DE3511700C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein umgekehrtes Mikroskop mit einem Mikromanipulator. Bei einem solchen Mikroskop wird ein zu beobachtendes Objekt, das in einem Objektträger auf einem Objekttisch angeordnet ist, mit einem Objektiv durch die Unterseite des Objektträgers hindurch beobachtet. Zum Durchführen von Mikromanipulationen an dem zu beobachtenden Objekt ist ein Mikromanipulator mit einem nadelförmigen Miniaturwerkzeug vorgesehen, dessen Spitze im optischen Strahlengang zwischen einem Kondensor und dem Objektträger angeordnet ist und das in Verriegelung mit einem in Richtung der optischen Achse des Objektivs bewegbaren Mikroskopbauteil bewegbar ist.

Ein solches umgekehrtes Mikroskop mit einem Mikromanipulator ist aus der DE 29 22 212 A1 bekannt. Wie in Fig. 3 gezeigt, ist ein Mikromanipulator 2 in einen Kondensor 1 des Mikroskops integriert, so daß dann, wenn der Mikromanipulator 2 verti­ kal entlang der optischen Achse eines Objektivs 3 bewegt wird, seine Spitze in eine Zelle eindringt, die sich in ei­ nem Kulturbehälter 5 befindet, der auf einem Objekttisch 4 angeordnet ist. Derartige Zellmanipulationen haben an Be­ deutung und Exaktheit zugenommen. Sie dienen beispielsweise dazu, die Farbe eines Keims aus einem Ei innerhalb einer befruchteten Zelle einer Maus von der Farbe eines Keims aus einem Spermatozoon zu unterscheiden und lediglich den Keim aus dem Ei auszusaugen. Im Hinblick auf das Auflösungsver­ mögen wird oft eine Differential-Interferenz-Mikroskopie durchgeführt. Bei der Einstellung des Mikromanipulators 2 oder bei der Handhabung einer Eizelle einer Kuh wird häufig eine vergleichsweise kleine Vergrößerung benutzt. Will man die Vergrößerung umschalten oder auf die Differential-In­ terferenz-Mikroskopie übergehen, so ist es erforderlich, das Beleuchtungssystem, nämlich den Kondensor, anzubauen, abzubauen, zu ersetzen oder umzuschalten. Dies ist bei der vorliegenden bekannten Konstruktion nicht einfach, da der Mikromanipulator 2 in den Kondensor 1 integriert ist.

Ferner ist ein umgekehrtes Mikroskop mit einem Mikromanipu­ lator bekannt, dessen Konstruktion sich aus Fig. 4 ergibt. Fig. 4 zeigt einen Objekttisch 10 des Mikroskops, einen Kulturbehälter 11, der auf dem Objekttisch 10 angeordnet ist und Zellen 11a enthält, einen Kondensor 12 mit einer darin enthaltenen Ringblende 12a, ein Objektiv 13, das an einem Revolver 14 angeordnet ist und eine Phasenplatte 15 enthält, und einen Mikromanipulator 16, der über eine Hal­ terung 17 an dem Objekttisch 10 (bzw. an einem Teil des Mi­ kroskopkörpers nahe dem Objekttisch 10) befestigt ist und sich mit seiner gläsernen Nadel 18a zu der Zelle 11a inner­ halb des Kulturbehälters 11 erstreckt, also in die Nähe des Fokuspunktes des Mikroskops. Soll mit diesem umgekehrten Mikroskop beispielsweise ein sogenanntes Punktieren durch­ geführt werden, bei dem die gläserne Nadel 16a des Mikro­ manipulators 18 in die Zelle 11a innerhalb des Kulturbehäl­ ters 11 eindringt, um die Zelle mit dem in der Kulturflüs­ sigkeit enthaltenen Enzym zu imprägnieren, so wird selbst eine geübte Bedienungsperson nicht mehr als beispielsweise etwa 500 Zellen pro Stunde behandeln können, da die Posi­ tionen der jeweiligen Bedienungsteile von Mikromanipulator 16, Objekttisch 10 und Vertikalsteuerung des Mikroskopkör­ pers in unterschiedlicher Weise voneinander entfernt lie­ gen. Da außerdem die Bodenfläche des Kulturbehälters, ins­ besondere wenn dieser aus Plastik besteht, nicht eben ist und sich der Wuchs der Zellen nicht gleichförmig über die Bodenfläche des Kulturbehälters ausbreitet, nehmen die je­ weiligen Zellen unterschiedliche Positionen in Richtung der optischen Achse ein, so daß die Scharfeinstellung wegläuft, wenn man den Objekttisch 10 in horizontaler Richtung be­ wegt. Daher wird es erforderlich, die Scharfeinstellung nachzustellen und die jeweiligen Bedienungsteile des Mikro­ manipulators 16 zu handhaben, um dessen gläserne Nadel 16a in die Nähe des Scharfeinstellungspunktes zu bringen. Die gesamte Bedienung wird dadurch äußerst kompliziert.

Aus der CH-PS 5 72 221 ist ein Mikromanipulationsgerät be­ kannt, das als Zusatzgerät bei einem Lichtmikroskop verwen­ det werden kann. Dabei ist vorgesehen, daß das Mikromanipu­ lationsgerät an dem Objektiv des Mikroskops angeklemmt wird. Dieses Gerät erfüllt vor allem die Erfordernisse ei­ nes relativ billigen, einfachen Zusatzgerätes, das bei an sich nicht für das Mikropunktieren besonders ausgerüsteten Mikroskopen verwendet werden kann. Das Mikropipettieren ist dabei nur dann einfach, wenn nacheinander sehr ähnliche Proben untersucht werden sollen, so daß die Einstellung er­ halten bleiben kann. Bei jedem Objektivwechsel muß das Mi­ kromanipulationsgerät entfernt und danach wieder angebracht und grob und fein justiert werden. Für die inverse Mikro­ skopie ist das Gerät auch deshalb schlecht geeignet, weil bei Befestigung des Gerätes direkt am Objektiv der Mikroma­ nipulator in weitem Bogen um den zwischen Objektiv und Ob­ jekt gelegenen Objekttisch herumgeführt werden muß. Dies bringt schon bei normaler Objekttischgröße von mindestens der Größe einer Petrischale die Gefahr mit sich, daß die Pipette des Mikromanipulators bereits bei geringen Erschüt­ terungen vibriert und das Pipettieren so erschwert oder un­ möglich macht.

Dementsprechend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein gattungsgemäßes umgekehrtes Mikroskop so weiterzubil­ den, daß Zellpunktierungen bei frei wählbarer Vergrößerung und Beleuchtung einfach und rasch ausgeführt werden können, ohne daß der Mikromanipulator bei einer Änderung der Ver­ größerung oder Beleuchtung entfernt werden muß.

Erfindungsgemäß wird dies dadurch erreicht, daß der das Miniaturwerkzeug tragende Mikromanipulator sich an der Oberseite des Objekttisches um diesen herum zu dessen Unterseite erstreckt und an der Unterseite des Objekt­ tisches mit einer Halterung für einen das Objektiv tragen­ den Objektivrevolver fest verbunden ist, daß beim Scharf­ tellen des Objektivs auf das zu untersuchende Objekt ver­ mittels einer Vertikalverstelleinrichtung das Miniaturwerk­ zeug in die Manipulationsposition gelangt, wenn das Objek­ tiv in seine Scharfstellung gelangt, und daß der Mikromani­ pulator in Richtung der optischen Achse des Objektivs rela­ tiv zum Objektiv zusätzlich verschiebbar gelagert ist.

Da erfindungsgemäß der Mikromanipulator nicht in den Kon­ densor integriert ist, kann das Beleuchtungssystem und ins­ besondere der Kondensor ohne weiteres ersetzt oder beim Übergang auf eine Phasen-Kontrast-Mikroskopie bzw. auf eine Differential-Interferenz-Mikroskopie umgeschaltet wer­ den, was beispielsweise für die Genbehandlung wichtig ist. Wenn die Spitze der gläsernen Nadel des Mikromanipulators geringfügig oberhalb des Scharfeinstellungspunktes, d. h. innerhalb des Tiefenschärfenbereichs, positioniert ist, so nimmt sie immer eine korrekte Stellung ein. Dadurch ist eine feine und exakte Manipulation in sehr wirtschaftlicher Weise möglich. Es können etwa 1000 bis 2000 Zellen pro Stunde punktiert werden. Auch wird die Effizienz der Mani­ pulation selbst dann nicht vermindert, wenn der Boden des Kulturbehälters nicht eben ist. Falls es im Zuge der Be­ handlung erforderlich wird, kann der Bewegungsmechanismus des konventionell verwendeten Manipulators benutzt werden, um lediglich dessen gläserne Nadel vertikal zu verstellen.

Bevorzugte Ausführungs­ beispiele werden im Zusammenhang mit den Fig. 1 und 2 der bei­ liegenden Zeichnung beschrieben.

Fig. 1 zeigt eine erste Ausführungsform eines umgekehrten Mikroskops nach der Erfin­ dung;

Fig. 2 zeigt eine zweite Ausführungsform nach der Erfindung;

Fig. 3 und 4 zeigt je eine bekannte Ausführungsform eines umgekehrten Mikroskops.

In Fig. 1 sind diejenigen Teile, die mit der bekannten Aus­ führungsform nach Fig. 4 übereinstimmen, mit denselben Be­ zugsziffern gekennzeichnet. Sie werden nicht näher erläu­ tert.

Nach Fig. 1 ist eine Halterung 18 vorgesehen, die den schwenkbaren Objektivrevolver 14 trägt und zur Scharfein­ stellung vertikal verschoben werden kann, und zwar durch Zusammenwirken einer Zahnstange 18a, die an der Halterung 18 befestigt ist, mit einem Ritzel 19, das durch die Betä­ tigung einer nicht dargestellten, am Mikroskopkörper ange­ ordneten Einrichtung zur Vertikaleinstellung drehbar ist. Bei dieser Ausführungsform ist der Mikromanipulator 16 an der Halterung 18 über eine Halterung 20 befestigt, wobei die gläserne Nadel 16a mit dem Körper des Mikromanipulators über einen T-förmigen Arm 16b in Verbindung steht. Die Spitze der Nadel liegt innerhalb des Tiefenschärfenbereichs des Scharfeinstellungspunktes, der sich auf der Zelle 11a innerhalb des Kulturbehälters befindet.

Wenn mit dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform bei­ spielsweise das oben erwähnte Punktieren durchgeführt wer­ den soll, bei dem die gläserne Nadel 16a in die Zelle 11a eindringt, um die Zelle mit dem in der Kulturflüssigkeit enthaltenen Enzym zu imprägnieren, so wird zuerst die nicht dargestellte, am Mikroskopkörper angeordnete Einrichtung für die Vertikalverschiebung betätigt, um das Ritzel 19 zu drehen und dadurch die Halterung 18 vertikal zu verstellen, so daß eine Scharfeinstellung auf die im Kulturbehälter 11 befindliche, zu punktierende Zelle erfolgt. Sodann wird ein Vertikal-Antrieb 16C des Mikromanipulators betätigt, um die Spitze von dessen gläserner Nadel 16a auf einen Punkt ge­ ringfügig oberhalb der Zelle 11a, also innerhalb des Tie­ fenschärfenbereichs, einzustellen. Wenn man anschließend die am Mikroskopkörper angeordnete Einrichtung zur Verti­ kalverstellung bedient, um die Halterung 18 geringfügig nach unten zu bewegen, so wird in Verriegelung mit dieser nach unten gerichteten Verschiebung der Halterung 18 auch die gläserne Nadel 16a des Mikromanipulators 16 nach unten bewegt. Sie dringt in die Zelle 11a ein, um diese zu imprä­ gnieren. Wird dann die am Mikroskopkörper angeordnete Ein­ richtung zur Vertikalverstellung in ihre Ursprungsposition zurückgestellt, so kehren die Halterung 18 und der Mikro­ manipulator 16 in ihre jeweiligen Stellungen, die sie vor der Abwärtsbewegung einnahmen, zurück. Man verschiebt so­ dann den Objekttisch 10 in horizontaler Richtung, so daß die als nächste zu punktierende Zelle in die optische Achse des Mikroskops gelangt. Anschließend wiederholt man den obigen Vorgang, um die Zelle zu punktieren. Es sei angenom­ men, daß die Bodenfläche des Kulturbehälters nicht eben ist, daß sich der Wuchs der Zellen innerhalb des Kulturbe­ hälters nicht gleichförmig über dessen Bodenfläche ausbrei­ tet und daß daher die Positionen der jeweiligen Zellen in der optischen Achse voneinander abweichen. Wenn jedoch er­ findungsgemäß die am Mikroskopkörper angeordnete Einrich­ tung zur Vertikalverstellung betätigt wird, um die Halterung 18 vertikal zu verschieben und dadurch eine Scharfeinstel­ lung auf das Objekt 11a vorzunehmen, so verschiebt sich der Mikromanipulator 16 in Verriegelung mit der vertikalen Be­ wegung der Halterung 18 ebenfalls in vertikaler Richtung, wobei sich die Spitze der gläsernen Nadel 16 immer gering­ fügig oberhalb des Scharfeinstellungspunktes befindet, also innerhalb des Tiefenschärfenbereichs. Selbst wenn also die Lage der Zelle in Richtung der optischen Achse abweicht, so wird durch die Scharfeinstellung die Spitze der gläsernen Nadel 18a des Mikromanipulators 16 immer in die korrekte Position gebracht. Auch kann durch Verwendung der Ring­ blende 12a im vorderseitigen Brennpunkt des Kondensors 12 und der Phasenplatte 15 im rückwärtigen Brennpunkt des Ob­ jektivs 13 eine Phasen-Kontrast-Mikroskopie durchgeführt werden. Geht man also in dieser Weise vor, so läßt sich eine Manipulation, wie etwa ein Punktieren, derart durch­ führen, daß man den Vertikal-Antrieb 16c des Mikromanipula­ tors 16 betätigt.

Fig. 2 zeigt eine Ausführungsforn nach der Erfindung, mit der eine Differential-Interferenz-Mikroskopie möglich ist. Im Linsenstutzen des Kondensors 12 sind ein Polarisator 21 und ein Nomarski-Prisma 22 eingebaut. Ferner sind ein No­ marski-Prisma 23 und ein Analysator 24 in einem Einsatz 25 auf der rückwärtigen Seite des Objektivs 13 integriert. Im übrigen stimmt die Anordnung mit der Ausführungsform nach Fig. 1 überein. Gemäß Fig. 2 geht das Beleuchtungslicht durch den Polarisator 21 und das Nomarski-Prisma 22 hin­ durch, beleuchtet dann durch den Kondensor 12 die Zelle 11a innerhalb des Kulturbehälters 11, durchdringt das Objektiv 13 und dann das Nomarksi-Prisma 23 sowie den Analysator 24 innerhalb des Einsatzes 25 und wird schließlich in das Oku­ larsystem eingeleitet. Die Feinstruktur der Zelle 11a in­ nerhalb des Kulturbehälters 11 kann also als Interferenz­ bild mit Interferenzkontrast und dreidimensionalem Eindruck betrachtet werden, ähnlich dem Reliefeffekt einer Schattie­ rung beispielsweise in einem Elektronenmikroskop. Die Aus­ führungsform nach Fig. 2 ist also insbesondere im Hinblick auf Helligkeit, Auflösungsvermögen und Kontrast vorteilhaft im Falle einer Manipulation, bei der beispielsweise eine Injektion in den vorderen Keimabschnitt der Zelle vorgenom­ men wird.

In der obigen Beschreibung wurde als mögliche Manipulation das Punktieren von Zellen innerhalb eines Kulturbehälters beschrieben, der auf dem Objektträger angeordnet ist. Er­ sichtlich kann die vorliegende Erfindung auch auf ein umge­ kehrtes Mikroskop mit einem Mikromanipulator Anwendung fin­ den, das nicht nur dem oben beschriebenen Einsatz dient, sondern sich für verschiedene andere minutiöse Manipulatio­ nen an zu betrachtenden Objekten auf dem Objekttisch eignet.

Claims (2)

1. Umgekehrtes Mikroskop, bei dem ein zu beobachtendes Ob­ jekt (11a), das in einem Objektträger (11) auf einem Ob­ jekttisch (10) angeordnet ist, mit einem Objektiv (13) durch die Unterseite des Objektträgers hindurch beobachtet wird, und bei dem zum Durchführen von Mikromanipulationen in dem zu beobachtenden Objekt (11a) ein Mikromanipulator (16) mit einem nadelförmigen Miniaturwerkzeug (16a) vorge­ sehen ist, dessen Spitze im optischen Strahlengang zwischen einem Kondensor (12) und dem Objektträger (11) angeordnet ist und das in Verriegelung mit einem in Richtung der opti­ schen Achse des Objektivs (13) bewegbaren Mikroskopbauteil bewegbar ist, dadurch gekennzeichnet, daß der das Miniaturwerkzeug (18a) tragende Mikromanipula­ tor (16) sich an der Oberseite des Objekttisches (10) um diesen herum zu dessen Unterseite erstreckt und an der Un­ terseite des Objekttisches (10) mit einer Halterung (18) für einen das Objektiv (13) tragenden Objektivrevolver (14) fest verbunden ist, daß beim Scharfstellen des Objektivs (13) auf das zu untersuchende Objekt (11a) vermittels einer Vertikalverstelleinrichtung (18a, 19) das Miniaturwerkzeug (16a) in die Manipulationsposition gelangt, wenn das Objek­ tiv (13) in seine Scharfstellung gelangt, und daß der Mi­ kromanipulator (16) in Richtung der optischen Achse des Ob­ jektivs (13) relativ zum Objekt (11a) zusätzlich verschieb­ bar gelagert ist.

2. Umgekehrtes Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß ein Objektiv (13) des Objektivrevolvers (14) mit einem Normarski-Prisma (23) und einem Analysator (24) ausrüstbar ist, um eine Differential-Interferenz-Mikros­ kopie zu ermöglichen.