DE3408358A1

DE3408358A1 - Verfahren zur bestimmung der oxidationsaktivitaet einer biologischen fluessigkeit und dazu geeignetes reagens

Info

Publication number: DE3408358A1
Application number: DE19843408358
Authority: DE
Inventors: Michele Neapel/Napoli Testa
Original assignee: Savapa Srl
Current assignee: Savapa Srl
Priority date: 1983-03-07
Filing date: 1984-03-07
Publication date: 1984-09-13
Also published as: JPS59210367A; AU2524284A; IT1194149B; IT8319932A1; GB8404885D0; ES8500457A1; ES530304A0; FR2542449A1; IT8319932A0; GB2136122A

Description

PATENTANWÄLTE
Dipl.-Ing. H. MITSCHERLICH Dipl.-Ing. K. GUNSCHMANN Dipl.-Ing.Dr.rer.nat. W. KÖRBER Dip!.-Ing. J. SCHMIDT-EVERS Dipl.-Ing. W. MELZER EUROPEAN PATENT ATTORNEYS Telefon (089) 29 66 84-86 Telex 523155mitshd Telegramme Patentpaap Telecopier (089) 29 39 63 Psch-Kto. Mchn. 195 75-803 EPA-Kto. 28 000 206

Steinsdorfstraße 10 D-8000 München 22

7. März 1984

SAVAPA S.r. 1. Via Tasso 428 F

Napoli / Italien

Verfahren zur Bestimmung der Oxidationsaktivität einer biologischen Flüssigkeit und dazu geeignetes

Reagens

Verfahren zur Bestimmung der Oxidationsaktivität einer biologischen Flüssigkeit und dazu geeignetes Reagens.

Die Erfindung betrifft ein sehr einfaches, leicht reproduzierbares Verfahren zur Bestimmung der Oxidationsaktivität einer biologischen Flüssigkeit (BLOA). Der Begriff "Oxidationsaktivität", wie er in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, bedeutet die Senkung des Gehalts an SH- Gruppen, die in den Proteinen vorliegen und aus in biologischen Flüssigkeiten vorliegenden Substanzen entstehen.

Der Ausdruck "biologische Flüssigkeit"bedeutet Blut, Serum oder äußerliche Drüsenabscheidungen, wie Speichel oder Tränen.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung vom Reagens für die oben angeführte Bestimmung sowie das dabei entstehende Produkt.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Bestimmung der potentiellen therapeutischen Aktivität eines pharmazeutischen Mittels auf die Oxidationsaktivität von

²^ biologischen Flüssigkeiten (BLOA) eines Patienten, welchem das pharmazeutische Mittel verabreicht worden ist. Weitere Gegenstände der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung.
In den letzten Jahren haben viele Forscher ihre Arbeit und Beobachtungen auf den Gehalt an SH-(=Sulfhydryl-)Gruppen ausgerichtet, die im Blut, Serum und biologischen Flüssigkeiten oder Geweben im allgemeinen vorhanden sind. Insbesondere hat der Anmelder in Zusammenarbeit mit anderen Forschern in "Experimental Eye Research", Seiten 276- 290, Band 7(1968), eine Arbeit veröffentlicht über die Oxidationswirkung auf die SH- Gruppen der in Augenlinsen vorhandenen Proteine, und zwar unter Verwendung eines amperometrischen Meßsystems. Andere Autoren haben Methoden zur Bestimmung der SII-Gruppen im Blut und Serum untersucht. Eine 'besonders in-

teressante veröffentlichte Arbeit betrifft das analytische System, welches von G. Ellman und H. Lysko in "Analytical Biochemistry",Band 93, Seiten 98- 1o2, 1979 , vorgeschlagen wurde; dabei wird Gebrauch gemacht von 5,5 -Dithiobis-2- nitrobenzoesäure (D.TNB), N-Ethylmaleinsäureimid (NEM) und Nitrothiobenzoat (NTB). Diese Methode ist sehr genau, aber erfordert geschicktes Handhaben der Muster und sehr genaue Aufmerksamkeit bei der Ausführung der verschiedenen Arbeitsschritte. Im Hinblick auf die Wichtigkeit der Bestimmung der obengenannten SH- Gruppen besteht ein dringendes Bedürfnis nach einer einfachen, aber genauen Bestimmungsmethode, die für die damit befaßten Kräfte ein geeignetes Instrumentarium darstellt.

Der Anmelder hat nun eine sehr einfache Bestimmungsmethode gefunden, welche auf der Verwendung von Augenlinsen von Säugetieren basiert.

Demeri?sprechend ist ein wesentlicher Teil der Erfindung die Herstellung des obengenannten Reagens und dessen Verwendung für die Bestimmung der Oxjdationsaktivität einer biologischen Flüssigkeit (BLOA).

Die Erfindung beruht auf der Feststellung, daß biologische Flüssigkeiten eine Oxidationsaktivitä'jj (BLOA) aufweisen, die auf noch nicht identifizierte Substanzen in ihnen zurückzuführen sind, welche fähig sind zur Oxidation der SH- Gruppen in den löslichen Proteinen der Augenlinsen von Säugetieren. ι ;

Dementsprechend wird ein Homogenisat hergestellt aus den vorgenannten Linsen und als spezifisches Reagens für die _n Bestimmung der Oxidationsaktivität -von biologischen Flüssigkeiten (BLOA) verwendet. Das Linsenhomogenisat .wird hergestellt durch Entnahme der Augen von den Säugetieren innerhalb einer Stunde nach dem Schlachten, Entfernen der Augapfel-Kapseln (capsules) und Epithelgewebje und Homogenisieren des Restes mit einer Pufferlösung bei einem pH-Wert

zwischen 7 und 9 bei einer Temperatur unterhalb 10⁰C, besonders nahe O⁰C.

Die bevorzugte Pufferlösung ist eine 0,05 M wäß^rige Lösung von 2- Amino-2-hydroxymethylpropan-1,3-diol als Hydrochlorid (TRIS).

Die Pufferlösung wird stabilisiert gegen bakteriellen Bewuchs durch Zugabe einer kleinen Menge an Natriumazid, üblicherweise 0,01 bis 0,05 Gewichtsprozent der Lösung. Das erhaltene Homogenisat wird gereinigt durch Zentrifugieren der in Suspension befindlichen Materialien und anschließende Dialyse in den herkömmlichen Dialyserohren, wobei die Dialysierlösung_/die gebraucht wird, dieselbe ist wie für die Homogenisierung^edoch mit Zusatz geringer Mengen von Thymol, normalerweise von 1oo bis 1 000 ppm.

Der Dialysevorgang wird durchgeführt bei Temperaturen unterhalb 1O⁰C, vorzugsweise nahe O⁰C; die Dialysierlösung wird solange wiederholend gewechselt bis die Nichtprotein-SH- Gruppen verschwinden aus/dem Homogenisat, das dialysiert worden ist(dialysiertes Homogenisat).

Das Verschwinden der Nichtprotein- SH- Gruppen aus dem dialysierten Homogenisat wird geprüft durch Bestimmung der SH- Gruppen in der oberen Flüssigkeitsschicht eines Musters vom Dialysat nach Behandlung mit einer konzentrierten wässerigen Lösung von Trichloressigsäure und unter Verwendung der kolorimetrischen Reaktion mit D.TNB und NEM.

Die Dialyse dauert normalerweise 36 bis 50 Stunden und die Dialyselösung wird dreimal gewechselt. Auf diese V/eise wird das Homogenisat befreit von allen niedermo- .

lekularen Substanzen, welche in der Pufferlösung löslich sind, einschließlich denjenigen, die SH- Gruppen enthalten und die Genauigkeit während der folgenden Verwendung des Homogenisats als Reagens verminfern. Das reaktive Homogenisat ist dann fertig für die Anwen- · dung und wird "in vitro" unverändert aufbewahrt bei Tem-

peraturen unterhalb -15°C oder wird gefriergetrocknet nach üblichen Methoden des Gefriertrocknens von Proteinen nach der Entfernung der anorganischen Salze durch eine Dialyse mit Wasser.

Bei der Aufbewahrung bei niedriger Temperatur bleibt das Reagens für mindestens zwei Monate aktiv; gefriergetrocknet kann es noch nach einem Jahr gebraucht werden. Das Homogenisat kann hergestellt werden aus den Augenlinsen (cristal lenses) von Säugetieren. Die für die. Zwecle der Erfindung bevorzugten Säugetiere sind Rinder, Kaninchen und Mäuse auf Grund der Leichtigkeit ihrer Beschaffung entweder in Schlachthäusern durch die Nahrungsmittelversorgung für den menschlichen Bedarf oder in biologischen Forschungslaboratorien.

Natürlich kann das Reagens gemäß der Erfindung auch unter Verwendung von Augen anderer Tiere hergestellt werden, vorausgesetzt es sind Säugetiere.

Bei der typischen Verwirklichung der Erfindung wird das in der beschriebenen Weise hergestellte Homogenisat verwendet als Reagens durch Mischen desselben mit der zu untersuchenden Substanz, zB der biologischen Flüssigkeit, in der folgenden Weise:

Eine kleine Menge des Homogenisats, gewöhnlich einige Mikroliter, wird gemischt mit der zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit, normalerweise im Verhältnis von 1 bis 4 Volumenteilen; daraufhin wird .gereift (incubated) bei einer Temperatur von 10 bis 40 C während einer Zeit von 4 bis 20 Stunden. Danach werden wenige ml von DTNB zugesetzt und die Probe während 15 Minuten bei Raumtemperatur belassen; danach erfolgt eine kolorimetrische Ablesung der Lichtabsorption bei 41o nmi(oder ein Vergleich gegenüber einer vorher hergestellten Farbskala). Danach werden einige Mikroliter von NEM zugesetzt und die kolorimetrische Ablesung nach 2o Minuten wiederholt. Die Differenz zwischen beiden Werten stellt den Gehalt an SH-

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Gruppen im Muster dar.

Derselbe Arbeitsvorgang wird wiederholt mit einem entsprechenden Muster, das nicht gereift, worden ist; dadurch erhält man einen Vergleichswert.

Der Prozentsatz zwischen dem Wert der "gereiften Probe und der nicht '..gereiften. Probe stellt dann das Oxidationsvermögen der biologischen Flüssigkeit (BLOA), die zu untersuchen ist, dar.
In Hinsicht auf die Gültigkeit der vorgenannten Methode und die große Leichtigkeit ihrer Anwendung war der Anmelder in der Lage, eine eingehende Untersuchung durchzuführen bezüglich der Oxidationskapazität einer biologischen Flüssigkeit (BLOA) und einer sehr verbreiteten Augenkrankheit, nämlich grauer Star (Linsenstar).

Die Entstehung des grauen Stars beim Menschen wird gegenwärtig drei Mechanismen zugeschrieben, die durch verschiedene Forscher gut bewiesen sind: ein Wechsel in der. Undurchdringlichkeit der Linsenmembranen, Denaturieren der Linsenproteine und Oxidation derselben unter Bildung unlöslicher Aggregate.

Demensprechend gab es kürzlich eine Reihe von Studien und Arbeiten mit dem Ziel der Behandlung vom grauen Star mit Arzneimitteln, die einen antioxidierenden Effekt auf die SH- Gruppen in den Proteinen haben, um so dem Denaturieren der Proteine entgegenzuwirken und ^ie Membranen zu stabilisieren.

In "The Lancet", 10.April 1982, Seiten 849" 850, hat der Anmelder zusammen mit anderen eine Versuchsstudie veröffentlicht über die Verwendung von "Bendazac" zur Behandlung vom grauen Star.

Ein enormes Interesse auf diesem Gebiet wurde erweckt durch die Möglichkeit der Behandlung vom grauen Star in einem fortgeschrittenen Stadium und des Erreichens eines Zurückgehens vom beginnenden subkapsulären grauen Star.

Anfänglich wurde angenommen, daß "Bendazac" aktiv wäre

auf Grund seiner ihm zugeschriebenen starken anti-denaturierenden Wirkung auf die Proteine.

Der Anmelder führte die Forschung auf diesem Gebiet weiter und widmete seine Aufmerksamkeit auf Arzneimittel mit ähnlichen Eigenschaften, dh entzündungshemmende., nicht steroide. Arzneimittel(AINS).

Der Anmelder hat so durch seine eigene Forschung festgestellt, daß es da eine Wechselwirkung zwischen grauem

der
Star und/Oxidationsaktivität von biologischen Flüssigkeiten (BLOA) gibt, wie sie bestimmt und beschrieben ist gemäß der erfindungsgemäßen Methode. Er hat so ermittelt, daß AINS- Arzneimittel; eine positive Wirkung bei der Behandlung von grauem Star haben,, besonders bei fortgeschrittenem grauen Star sofern sie fähig sind,die Oxidationsaktivität von biologischen Flüssigkeiten (BLOA) nach der Verabreichung an den Patienten zu mindern. Es wird angenommen, daß die Inaktivität von AINS- Arzneimitteln, die nicht die Oxidationsaktivität biologischer Flüssigkeiten (BLOA) vermindern, zurückzuführen ist auf rait dem Stoffwechsel zusammenhängende Gründe oder andere Substanzen oder Arzneimittel, welche auf die Leber irgendwie unter Bildung aktiver Stoffwechselprodukte oder direkt zB auf die vom grauen Star beeinflußten Linsen durch konkurrierende Einflüsse einwirken.

Diese Mechanismen können so erklären, warum einige AINS zu weniger als 50% wirksam sind bei Patienten, die an Stoffwechselkrankheiten, wie Diabetis, leiden oder die gleichzeitig mit anderen Arzneimitteln behandelt werden, insbesondere mit psychotropen Arzneimitteln, oder die besondere Augenbedingungen, wie schwere Kurzsichtigkeit oder grünen Star haben.

Dementsprechend ist es bei der Auswertung der Behandlungsmöglichkeit von grauen Star wesentlich, einen Test zu besitzen, mit dem festgestellt werden kann, ob das ausgewählte Arzneimittel auch eine Heilwirkung hat. Dieser

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Test ist ein wesentlicher Gegenstand der Erfindung.

Dieser Test ist sehr einfach und besteht in der Behandlung des zu untersuchenden Patienten mit dem Arzneimittel, welches als geeignet für die Behandlung vom grauen Star angesehen wird, und in der Messung der Veränderung der Oxidationsäktivitat von biologischen Flüssigkeiten (BLOA) des Patienten vor und nach der Verabreichung des Arzneimittels, wobei die Meßmethode gemäß dem ersten Teil der Beschreibung verwendet wird. Das Arzneimittel wird dem Patienten verabreicht in der normalen Handelsform und in der minimalen Menge der normalen Dosis, wie sie in der der Packung beiliegenden Instruktion angegeben ist.
Zwei Stunden nach der Verabreichung des Arzneimittels wird eine Probe einer biologischen Flüssigkeit vom Pa-

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tienten genommen und verwendet für die Bestimmung des BLOA- Wertes. Wenn derBLOA- Wert abgenommen hat, ist das Arzneimittel potentiell aktiv für die Behandlung vom grauen Star, wohingegen bei unverändertem BLOA- Wert keine Wirkung in der Behandlung gegeben ist.

Es ist so durch Testen der verschiedenen Arzneimitteltypen möglich, das für den in Untersuchung befindlichen Patienten geeignete Medikament auszuwählen, das heißt, daß die Behandlung selektiv sein kann unter Berücksichtigung der individuellen Reaktion jedes Patienten auf das Arzneimittel.

Die therapeutische Bedeutung dieses Verfahrens ist klar, da es ja den Arzt mit einer unersetzbaren Leichtigkeit in die Lage versetzt, eine so komplexe und verbreitete Krankheit wie grauen Star zu bahendeln.

Es wurde dabei gefunden, daß die Reaktionen eines vorgegebenen Arzneimittels von einem zum anderen Patienten beträchtlich variieren und daß nur Patienten mit einem entsprechenden Reaktionsvermögen, das heißt Patienten,

og die bei den vorgenannten Tests eine Abnahme des BLOA-Wertes auf Grund des verabreichten Medikaments zeigen, auch eine Besserung des,grauen Stars auf Grund der medikamentösen Behandlungfhaben werden.

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So wurde völlig unerwartet und überraschend gefunden, daß die entzündungshemmende Wirkung von AINS- Medikamenten nicht deren Wirkung gegen den grauen Star bedingt und daß'sogar einige Arzneimittel mit niedriger entzündungshemmender Wirkung sehr viel effektiver bei der Behandvom grauen Star sind als andere ähnliche Mittel mit einer hohen entzündungshemmenden Wirkung. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung klarer ohne sie irgendwie einzuschränken. Beispiel 1

50 Kälberaugen wurden unmittelbar nach dem Schlachten entnommen. Sobald sie entfernt waren, wurden die Augen in eine Mischung aus Eis und Wasser eingetaucht und zu dem laboratorium gebracht, wo die Linsen entnommen und von den Kapseln befreit wurden.

Each ihrer Entnahme werden die Linsen homogenisiert, indem sie in einem Potter- Elvehejm- Glashomgenisator in ein auf O⁰C gehaltenes Bad eingetaucht und mit 125ml einer 0.05M wässerigen Pufferlösung von TRIS, welche 0,03% Natriumazid enthält und einen pH von 8,2 hat, gemischt.

Das Hom^.ogenisat wird dann zentrifugiert mit 6.000 UpM während 30 Minuten, um so eine vollständige Entfernung von jedem unlöslichen Material zu .-erreichen; hierbei ist darauf zu achten, daß die Temperatur immer unter 10⁰C bleibt.
Nach dieser Reinigung wird das Homogenisat in einen KoI-

lodium- Dialysator gebracht und mit der Pufferlösung wie sie für die Homogenisierung gebraucht wurde - dia-

OQ lysiert, wobei die Pufferlösung noch 50 ppm Thymol als Bakteriostatikum enthielt.

Die Dialyse wird ausgeführt bei 5⁰C unter Verwendung von 2 Liter der Pufferlösung, die alle 12 Stunden erneuert wird.

Nachdem die Pufferlösung zum dritten Mal entfernt wor-

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den ist, wird eine kleine Probe des Homogenisats genommen und mit 5o%iger Trichloressigsäure versetzt. Die Abwesenheit von nicht- proteinischen SH- Gruppen wird bestätigt durch eine kolorimetrische Bestimmung unter Verwendung von DTNB und NEM mittels einer Probe aus der oberen Flüssigkeitsschicht.

Die Protein- Konzentration im erhaltenen Dialyse- Homogenisat liegt, gemessen nach der Methode von Warburg und Christian, bei 17j6 %.

Das Homogenisat wird dann aus dem Dialysiergefäß in einen Glasbehälter überführt und bei -20⁰C aufbewahrt. Seispiel 2

Die im Beispiel 1 beschriebene Arbeitsweise wird wiederholt unter Einhaltung aller sonstigen Bedingungen, nur werden 10 Augen von Kaninchen verwendet.

Die Linsen werden homogenisiert mit 5· ml Pufferlösung bei jeder Erneuerung.

Das erhaltene Dialyse- Homogenisat hat einen Protein- Gehaltyon 18 %,

Beispiel 5

Das Verfahren gemäß Beispiel 1 wird mit denselben Arbeitsmethoden wiederholt, jedoch unter Verwendung von 60 Augen von Mäusen.
Die Linsen werden homogenisiert mit 5 ml Pufferlösung und dialysiert mit 8o ml Pufferlösung bei jeder Erneuerung. Das erhaltene dialysierte Homogenisat hat einen Protein-Gehalt von 17,2 %.
Beispiel 4

Ein Teil des gemäß Beispiel 1 erhaltenen Dialyse- Homogenisats wird mit derselben Pufferlösung wie für die Homogenisierung verdünnt, und zwar bis der Protein-' Gehalt 3 mg/ml beträgt.

8 mikroliter des verdünnten Homogenisats werden gemischt mit 42 mikroliter Serum, welches klar und nicht hämolysiert ist und durch einfache Koagulation einer Blutprobe

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gewonnen wurde; das Mischen wird ausgeführt in einer Kunststoffzelle für spektrometrische Messungen. Die Zelle wird geschlossen und gereift bei 35⁰C während 4 Stunden. Nach der Reifung werden 2 ml DTNB zugesetzt. Dann wird eine erste Messung der Lichtabsorption gemacht gemäß der Methode von Ellman und Ly&o unter Verwendung eines Spektrometers nach Beckmann. Darauf werden 20 mikroliter von NEM zum Inhalt der Zelle zugesetzt und eine weitere kalorimetrische Ablesung gemacht. Die Differenz zwischen den beiden Werten wird als Absorptionswert des Musters festgehalten. Die Arbeitsgänge und Ablesungen werden wiederholt mit einer Probe des mit dem Serum vermischten Homogenisats, jedoch ohne daß eine Reifung erfolgt.

Der prozentuale Unterschied zwischen der nichtgereiften Probe und der'gereiften wurde mit 33,3% gefunden. Dies zeigte die Oxidations- Aktivität vom Serum des Patienten, der sich in Untersuchnung befindet.

Bei einer Wiederholung des beschriebenen Verfahrens wurde eine Serumprobe desselben Patienten untersucht, das aus einer Blutprobe stammte, die zwei Stunden nach der Verabreichung von o,2 g Butazolidin genommen wurde. Der BLOA- Wert wurde mit 20 gefunden.

So konnte ermittelt werden, daß der Patient positiv reagiert auf die Behandlung mit dem Butazolidin- Medikament. Nachdem der Patient 15 Tage mit Butazolidin behandelt worden war, zeigte sich eine deutliche Verbesserung in der Sehkraft, der Augenbrechung und der Durchsichtigkeit der Linsen.

3Q Das Geaamtverfahren zur Bestimmung des BLOA- Wertes bei dem Patienten wurde wiederholt, jedoch unter Verwendung von Speichel des Patienten als biologische Flüssigkeit anstelle des Serums.

Der gemessene BLOA- Wert und die Variation in Abhängigkeit der Verabreichung des Medikaments sind völlig ähnlich wie bei Verwendung von Serum.

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Beispiel 5

Ein klinischer Test wurde gemacht mit 41 männlichen Patienten im Alter zwischen 40 und 65, die an einem zentralen hinteren subkapsulären idiopathischen grauen Star leiden.

Die untersuchten Patienten hatten keine Stoffwechselerkrankungen oder ernsthaften Augendefekte und wurden mit keinen anderen Arzneimitteln während der Beobachtungsperiode behandelt.

IQ Die BLOA- Werte aller in Untersuchung stehenden Patienten wurden gemessen, entweder mittels Serum oder Speichel; sie lagen zwischen 1o und 32, gemessen gemäß der im Beispiel 4 beschriebenen Methode.
Die BLOA- Werte derselben Patienten wurden dann bestimmt jeweils zwei Stunden nach der Verabreichung folgender Medikamente: Bendalina(hergesteilt durch Acraf); Proben (hergestellt durch Boots- Pormenti) und Tantum (hergestellt durch Acraf); alle Mittel wurden in der minimalen Dosis und gemäß Erläuterung im Beipack gegeben.

_on Die gemessene Abnahme in den BLOA- Werten war signifi-

kant, dh mehr als 30 % unterhalb des ursprunglichen Wertes, und zwar bei 7 Patienten mit Bendalina- Behandlung, 14 Patienten mit Proben- Behandlung und 11 mit Tantum-Behandlung. Bei 9 Patienten zeigte sich keine Abnahme im BLOA- Wert.

Daraufhin erfolgte eine therapeutische Behandlung während 20 Tagen, wobei jedem Patienten das Medikament verabreicht wurde, das die größte Abnahme im BLOA- Wert zur Polge hatte.

Die 9 Patienten, die keine Verminderung im BLOA-Wert zeig-30

ten,wurden derart weiterbehandelt, daß jeweils drei mit einem der itex drei Arzneimittel in regelloser Weise versorgt wurden.

Am Ende der Behandlung zeigte sich eine deutliche Verbesserung bei der Seh kraft, der Brechnung und der Durch-

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sichtigkeit der Augenlinsen bei 5 der 7 mit Bendalina be-

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1 handelten Patienten, bei 7 der 14 mit Proben behandelten Patienten und 8 der 11 mit Tantum behandelten Patienten; dahingegen war bei keinem der 9 Patienten, die beim Vorversuch eine Abnahme im BLOA- Wert nicht zeigten, eine

5 sichtbare Verbesserung zu erkennen.

Claims

Patentansprüche;

Verfahren zur Bestimmung der Oxidations- Kapazität einer biologischen Flüssigkeit (BLOA), dadurch gekennzeichnet, daß man zwei Proben der biologischen Plüssigkeit mit einem aus homogenisierten Augenlinsen von Säugetieren gewonnenen Reagens behandelt, die eine Probe bei einer Temperatur von 10⁰C bis 40⁰C während 2o bis 4 Stunden reifen läßt und die andere nicht inkubiert und dann die Differenz der Lichtabsorption der Proben durch kolorimetrische Messung nach Ellman und Lysko ermittelt.
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das als Reagens verwendete Homogenisat aus Linsen von Kälbern stammt.
!5 3. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das als Reagens verwendete Homogenisat aus Linsen von Kaninchen stammt.
4. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das als Reagens verwendete Homogenisat aus

2Q Linsen von Mäusen stammt.
5. Verfahren nach den Patentansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Reifung (incubation) durchgeführt wird bei einer Temperatur von 32°C bis 35 C während 4 Stunden.
6. Verfahren zur Herstellung des Reagens zur Bestimmung der Oxidationsaktivität einer biologischen Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß man die Augen von Säugetieren entnimmt, die Kapseln und epithelischen Gewebe innerhalb einer Stunde nach dem Schlachten entfernt,

__ den Rückstand homogenisiert mit einer Pufferlösung

mit einem pH zwischen 7 und 9 und anschließend - nach Entfernung aller festen suspendierten Teilchen, eine Dialyse durchführt, wobei man die zur Homogenisation verwendete Pufferlösung mit einem Zusatz von 1oo bis 1.000 ppm Thymol einsetzt und darauf achtet, daß alle

Ι Arbeitsschritte bei einer Temperatur unterhalb 1O⁰C durchgeführt werden, sowie die Dialyse solange wiederholt bis keine weitere Reaktion von SH- Gruppen im Rückstand vorliegt und das erhaltene Produkt auf^bewahrt entweder bei einer Temperatur unterhalb -15⁰C oder gefriergetrocknet und gefriergetrocknet bis zur Verwendung beläßt.
7. .Verfahren nach Patentanspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Pufferlösung eine 0,05 M wässerige Lösung von TRIS ist, die noch 0,03 Gew.-% Natriumazid enthält.
8. Verfahren nach Patentanspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Dialyse derart durchgefühert wird, daß die Dialysierlösung wenigstens dreimal erneuert wird und während eines Zeitraumes von nicht weniger als 24 Stunden erfolgt.
9. Verfahren nach Patentanspruch 6, dadurch gekennzeichne_t, daß das für die Entnahme der Linsen verwendete Säugetier ein Kalb ist.
10.Verfahren nach Patentanspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Säugetier ein Kaninchen ist.
11.Verfahren nach Patentanspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Säugetier eine Maus ist.
12.Ein dialysiertes Homogenisat aus Augenlinsen von Säugetieren, geeignet als Reagens zur Bestimmung der Oxidationsaktivität von biologischen Flüssigkeiten (BLOA).
13.Ein dialysiertes Homogenisat nach Patentanspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es bei einer Temperatur Q₀ unterhalb -15⁰C nicht langer als ij' Monate seit seiner

Herstellung aufbewahrt wird.
14.Ein dialysiertes Homogenisat nach Patentanspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es in gefriergetrockneter Form . weniger · als 1 Jahr seit, seiner Herstellung aufbewahrt wird.
15. Ein dialysiertes Homogenisat nach den Patentansprüchen 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es von Kälbern als Säugetieren stammt.
16. Ein dialysiertes Homogenisat nach den Patentansprüchen 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es von Kaninchen stammt.
17. Ein dialysiertes Homogenisat nach den Patentansprüchen 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es von Mäusen stammt.
18. Verfahren zur Bestimmung der therapeutischen Wirksampharmazeutischen Mittels für die nichtlokale Anwendung bei einem an grauen Star leidenden Patienten, dadurch gekennzeichnet, daß die Verminderung der Oxidationsaktivität einer biologischen Plüssigkeit (BLOA) des Patienten gemessen wird, welche durch die Verabreichung des Medikaments verursacht wird.
19. Verfahren nach Patentanspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das pharmazeutische Mittel in der handelsüblichen Form verabreicht wird,und zwar in der Minimaldosis gemäß dem Beipack.
20. Verfahren nach Patentanspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Oxidationsaktivität der biologischen Flüssigkeit gemessen wird vor der Verabreichung des Medikaments und zwei Stunden nach seiner Verabreichung.