FR2542449A1 - Procede pour determiner l'activite oxydante d'un liquide biologique, reactif pour sa mise en oeuvre, procede pour la preparation du reactif et utilisation du procede et du reactif - Google Patents

Abstract

PROCEDE ET REACTIF POUR DETERMINER LA CAPACITE OXYDANTE D'UN LIQUIDE BIOLOGIQUE AOLB. ON UTILISE LA METHODE COLORIMETRIQUE CONNUE D'ELLMAN ET LYSKO POUR MESURER LA DIFFERENCE ENTRE L'ABSORPTION DE LA LUMIERE PAR DEUX ECHANTILLONS DU LIQUIDE BIOLOGIQUE TRAITE PAR UN REACTIF A BASE DE CRISTALLINS DE MAMMIFERES HOMOGENEISES, UN ECHANTILLON AYANT ETE SOUMIS A INCUBATION A UNE TEMPERATURE DE 10 A 40C PENDANT UNE DUREE DE 20 A 4H ET L'AUTRE ECHANTILLON N'AYANT PAS ETE SOUMIS A INCUBATION. L'INVENTION COMPREND EGALEMENT LE REACTIF A BASE DE CRISTALLINS DE MAMMIFERES HOMOGENEISES, ET L'UTILISATION DU PROCEDE ET DU REACTIF POUR APPRECIER L'ACTIVITE THERAPEUTIQUE POTENTIELLE D'UN MEDICAMENT SUR UN PATIENT SOUFFRANT DE LA CATARACTE.

Description

La présente invention concerne un procédé très simple, bien reproductible,

pour déterminer l'activité oxydante d'un liquide biologique (AOLB) Elle comprend également un procédé pour préparer le réactif utilisé dans ce procédé de détermination, le réactif lui-même, et l'utilisation du procédé et du réactif

pour déterminer l'activité thérapeutique potentielle d'une compo-

sition pharmaceutique sur l'activité oxydante des liquides biolo-

giques (AOLB) du patient auquel la composition pharmaceutique a

été administrée.

D'autres buts et avantages de l'invention appa-

raitront plus clairement à la lecture de la description ci-après.

L'expression "activité oxydante" telle qu'elle est utilisée dans la présente demande, désigne la diminution de la teneur en groupes -SH fixés sur les protéines, provoquée par des substances présentes dans les liquides biologiques, L'expression "liquide biologique" s'applique au sang, au sérum ou à des sécrétions

de glandes externes comme la salive ou les larmes.

Au cours des dernières années, de nombreux chercheurs ont concentré leur travail et leurs observations sur la quantité des groupes -SH (sulfhydryle) présentsdans le sang, le

sérum et d'une manière générale dans les liquides ou tissus biolo-

giques. Plus particulièrement, la demanderesse, en coopération avec d'autres chercheurs (Experimental Eye Research, pages 276 290, volume 7, 1968) a publié une étude sur l'effet d'oxydation des groupes -SU dans les protéines présentes dans les

cristallins, par utilisation d'un système de mesure ampérométrique.

D'autres auteurs ont étudié des procédés pour déterminer des groupes sulfhydryles dans le sang et le sérum Une publication particulièrement intéressante est celle du système analytique proposé par G Ellman et H Lysko (Analytical Biochemistry, volume 93, pages 98 102, 1979) dans lequel on utilise de l'acide ,5 '-dithiobis-( 2-nitrobenzoique) (DNBT), du N-éthyl maléimide (NEM)

et du nitrothiobenzoate (NTB).

Ce procédé est très exact mais exige une manipu-

lation très soignée des échantillons et une attention très grande

dans les diverses opérations.

Tenu compte de l'importance de la détermination des groupes -SH, il existe donc toujours un problème urgent, à

savoir la mise au point d'un procédé simple et exact de détermina-

tion qui constituerait un instrument de recherche approprié à la

disposition des chercheurs.

La demanderesse a maintenant trouvé un procédé très simple de détermination, procédé qui est basé sur l'utilisation

d'un réactif lui-même à base de cristallins homogénéisés de mam-

mifères.

En conséquence, dans l'un de ses aspects, l'in-

vention concerne la préparation du réactif en question et son uti-

lisation pour la détermination de l'activité oxydante d'un liquide

biologique (AOLB).

L'invention est basée sur la découverte que les liquides biologiques ont une activité oxydante (AOLB) due à des substances non encore identifiées et qui sont capables d'oxyder

des groupes -SH présents dans les protéines solubles des cristal-

lins de mammifères.

En conséquence, on prépare à partir de ces cris-

tallins un homogénéisat qu'on utilise comme réactif spécifique pour

déterminer l'activité oxydante des liquides biologiques (AOLB).

Pour préparer l'homogénéisat de cristallins, on prélève les yeux des mammifères dans un délai de 1 h après l'abattage, on retire les capsules et les tissus épithéliaux et on homogénéise le résidu avec une solution tampon à p H 7 à 9 et à une température inférieure à 10 'C et de préférence voisine de 00 C La solution tampon qu'on

préfère est une solution aqueuse 0,05 M de chlorhydrate de 2-amino-

2-hydroxyméthylpropane-1,3-diol (TRIS).

La solution tampon est stabilisée contre les proliférations bactériennes par addition d'une petite quantité d'azothydrate de sodium, normalement 0, 01 à 0,05 % du poids de la solution L'homogénéisat obtenu est clarifié par centrification des matières en suspension puis dialysé dans des tubes de dialyse classiques, la solution utilisée pour la dialyse étant la même solution tampon que pour l'homogénéisation additionnée toutefois

de petites quantités de thymol, normalement de 100 à 1 000 ppm.

L'opération de dialyse est effectuée à une tem-

pérature inférieure à 100 C, de préférence au voisinage de O C, la solution de dialyse étant changée plusieurs fois jusqu'à ce que les groupes -SH non protéiques disparaissent de l'homogénéisat

soumis à dialyse (homogénéisat dialysé).

On contrôle la disparition des groupes -SH non protéiques de l'homogénéisat dialysé par dosage des groupes -SH dans la couche liquide supérieure d'un échantillon du dialysat homogénéisé traité par une solution aqueuse concentrée d'acide trichloroacétique, en exploitant la réaction colorimétrique avec

le DNTE et le NEM.

L'opération de dialyse dure normalement de 36 à h et la solution de dialyse est changée trois-fois Dans ces conditions, l'homogénéisat est débarrassé de toutes les substances à bas poids moléculaire solublesdans la solution tampon, y compris celles qui contiennent des groupes -SH et qui pourraient diminuer l'exactitude au cours de l'utilisation subséquente de l'homogénéisat

en tant que réactif.

L'homogénêisat réactif est alors prêt à l'utili-

sation et il est conservé à l'état non modifié in vitro à une tem-

pérature inférieure à -15 'C ou il est lyophilisé par les techniques normales de lyophilisation des protéines après élimination des

sels minéraux par dialyse avec de l'eau.

Lorsqu'il est conservé non modifié et à basse température, le réactif reste actif pendant au moins 2 mois; lorsqu'il est lyophilisé, il peut être utilisé pendant plus d'un an. L'homogénéisat peut être préparé par utilisation de cristallins de mammifères Les mammifères préférés pour les buts de l'invention sont les bovins, les lapins et les souris tenu compte de la facilité avec lesquels on peut les obtenir dans des

abattoirs ou dans des laboratoires de recherche biologique.

Naturellement, le réactif selon l'invention peut également être préparé en utilisant les yeux d'autres animaux à

condition qu'il s'agisse de mammifères.

Dans un mode de réalisation typique de l'invention, l'homogénéisat préparé comme décrit ci-dessus est utilisé comme réactif par mélange avec la substance à examiner, c'est-à-dire le liquide biologique, de la manière suivante: une petite quantité d'homogénéisat, en général quelques p, est mélangée avec le liquide biologique à examiner, de manière typique dans le rapport de 1 à 4 en volume, et incubée à une température de 10 à 40 ôC pendant une durée comprise entre 4 et h, on ajoute quelques ml de DNBT, on laisse reposer le tube à essai pendant 15 min à température ambiante et on effectue ensuite une lecture calorimétrique de l'absorption de la lumière à 410 nm (ou bien on compare avec une échelle de couleurs préparée précedemment) On ajoute ensuite quelques pl de NEM, on attend min et on répète la lecture calorimétrique La différence entre les deux lectures représente la teneur en groupes -SH de l'échantillon. On répète le même mode opératoire pour un échantillon analogue non soumis à incubation, en obtenant ainsi

une valeur de référence.

La différence en pourcentage entre les lectures

de l'échantillon incubé et de celui non incubé représente l'acti-

vité oxydante du liquide biologique examiné (AOLB).

Tenu compte qu'on dispose du procédé ci-dessus et qu'il est très facile à appliquer, la demanderesse a pu faire une étude détaillée de l'interaction entre la capacité oxydante d'un liquide biologique (AOLB) et une maladie des yeux très

répandue: la cataracte.

La pathogénèse de la cataracte chez l'homme est attribuée à présent à trois mécanismes qui ont été bien étudiés par de nombreux chercheurs, à savoir, une modification

de l'imperméabilité de la membrane du cristallin, la dénatura-

tion des protéines du cristallin et leur oxydation avec forma-

tion d'agrégats insolubles.

Par suite, on a procédé à une série d'études et de recherches visant à traiter la cataracte par des médicaments ayant un effet anti-oxydant sur les groupes -SH des protéines, afin de s'opposer à la dénaturation des protéines et de stabiliser les membranes. Récemment, la demanderesse et d'autres auteurs ont publié une étude pilote (THE LANCET 10 avril 1982, pages 849 a

850) sur l'utilisation du Bendazac pour le traitement de la cata-

racte. Les études faites dans ce secteur ont connu un intérêt énorme en raison de la possibilité de traiter la cataracte

dans un stade très avancé et d'obtenir une rémission de la cata-

racte sub-capsulaire débutante.

Initialement, on a supposé que le Bendazac était

actif en raison de son fort effet anti-dénaturant sur les protéines.

La demanderesse a procédé à des recherches sur le sujet, en portant son attention sur des médicaments possédant

des propriétés analogues, c'est-à-dire des médicaments anti-

inflammatoires non stéroîdiques La demanderesse a ainsi découvert à la suite de ses recherches qu'il y avait une corrélation entre la cataracte et l'activité oxydante des liquides biologiques (AOLB) déterminée par le procédé selon l'invention décrit ci-dessus On a mis en évidence que les médicaments du type anti-inflammatoire non stéroïdique avaient un effet positif dans le traitement de la cataracte, plus particulièrement de la cataracte progressive, mais

seulement lorsqu'ils étaient capables de diminuer l'activité oxy-

dante des liquides biologiques (AOLB) lorsqu'ils étaient administrés

aux patients.

On pense que l'inactivité des médicaments de ce

genre qui ne diminuent pas l'activité oxydante des liquides biolo-

giques est due à des raisonsmétaboliques ou à d'autres substances ou médicaments agissant sur le foie (formation de métabolites actifs) ou sur le récepteur, c'est-à-dire les cristallins souffrant

de cataracte (effets compétitifs opposés).

Ces mécanismes peuvent donc expliquer comment certains médicaments antiinflammatoires non stéroidiques avaient une efficacité de moins de 50 % sur les patients souffrant de maladies du métabolisme comme le diabète ou sur les patients traités simultanément par d'autres médicaments, plus particulièrement des médicaments psychotropes, ou sur des patients présentant des états oculaires particuliers tels qu'une myopie sévère ou un glaucome. Par conséquent, pour évaluer la possibilité de traitement de la cataracte, il est essentiel de disposer d'un essai permettant de déterminer au préalable si le médicament

choisi pour le traitement a une capacité curative Ce test cons-

titue un objet de l'invention.

Le test est très simple et consiste à traiter le patient examiné par le médicament qu'on suppose utile pour le traitement de la cataracte et à mesurer la variation de l'activité

oxydante des liquides biologiques du patient avant et après admi-

nistration du médicament, en exploitant le procédé de mesure décrit cidessus. Le médicament est administré au patient sous la forme commerciale normale etàla quantité minimale prescrite dans

les instructions figurant dans l'emballage.

2 h après l'administration du médicament, on prélève sur le patient un échantillon de liquide biologique et on l'utilise pour mesure de l'AOLB Si l'AOLB a diminué, le médicament est potentiellement actif dans le traitement de la cataracte alors que si l'AOLB n'a pas changé, le médicament n'a pas d'effet dans le

traitement de la cataracte.

Il est ainsi possible, en soumettant à cet essai divers types de médicaments, de choisir le médicament qui convient pour le traitement du patient examiné, au point que le traitement peut être sélectif par rapport à la réponse individuelle de chaque

patient au traitement par le médicament.

L'importance thérapeutique de cette procédure est claire car elle donne aux médecins une facilité irremplaçable pour le traitement d'une maladie aussi complexe et aussi répandue que

la cataracte.

On a ainsi trouvé que les réactions à un médica-

ment déterminé varaient considérablement d'un patient à l'autre et seuls les patients qui "répondent", c'est-à-dire les patients qui, dans les essais ci-dessus, ont manifesté une diminution de 1 'AOLB résultant du traitement par le médicament, auront des améliorations de la cataracte résultant du traitement par les médicaments en question. On a ainsi trouvé contre toute attente que l'activité anti-inflammatoire des médicaments anti-inflammatoires non stéroldiques n'était pas en relation avec leur-activité sur

la cataracte et que certains médicaments à faible activité anti-

inflammatoire étaient plus efficaces pour le traitement de la ca-

taracte que d'autres médicaments analogues à haute activité anti-

inflammatoire. Les exemples qui suivent illustrent l'invention

sans toutefois en limiter la portée; dans ces exemples les indi-

cations de parties et de pourcentages sont donc en poids sauf

mention contraire.

Exemple 1

On prélève 50 yeux de veaux immédiatement après abattage Aussitôt après prélèvement, les yeux sont immergés dans un mélange de glace et d'eau et portés au laboratoire o on prélève

les cristallins et o on les débarrasse des capsules.

Après avoir retiré les capsules, on homogénéise les cristallins dans un homogénéiseur en verre type Potter-Elvehejm immergé dans un bain maintenu à 00 C et on les mélange avec 125 ml d'une solution aqueuse 0,05 M de TRIS, solution tampon, contenant

0,03 % d'azothydrate de sodium, p H 8,2.

L'homogénéisat est ensuite centrifugé à 6 000 tr/nin pendant 30 min pour élimination complète de toutes les substances insolubles, en veillant à maintenir la température en permanence

en dessous de 10 'C.

Après cette clarification, on place l'homogénéisat dans un tube de dialyse en collodion et on dialyse l'homogénéisat contre la solution tampon utilisée pour l'homogénéisation après

addition de 50 ppm de thymol qui sert d'agent bactériostatique.

La dialyse est effectuée à 50 C à l'aide de 2 1 de solution tampon qu'on renouvelle toutes les 12 h. Après le troisième remplacement de la solution tampon, on prélève un petit échantillon de l'homogénéisat et on traite par de l'acide trichloracétique à 50 %, l'absence des groupes -SIU non protéiques étant confirmés par réaction colorimétrique entre le DTPN et le NEM et la couche surnageante du liquide. La concentration en protéines de l'homogénéisat dialysé obtenue, mesurée par la méthode de Warburg et Christian,

est de 17,6 %.

L'homogénéisat est ensuite transféré du tube

de dialyse dans un récipient en verre et conservé à -20 C.

On répète l'opération décrite dans l'exemple 1,

dans les mêmes conditions, sur 10 yeux de lapins.

Les cristallins sont homogénéisés avec 5 ml de

solution tampon à chaque renouvellement.

L'homogénéisat dialysé obtenu contient 18 % de protéines.

Exemple 3

On répète l'opération décrite dans l'exemple 1,

dans les mêmes conditions, sur 60 yeux de souris.

On homogénéise les cristallins avec 5 ml de solution tampon et on dialyse avec 80 ml-de solution tampon à chaque renouvellement L'homogénéisat dialysé obtenu contient 17,2 % de protéines.

Exemple 4

On dilue une portion de l'homogénéisat dialysé obtenu dans l'exemple 1 par une solution tampon identique à celle utilisée pour l'homogénéisation, jusqu'à une teneur en protéines

de 3 mg/ml.

On mélange 8/ul de l'homogénéisat dilué avec 42 Pl de sérum (clair et non hémolysé, obtenu par simple cpagulation d'un échantillon de sang) le mélange étant effectué immédiatement

dans une cellule de matière plastique pour des mesuresspectrométriques.

La cellule est fermée et soumise à incubation de 4 h à 35 C Après incubation, on introduit dans la cellule 2 mi de DTNB et on procède à une première mesure de l'absorption de

lumière par la méthode d'Ellman et Lysko en utilisant un spectro-

photomètre de Beckmann On ajoute ensuite au contenu de la cellule /il de NEM et on procède à une autre lecture calorimétrique, la différence entre les deux valeurs étant enregistrée et représentant l'absorption de l'échantillon On répète les opérations et les lectures sur un échantillon d'homogénéisat mélangé avec du sérum

mais non soumis à incubation après mélange.

La différence entre l'absorption de l'échantillon non incubé et celle de l'échantillon incubé est de 33,3 %* Ce

chiffre représente l'activité oxydante du sérum du patient (AOLB).

On a répété toute l'opération décrite ci-dessus sur un échantillon de sérum du même patient obtenu à partir d'un échantillon de sang prélevé lui-même 2 h après administration de

0,2 g de butazolidine; on trouve une valeur d'AOLB de 20.

Il est donc clair que le patient répond positi-

vement au traitement par le médicament butazolidine.

Dans ces conditions, le patient a été traité par

la butazolidine pendant 15 jours: on a alors constaté une amélio-

ration marquée de la vision correcte, de la réfraction oculaire et de la transparence du cristallin On a répété parallèlement toute l'opération décrite ci-dessus pour la détermination de l'AOLB du patient en utilisant à la place du sérum la salive du

patient en tant que liquide biologique.

On a constaté que la valeur mesurée pour l'AOLB et sa variation résultant de l'administration du médicament étaient

tout à fait semblablesà celles obtenues avec le sérum.

Exemple 5

On procède à un essai clinique sur 41 patients de sexe masculin âgés de 40 à 65 ans et souffrant de cataracte

idiopathique sub-capsulaire postérieurecentral>.

Les patients examinés au cours de la recherche

n'avaient pas de maladies métaboliques ni de sérieux défauts ocu-

laires et n'étaient pas traités par des médicaments autres que ceux

administrés au cours de la période d'observation.

On a mesuré (sur le sérum ou la salive) les valeurs d'AOLB pour tous les patients examinés et on a trouvé des

valeurs de 10 à 32 par le mode opératoire décrit dans l'exemple 4.

On a également déterminé les valeurs d'AOLB pour

les mêmes patients 2 h après administration des médicaments sui-

vants: Bendalina de la firme Messrs Acraf, Froben de la firme BootsFormenti et Tantum de la firme ACRAF, aux doses minimales

et suivant la posologie indiquée sur l'emballage du commerce.

La diminution des valeurs d'AOLB à la mesure a été appréciable (c'est-àdire que les valeurs étaient inférieures de plus de 30 % aux valeurs mesurées à l'origine) chez 7 patients traités par le Bendalina, 14 traités par le Froben et Il traités par le Tantum; 9 patients ne présentaient aucune diminution de

l'AOLB après administration de l'un quelconque des trois médica-

ments soumis aux essais.

On a fait suivre d'un traitement thérapeutique pendant 20 jours en administrant à chaque patient le médicament

qui avait produit la plus forte diminution de l'AOLB dans l'essai.

Les 9 patients qui n'avaient pas présenté de diminution de l'AOLB après administration des trois médicaments soumis aux essais ont été traités par l'un des trois médicaments

de manière statistique, à raison de 3 patients par médicament.

A la fin du traitement, on a constaté une amé-

lioraticn marquée dans la correction de vision, la réfraction et la transparence des cristallins chez 5 patients sur 7 traités par le Bendalina, 7 patients sur E 14 traités par le Froben et 8 sur 1 l traités par le Tantum; aucun des 9 patients qui n'avait pas présenté de diminution de l'AOLB dans le test préliminaire n'avait

donné de signes visibles d'amélioration.

Claims (14)

R E V E N D I C A T I O N S

1 Procédé pour déterminer la capacité oxydante d'un liquide biologique (AOLB) caractérisé en ce que l'on utilise la méthode colorimétrique connue d'Ellman et Lysko pour mesurer la différence entre l'absorption de la lumière par deux échantil-

long du liquide biologique traité par un réactif à base de cris-

tallins de mammifères homogénéisés, un échantillon ayant été soumis à incubation à une température de 10 à 40 C pendant une durée de

à 4 h, et l'autre échantillon n'ayant pas été soumis à incubation.

2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en

ce que l'homogénéisat est un homogénéisat de cristallins de veau.

3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en

ce que l'homogénéisat est un homogénéisat de cristallins de lapin.

4 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en

ce que l'homogénéisat est un homogénéisat de cristallins de souris.

Procédé selon l'une quelconque des revendica- tions 1 à 4, caractérisé en ce que l'incubation est effectuée à une température de 32 à 35 C pendant 4 h. 6 Procédé pour préparer un réactif pour la mise en

oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5,

caractérisé en ce que l'on prélève les yeux d'un mammifère, on en élimine les capsules et le tissus épithélial dans le délai de 1 h après l'abattage, on homogénéise le résidu avec une solution tampon à p H 7 à 9 et on dialyse le mélange obtenu après élimination des substances solides éventuellement en suspension, avec une solution tampon identique à celle utilisée pour l'homogénéisation, additionnée cependant de 100 à 1 000 ppm de thymol en veillant à maintenir dans toutes les opérations une température en permanence inférieure à O C, on répète l'opération de dialyse après renouvellement de la solution tampon jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de réaction des groupes -SH dans le résidu et on conserve le produit obtenu à des températures inférieures à -15 C ou on le lyophylise et on le conserve

à l'état lyophylisé jusqu'au moment de l'utilisation.

7 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la solution tampon est une solution aqueuse 0,05 M de

TRIS et contient 0,03 %/ en poids d'azothydrate de sodium.

8 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la dialyse est effectuée en renouvelant la solution de

dialyse au moins trois fois et pendant une durée totale non infé-

rieure à 24 h. 9 Procédé selon la revendication 6, caractérisé

en ce que le mammifère est un veau.

Procédé selon la revendication 6, caractérisé

en ce que le mammifère est un lapin.

11 Procédé selon la revendication 6, caractérisé

en ce que le mammifère est une souris.

12 Réactif pour la mise en oeuvre du procédé selon

l'une quelconque des revendications 1 à 5, et préparé par un

procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 11, consistant

en un homogénéisat dialysé de cristallins de mammifères.

13 Réactif selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'on le conserve à une température inférieure à -15 'C pendant une durée ne dépassant pas 3 mois à-partir du moment de

la préparation.

14 Réactif selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'on le conserve à l'état lyophilisé pendant une durée

inférieure à 1 an à partir du moment de la préparation.

Réactif selon l'une quelconque des revendica-

tions 12 à 14, caractérisé en ce que les mammifères sont des veaux.

16 Réactif selon l'une quelconque des revendica-

tions 12 à 14, caractérisé en ce que les mammifères sont des lapins.

17 Réactif selon l'une quelconque des revendica-

tions 12 à 14, caractérisé en ce que les mammifères sont des souris.

18 Utilisation du procédé selon l'une quelconque des

revendications 1 à 5 et du réactif selon l'une quelconque des reven-

dications 12 à 17 pour l'appréciation de l'activité thérapeutique potentielle d'une composition pharmaceutique pour l'utilisation non locale sur un patient souffrant de la cataracte, caractériséeen ce que l'on mesure la diminution de l'activité oxydante d'un liquide biologique (AOLB) du patient, provoquée par l'administration de

ladite composition pharmaceutique.

19 Utilisation selon la revendication 18 caracté-

risée en ce que la composition pharmaceutique est administrée sous la forme normale du commerce et à la dose minimale prescrite dans

les instructions accompagnant l'emballage du commerce.

Utilisation selon la revendication 18, caracté-

risée en ce que l'activité oxydante du liquide biologique (AOLB) est mesurée avant administration de la composition pharmaceutique

soumise à l'examen et 2 h après son administration.