JPS59210367A - 生物流体の酸化活性の測定試薬及びその製造方法、及びその測定方法、並びにそれを用いた、医薬の治療活性の評価方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、極めて簡便で容易に再現できる、生物流体
の酸化活性の測定方法に関する。

この明細書において、「酸化活性」とは、生物流体内に
存在する物質によって引き起こされる、タンパク賀に結
合したーＳＨ基の還元を意味する。

「生物流体」という語は、血液、血清、又は、だ液若し
くは涙のような外部腺分泌物を意味する。

この発明はまた、上記測定に用いる試薬及びその製造方
法にも関する。

この発明はまた、薬剤組成物が予め投与された患者から
の生物流体の酸化活性に基づき、その薬剤！ｉ成物の潜
在的な治療活性を測定する方０；にも関する。

この発明の他の主題は、以下の明細書により明らかにな
るであろう。

ここ数年、血液、血清、一般的に言えば生物流体又は組
織中に存在する一３Ｈ（スルフヒドリル）ＵＯの量に関
し、研究者が研究し、注目している。

さらに詳細に言うと、他の研究者と共同して、１［流Ｊ
１１定システムを用いた。・レンズ中に存在するーＳＨ
基の醇化効果に関する研究結果を発表した（Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔａｌ　Ｅｙｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　ｐｐ２
７６−２９０゜ｖｏｌ、　７．　ＩＨ８） 他の著者らは、血液及び血清中のスルフヒドリル基の定
量方法を研究した。発表された研究の中で非常に興味の
あるものの１つは、シー・エルマン（Ｇ、　Ｅｌｌｍａ
ｎ）とエイチ番すスコ（ｌ（、Ｌｙｓｋｏ）とによって
提案された（　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ。

ｖｏｌ、　８３．　ｐｐ　ｌ１８ｉ０２．１９７９）、
５−５−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＮＢ
Ｔ）と、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）と、ニトロチ
オヘンシェードを用いる分析システムである。

この方法は極めて精密であるが、試料の取り扱いに熟練
を要し、種々の操作を極めて悄正に行なわなければなら
ない。

一５Ｈ基の定量の重要性に鑑み、研究機器に適合した、
研究者が自由に使用することかで５る、簡便で正確な−
ＳＨ基の定量方法を提供することが急務である。

出願人は、＠乳動物のレンズを基礎とする試薬を用いた
、極めて簡便な定量方法を発明した。

従って、この発明に必須の特徴の１つは、」二記試薬の
製造及び、生物流体の酸化活性を測定するためのその使
用である。

この発明は、未だ同定されてはいないが生物流体中に存
在し、吐乳動物のレンズ中の可溶性タンパク質中の−Ｓ
Ｈ基を酸化することができる物質に基づき、生物流体が
酸化活性を有するという知見に基づく。

従って、に述のレンズからホモジネートがつくられ、生
物流体の酸化活性を測定する特異的試薬として用いられ
る。レンズのホモジネートは、屠殺後１時間以内に哺乳
動物から眼球を取り、嚢組織及び上皮組織を除去し、残
ったものを１０℃未満、好ましくは０℃付近でＰＨ７な
いし９の緩衝液とともにホモジナイズすることによって
つくられる。好ましい緩衝液は、２−アミノ−２−ヒド
ロキンメチルプロパン−１，３−ジオールヒドロクロリ
ド　（ＴＲＩＳ）の０．０５Ｍ水溶液である。

緩衝液は、通常溶液に対して０．０１ないし００５重量
％の、小品のナトリウムアジドを加えることによって１
細菌に対して安定化される。得られたホモジネートを遠
心して懸濁液を透明化し、従来の透析チューブに入れて
、ホモシネ−ジョンに用いた緩衝液に通常１００ないし
１０００　ｐｐｍの少匿のチモールを加えた液に対して
透析する。

透析操作は、１０℃未満、好ましくは０℃付近の温度下
において行なわれる。透析液は、透析されたホモジネー
ト（透析ホモジネート）から非タンパク性−５Ｈ基が消
失するまで繰り返し取り替える。

透析ホモジネートからの非タンパク性−３Ｈ基の消失は
、トリクロロ酢酸濃水溶液で処理した透析ホモジネート
の試料の上部液層中の一３Ｈ基を、ＤＮＴＥ及びＮＥＭ
による比色反応を用いて測定することによってチェック
される。

透析操作は通常３６ないし５０時間続けられ、透析液は
通常３回替えられる。

このようにして、ホモジネートから、−５Ｈ基を有する
ものも含めて、後にホモジネートを試薬として用いた際
に操作の正確さを低下させることかできる、緩衝液に可
溶性の全ての低分子物質か除去される。

反応性ホモジネートはこの状態でそのまま使用すること
ができ、また、水に対して透析することによって無機塩
を除去した後、−１５°Ｃ未満の温度下で、あるいはタ
ンパク質を凍結乾燥する常法によって凍結乾燥すること
により、変化することなく生体外で保存し得る。

ホモジネートは、哺乳動物からのクリスタルレンズを用
いることによって製造することができる。この発明の目
的にとって好ましい哺乳動物は、ウシ、ウサギ及びマウ
スである。なぜなら、これらの動物は、人間が消費する
食料を供給している屠殺場や、生物学研究所において入
手し易いからである。

もちろん、この発明の試薬は、それか咀１乳動物である
ならば、他の動物の眼球からも製造することかできる。

この発明の典型的な具体例においては、１−述のように
して得たホモシネ−１・を、次のようにして被検試料、
すなわち生物流体と混合することによって試薬として用
いる。

少欲のホモジネート、通常数マイクロリアトルのホモジ
ネートを、生物流体と通常１対４の体積比で混合し、１
０℃ないし４０°Ｃの温度下で４ないし２０時間インキ
ュベートし、その後、数ミリリットルのＤＴＮＢを加え
、試験管を室温に１５分間放置し、４１０ｎｍにおける
吸光度を読み取る（あるいは、予め作成した色スケール
と比較する）。次に、数マイクロリットルのＮＥＭを加
え、２０分後に比色定量を繰り返す。これら２つの読み
の差か試料中の−ＳＨ基の星を表わす。

同じ操作を、インキュベートしていない同様な試料につ
いて行ない、対照値を得る。

インキュベートした試料としない試料とのＪｌｌｌ定値
の百分率差（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎ
ｃｅ）が、被検生物流体の耐化能力（Ｂ　Ｌ　Ｏ’Ａ　
）を表わす。

上述した方法は非常に容易に用いることができるので、
出願人は、生物流体の酸化能力（ＢＬＯＡ）と、極めて
広範な眼球の一疾病である白内障との相互作用を詳細に
研究することができた。ヒトにおける白内障の病因は、
現在、３つのメカニズムによると考えられており、これ
らは多くの研究堪によって多くの文献に記載されている
。３つのメカニズムとは、レンズ膜の不透過性、レンズ
タンパク質の変性、及びレンズタンパク質が酸化して不
溶性の塊を形成することである。

従って、タンパク質の一５Ｈ基の醇化防止作用を有する
薬剤によって、タンパク質の変性を防止して膜を安定化
させて白内障を治療することを目的とする一連の研究が
最近なされた。

最近（Ｔ）ＩＥ　ＬＡＮＣＥＴ、　１９８２年４８１０
日、ｐｐ　ａ４９−８５０）　、出願人と他の渚は、白
内障の治療の、だめのヘンタザク（Ｅｅｎｄａｚａｃ）
の使用に関するパイロンド試験を発表した。

この分野において、非常に進行した段階の白内障の治療
、及び貴下白内障の初期治療の可能性が大きな関心を呼
んでいる。

められた強力な抗変性作用の故に活性であるのであろう
と考えられた。

出願人は、同様な性質を有する他の薬剤、すなわち、抗
炎症非ステロイド薬剤（ＡＩＮＳ）に注意を向けながら
、この問題を研究した。

出願人は自らの研究により、白内障と、この発明の方法
によって測定される生物流体の酸化活性との間に関係が
あることを発見した。すなわち、ＡｌＮ５薬剤は、白内
障、さらに詳細に言うと進行性白内障の治療にとって治
効であるか、その有効性は、患者に投与されたときに生
物流体の酸化活性を減少させることができる場合に限ら
れる。

生物流体の酸化活性を低ドさせないＡｌＮ５の不活性さ
は、代謝的な理由又は他の物質や薬剤が、肝臓゛に作用
しく活性な代謝生産物の生成）若しくはレセプター、す
なわち、白内障をわずらったレンズに作用（競合作用）
することによると考えられる。

この１！構によると、糖尿病のような代謝疾病を患って
いる患者に投与した場合や、他の薬剤、特に向精神剤と
回持に投与した場合や、強度の近視や緑内障のような特
殊な目の状態を有しているｊＱ　４に投与した場合のＡ
ｌＮ５の有効性が５０％未満であることか説明される。

従って、白内障治療の可能性を評価するにあたり１拍療
のために選ばれた薬剤が、治療効果を有するかどうかを
予め試験しなければならない。

この試験がこの発明の必須的な特徴である。

この試験は非常に単純である。この試験は、白内障の治
療に使用されるであろう被検薬剤を患者に投与し、この
明細書の最初の部分で説明した測定方法を用いて、薬剤
の投与前後の生物流体の醇化活性（以下、Ｂ　ＬＯＡと
いう）の変化を測定することからなる。

被検薬剤は、通常の商業形態で、パッケージに垢付Ｓれ
た使用説明書に記載された通常投与量の最低黴を患者に
投与する。

薬剤投与２時間後、患者から生物流体試料を取り、Ｂ　
ＬＯＡの測定に用いる。もしＢＬＯＡが減少していれば
その被検薬剤は、白内障の治療に潜在的に有効であり、
もしＢＬＯＡが変化していなければその薬剤は白内障の
治療に無効である。

このように種々の型の薬剤を試験することにより、その
患者の治療に適した薬剤を選択することができ、その結
果、それぞれの患者の薬剤治療に対する個々の反応に基
づき治療を選択的にすることができる。

この操作の治療的重要性は明らかである。なぜなら、医
師が、白内障のような複雑で広範な疾病を治療するのが
非常に容易になるからである。

このように、ある薬剤に対する反応は個々の患者によっ
てかなり異なっており、「陽性」の反応、すなわち、上
述の試験においてＢＬＯＡの減少を示した者のみが、そ
の薬剤によって白内障の治療効果を得ることができるこ
とが見出された。

従って、全く驚くべきことに、ＡｌＮ５薬剤の抗炎症力
は、その白内障に°対する治療効果とは無関係であり、
抗炎症力の低い薬剤か、他の類似の抗炎症力の高い薬剤
よりも白内障の治療に関しはるかに優れていることもあ
ることが見出された。

以下の実施例は、この発明の範囲を限定することなくこ
の発明をさらに明確に例示するものである。

Ｌｉ２ユ ５０頭のウシの眼球を屠殺後直ちに取り出した。取り出
した後、できるだけ速やかに眼球を氷と水との混合物に
入れて実験室に運ひ、ここでレンズを取り出し青を除去
した。

嚢を取り除いた後、レンズを０°Ｃに保たれたポッター
ーエルヘヘシュム（Ｐｏｔｔｅｒ−ＥＩｖｅｈｅｊ＋ｅ
）型ガラスホモジナイザー中で０．０３％のナトリウム
アジドを含む０．０５ＨのＴＲｌ５緩衝水溶液（ｐＨ８
，２）Ｘ２５１１１と混合してホモジナイズした。

次にホモジネートを６０００回転で３０分間遠心し、全
ての不溶性成分を完全に除去した。この際、温度が常に
１０℃未満になるようにｒ］、ｅした。

このように透明化した後、ホモシネ−Ｉ・をコロジオン
透析チューブ中に入れ、ホモジネートを、上述のホモジ
ナイズに用いた緩衝液に静菌作ｊとして５０ｐｐｍのチ
モールを加えた液に対して透析した。

透析は２リツトルの緩衝液を用いて５°Ｃで行ない、液
は１２時間毎に取り替えた。

緩衝液を３回取り替えた後、ホモジネートの小品を試料
として取り、　５０％トリクロロ酢酩で処理し、ＤＴＭ
ＮとＮＥＭと試料との発色反応に基づしムで非タンパク
性の一９Ｈ基が存在しな１，１ことを確認した。

得られた透析ホモジネートのタンノくり質濃度をワーブ
ルグとクリスチャン（ＷａｒｂｕｒｇとＣｂｒｉｓｔｉ
ａｎ）の方法で測定したところ１７．６％であった。

ホモジネートを透析チューブからカラス容器に移し、−
２０℃で保存した。

支ｍ １０匹のウサキの眼球を用い、実施例１と同林な操作を
繰り返した。

レンズを５　ｍｌの緩衝液とともにホモジナイズした。

得られた透析ホモシネ−１・は１８％の濃度のタンパク
質を含んでいた。

ｉ亙１ユ ６０匹のマウスを用い、実施例１と同様の操作を行なっ
た。

レンズを５＠１（７）緩衝液とホモジナイズし、１回毎
に８０ｍ１の緩衝液に対して透析した。得られた透析ホ
モジネートは１７．２％のタンパク質を含んでいた。

！」１遣り土 実施例１で得られた透析ホモジネートの１部を、ホモジ
ナイズに用いた緩衝液と同一の緩衝液でタンパク買濃度
が３Ｂ／ｍｌになるまで稀釈した。

８マイクロリツトルの稀釈ホモジネートを４２マイクロ
リツ）・ルの血清（血液試＃１の巾なる凝固によって得
られた透明で溶血していないもの）とと混合した。この
混合は、比色測定のためのプラスチックセルの中で直ち
に行なった。

セルを３５°Ｃで４時間インキユヘートした。インキュ
ヘーション後、２　ｍｌのＩＩＴＩＩＢをセルに加工。

エルマンとリスコ（ＥｌｌｍａｎとＬｙｓｋｏ）の力〃
：によってヘツクマン吸光光度計を用いて吸光度の第１
の測定を行なった。次に２０マイクロリ−／　）ルのＮ
ＥＭをセルに加え、吸光度を測定し、これら２つの吸光
度の差を試料の吸光値として記録した。ホモジネートと
血清を混合し、混合物をインキュベートすることなく同
じ操作及び測定を繰り返した。

インキユベーシヨンしていない試料とした試料の百分率
差（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）は
３３．３％であった。これは、患者の血清の酪化活性（
ＢＬＯＡ）を示している。

同じ患者に０．２ｇのブタソリジンを投与し、２時間後
に採取した血清について全く同じ操作を謹り返したとこ
ろＢ　Ｌ　ＯＡ　値は２０であった。

このように、この患者はブタシリジンの治療に対して陽
性に反応したことか示された。

この患者をブタンリジンで１５日間拍蒸したところ、正
確な視野、ｈ；折力及びレンズの透明性か驚くほど改善
された。

生物流体として血清ではなくだ液を用いて上述したＢＬ
ＯＡ測定力法を方法して行なった。

測定されたＢＬＯＡ値及び、薬剤を投与することによる
その値の変化は、血清から得られた結果と完全に類似し
ていた。

Ｌ五皇王 中心後部貴下白内障を患った４０〜６５才の４１人の男
性患者について臨床試験を行なった。

試験中に調べられた患者は、代謝性疾患や重症の眼疾患
を有しておらず、観察期間中に投与した薬剤と異なる薬
剤による治療は行なわれていなかった。

１−述の実施例４の操作を用いて測定した全ての、巴渚
のＢＬＯＡ値（血清及びだ液について測定し回し患者に
次の薬剤を投句、して２１１″ｆ間後のＢＬＯＡ値もま
た測定した。メサースーアクラフ（Ｍｅｓｓｒｓ、　Ａ
ｃｒａｆ）によってつくられたヘンタリナ（Ｂｅｎｄａ
ｌｉｎａ）　　；ブーツ−７ｔ−メンテ（Ｂｏｏｔｓ−
Ｆｏｒｍｅｎｔｉ）によってつくられたフローペン（Ｆ
ｒｏｂｅｎ）　；及びアクラフ（ＡＧＲＡＦ）によって
つくられたタンタム（Ｔａｎｔｕｌｌ）。これらの薬剤
は、商業用パッケージに記載された操作に従って最小量
投与した。ヘンタリナで処置した患者のうち１人につい
てはＢＬＯＡ値の減少か有意（最初に測定した値よりも
３０％以上低かった）であり、フロペン及びタンタムに
ついてはそれぞれ１４人、１１人か有意のＢＬＯＡ値減
少音減少た。しかしながら、９人の、ル渚はいずれの薬
剤についてもＢＬＯＡ値の減少を示さなかった。

ＢＬＯＡ値の減少を示した。巴者を、減少値の最も大き
かった薬剤で引き続き２０日間治療した。

上記３つの薬剤のいずれを投与した後もＢＬＯＡ値の減
少を示さなかった９人の患者を、上記３つの薬剤のうち
のいずれかをランタムに選んでその薬剤で治療した。

ベンダリナで冶ｆＭした７人のうち５人、フローペンで
治療した１４人のうち７人、タンタムで治療した１１人
のうち８人が、正確な視野、屈折力、レンズの透明性に
ついてｊｊｌ著な治療効果を示した。しかしながら、Ｂ
　ＬＯＡ値の減少を示さなかった９人の患者は、全く治
療効果を示さなかった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）同一の生物流体からなる２つの試料を、哺乳動物
   のレンズのホモジネートを基礎とする試薬で処理し、−
   ブ」の試薬は１０℃ないし４０℃で４ないし２０詩間イ
   ンキュベートし、他方の試料はインキュへ−１・せず、
   既知のエルマンとりスコツ比色方法を用いてこれら２つ
   の試料の吸光度の差を測定することを特徴とする生物流
   体の酸化活性の測定方法。 （２）前記ホモジネートはウシのレンズからつくられる
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 （３ン前記ホモシネ−１・はウサギのレンズがらつくら
   れる特許請求の範囲第１項記載の方法。 （４）前記ホモジネートはマウスのレンズからつくられ
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 （５）前記インキュベーションは３２℃ないし３５℃の
   温度下で４時間行なわれる特許請求の範囲第１項ないし
   第４項のいずれか１項に記載の方θ、。 （６）吐乳動物から眼球を取り、屠殺後ｌ峙ＩＩ以内に
   嚢と上皮を除去し、残液をｐＨ７ないし９の緩衝液と共
   にホモジナイズし、得られた程合物から全ての固形分を
   除いた後、上記ホモジナイズに用いた緩衝液に１００な
   いし１１０００ｐｐのチモールを加えた液に対して透析
   し、得られた生成物を一１５℃未満の温度下で保存し、
   又は凍結転帰して使用昨まで凍結乾燥状態で保つことか
   らなり、この操作は常に１０℃未満の温度下で行ない、
   かつ上記透析は上記残渣中で一５Ｈ基の反応かなくなる
   まで上記緩衝液を取り替えて繰り返し行なわれる、生物
   流体の酸化活性の測定のだめの試薬の製造方法。 （７）上記緩衝液は、　０．０３℃量％のナトリウムア
   シドを含む０．０５Ｍのトリス水溶液である特許シ１）
   求の範囲第６項記載の方法。 （８）前記透析は、透析液を少なくとも３回取り村え、
   全体で２４時間以上行なわれる特許請求の範囲第６項記
   載の方法。 （９）前記哺乳動物はウシである特許請求の範囲第６項
   記載の方法。 （１０）前記１ζａ乳動物はウサギである特許請求の範
   囲第６項記載の方７ノ：。 （１１）前記哺乳動物はマウスである４￥許請求の範囲
   第６項記載の方法。 （＋　２　）　１４ｆｉ乳動物のレンズのホモジネート
   透析物からなる生物流体の醇化活性測定試薬。 （１３）前記試薬は、−１５℃未満の温度下で、製造後
   ３力月以内の期間保存される特許請求の範囲第１２ＲＡ
   記載の試薬。 （１４）前記試薬は、製造後１年以内の期間凍結乾燥状
   態で保存される特許請求の範囲第１２項記載の方　７人
   　。 （１５）前記哺乳動物はウシである特許請求の範囲第１
   ２項ないし１４項のいずれが１項に記載の試薬。 （１６）前記ｉ１ｉ乳動物はウサギである特許請求の範
   囲第１２項ないし１４項のいずれ２１１１９ｊに記・伎
   の試薬。 （１７）前記哺乳動物はマウスである特許＋ｉ／ｉ求の
   範囲第１２項ないし１４項のいずれか１項に記載の試薬
   。 （１８）非局部的に使用される医薬を、を者に投与する
   ことによって引き起こされる。患者の生物流体の酸化活
   性の減少を測定することからなる、上記非局部用医薬の
   潜在的治療活性の評価方法。 （１９）前記医薬は、商業的に通常利用可能な形態で投
   与され、その投与量は、商業用パッケージに添付された
   使用説明書に記載された通常の投与量である特許請求の
   範囲第１８項記載の方法。 （２０）生物流体の醇化活性は、前記医薬を投与−する
   前と、投与後２時間に測定される特許請求の範囲第１８
   項記載の方法。