DE3317702A1

DE3317702A1 - Anthracyclinglykoside, verfahren zu deren herstellung und arzneimittel, welche diese enthalten

Info

Publication number: DE3317702A1
Application number: DE19833317702
Authority: DE
Inventors: Alberto Dr. 20146 Milano Bargiotti; Anna Maria Dr. 20133 Milano Casazza; Sergio Dr. 20147 Milano Penco
Original assignee: Farmitalia Carlo Erba SpA 20159 Milano; Farmitalia Carlo Erba SRL
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1982-05-24
Filing date: 1983-05-16
Publication date: 1983-11-24
Also published as: IT8321198A0; SE8302831L; FI75834C; FI831709A0; AU1455483A; IE55231B1; IE831141L; AT380480B; CA1237714A; IT1206116B; SE8302831D0; DK219483D0; US4522815A; AU554416B2; SU1378784A3; DE3317702C2; BE896775A; ATA178083A; IL68720A0; IL68720A

Description

FARMITALIA CARLO ERBA S.ρ.Α., MAILAND / ITALIEN

Änthracyclinglykoside, Verfahren zu deren Herstellung und Arzneimittel, welche diese enthalten

Die Erfindung betrifft ein Verfahrenzur Herstellung
von Anthracyclinglykosiden, Änthracyclinglykoside, die so hergestellt wurden, und Arzneimittel, welche diese enthalten.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung
von Anthracyclinglykosiden der allgemeinen Formel (I) oder der allgemeinen Formel (II)

OH

OK

(I)

(ID

worin R₁ ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxygruppe und R₂ ein Wasserstoffatom oder eine Methoxygruppe bedeuten. Bei dem Verfahren wird ein Anthracyclinon der allgemeinen Formel (III), worin R ein Wasserstoffatom oder eine t-Butyl-diphenyl-siloxy-gruppe darstellt und R_ die oben angegebene Bedeutung hat, mit 3,4-Di-O-acetyl-2, 6-dideoxy-oi- -L-arabino-hexopyranosylchlorid der Formel (IV) kondensiert und dann werden die Acetyl-Schutzgruppe(n) und erforderlichenfalls die t-Butyldiphenyl-sily!-Schutzgruppe aus den gebildeten Anthracyclinglykosiden der allgemeinen Formeln (V) und (VI), worin R und R₂ die vorher angegebenen Bedeutungen haben, entfernt.

Das Verfahren wird im nachfolgenden Reaktionsschema beschrieben:

— 1 1 —

(IV)

(VI )

Entfernung der Schutzgruppen

Die als Ausgangsmaterialien verwendeten Änthraeyclinone . (III) sind die bekannten Verbindungen Daunomycinon (III, R=H, R₂=CH₃O: nachfolgend lila) und 4-Demethoxy-

daunomycinon (III, R=R₃=H: nachfolgend IIIb) und die neuen Verbindungen 14-0-(t-Butyl-diphenyl-silyl)-adriamycinon (III, R=t-Butyl-diphenyl-siloxy, R₃=CH₃O: nachfolgend IHc) und 14-O-(t-Butyl-diphenyl-silyl)-4-demethoxy-adriamycinon (III, R=t-Butyl-diphenyl-siloxy, R₂=H; nachfolgend Illd). Die Verbindungen (IHc) und

t *4 « ν « W V * ■» *» «ι·

! " I I - ^w 3 "5*: ■

- 12 -

(IIId) können durch Kondensation der bekannten Verbindungen Adriamycinon und 4-Demethoxy-adriamycinon mit t-Butyl-diphenyl-chlorosilan in einem Lösungsmittel, wie wasserfreiem Dimethylformamid in Gegenwart einer 5· organischen Base, wie Imidazol/ hergestellt werden. Die t-Butyl-diphenyl-silyl-Schutzgruppe bietet den Vorteil/ dass sie während der Kondensation und der Entfernung der.Acetylschutzgruppe(n) nicht beeinflusst wird und ass man sie leicht durch Behandlung mit Tetran-butylammoniumfluorid abspalten kann. Die anderen Ausgangsmaterialien, der geschützte Chlorzucker (IV), ist eine bekannte Verbindung (H.S. El Khadem et al., Carbohydr. Res. 5_8, 1977, 230).

Die Kondensation kann unter modifizierten Koenigs-Knorr-Reaktionsbedingungen durchgeführt werden, indem man das Anthracyclinon (III) in einem Lösungsmittel, wie Dichlormethan, löst und es mit dem Chlorzucker (IV) in einer heterogenen Phase, katalysiert durch Mercuribromid und Mercurioxid, oder in homogener Phase,katalysiert durch Silbertrifluoromethansulfonat, umsetzt. Man erhält eine Mischung der Anthracyclinglykoside (V) • und (VI). Bei Verwendung des Anthracyclinons (lila) erhält man eine Mischung der Anthracyclinonglykoside (V), R=H, R₂=CH₃O (nachfolgend Va) und (VI), R=H, R₂=CH₃O (nachfolgend VIa). Bei Verwendung des Anthracyclinons (IHb) erhält man eine Mischung der Anthracyclonglykoside (V), R=R₂=H (nachfolgend Vb) und (VI), R=R₂=H (nachfolgend VIb). Bei Verwendung des Anthracyclinons (IIIc) erhält man eine Mischung der Anthracyclinonglykoside (V), R=t-Butyl-diphenyl-siloxy,

(t. ,)« j· ft » * ϊ» Λ f* V * * »b ft

Λ * n "t · ft" ι»β Λ

— 13 — '

R₂=CH₃O (nachfolgend Vc) und (VI), R=t-Butyl-diphenylsiloxy, R₂=CH₃O (nachfolgend VIc). Bei Verwendung des Anthracyclinons (HId) erhält man eine Mischung der Anthracyclinglykoside (V), R=t-Butyl-diphenyl-siloxy, R₂=H (nachfolgend Vd) und (VI), R=t~Butyl-diphenylsiloxy, R₂ ^=H (nachfolgend VId).

Die Mischungen der Anthracyclinglykoside (Va) und (VIa), (Vb) und (VIb) , (Vc) und (VIc) , (Vd) und (VId) können in ihre jeweiligen Komponenten durch fraktionierte

Kristallisation oder chromatografisch aufgetrennt werden. Durch Entfernung der Acetylschutzgruppe(n) durch • Behandeln mit katalytischen Mengen von Natriummethoxid in Methanol oder mit einer wässrigen Natriumhydroxidlösung von (Va), (Vb), (VIa) bzw.,(VIb) ergibt die Anthracyclinglykoside 7-0- (2 ,6-Dideoxy- oCz-L-arabino-hexopyranosyl)-daunomycinon (I, R₁=H, R₃=CH₃O; nachfolgend Ia), 4-Demethoxy-7-0-(2,6-dideoxy-o6 -L-arabino-hexopyranosyl)-daunomycinon (I, R₁=R₇=H: nachfolgend Ib), 1-0- (2_/3,6-Trideoxy-o(/ -L-erythro-hex-2-enopyranosyl) daunomycinon (II, R₁=H, R₂=CH₃O); nachfolgend Ha) und 4-Demethoxy-7-0-(2,3,6-trideoxy- <& -L-erythro-hex-2™ enopyranosyl)-daunomycinon (II; R =R₂=H; nachfolgend Hb). ■

Nach Entfernung der Acetylschutzgruppe(n) in der vorbeschriebenen Weise und anschliessendem Entfernen der t-Butyl-diphenyl-silyl-Schutzgruppe durch Behandeln mit Tetra-n-butyl-ammoniumfluorid in Tetrahydrofuran, aus (Vc), (Vd), (VIc) und (VId), erhält man die entsprechendenAnthracyclinglykoside 7-0-(2,6-Dideoxy-oC-

L-arabino-hexopyranosyl)-adriamycinon (Ϊ, R₁=OH, R„= CH_O; nachfolgend Ic), 4-Demethoxy-7-0-(2,6-dideoxyco -L-arabino-hexopyranosyl)-adriamycinon (I, R₁=OH,
R₂=H; nachfolgend Id), 7-0-(2,3,6-Trideoxy-oC-L-erythro-hex-2-enopyranosyl)-adriamycinon (II, R₁=OH, R₂=CH₃O; nachfolgend lic) und 4-Demethoxy-7-0-(2,3,6-trideoxy-o^-L-erythro-hex-2-enopyranosyl)-adriamycinon (II, R₁=OH, R₂=H;. nachfolgend lld).

Die Verbindungen (Ia) und (Ic) sind bekannte Verbindungen, die in der britischen Patentbeschreibung
8 128 252 beschrieben werden. Die weiteren Anthracyclinglykoside (I) und (II), nämlich die Verbindungen (Ib, (Id, (Ha) , (lib), (lic) und (lld) sind neue Verbindungen und werden erfindungsgemäss beansprucht.

Ähnlich wiedie Verbindungen (Ia) und (Ic) sind diese Verbindungen zur Behandlung von bestimmten Tumoren
in Lebenwesen geeignet und die Erfindung betrifft deshalb auch Arzneimittel, welche ein Anthracyclinglykosid (Ib) , (Id) , (Ha) , (Hb) , (lic) oder (Hd) in

Mischung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel enthält.

In den nachfolgenden Beispielen beschreiben die Beispiele 3 bis 6 die vorliegende Erfindung und die Beispiele 1 und 2 betreffen die Herstellung der bestimmten Ausgangsmaterialien.

η β ι* * * β

- 1.5 -

Beispiel 1

mvcinon__(IIIc)_
5

Eine Lösung aus 0,414 g Adriamycinon in 20 ml wasserfreiem Dimethylformamid wurde mit 0,28 ml t-Butyldiphenyl-chlor-silan und 0,15 g Imidazol behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatür stehen gelassen, anschliessend wurden 200 ml Wasser zugegeben und die Lösung wurde dann mit Methylendichlorid extrahiert. Die organische Schicht wurde abgetrennt/ über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum zur Trockne abgedampft. Der Rückstand wurde chromatografisch über Kieselgel unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus Ethylacetat:Toluol (1:2 v/v) als Eluiersystem gereinigt. Das reine (HIc) (0,46 g) schmilzt bei 208 bis 209⁰C.

FD-MS: m/z 652 (M⁺')

PMR (CDCl-.): inter alia bei 1,14 d(s, (CH-),-C),

3,98 ί Cs, CH₃O) und 4,89 (s, CH₂-Si-).

Beispiel 2
³⁰

Eine Lösung aus 0,385 g 4-Demethoxyadriamycinon in 15 ml

wasserfreiem Dimethylformamid wurde mit 0,3 ml t-Butyl-diphenyl-chlor-silan und 0,15 g Imidazol behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen und anschliessend wurden
200 ml Wasser zugegeben und die Lösung wurde mit

Methylendichlorid extrahiert. Die organische Schicht wurde abgetrennt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde dann chromatografisch
über Kieselgel, unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus Toluol: Aceton "{95:5 v/v) als Eluiersystem, gereinigt. Das reine (HId) (0,6 g) schmilzt
bei 101 bis 102⁰C.

FD-MS: m/z 622 (M⁺")

PMR (CDCl₃): inter alia bei 1,13 tf(s, CH₃J₃,

3,41 6 (d, OH-C-7),
4,87 (s, CH₂-Si-),
5,24 6 (m, C-H-7).

Beispiel 3
25-

Zu einer Losung aus 2 g Daunomycinon (Illa)in 200 ml wasserfreiem Methylendichlorid wurden 1,25 g 3,4-Di-O-acetyl-2,6-dideoxy-uk-L-arabino-hexopyranosylchlorid

(IV), gelöst in 30 ml Methylendichlorid, in Gegenwart

von 12 mg eines Molekularsiebes (4 A Merck) gegeben. Die Mischung wurde mit 1,28 g Silbertrifluormethansulfonat, gelöst in 30 ml wasserfreiem Diethylether, behandelt. Nach 5 Minuten wurde das Reaktionsgemisch mit 0,65 ml wasserfreiem Kollidin neutralisiert. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde die organische Lösung miteiner gesättigten wässrigen Lösung von Natriumbikarbonat, mit Wasser, mit wässriger 0,1N SaIzsäure und schliesslich mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde abgetrennt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde chromatografisch über einer Kieselgelsäule, unter Verwendung von Ethylacetat: Cyclohexan (1:1 v/v) als Eluiersystem, gereinigt. Man erhielt getrennt 0,9 g des Produktes (Va), F: 117 bis

PMR (CDCl₃): inter alia bei 1,23 <f (d, CH₃-C-S¹) 1 ,95 cf (s, CH₃COOC) , "

2,07	6	(s, CH₃COOC),
2,43	6	(s, CH₃CO),
5,20	6	(CH-7) und
5,53	ά	/ /TfJ Ί I \ \ν^Χΐ I /

und 0,9 g des Produktes (Via), F: 83 bis 84⁰C.

Die Verbindung (Va) (0,7 g) wurde in Aceton (45 ml) gelöst und mit 50 ml einer 0,2N wässrigen Natriumhydroxidlösungbei Raumtemperatur behandelt. Nach 1 Stunde wurde die Lösung auf den pH-Wert 7 eingestellt und mit Chloroform extrahiert. Nach dem Abdampfen des organischen

. Lösungsmittels im Vakuum erhielt man reines (Ia) in quantitativer Ausbeute.

F: 162-162°C

FD-MS: m/z 528 (M⁺').

Analog erhielt man aus der Verbindung (VIa) nach einer basischen Behandlung unter den vorerwähnten Bedingungen reines (Ha) .
10

F: 181-182⁰C

FD-MS: m/z 510 (M⁺*)

PMR (CDCl₃): inter alia bei 1,40 c!(d, CH₃-C-S¹) , 2,42 d(s, CH₃CO) ,

5,33 6 (CH-7), 5,58 6 (CH-1') und 5,5-6,0 6(m, CH-2¹, CH-3').

Beispiel 4

25' §£§bing-hexg2YrangsYl)_-daunomYcingn_ J[Ib )__und__4-De-

Zu einer Lösung aus 0,74 g 4-Demethoxy-daunomycinon (HIb) in wasserfreiem Methylendichlorid (70 ml) wurden 0,65 g des Halogenzuckers (IV) in 10 ml Methylenchlorid

in Gegenwart von 5 g eines Molekularsiebes (4 A Merck) zugegeben. Die Mischung wurde mit 0,64 g Silbertrifluormethansulfonat, gelöst in 15 ml wasserfreiem Diethylether, behandelt. Nach 5 Minuten wurde das Reaktionsgemisch mit 0,4 ml Kollidin neutralisiert. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurde die organische Lösung mit einergesättigten wässrigen Lösung von Natriumbikarbonat, Wasser, wässriger 0,1N Salzsäure und schliesslich mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde abgetrennt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde chromatografisch über einer Kieselgelsäule, unter Verwendung von Chloroform:Aceton
(96:4 v/v) als Eluiersystem, gereinigt. Man erhielt
O₇48 g des Produktes (Vb),

F: 65-66°C

FD-MS: m/z 582 (M⁺*)

und 0,45 g des Produktes (VIb). Die Verbindung (Vb)
wurde in 20 ml Aceton gelöst· und mit 20 ml 0,2N wässriger Natriumhydroxidlösung bei Raumtemperatur behandelt. Nach 1 Stunde wurde die Lösung auf den pH-Wert eingestellt-und mit Chloroform extrahiert. Nach dem Abdampfen des organischen Lösungsmittels im Vakuum erhielt man reines (Ib) in quantitativer Ausbeute,

F: 165-166⁰C

FD-MS: m/z 4 98 (M⁺*).

Analog erhielt man aus der Verbindung (VIb) nach basischer Behandlung unter den vorerwähnten Bedingungen

reines (lib).

PMR (CDCl₃) inter alia bei 1,39.(CH₃-C-S¹)#

2,42 6 (s, CH₃-CO), 3,50-4,0OcT(Tn, C-H-4 ' und C-H-5 ' ) , 4,08 S (s, CH₃O), 5,33 £ (bs, C-H-7), 5,58 <T(bs, C-H-1 ') , 5,65 (d, C-H-3¹), 5,93 S (d, C-H-2¹) .

Beispiel 5
15

Zu einer Lösung von 1,25 g (IIIc), hergestellt gemäss Beispiel 1, in 100 ml wasserfreiem Methylendichlorid, wurden 2,4 g Quecksilber(II)oxid, 0,75 g Quecksilber-

(Il)bromid, 8 g eines Molekularsiebes (4 A Merck) und 0,85 g des Chlorzuckers (IV) gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand wurde chromatografisch über einer Kieselgelsäule, unter Verwendung von Toluol: Aceton (9:1 v/v) als Eluiersystem, gereinigt. Man erhielt 1,2 g des Produktes (Vc),

· 1

- 21 -

F: 55-56⁰C

FD-MS: m/z 866 (M⁺") ,

sowie 0,15 g des Produktes (VIc), 5

F: 88-89°C.

Die Verbindung (Vc) (0,87 g) wurde in wasserfreiem Möthylendichlorid (10 ml) gelöst und mit 200 ml einer 0,01N Lösung Natriumhydroxid in wasserfreiem Methanol behandelt. Nach 3 Stunden* bei Raumtemperatur waren die Acetylschutzgruppen entfernt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Essigsäure angesäuert und im Vakuum eingedampft. Das erhaltene öl wurde in 200 ml Tetrahydrofuran gelöst und mit 0,7 g Tetra-n-butylammoniumfluorid behandelt. Nach 1,5 Stunden war die Hydrolyse der t-Butyl-diphenyl-silyl-gruppe vollständig erfolgt. Vom Rückstand wurde im Vakuum das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand wurde chromatografisch über einer Kieselgelsäule, unter Verwendung von Toluol: Aceton (1:1 v/v) als Eluiersystem, gereinigt, wobei man reines (Ic) (0,35 g) erhielt

' F: 189-19O⁰C
■

PMR (CDCl₃): inter alia bei 1,34 cT(d, CH₃-C-S¹) ,

4,08 ei (s, CH₃O) ,

4,77 6 (s, CH₉OH),

.5,30 o^r(d, CH-7) ,

5,50 6(ä, CH1-').

Analog ergab die Verbindung (VIc) nach Hydrolyse der Schutzgruppen (lic)

F: 205-207⁰C
5

PMR (CDCIo): inter alia bei 1,38 ό(ά, CH^-C-S¹),

3,25-4,00 € (m, C-H-4' undC-H-5') , 4,08 cf (s, CH₃O) , 4,76 6 (d, CH₂OH) , 5,36 ei (breites s, C-H-7) ,

5_V57 6 (breites s, C-H1'), 5,63 6 (d, C-H-3'), 5,93 (Πα, C-H-2·) .

Beispiel 6

■ Zu einer Lösung von 0,63 g (IHd) , hergestellt gemäss Beispiel 2, in 50 ml wasserfreiem Methylendichlorid wurden 1,2 g Quecksilber(II)oxid, 0,4 g Quecksilber-(Il)bromid, 8 g eines Molekularsiebes (4 A Merck) und 0,75 g des Chlorzuckers (IV) gegeben. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum eingedampft und der Rückstand wurde chromatografisch über einer

It * ■*

η 9 *

- 23 -

Kieselgelsäule, unter Verwendung von Toluol:Aceton (96:4 v/v) als Eluiersystem, gereinigt. Man erhielt 0,585 g des Produktes (Vd),

F: 212-213⁰C

FD-MS: m/z 236 (M⁺')

sowie 0,200 g des. Produktes (VId). Das Produkt (VId) (0,5 g) wurde in wasserfreiem Methylendichlorid (10 ml) gelöst und mit 150 ml einer 0,01N Lösung Natriummethoxid in wasserfreiem Methanol behandelt. Nach 3 Stundenbei Raumtemperatur war die Entfernung der Acetylschutzgruppen vervollständigt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Essigsäure angesäuert und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 100 ml Tetrahydrofuran gelöst und mit 0,5 g Tetra-n-butylammoniumfluorid behandelt. Nach 2 Stunden war die Hydrolyse der t-Butyl-diphenyl-silyl-gruppe vervollständigt. Vom Rückstand wurde das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft und dann wurde die Reinigung durch Chromatografie über einer Kieselgelsäule, unter Verwendung von ToluolrAceton (1:1 v/v) als Eluiersystem, durchgeführt, wobei man 0,2 g reines (Id) erhielt.

F: 204-206⁰C

FD-MS: m/z 514. (M⁺*)

PMR (CDCl₃): inter alia bei 1,3 <f (d, CH₃-C-S¹),

4,78 cf (s, CH₂OH) ,

5,34 cf (breites s, CH-7) ,

5,54 ei (bs, C-H-1 ') .

Analog ergab die Verbindung (VId) bei der Hydrolyse der Schutzgruppen (lld)

F: 166-167⁰C
5

PMR (CDCl₃): inter alia bei 1,39 cf(d, CH₃-C-S¹) ,

3,96 cT(d, C-H4¹) , 4,77 tf(s, CH₂OH), 5,35 <£ (breites s, C-H-7) , 5,55 rf (breites s, C-H-I¹Ji

5_V71 £(m, CH-3¹), 5,95 ei (d, C-H-2¹).

Biologische Aktivitäten von (Ha) , (Ib) , (lic) und (Id)

Die Verbindungen (Ilaj und (lic) wurden im Vergleich zu Daunorubicin (DNR) und Doxorubicin (DX) jeweils in vitro und in vivo zur Bestimmung der Cytotoxizität und der Antitumoraktivität getestet.

Tabelle 1 zeigt die Wirkung der HeLa-Zellen-Klonungs-• effizienz in vitro.
25

(Ha) ist etwa 25 mal weniger cytotoxisch als DNR und (lic) ist etwa 5 mal weniger cytotoxisch als DX.

Die erste Untersuchung in citro wurde an CDF-1-Mäusen, die mit aszitischer P388-Leukämie (10 Zellen/Maus) befallen waren, durchgeführt. Die Ergebnisse werden in

«ft « * A ^ »fc-ΐ » «A4 ** «* **■· «♦

- 25 -

Tabelle 2 gezeigt. Sowohl (Ha) als auch (lic) wurden in 10 %-igem Tween 80 suspendiert und intraperir toneal injiziert. Die beiden Verbindungen waren weniger toxisch und wirksam als die Stammverbindungen DNR und DX. (Ha) war inaktiv bei P388 aszitischer Leukämie bei den beiden geprüften Dosen, einschliesslich der maximal tolerierten Dosis Mx TD von 100 mg/kg, während (lic) eine gewisse Antitumoraktivität aufwies/ die jedoch im Vergleich zu DX niedriger war.

Die Verbindungen (Ib) und (Id)> wurden in vitro gegenüber HeLa-Zellen und P388 Leukämie-Zellen, die empfindlich (P388) und resistent (P388/DX) gegenüber DX waren, sowie in vitro gegenüber P388 und Gross-Leukämie untersucht. Die in Tabelle 3 gezeigten Daten geben an, dass (Ib), das hinsichtlich der HeLa-Zellen-Klonungseffizienz in vitro im Vergleich zu der Stammverbindung DNR und 4-Demethoxy-DNR (4-dm DNR) geprüft wurde, drei- bzw. sechsmal weniger cytotoxisch ist als DNR bzw. 4-dm DNR, während (Id) beim gleichen Versuch ebenso cytotoxisch wie DX ist.

Die Verbindung (Ib) wurde in vitro gegenüber P388/DX • geprüft. ';

P388 und P388/DX-Leukämie-Zellen wurden aus einer Mäuse-aszitischenFlüssigkeit geerntet und in vitro in Suspension wachsen gelassen. Die Cytotoxizitätsprüfungen wurden durchgeführt, indem man die Zellen verschiedenen Arzneimittelkonzentrationen während 48 Stunden aussetzte; nach der Beendigung der Aussetzungszeit wurden die Zellen in einer Zellzählvorrichtung

gezählt und der ID₅₀ (Dosis, die eine 50 %-ige Verminderung der Anzahl im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrollprobe ergibt) wurde berechnet.

Tabelle 4 zeigt, dass (Ib) etwa so cytotoxisch ist wie DNR gegenüber P388-Leukämie-Zellen und dass es sehr aktiv ist gegenüber P388/DX-Leukämie-Zellen. DNR war etwa 500 mal weniger aktiv gegenüber der resistenten als gegenüber der empfindlichen Linie.

Ergebnisse einer ersten Untersuchung in vivo, die an CDF-1-Mäusen, die von P388 aszitischer Leukämie befallen waren, durchgeführt wurden und wobei man nach dem Tag der Tumortransplantationsbehandlung i.p.

durchführte, werden in Tabelle 5 gezeigt.

(Ib) ergab eine zweifach grössere Wirksamkeit als DNR und eine um etwa 1,5-fach wenigere Wirksamkeit als 4-dm DNR; im Vergleich zu Mx TD zeigt die Verbindung eine geringere Aktivität als DNR und 4-dm DNR. Die Verbindung (Id) war etwa um das 5-fache wirksamer als DX. Die Antileukämieaktivität gegenüber P388-Leukämie war gut, aber niedriger im Vergleich zu DX.

25' Untersuchungen, die an C3H/Me-Mäusen, denen i.v.

Gross-Leukämie transplantiert worden war und die i.v. am Tag nach der Tumortransplantation behandelt wurden, werden in Tabelle 6 gezeigt. Sowohl (Ib) als auch (Id) waren toxischer und wirksamer als die Ausgangsverbindungen. Im Vergleich zu Mx TD zeigte (Ib) eine grössere Aktivität als DNR und (Id) zeigte eine

- 27 -

gute Antitumoraktivität, die in der gleichen Grössenordnung wie die von DX liegt. Die Verbindungen (Ib) und (Id) wurden weiterhin auf ihre orale Aktivität gegenüber Gross-Leukämie, die i.v, transplantiert worden war, im Vergleich zu DNR, DX, welche i.v. verabreicht wurde, und 4-dm DNR, die oral verabreicht wurde, untersucht.

Die in Tabelle 7 angegebenen Daten zeigen, dass (Ib) eine gute Antitumoraktivität bei oraler Verabreichung am ersten Tage aufweist, die ^vmitder vergleichbar ist von 4-dm DNR (von dem bereits gezeigt wurde, dass diese Verbindung bei oraler Verabreichung aktiv ist) und von i.v.-infiziertem DNR.
15

Die Daten über die Antitumoraktivität von (Id), verabreicht am ersten Tage oder 1, 2 oder 3 Tage nach der Tumortransplantation werden gleichfalls in Tabelle 7 gezeigt. Bei oraler Verabreichung am Tage 1 war (Id) bei der Mx TD weniger aktov als DX i.v.. Bei einem unterschiedlichen Behandlungsschema (1, 2, 3) war.die Antitumoraktivität der Verbindung höher als bei i.v. verabreichtem DX.

- 28 Tabelle 1

Kolonieninhibierungstest gegenüber HeLa-Zellen in vitro (24 Stunden Behandlung)

Verbindung	Dosis (ng/ml)·	%*	ID₅₀ (ng/ml)
DNR	25	12
	12,5	74	~16
	6,2	106
Verbindung (Ha)	400	146
	100	136	400
	25	143
	6,2	127
	1,5	120
DX	25	24	'viO
	12,5	40
	6,2	69
Verbindung (lic)	400	4
	100	33	A.50
	25	65
	6,2	68
	1,5	86

* Anzahl der Kolonien; % der unbehandelten Kontrolle

+ m m

^ * ft A - *

- 29 -

Tabelle 2

Antituworaktivität gegenüber aszitischer P388-Leukämie Behandlung i.p. am Tage 1

Verbindung	Dosis (mg/kg)	T/C^a %	LTS^b	Todesfälle durch Ver giftung⁰
DNR	2,9	160	0/10	0/10
	4,4^d	165-170	0/10	0/20
	6,6^d	150-160	0/10	7/20
Verbindung	(Ua) 75	120	0/5	0/5
	100	90	0/10	1/10
DX	4,4^d	220-227	2/18	0/10
	6,6^e	227-305	2/26	0/26
	10^e	268-<610	7/26	3/26
Verbindung	(lic) 17,6	118	9/8	0/8
	23	127	0/7	0/7
	30^d	125-136	0/17	0/17
	45	130.	0/10	0/10
	67,5	140	0/10	0/10
	100	150	0/7	0/7

a: mittlere Überlebenszeit % gegenüber nicht-behandel· ter Kontrolle

b: Langzeit-Überlebende (- 60 Tage)

c: bewertet aufgrund der Autopsie an toten Mäusen

ds Daten aus zwei Versuchen (Bereich)

es Daten ausdrei Versuchen (Bereich)

Tabelle 3

Verbindung	Dosis (ng/ml)	%*	ID50(ng/ml)
DNR	25	9
	12,5	51	^■12
	6,2	83
4-dm DNR	25	0
	12,5	18	ν 6,3
	6,2	53
	3,1	84
Verbindung (Ib)	100	0
	25	67	-v35
	6,2	87
	1,5	107
DX	25	0
	12,5	28	λ/7,5
	6,2	59
Verbindung (Id)	100	0
	25	0	^7
	6,2	59
	1,5	106

* Anzahl der Kolonien; % der unbehandelten Kontrollen

- 31 -

Tabelle 4

Wirkung auf die Empfindlichkeit und Doxorubicinempfindlicher P388-Leukämie in vitro

Verbindung	(Ib)	^ID50	(ng/ml)^a	470 25
	P388^b	P388/DX^e
DNR Verbindung	1,7 1,2	800 30

a: Dosis, die eine 50 %-ige Verminderung der Zellenanzahl im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrolle ergibt

P388-Leukämie-Zellen, empfindlich gegenüber P388-Leukämie-Zellen, resistent gegenüber DX,

Verhältnis zwischen ID₅₀ gegenüber P388

gegenüber P388/DX und

Tabelle 5

Antitumoraktivität von (Ib) und (Id) gegen aszitische P388-Leukämie (Behandlung 1 mal täglich i.p.)

Verbindung	Dosis (mg/kg)	T/C^a %	LTS^b	Todesfälle durch Ver giftung⁰
DNR	2,9^d	159-194	0/18	0/8
	4,4^d	140-184	0/18	7/18
4-dm DNR	0,75	163	0/8	0/8
Verbindung (Ib)	1,25	140	0/8	0/8
	2,5	163	0/9	3/9
	5	63	0/10	10/10
DX	4,4	220	1/10	0/10
	6,6	305	0/10	0/10
	10	>610	5/10	0/10
Verbindung (Id)	1 ,12	170	0/10	0/10
	1,68	185	0/10	0/10
	2,53	230	1/10	2/10

a, b, c, d: siehe Tabelle 2

β Λ * Λ

- 33 -

Tabelle 6

Antitumoraktivität gegenüber i.v. Gross-Leukämie Behandlung i.v. am Tage 1

Verbindung	Dosis (mg/kg)	T/C^a %	Todesfälle durch Ver giftung*³
DNR	15	171	0/8
	22,5	^v 171	0/8
Verbindung(Ib)	2,9	214	0/7
	4,4	100	7/8
DX	10	171	0/10
	13	200	0/10
	16,9	207	3/10
Verbindung (Id)	1,2	171	1/10
	2,16	200	1/10
	3,8	114	5/9

a, b: siehe Tabelle 2

Tabelle 7

Orale Aktivität von (Ib) und (Id) gegenüber Gross-Leukämie

Verabrei chungs- route	S	oral	Behandlung Schema^a Verbin dung	DNR	Dosis (mg/kg)	T/C^b %	Todes fälle durch Vergif tung⁰
i.v.		+ 1		15	200	0/10
			4-dm DNR	22,5	125	6/10
oral	oral	+ 1		3	150	0/6
				3,6	150	0/6
			(Ib)	4,3	216	0/3
oral	+ 1		2,9	167	0/10
			4,4	208	0/10
		DX	6,6	116	4/9
i.v.	+ 1		10^d	171-171	1/20
			13^d	200-200	1/20
	(Id)	16,9^d	200-207	3/13
+ 1		1/.2	171	0/9
		2,1	185	0/8
	(Id)	3,8	214	■ 3/8
1,2,3		0,48	183	0/10
		0,62	208	0/10
	0,8^d	233-258	2/20

a: Tage nach Tumortransplantation b, c: siehe Tabelle 2

d; Daten aus zwei Versuchen (Bereich)

Claims

» ♦ H-.

HOFFMANN · EITLE & PARTNER

PATENT-UND RECHTSANWÄLTE

PAtENTANWALTE DIPL.-ING. W, EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN . DIPL.-ΙΝβ. W. LEHN

DIPL.-ING. K. FÜCHSLE - DR. RER. NAT. B. HANSEN · DR, RER, NAT, H.-A. BRAUNS · DIPL.-INQ. K, GORQ

DIPL.-ING. K. KOHLMANN ■ RECHTSANWALT A. NETTE

38 455 o/wa

FARMITALIA CARLO ERBA S.p.A., MAILAND /ITALIEN

Anthracyclinglykoside, Verfahren zu deren Herstellung und Arzneimitte1, welche diese enthalten

PATENTANSPRÜCHE

1./ Anthracyclinglykosid der allgemeinen Formel (I)

(D

OH

worin R₁ Wasserstoff oder Hydroxy und R_ Wasserstoff bedeuten.

TCi crt^rM=?icn5crc? oi ocj

VW «* * U

_ ο —

2. Anthracyclinglykosid der allgemeinen Formel (II)

worin R₁ Wasserstoff oder Hydroxy und R- Wasserstoff oder Methoxy bedeuten.
15

3. Verbindung gemäss Anspruch 1, nämlich 4-Demethoxy-7-0-(2,6-dideoxy-co-L-arabino-hexopyranosy1)-daunomyc inon.

4. Verbindung gemäss Anspruch 1, nämlich 4-Demethoxy-7-0-(2,6-dideoxy-oO-L-arabino-hexopyranosyl)-adriamycinon.

5. Verbindung gemäss Anspruch 2, nämlich 7-0-(2,3,6-Trideoxy-ot- -L-erythro-hex-2-enopyranosyl) -daunomycinon.

6. Verbindung gemäss Anspruch 2, nämlich 4-Demethoxy-7-0- (2,3,6-trideoxy- oc/ -L-erythro-hex-2-enopyranosyl)-daunomycinon.

7. Verbindung gemäss Anspruch 2, nämlich^-O-(2,3,6-Trideoxy-Ck-L-erythro-hex-2-enopyranosyl)-adriamycinon.

8. Verbindung gemäss Anspruch 2, nämlich 4-Demethoxy-7-0-(2,3,6-trideoxy-oO -L-erythro-hex-2-enopyranosyl) adriamycinon.

Verfahren zur Herstellung eines Anthracyclinglykosids der allgemeinen Formel (I) oder (II)

O pH

08

und

(D

(II)

worin R₁ Hydroxy und R₂ Wasserstoff oder Methoxy bedeuten, dadurch gekennzeichnet , dass man ein Anthracyclinon der allgemeinen Formel (III)

■- 4 -

OCH₂R

(III)

OH OH

worin R Hydroxy und R₂ Wasserstoff oder Methoxy bedeuten, in wasserfreiem Dimethylformamxd löst, bei Raumtemperatur mit t-Butylchloro-diphenylsilan in Gegenwart von Imidazo! zu dem 14-t-Butyldiphenylsilylether umsetzt, den Ether in wasserfreiem Methylenchlorid mit 3,4-Di-0-acetyl-2,6~dideoxy-O/-L-arabino-hexapyranosylchlorid der Formel (IV)

H₃CCO

Cl

:h

(IV)

OOCCH.

in Gegenwart einer Mischung aus Merkuribromid/ Merkurioxid und einem Molekularsieb kondensiert, unter Erhalt einer Mischung der geschützten Glykoside der Formeln (V) und (VI)

(V)

(VI)

worin R t-Butyl-diphenyl-siloxy und R₂ Wasserstoff oder Methoxy bedeuten, dass man die Verbindungen (V) und (VI) chromatografisch über einer Kieselgelsäule unter Verwendung des Systems Toluol:Aceton (1:1 v/v) als Eluiermittel trennt und reinigt, dass man die O-Acetyl-Schutzgruppe(n) von jedem Zuckerrest durch Behandeln mit einer katalytischen Menge Natriummethoxid in Methanol entfernt und anschliessend die 14-t-Butyldiphenylsiiyl-Schutzgruppe an jedem Aglykonrest durch Behandeln mit Tetra-n-butylammoniumfluorid und Tetrahydrofuran entfernt, unter Erhalt der reinen Glykoside der Formeln (I) und (II),

10. Verfahren zur Herstellung des Anthracyclinglykosids der allgemeinen Formel (I) und der allgemeinen Formel (II)

HO

OH

(D

und·

OH

(ID

.worin R₁ Wasserstoff und R₂ Wasserstoff oder Methoxy bedeuten, dadurch gekennzeichnet , dass man ein Anthracyclinon der allgemeinen Formel (III)

J I XOCH₂R OH N I I
OH I H
0

(III)

worin R Wasserstoff und R₂ Wasserstoff oder Methoxy bedeuten, in Methylenchlorid löst, in Gegenwart von Silbertrifluoromethansulfonat und einem Molekularsieb mit 3,4-Di-0-acetyl-2,6-dideoxy-oO L-arabino-hexopyranosyl-chlorid der Formel (IV)

^H3^CCO<?/T-O.^C1

:η

(IV)

OOCCH.

umsetzt, unter Erhalt einer Mischung der geschützten Glykoside der Formeln (V) und (VI)

(V)

(VI)

worin R Wasserstoff und R« Wasserstoff oder Methoxy bedeuten, dass man die geschützten Glykoside der Formeln (V) und (VI) über einer Kieselgelsäule unter Verwendung des Systems Ethylacetat:Cyclohexan (T;1 v/v) als Eluiermittel trennt und reinigt, dass man die 0-Acetyl-Schutzgruppe(n) von jedem Zuckerrest durch Behandeln mit 0,2 N wässrigem Natriumhydroxid bei Raumtemperatur entfernt, unter Erhalt der reinen Glykoside der Formeln (I) und (II).

11. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem.Anthracyclinglykosid der allgemeinen Formeln (I) und (II) gemäss Ansprüchen 1 und 2,