betrachtung von Bakterien oder Zellmustern besonders vorteilhaft. Die Schichtdicke des Kunststoffes kann insbesondere 0,1 bis 0,18 mm betragen. Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß übliche Unebenheiten im Lochboden nicht hinderlich sind und eine optisch zufriedenstellende mikrosko pische Untersuchung erlauben.

Mit Vorteil kann der mit einer getrockneten Zellschicht ver sehene Objektträger in luftdichter Verpackung, insbesondere in Anwesenheit eines Trockenmittels vorliegen. Auf diese Weise ist es möglich, vorgefertigte erfindungsgemäße Objekt träger in gebrauchsfertigem Zustand bequem zu transportie ren, zu lagern und bei Bedarf schnell und einfach einsatzbe reit zu machen, ohne daß eine Beeinträchtigung des Objektträ gers und seiner Zellenbeschichtung zu befürchten ist.

Der Objektträger gemäß der vorliegenden Erfindung zeichnet sich dadurch aus, daß in seinen Vertiefungen befindliche Proben direkt einer mikroskopischen visuellen Untersuchung durch den Boden des Objektträgers zugänglich sind. Der Kunststoffobjektträger ermöglicht somit eine einfache Vor bereitung der zu untersuchenden Proben, ohne zusätzlichen Präparierungsschritt für die mikroskopische Untersuchung. Ferner erübrigt sich die Verwendung eines Deckglases. Auf diese Weise ist der erfindungsgemäße Objektträger für jeg liche Art des diagnostischen Mikroskopierens geeignet.

Ein Objektträger in Form einer 96-Loch-Platte aus tiefgezoge nem Kunststoffmaterial kann mit Vorteil zur Züchtung von Zel len in einer Monolayerschicht für die spätere diagnostische Untersuchung unter dem Mikroskop verwendet werden.

Ein Verfahren zur Herstellung eines mit einer Zellenbeschich tung versehenen Objektträgers ist dadurch gekennzeichnet, daß in eine 96-Loch-Platte Zellen eingebracht werden, man die Zellen adhärieren und in Monolayerschicht wachsen läßt und danach die Monolayerschicht getrocknet und fixiert wird. Das Einbringen von Zellen in die Vertiefungen einer 96-Loch-Plat te kann nach einem üblichen Verfahren, insbesondere einem automatisierten Verfahren vorgenommen werden. Vorgefertigte Mikrotiterplatten, wie beispielsweise 96-Loch-Platten, aus Kunststoffmaterial sind für eine Verwendung in automatisier ten Laborverfahren besonders geeignet.

Die Zellen können insbesondere in Form von Suspensionen in geeignetem Medium verwendet werden. Das Einbringen von Zellen bzw. Zellsuspensionen kann mit Hilfe von üblichen Dosierein richtungen, wie beispielsweise automatischen Pipettieranla gen, vorgenommen werden. Wie oben schon erwähnt, können alle für vorgesehene Untersuchungen geeigneten Zellen vorgelegt werden. Beispielsweise können eukaryontische, prokaryontische Zellen, wie Borrelien oder infizierte Zellen, insbesondere mit Viren, z. B. Chlamydien infizierte Zellen, verwendet werden.

Mit Vorteil kann den Zellen 1 bis 2 Tage Zeit gelassen wer den, um am Boden des Kunststoffobjektträgers zu adhärieren und zu wachsen, so daß sich ein Monolayer ausbildet. Bei Zellen, die nicht von selbst am Objektträger adhärieren, kann ein geeignetes Mittel, beispielsweise Polylysin oder Glu taraldehyd zugegeben werden, um die Zelladhäsion zu fördern. Nach dieser Zeit von etwa 20 bis 50 Stunden haben sich die Zellen um ungefähr 50 bis 70% vermehrt.

Die überstehende Lösung kann nun auf einfache Weise durch Um stülpen des 96-Loch-Trägers und Ausklopfen entfernt werden. Dieser Schritt kann auf übliche Weise, insbesondere auch automatisch durchgeführt werden. Danach können geeignete Fixierungsmittel, wie Methanol, Aceton zugesetzt werden, damit die Zellmembranen angegriffen und mindestens teilweise aufgebrochen werden, so daß das Zellinnere zugänglich wird. Dadurch wird der Zutritt zum Zellinneren sowie einem darin enthaltenen Zellkern für Reaktanten, wie beispielsweise in einem zu untersuchenden Serum enthaltenen Antikörpern, er leichtert. Auch die Zugabe des Fixierungsmittels kann nach üblichen Verfahren mittels automatischer Dosiereinrichtungen vorgenommen werden.

Anschließend werden die so vorbehandelten Zellen durch Zugabe eines geeigneten Immobilisierungsmittels, z. B. Polyacryl amid, am 96-Loch-Träger fixiert. Das Zellinnere so vorbehan delter Zellen ist somit nicht nur zugänglich gemacht worden, sondern die komplette Zelle wird durch geeignete Fixierungs mittel an den Objektträger fixiert. Abschließend wird die auf diese Weise mit Zellen beschichtete Mikrotiterplatte auf übliche Weise, zum Beispiel unter Verwendung eines Kammer trockners, oder durch Gefriertrocknen getrocknet. Durch Fixieren und Trocknen wird erreicht, daß die Zellen über einen längeren Zeitraum haltbar sind.

Nach dieser Vorgehensweise hergestellte 96-Loch-Platten aus Kunststoff mit Zellenbeschichtung liegen in direkt gebrauchs fertiger Form vor. Mit Vorteil können diese erfindungsgemäßen Objektträger mit einem geeigneten Deckel aus Kunststoffmate rial, bevorzugt dasselbe Material, aus dem auch der Objekt träger selbst gefertigt ist, versehen werden, so daß das in die Vertiefungen eingebrachte Zellenmaterial vor schädlichen Einwirkungen geschützt ist.

Außerdem können die nach Fixieren und Trocknen der Zellbe schichtung gebrauchsfertigen Mikrotiterplatten in geeignetes luftdichtes und feuchtigkeitsdichtes Verpackungsmaterial verpackt werden. Bevorzugt wird zum Objektträger in der Ver packung ein Trockenmittel in einer geeigneten Form, bei spielsweise Silicagel in Beutelchen, hinzugefügt. Das Ver packen kann insbesondere nach üblichen Methoden, z. B. durch Einschweißen in Folienbeutel, bevorzugt aus mit Aluminium be schichtetem Kunststoffverbundmaterial, durchgeführt werden. Derart verpackte erfindungsgemäße Objektträger können einfach und bequem transportiert und gelagert werden, wobei sie vor schädlichen Einflüssen hinreichend geschützt sind. Mit beson derem Vorteil können die Objektträger gemäß der Erfindung in der genannten Form der Verpackung in den Handel gebracht werden.

Ein mit einer Monolayerschicht von Zellen versehener Objekt träger kann mit Vorteil bei der diagnostischen Untersuchung von Körperflüssigkeiten unter dem Mikroskop verwendet werden. Einsatzgebiete des genannten Objektträgers sind beispiels weise die Infektionsserologie, Allergiediagnostik und Tumor diagnostik. Bevorzugt kann der erfindungsgemäße Objektträger in der Serologie, insbesondere zur Serumtiterbestimmung, verwendet werden. Besonders bevorzugt kann der erfindungsge mäße Objektträger in der Immunanalyse, insbesondere zur Be stimmung von Immunfaktoren verwendet werden. Mit besonderem Vorteil kann der Objektträger in der Rheumadiagnostik, zur Bestimmung von im Serum eines Patienten vorhandenen diagnos tisch relevanten Autoantikörper eingesetzt werden.

Mit besonderem Vorteil kann der Objektträger gemäß der vor liegenden Erfindung in der Routineanalytik unter Verwendung von automatisierten Analysegeräten eingesetzt werden. Da der Objektträger in seiner Gestaltung in Form einer 96-Loch-Plat te und in seinen Abmessungen den üblicherweise in der automa tisierten Analytik verwendeten Mikrotiterplatten entspricht, kann er problemlos in Verbindung mit üblichen automatisch arbeitenden Laborgeräten, wie beispielsweise Dosieranlagen, Probenwaschanlagen, Greifarmsystemen, Transportsystemen oder Laborrobotern, eingesetzt werden.

Ein Verfahren zur Immundiagnostik unter Verwendung eines Ob jektträgers gemäß der vorliegenden Erfindung zeichnet sich dadurch aus, daß in den Vertiefungen befindliche Proben direkt durch den Boden des Objektträgers hindurch mikrosko pisch, insbesondere visuell untersucht werden können. Das Prinzip aller immunologischen Verfahren liegt in der Reaktion zwischen Antigen und Antikörper. Durch solche immunanalyti sche Verfahren werden insbesondere Vorhandensein, Wechselwir kungen und Mechanismen von Antigenen und Antikörpern unter sucht. Von besonderer Bedeutung ist in diesem Zusammenhang der Nachweis von spezifischen Antikörpern gegen bestimmte pathogene Antigene im Körper eines Tieres oder eines Men schen, was Rückschlüsse auf einen akuten Erkrankungszustand oder auf eine Immunisierung bzw. Sensibilisierung durch frü heren Kontakt mit dem Antigen ermöglicht. Beispiele solcher Immunotests sind Nachweis von vorhandenen Antikörpern gegen Viren, Bakterien oder mehrzellige Parasiten sowie Nachweis von Antigenen von pathogenen Organismen. Üblicherweise werden als Hilfsmittel zur Erleichterung des Nachweises mit einem Marker versehene Reagenzien wie enzymmarkierte Antikörper, Antigene oder Anti-Antikörper in Enzymimmunoassays, bevorzugt in Verbindung mit farbstoffbildenden Substraten, oder fluo reszenzmarkierte Gruppen in Fluoreszenzimmunoassays verwen det. Beispiele für solche Anti-Antikörper sind Antikörper gegen IgG bzw. IgM Immunglobuline beim Menschen. Als Marker enzym werden beispielsweise Peroxydase oder Alkali-Phosphat ase eingesetzt. Beispiele für Farbindikatoren umfassen Fluo resceinisothiocyanat, Luminol oder o-Phenylendiamin. Eine solche Indikatorreaktion erlaubt eine Auswertung der Immun reaktion auf einfache Weise, häufig auch quantitativ, durch visuelle oder photometrische Bestimmung der Lumineszenz- oder Fluoreszenzintensität.

In einem Immundiagnoseverfahren unter Verwendung des Objekt trägers gemäß der Erfindung können Zellen verwendet werden, die Antigene enthalten, und/oder geeignet sind, eine Immun reaktion durchzuführen. In einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Immundiagnoseverfahrens können Zellen ver wendet werden, die Antikörper enthalten, und/oder geeignet sind, eine Immunreaktion durchzuführen. In einer bevorzugten Ausführungsform zum Nachweis von in menschlichem oder tieri schem Serum enthaltenen Antikörpern können nach Zugabe der Serumprobe während der Inkubation unter geeigneten Bedingun gen die gesuchten Antikörper an die feste Zellphase binden. Bevorzugt kann bei Bestimmungsverfahren unter Verwendung des erfindungsgemäßen Objektträgers ein geeignetes Indikatorrea gens eingesetzt werden, das innerhalb festgelegter Zellbe reiche, z. B. am Zellkern, in den Mitochondrien etc., eine Färbung oder Fluoreszenz ausbildet. Je nach Art der umgesetz ten Antigene bzw. Antikörper zeigt sich eine bestimmte Orien tierung und/oder Intensität der Indikatorreaktion, wodurch spezifisch auf bestimmte Immunzustände oder Krankheiten ge schlossen werden kann.

Zu den im erfindungsgemäßen Objektträger vorgelegten Zellen kann das zu untersuchende Probenmaterial, im allgemeinen Blut, Liquor oder Urin eines menschlichen oder tierischen Patienten, direkt zugegeben werden. Auf diese Weise ist auch die Einstellung spezifischer Verdünnungsreihen direkt im er findungsgemäßen Objektträger möglich. Dies erspart zeitrau bende separate Probenverdünnungen in zusätzlichen Laborgefä ßen. Bevorzugt können die Verdünnungsschritte durch automati sierte Dosiervorrichtungen durchgeführt werden. Nach Zugabe von Immunreagenzien einschließlich Markern und gegebenenfalls weiteren Hilfsmitteln direkt in die Vertiefungen des Objekt trägers kann durch Inkubieren unter geeigneten Bedingungen die Immunreaktion durchgeführt werden. Anschließende Wasch schritte zur Entfernung nicht umgesetzter Komponenten können ebenfalls direkt im erfindungsgemäßen Objektträger vorgenom men werden. Mit Vorteil kann nach Abschluß der Schritte zur Immunreaktion vor dem Mikroskopieren ein geeignetes Mittel zur Verbesserung der optischen Bedingungen, z. B. Glycerin, auf die Proben in den Objektträgervertiefungen gegeben wer den. Gemäß der Erfindung kann die Zugabe der Seren sowie der Immunreagenzien, Waschflüssigkeiten und gegebenenfalls weite rer Hilfsmittel bevorzugt in automatisierten Anlagen erfol gen.

Zur optisch mikroskopischen Untersuchung kann der Objektträ ger gemäß der vorliegenden Erfindung mit einem Deckel verse hen und umgestülpt werden. Auf diese Weise zeigt der Platten boden und damit der Inhalt der 96-Probenvertiefungen nach oben. In dieser Stellung kann der Objektträger auf einen Mikroskopiertisch angeordnet und mikroskopisch betrachtet werden. Das Auflegen eines Deckglases wie bei bisher bekann ten Objektträgern ist nicht erforderlich, so daß wiederum ein Arbeitsschritt eingespart wird. Da die Dicke der Bodenwand erfindungsgemäß in der Größenordnung eines üblichen Deckgla ses liegt, kann die mikroskopische Betrachtung entsprechend wie bei herkömmlichen Objektträgern mit Deckglas vorgenommen werden. Bedingt durch Unebenheiten der Bodenwand aus Kunst stoffmaterial sind ungefähr 70% des Gesichtsfeldes scharf erkennbar was völlig ausreichend ist. Bei visueller Unter suchung durch Bedienungspersonal kann das Bild gegebenenfalls auf einfache Weise nachfokussiert werden. Auch bei Unter suchung nach einem automatisierten Bildanalyseverfahren unter Verwendung beispielsweise einer Videokamera reicht dieses optische Auflösungsvermögen aus.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Immundiagno stikverfahrens kann eine Auswertung der Ergebnisse zunächst durch automatisierte Bildauswertung vorgenommen werden, wobei anhand von Vergleichsdaten positive und negative Proben aus gesondert werden und die visuelle Auswertung zur Diagnose nur noch anhand der positiven Proben vorgenommen wird. Nach einem solchen Ausschlußverfahren können die interessierenden (positiven) Proben vom Bedienungspersonal selektiv mikrosko pisch betrachtet werden. Die automatische bildanalytische Vorauswertung ermöglicht eine beträchtliche Ersparnis des Arbeitsaufwands beim Personal, da nur als auffällig erkannte Proben von Hand bzw. durch direkte Betrachtung von Labormit arbeitern überprüft werden müssen. Dadurch verringert sich auch das Risiko von Fehlanalysen durch Konzentrationsmangel oder Ermüdung des Bedienungspersonals bei langdauernder Mikroskopierarbeit. In einer anderen Ausführungsform des er findungsgemäßen Immundiagnostikverfahrens kann auch die visu elle Auswertung der positiven Proben durch automatisierte Bildanalyse vorgenommen werden.

Der erfindungsgemäße Objektträger ermöglicht somit auf ein fache Weise die Analyse zahlreicher Proben in kurzer Zeit und kann somit für insbesondere für Reihenuntersuchungen (Scree ning), beispielsweise in der Vorsorgemedizin oder zur Überwa chung therapeutischer Maßnahmen angewendet werden.

Weitere Merkmale und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten Ausfüh rungsformen. Die einzelnen Merkmale könne dabei jeweils für sich oder in Kombination verwirklicht sein. Die Erfindung ist jedoch in keiner Weise auf diese Ausführungsformen be schränkt.

Beispiel 1 Bestimmung von prokaryontischen Zellen

Antikörper sind Immunglobuline, die mit körperfremden Be standteilen (Antigenen), z. B. Bakterien (prokaryontische Zellen), reagieren. Zum Nachweis der antibakteriellen Anti körper werden auf einem mit Bakterienantigenen beschichteten 96-Loch-Objektträger aus transparentem Polystyrol 200 µl PBS (phosphatgepufferte NaCl-Lösung) vorgelegt und zur Einstel lung von geeigneten Serumverdünnungen 5 µl bis 10 µl Patien tenserum dazupipettiert, was einer Serumverdünnung von 1 : 20 bis 1 : 40 entspricht. Das verdünnte Serum wird 40 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach werden die Proben 3mal mit jeweils 300 µl PBS gewaschen. Nun werden 40 µl FITC-Kon jugat (Fluoresceinisothiocyanat) zu den Proben zugegeben. Nach 30 Minuten Inkubieren bei Raumtemperatur werden die Pro ben wiederum 3mal mit jeweils 200 µl PBS gewaschen und 50 µl Glycerin als Eindeckmedium daraufpipettiert. Das Einfüllen und Entfernen von Flüssigkeiten in die 96 Probenvertiefungen werden jeweils mit einer automatisierten Pipettieranlage durchgeführt. Die Mikrotiterplatte wird nun mit ihrem Deckel versehen und umgedreht, so daß der Plattenboden nach oben weist und auf den Mikroskopiertisch gestellt. Anschließend erfolgt unter dem Fluoreszenzmikroskop die Selektierung von positiven, d. h. fluoreszierenden, Proben. Diese mikroskopi sche Auswertung wird beispielsweise mit einem vollautomati sierten Bildanalysesystem durchgeführt.

Beispiel 2 Bestimmung von Antikörpern gegen den Epstein-Barr-Virus

Entsprechend der Vorgehensweise von Beispiel 1 werden in einen mit Epstein-Barr-Virus (EBV) infizierten Zellen be schichteten 96-Loch-Objektträger aus Polystyrol verdünnte Patientenserumproben eingebracht. Nach Inkubation bei Raum temperatur für 40 Minuten werden die Proben mit PBS gewaschen wie in Beispiel 1. Danach werden 40 µl Farbreagens Fluoresce in dazupipettiert. Nach weiteren 40 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur werden die Proben 3mal mit je 300 µl PBS ge waschen und mit 50 µl Glycerin versehen. Die mikroskopische Auswertung der angefärbten Serumproben erfolgt entsprechend wie in Beispiel 1 beschrieben.

Beispiel 3 Serumtiterbestimmung

Dazu werden in den Vertiefungen eines mit HEp-2-Zellen be schichteten 96-Loch-Objektträgers in die erste Reihe mit einer 12-Kanalpipette 190 µl PBS vorgelegt, in die übrigen jeweils 100 µl PBS. Nun werden in die 12 Vertiefungen der ersten Reihe jeweils 10 µl des positiven Patientenserums dazupipettiert, so daß sich eine Serumverdünnung von 1 : 20 ergibt. Mit einer 12-Kanalpipette werden aus der ersten Reihe 100 µl verdünntes Serum entnommen und zum in der zweiten Reihe vorgelegten PBS dazugegeben, wodurch sich eine Verdün nung von 1 : 40 ergibt. Von diesem verdünnten Serum werden nun wiederum 100 µl entnommen und in die dritte Reihe über tragen usw. Auf diese Weise ergibt sich für die 12 Serumpro ben eine Verdünnungsreihe von

1.) 1 : 20,
2.) 1 : 40,
3.) 1 : 80,
4.) 1 : 160,
5.) 1 : 320,
6.) 1 : 640,
7.) 1 : 1280,
8.) 1 : 2560.

Zur mikroskopischen Analyse der Serumtiter wird mit der Be trachtung bei einer der mittleren Verdünnungen, z. B. bei 1 : 320 begonnen. Wenn diese Proben noch positiv sind, wird so lange zu höheren Verdünnungen fortgeschritten, bis die Proben negativ sind. Umgekehrt wird bei negativen Proben in mittlerer Verdünnung zu niedrigeren Verdünnungen fortge schritten, bis sich positive Proben zeigen. Diese Vorgehens weise erspart ca. 40 bis 70% der bei bisherigen Verfahren benötigten Zeit.

Claims

1. Objektträger für die mikroskopische Diagnose mit einer Beschichtung von Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß er in Form einer 96-Loch-Platte aus Kunststoff gebildet ist, seine Bodenwanddicke in der Größenordnung eines mikroskopischen Deckglases liegt und die Zellbeschich tung am Boden der Löcher vorgesehen ist.

2. Objektträger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er durch thermoplastische Verformung, insbesondere durch Tiefziehen hergestellt ist.

3. Objektträger nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, daß die Zellenbeschichtung als Monolayer vorliegt.

4. Objektträger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellenbeschichtung in getrocknetem, insbesondere in gefriergetrocknetem Zustand vorliegt.

5. Objektträger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Kunststoffmaterial farblos und transparent ist.

6. Objektträger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Kunststoffmaterial halogenfreies, tiefziehbares, thermoplastisches Polymer material, insbesondere Polystyrol ist.

7. Objektträger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Bodenwanddicke so ge wählt ist, daß durch diese hindurch Mikroskopieren mit einem 40er oder 50er Objektiv möglich ist.

8. Objektträger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Bodenwanddicke 0,1 bis 0,18 mm beträgt.

9. Objektträger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der mit einer getrockneten Zellschicht versehene Objektträger in luftdichter und feuchtigkeitsdichter Verpackung, insbesondere in An wesenheit eines Trockenmittels vorliegt.

10. Objektträger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in den Vertiefungen befind liche Proben direkt einer mikroskopischen visuellen Untersuchung durch den Boden des Objektträgers zugäng lich sind.

11. Objektträger zur Immundiagnostik nach einem der vorher gehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Antigene enthalten und/oder geeignet sind, eine Immunreaktion durchzuführen.

12. Objektträger zur Immundiagnostik nach einem der vorher gehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Antikörper enthalten und/oder geeignet sind, eine Immunreaktion durchzuführen.

13. Verfahren zur Herstellung eines mit einer Zellenbe schichtung versehenen Objektträgers, dadurch gekenn zeichnet, daß als Objektträger in eine 96-Loch-Platte Zellen eingebracht werden, man die Zellen adherieren und in Monolayerschicht wachsen läßt und die Monolayer schicht getrocknet und fixiert wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Beschichtung von Zellen in einem automatisierten Verfahren vorgenommen wird.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeich net, daß der Objektträger nach Fixieren und Trocknen der Zellbeschichtung in eine luft- und feuchtigkeitsdichte Verpackung, insbesondere unter Zusatz eines Trockenmit tels, verpackt wird.

16. Verwendung eines Objektträgers in Form einer 96-Loch- Platte aus tiefgezogenem Kunststoffmaterial zur Züchtung von Zellen in einer Monolayerschicht für die spätere diagnostische Untersuchung unter dem Mikroskop.

17. Verwendung eines mit einer Monolayerschicht von Zellen versehenen Objektträgers für die diagnostische Unter suchung von Körperflüssigkeiten unter dem Mikroskop.

18. Verwendung des Objektträgers nach Anspruch 16 oder 17 in der Serumdiagnostik, insbesondere zur Serumtiterbe stimmung.

19. Verwendung des Objektträgers nach einem der Ansprüche 16 bis 18 in der Immunanalyse, insbesondere zur Bestimmung von Immunfaktoren.

20. Verwendung des Objektträgers nach einem der Ansprüche 16 bis 19 in der Routineanalytik mit automatisierten Analy segeräten.

21. Verfahren zur Immundiagnostik unter Verwendung eines Objektträgers nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß in den Vertiefungen befindliche Proben direkt durch den Boden des Objektträgers hindurch mikroskopisch, insbesondere visuell untersucht werden.

22. Verfahren zur Immundiagnostik nach einem der vorher gehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zugabe der Seren sowie der Immunreagenzien und der Waschflüssigkeiten in automatisierten Anlagen erfolgt.

23. Verfahren zur Immundiagnostik nach einem der vorherge henden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Aus wertung der Ergebnisse zunächst durch automatisierte Bildauswertung erfolgt, wobei anhand von Vergleichsdaten positive und negative Proben ausgesondert werden, und die visuelle Auswertung zur Diagnose nur noch anhand der positiven Proben, insbesondere durch automatisierte Bildanalyse vorgenommen wird.