-
-
Verfahren zur Bestimmung von Immunkomplexen
-
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Menge eines
Partners einer immunologischen Reaktion mittels trübungsoptischer Messung der entsprechenden
Antigen-Antikörper-Reaktion.
-
Optische Proteinbestimmungsmethoden - wie Nephelometrle und Turbidimetrie
- arbeiten nach dem Prinzip daß die Antigen-Antikörper-Reaktion unter standardisierten
Reaktionsbedingungen in dem Untersuchungsmaterial und mit verschiedenen Verdünnungen
eines Proteinstandards durch geführt und die Meßergebnisse miteinander verglichen
werden. Die Standardisierung der Reaktionsbedingungen - wie Reaktionszeit, verwendetes
Inkubationsmedium und Dosiergenauigkeit - bestimmen sehr wesentlich die Reproduzierbarkeit
der Messungen. Eine gute Reproduzierbarkeit bei der Messung der Standardkurve und
der Proben ist die Voraussetzung für ein richtiges Endresultat.
-
Ein Problem ist nun, daß die Reproduzierbarkeit über einen weiten
Konzentrationsbereich gegeben sein muß, das heißt sowohl der höchste, als auch der
niedrigste Meßpunkt der Referenzkurve - und damit die entsprechenden Konzentrationen
im Untersuchungsmaterial - müssen gleichermaßen zuverlässig meßbar sein. Naturgemäß
reagieren nun niedrige Antigen-Konzentra,tionen viel langsamer als hohe, das heißt
die Reaktion ist im oberen Konzentrationsbereich viel früher beendet als im unteren.
Wenn die Antigen-Antikörper-Reaktion beendet ist, neigen die entstandenen Immunkomplexe
wegen ihrer nun erreichten Größe zur Sedimentation. Das Streulichtsignal zeigt dann
zunächst
eine starke Unruhe und fällt anschließend steil ab. Im ungünstigsten Fall tritt
dieses Phänomen schon zu e-inem Zeitpunkt auf, an dem die Reaktion der niedrigen
Konzentrationsstufen noch nicht beendet ist.
-
Ein Weg, die Sedimentation innerhalb der vorgeschriebenen Reaktionszeit
zu verhindern, ist eine Verlangsamung der Reaktion. Es ist bekannt, daß man dies
durch Zusatz von bestimmten Salzen und Erhöhung der lonenstärke im Riktionsmedium
erreichen kann. Dies kann zur Folge haben, daß die Reaktion mit niedrigen Antigen-Konzentrationen
innerhalb einer praktikablen Reaktionszeit nicht beendet ist.
-
Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, die Sedimentation von
Antigen-Antikörper-Komplexen in einer Flüssigkeit zu verzögern,- ohne die optischen
Eigenschaften einer solchen Suspension zu beeinträchtigen. Diese Aufgabe wird dadurch-gelöst,
daß Hydroxyethyl-Cellulose zuyesetzt wird.
-
Es wurde überraschend gefunden, daß in einem trübungsphotometrischen
Verfahren zur Bestimmung eines Antigens oder eines Antikörpers mittels einer Antigen-Antikörper-Reaktion
das Meßsignal über einen längeren Zeitraum stabil bleibt, wenn Hydroxyethyl-Cellulose
anwesend ist.
-
Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Verfahren zur trübungsphotometrischen
Bestimmung der Menge eines Partners'einer immunologischen Reaktion in einer Flüssigkeit,
dadurch gekennzeichnet, daß Hydroxyethyl-Cellulose zugesetzt wird.
-
Im Unterschied zu anderen geprüften Zusätzen, wie Proteinen, gegebenenfalls
vernetzte, Geatine, Dextranen, Ethylenglycol, Glycerin oder Salzen, verändert Hydroxyethyl-Cellulose
die optischen Eigenschaften der Lösung nicht und führt bei nephelometrischen Messungen
nicht
zu höheren Blindwerten. Auch werden die für clas Dosieren mit Hilfe von manuellen
und automatischen Mikropipetten wichtigen Fließeigenschaften der Lösungen nicht
nachteilig beeinflußt.
-
Die Hydroxyethyl-Cellulose wird in einer Konzentration von 0,5 bis
5 g/l, vorzugsweise 1 bis 2 g/l verwendet.
-
Als besonders geeignet hat sich Hydroxyethyl-Gelluiose R erwiesen,
die unter dem Namen Tylose H bekannt ist, und für nephelometrische Messungen besonders
TyloseR H 10 000.
-
Diese zeigt einen niedrigen Blindwert und stört nicht die Pipettiergenauigkeit.
Sie wann in den unterschiedlichsten Puffersystemen auch in Gegenwart von Reaktionsbeschleunigern
- wie Polyäthylenglykol - eingesetzt werden und beispielsweise in einer Kochsalzlösung
gelöst zugesetzt werden.
-
TyloseR H ist Hydroxyethyl-Cellulose mit einer Viskosität einer Lösung
von 2 g in 100 ml Wasser von 10 bis 10 000 mPa.s bei 20°C. TyloseR H 10 000 ist
eine solche mit 10 000 mPa.s.
-
Beispiel Es wurde eine Lösung von0,15g- Xylose -H 10 000 in 100 ml
physiologischer NaCl-Lösung hergestellt und über ein Filter mit 0,45 µm Porendurchmesser
filtriert.
-
Eine solche Lösung sowie ein Verdünnungsmittel ohne Hydroxyethyl-Cellulose
wurden bei der nephelometrischen Ber stimmllng von Proteinen zur Verdünnung des
Antïserums,und des Standardserums bzw. der Patientenproben eingesetzt.
-
Im einzelnen wurde wie folgt gearbeitet: A. Nephelometrische Proteinbestimmung
Zur Konstruktion einer Referenzkurve wurde eine geometrische Verdünnungsreihe eines
Protein--Standard-Serums in physiologischer NaCl-Lösung hergestellt, die den Meßbereich
der jeweiligen Bestimmungsmethode umfaßte (z.B. 1:20 bis 1:640 bei IgG).
-
Ferner wurde eine geeignete Gebrauchsverdünnung eines spezifischen
Antiserums (z.B. 1:5) in physiologischer NaCl-Lösung angesetzt.
-
Schließlich-wurden die zu untersuchenden Patientenseren mit dem gleichen
Lösungsmittel in eine definierte Arbeitsverdünnung (z.B. 1:100), die innerhalb des
Meßbereichs der Standardkurve liegt, gebracht.
-
Zur Reaktion wurde ein konstantes Volumen der Standard-oder Pröbenverdünnung
(z.B. 100 ßI) mit einem konstanten Volumen der Antiserumverdünnung (z.B. 200 ßl)
in eine Halbmicro-Küvette pipettiert und durch kurzes Schütteln gemischt. Nach einer
definierten Reaktionszeit (z.B. 30 Minuten) wurden die Küvetten in der gleichen
Reihenfolge, wie sie angesetzt wurden, in den Strahlengang des Nephelometers gebracht
und das Streulichtsignal gemessen.
-
Zur Konstruktion der Referenzkurve wurden die Streulichtsignale der
umgesetzten'Standardverdünnungen gegen die zugehörige Standardkonzentration auf
doppeltlogarithmischem Papier aufgetragen. An dieser Kurve las man die Proteinkonzentrationen
der verdünnten Patientenproben über das gemessene Streulichtsignal ab.
-
Durch Multiplikation dieses Ergebnisses mit dem Verdünnungsfaktor
(s.o. 1:100) erhielt man die-gesuchte Proteinkonzentration im Patientenserum.
-
B. Proteinbestimmung unter Verwendung von Hydroxyethyl-Cellulose Zur
Herstellung des Reagenzes löste man 0,15 g TyloseR H 10 000 in 100 ml physiologischer
NaCl-Lösung und filtrierte über-ein Filter mit 0,45 tim Porendurchmesser.
-
Diese Lösung wurde in dem unter A. beschriebenen Verfahren ans-te-lle
der einfachen physiologischen NaCl-Lösung zum Verdünnen von Standardserum, Patientenseren
und Antiserum verwendet.
-
Im Gegensatz zu der Messung ohne Zusatz von Hydroxyethyl-Cellulose
zeigte das Meßsignal praktisch keine Unruhe und blieb über mehr als eine Stunde
konstant, wenn Hydroxyethyl-Cellulose -zugesetzt worden-war.