DE3218857C2 - Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung von Zellsuspensionen und deren Verwendung zur Isolierung von Mutanten - Google Patents

Abstract

Transportvorrichtung (10) zur Übertragung von mikroorganischen Zellen auf einen Objektträger (16). Die Transportvorrichtung (10) besteht aus einer Trägerplatte (11) in der eine Vielzahl von Trägerstiften (12) in Bohrungen (13) frei beweglich gegen Verkantung gesichert geführt sind. Die Trägerstifte (12) dienen dazu, von ursprünglichen Zellkolonien eine Vielzahl von definierten Zellen zu entnehmen und auf einen Objektträger oder eine Mediumplatte (24) zu übertragen.

Description

2. Verfahren zur Herstellung von Zellsuspensionen und deren Übertragung zur weiteren Behandlung, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte:

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— es wird eine fast rasenartige Zellkolonie (Zellrasen) gezüchtet;

— mit einer, eine Vielzahl sehr feine, bewegliche Stifte aufweisenden Feinstift-Transportvorrichtung werden Zellen von dem Zellrasen entnommen und in die mit flüssigem Wachstumsmedium versehenen Vertiefungen eines Multitest-Objektträgers übertragen, die Vertiefungen des Multitest-Objektträgers enthalten dabei so viel flüssiges Wachstumsmedium, wie die Zellen für die Inkubation benötigen;

— die in den Vertiefungen des Multitest-Objektträgers nach einer vorgegebenen Inkubationszeit entstandene Tellsuspension wird mit einer, eine Vielzahl beweglicher Rundkopfstifte aufweisenden Rundkopf-Transportvorrichtung aus den Vertiefungen des Multitest-Objektträgers entnommen und zur weiteren Behandlung auf eine Behandlungs-Mediumplatte übertragen.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Multitest-Objektträger nach der Zugabe der Zellen zur Beschleunigung des Zellen-

wachstums geschüttelt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellsuspension vor Übertragung auf die Behandlungs-Mediumplatte mit einer Pufferlösung verdünnt wird.

5. Vorrichtung zur Übertragung einer definierten Anzahl mikroorganischer Zellen einer Zellkolonie, insbesondere zur Durchführung der Verfahren nach den Ansprüchen 2 bis 4, gekennzeichnet durch eine Trägerplatte (11), in der Trägerstifte (12) in Bohrungen (13) beweglich gehalten sind.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Bohrungen (13) etwa senkrecht zur Ebene der Trägerplatte verlaufen.

7. Vorrichtung nach den Ansprüchen 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerstifte (12) in den Bohrungen (13) frei beweglich sind und durch ihr Eigengewicht mit Haltekragen (14) in der Trägerplatte (11) gehalten sind.

8. Vorrichtung nach den Ansprüchen 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Haltekragen (14) in ihrem Außendurchmesser größer als die Innendurchmesser der Bohrungen (13) sind und ihre individuelle Größe zur Justierung der individuellen Masse der in einer Trägerplatte (11) angeordneten Trägerstifte (12) variabel ist.

9. Vorrichtung nach den Ansprüchen 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerstifte (12) an ihren, der Trägerplatte (11) abgewandten Enden mit Rundköpfen (18) versehen sind.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Rundköpfe in ihrem Außendurchmesser größer als die sie tragenden Schäfte (29) der Trägerstifte (12) sind.

11. Vorrichtung nach den Ansprüchen 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerstifte (12) durch auf die den Rundköpfen (18) gegenüberliegenden Enden der Schäfte (29) aufgesetzte Halteringe (19) gehalten sind.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Halteringe (19) von den Trägerstiften (12) lösbare Kunstsioffringe sind.

13. Vorrichtung zur Übertragung einer definierten Anzahl mikroorganischer Zellen von einer Zellkolonie, insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine Vielzahl mittels Distanzhalter (2?.) etwa parallel zueinander auf Abstand gehaltener Klingen (21).

14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Klingen (21) durch die Distanzhalter (22) in einem gleichmäßigen Abstand (34) zueinander gehalten sind und dieser Abstand (34) dem Abstand der in Reihen stehenden Trägerstifte (12) entspricht.

15. Vorrichtung nach den Ansprüchen 13 und 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Klingen (21) etwa senkrecht zur Achse der Distanzhalter (22) verlaufend angeordnet sind.

16. Verwendung der nach den Ansprüchen 1 bis 4 hergestellten Zellsuspensionen zur Isolierung von Mutanten.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Zellsuspensionen und deren Übertragung zur weiteren Behandlung.

Mit einem derartigen Verfahren sollen Suspensionen lus Mikroorganismen-Zellen, beispielsweise Hefen, Bakterien, Gewebekulturen oder dergleichen aus irsprünglichen Zellkolonien hergestellt werden. Die iel'suspensionen sollen zur Isolierung von Mutanten jder ganz allgemein zur Erforschung der Eigenschaften der Zellen auf Objektträger oder auf mit synthetischen Wachstumsmedien versehenen Medienplatten übert. agen werden.

Bekannt ist zur Übertragung der Zellen die Replica-Methode, die Lederberg 1952 in den Vereinigten Staaten von Amerika entwickelte und die sich inzwischen allgemein durchgesetzt hat Dabei werden auf einer Mediumplatte eine Vielzahl von ursprünglichen Zellkolonien gezüchtet und anschließend auf ein Samttuch abgedruckt und von dort auf eine weitere Platte gedruckt. Durch diese Methode kann man die Eigenschaften der Zellen auf die erste Platte im Vergleich mit den Eigenschaften der Zellen auf der zweiten Platte prüfen, wobei der Inhalt des Mediums auf der zweiten Platte variiert oder die Zellen auf der zweiten Platte physikalisch oder chemisch behandelt werden.

Diese heute weltweit benutzte Methode hat jedoch den Nachteil, daß man eine sehr unterschiedliche Anzahl von Zellkolonien auf der zweiten Platte erhält, da die Zellkolonien aus der ersten Platte oft unterschiedliche Größen besitzen. Ferner können auf der zweiten Platte sehr unterschiedlich dicke Zellschichten entstehen, die eine physikalische Prüfung, beispie^- weise eine Bestrahlung mit UV-Licht oder eine chemische Prüfung der Zelleigenschaften sehr erschweren und beispielsweise durch ihre unterschiedliche Lichtdurchlässigkeit zu ungenauen Meßergebnissen führen. Ein weiterer Nachteil ist darin zu sehen, daß man mit dieser Methode keine Zellsuspensionen herstellen kann, die für die Untersuchung der Eigenschaften und die Behandlung der Zellen manchmal unbedingt erforderlich sind.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zu schaffen, mit dem Zellsuspensionen aus Einzelzellkolonien zuverlässig hergestellt werden können. Gelöst wird diese Aufgabe durch die folgenden Verfahrensschritte:

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— auf einer mit Wachstumsmedium behandelten Mediumplatte wird eine ursprüngliche Zellkolonie gezüchtet;

— mit einer mehrere parallel zueinander verlaufende Klingen aufweisenden Klingen-Transportvorrichtung werden Zellen aus der ursprünglichen Zellkolonie in Linien auf eine Mediumplatte gedruckt (on lines stamping);

— nach einer vorgegebenen Inkubationszeit wird die Klingentransportvorrichtung quer zu dem ersten Zeil-Abdruck auf die Mediumplatte gedrückt, dabei Zellen aus den inzwischen entstandenen zellenförmigen Zellkolonien in vorgegebenen Abständen entnommen und auf eine weitere Mediumplatte gedruckt (on points stamping);

— nach einer vorgegebenen Inkubationszeit werden mit einer bewegliche Stifte aufweisenden Stift-Transportvorrichtung, deren Stiftabstand dem Klingenabstand der Klingen-Transportvorrichtung entspricht, Zellen aus den inzwischen gewachsenen Einzelzellkolonien entnommen und auf einen eine Vielzahl von Vertiefungen aufweisenden Multitest-Objektträger übertragen, wobei in die Vertiefungen zuvor Lösungsmittel eingebracht worden ist;

— der Objektträger wird geschüttelt;

— die durch das Schütteln in dem Objektträger entstandene Zellsuspension wird mit einer, eine Vielzahl von Rundkopf-Stiften aufweisenden Rundkopf-Transportvorrichtung auf eine Behandlungs-Mediumplatte übertragen.

Durch diese Maßnahmen wird ein Verfahren geschaffen, mit dem zunächst einzelne Zellkolonien gezüchtet und aus diesen Einzel-Zellkolonien Zellsuspensionen zur weiteren Behandlung hergestellt werden können.

Eine Abwandlung dieses Verfahrens sieht die folgenden Verfahrensschritte vor:

— es wird eine fast rasenartige Zellkolonie (Zellrasen) gezüchtet;

— mit einer, eine Vielzahl sehr feine, bewegliche Stifte aufweisenden Feinstift-Transportvorrichtung werden Zellen von dem Zellrasen entnommen und in die mit flüssigem Wachstumsmedium versehenen Vertiefungen eines Multitest-Objektträgers übertragen, die Vertiefungen des Multitest-Objektträgers enthalten dabei so viel flüssiges Wachstumsmedium, wie die Zellen für die Inkubation benötigen;

— die in den Vertiefungen des Multitest-Objektträgers nach einer vorgegebenen Inkubationszeit entstandene Zellsuspension wird mit einer, eine Vielzahl beweglicher Rundkopfstifte aufweisenden Rundkopf-Transpoirtvorrichtung aus den Vertiefungen des Multitest-Objektträgers entnommen und zur weiteren Behandlung auf eine Behandlungs-Mediumplatte übertragen.

Bei diesem Verfahren wird anstelle der Klingen-Transportvorrichtung eine Feinstift-Transportvorrichtung verwendet. Diese Feinstift-Transportvorrichtung weist sehr feine Stifte mit einem Durchmesser von ca. 0,01 -0,1 mm auf. Durch diese geringen Stiftdurchmesser wird gewährleistet, daß Zellen aus einer ursprünglichen Zelikolonie entnommen werden.

Zur Ausgestaltung dieser A j,sführungsform ist es vorgesehen, daß der Multitest-Objektträger nach der Zugabe der Zellen zur Beschleunigung des Zellenwachstums geschüttelt wird, sowie daß die Zellsuspension vor Übertragung auf die Behandlungs-Mediumplatte mit einer Pufferlösung verdünnt wird. Die nach diesen Verfahren hergestellten Zellsuspensionen entstehen somit direkt in den Vertiefungen des Multitest-Objektträgers, wobei die Wachstumsmedien so bemessen sind, daß sie nach Verlauf der Inkubation aufgebraucht sind. Stoffwechselprodukte sowie von dem jeweils zu suspensierenden Zellen nicht verdaubare Nährstoffe verbleiben dabei in der Lösung. Im allgemeinen stören diese Verunreinigungen nicht, sollten sie stören, so können sie durch Pufferlösungen neutralisiert werden.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Vorrichtung zu schaffen mit der Zellen oder Zellsuspensionen in definierter Menge transportiert werden können. Gelöst wird diese Aufgabe durch eine Trägerplatte, in der Trägerstifte in Bohrungen beweglich gehalten sind. Zur Ausgestaltung ist es dabei vorgesehen, daß die Bohrungen etwa senkrecht zur Ebene der Trägerplatte verlaufen, sowie daß die Trägerstifte in den Bohrungen frei beweglich sind und durch ihr Eigengewicht in Haltekragen in der

Trägerplatte gehalten sind. Um eine stets gleiche Eintauchtiefe in die unterschiedliche Dicke der zu übertragenen Zellkolonien zu gewährleisten, ist es vorgesehen, daß die Haltekragen in ihrem Außendurchmesser größer als die Innendurchmesser der Bohrungen sind und ihre individuelle Größe zur Justierung der individuellen Masse der in einer Trägerplatte angeordneten Trägerstifte variabel ist. Durch diese Maßnahmen wird gewährleistet, daß die Trägerstifte stets gleich tief in die Zellkolonien eintauchen, aus denen etwa gleich große Zellmengen entnommen werden sollen.

Zur Übertragung der Zellsuspensionen auf eine Mediumplatte zur Weiterbehandlung ist es vorgesehen, daß die Trägerstifte an ihren, der Trägerplatte abgewandten Enden mit Rundköpfen versehen sind, sowie daß die Rundköpfe in ihrem Außendurchmesser größer als die die tragenden Schäfte der Trägerstifte sind. Durch diese Maßnahmen wird eine Transportvorrichtung geschaffen, die eine ausreichend große Oberfläche aufweist, um die zur Weiterbehandlung erforderliche Zellsuspensionsmenge aus den Vertiefungen des Multitest-Objektträgers zu entnehmen und auf eine Mediumplatte zu übertragen. Die Abstände der Trägerstifte bzw. der Rundkopfstifte sind auf die Abstände der Vertiefungen in dem Multitest-Objektträger abgestimmt.

Um eine gleichmäßige Eintauchtiefe der Rundkopf-Stifte zu gewährleisten, ist es vorgesehen, daß die Trägerstifte durch auf die den Rundköpfen gegenüberliegenden Enden der Schäfte aufgesetzte Halteringe gehalten sind, wobei es vorteilhaft ist, daß die Halteringe von den Trägerstiften lösbare Kunststoff ringe sind. Durch diese Maßnahmen sind die Rundkopf-Stifte leicht und frei beweglich und elastisch in der Trägerplatte gehalten.

Zur Übertragung einer definierten Anzahl mikroorganischer Zellen von einer Zellkolonie auf eine Mediumplatte sowie deren anschließende Aufteilung in Einzelzellkolonien dient eine Vorrichtung, bestehend aus einer Vielzahl mittels Distanzhalter etwa parallel zueinander auf Abstand gehaltener Klingen. Dazu ist es vorgesehen, daß die Klingen durch die Distanzhalter in einem gleichmäßigen Abstand zueinander gehalten sind, wobei der Abstand dem Abstand der Trägerstifte in den Trägerplatten entspricht. Um eine gegenseitige Beeinflussung, bzw. die Gefahr eines Grenzschnittes zwischen zwei Zellkolonien zu verringern, ist es vorgesehen, daß die Klingen etwa senkrecht zur Achse der Distanzhalter verlaufend angeordnet sind.

Eine erfindungsgemäße Verwendung der oben beschriebenen Verfahren sieht vor, daß die hergestellten Zellsuspensionen zur Isolierung von Mutanten verwendet werden.

Die Vorrichtungen sind in der Zeichnung dargestellt und werden nachfolgend näher beschrieben; es zeigt

F i g. 1 den Schnitt durch eine Trägerplatte mit eingesetzten Trägerstiften,

F i g. 2 den Schnitt durch einen Multitestobjektträger zur Aufnahme der mit der Vorrichtung nach der F i g. 1 transportierten Zellen,

Fig. 3 eine Randkopf-Transportvorrichtung zur Übernahme von Zellsuspensionen an einem Objektträger nach der F i g. 2,

F i g. 4 die Vorderansicht auf eine Klingen-Transportvorrichtung,

F i g. 5 die Draufsicht auf eine Vorrichtung nach der Fig. 4,

F i g. 6 den ersten Abdruck einer Vorrichtung nach der F i g. 4 auf eine Mediumplatte und darauf gewachsene Zellkolonie-Zeilen,

Fig. 7 den zweiten, quer zum Abdruck auf der Mediumplatte nach der Fi g. 6 erfolgten Abdruck einer Vorrichtung nach der Fig.4 und daraus gewachsene Punkt-Zellkolonien.

Die in der F i g. 1 dargestellte Stift-Transportvorrichtung 10 besteht im wesentlichen aus einer Trägerplatte 11 durch die in definierten Abständen 34 Bohrungen 13

ίο vorgesehen sind. In diese Bohrungen 13 sind Trägerstifte 12 eingesteckt und gehalten. Die Trägerstifte 12 sind mit Spiel leichtgängig und gegen Verkanten geführt. Auf der Oberseite 30 der Trägerplatte 11 sind die Trägerstifte 12 mit Hilfe von Haltekragen 14 gehalten;

is sie hängen durch ihr Eigengewicht bedingt frei in den Bohrungen 13. Um die Trägerstifte 12 leicht in die Bohrungen 13 einsetzen zu können, sind sie mit einem Überstand 15 versehen. Der Überstand 15 und der Haltekragen 14 kann zur Justierung der Trägerstift-Masse dienen.

Mit einer derartigen Stift-Transportvorrichtung 10 können definierte Zeil-Mengen auch von unterschiedlich dicken ursprünglichen Zellkolonien entnommen werden. Bedingt durch ihre gleiche Masse tauchen die Trägerstifte 12 auch bei unterschiedlichen Wachstumshöhen der Zellkolonien gleichmäßig in diese ein. Die entnommenen Zellen sind zur Übergabe auf einen Objektträger 16 — wie er in der F i g. 2 dargestellt ist — bestimmt. Der Objektträger 16 entspricht in seiner flächigen Abmessung etwa der Trägerplatte 11 und ist mit Vertiefungen 17 versehen, die in ihrer Lage zueinander der Lage der Trägerstifte 12 entsprechen.

Bei der in der F i g. 3 dargestellten Ausführungsform sind die der Trägerplatte 11 abgewandten Spitzen der Trägerstifte 12 mit nietenartigen Rundköpfen 18 versehen. Diese Rundköpfe weisen Hinterschneidungen 31 gegenüber ihren Stiftschäften 29 auf. Gehalten werden diese Trägerstifte 12 durch Halteringe 19, die auf der den Rundköpfen 18 entgegengesetzten Seite der Trägerplatte 11 über die freien Enden gezogen sind. Die Halteringe 19 sind aus einem elastomeren Werkstoff, beispielsweise aus Kunststoff, gefertigt und mit strammem Sitz aufgezogen.

In den F i g. 4 und 5 ist eine Klingentransportvorrichtung 20 dargestellt, die aus einer Vielzahl von parallel zueinanderstehenden Klingen 21 besteht. Die Klingen 21 werden durch Distanzhalter 22 auf gleichmäßigem Abstand 34 gehalten und mit Haltemitteln 23 — beispielsweise Nieten oder Muttern — zusammengehalten.

Mit einer derartigen Klängentransportvorrichtung 20 können längs verlaufende Klingenabdrücke 25 von zu übertragenden Zellen auf einen Mediumträger gedruckt werden. Auf den Medienträgern 24 lassen sich unterschiedliche Wachstumsmedien aufbringen, so daß längs verlaufende Zellkolonien 27 entstehen. Zur Isolierung von Mutanten oder zur Herstellung von punktförmigen Zellkolonien wird die Klingentransportvorrichtung 20 noch einmal quer über die zeilenförmigen Zellkolonien 27 gedrückt und ein — in der F i g. 7 dargestellter — querverlaufender Klingenabdruck 26 auf einen weiteren Medienträger gedruckt

Auch dieser Medienträger 32 ist mit Wachstumsmedium versehen, so daß die mit der Klingentransportvorrichtung 20 beim Schnitt der zellenförmigen Zellenkolonien 27 mitgenommenen Zellen neue punktförmige Zellkolonien 28 entwickeln können. Die punktförmigen Zellkolonien 28 dienen der Isolierung von Mutanten, sie

können mit Hilfe einer Stift-Transportvorrichtung 10
aufgenommen und auf einen Objektträger 16 übertragen werden. Das Wachstum der punktförmigen 10 Zellkolonien 28 ist oft unregelmäßig, was durch die 11 unterschiedlichen Wachstumsmedien hervorgerufen 5 12 werden kann. Die nicht besetzten Schnittpunkte 33 der 13 Klingenabdrücke 25 und 26 weisen auf bestimmte 14 Eigenschaften der hier abgedrückten Zellen im Verhält- 15 nis zu dem Wachstums- oder Prüfmedium, mit dem der 16 Medienträger 32 getränkt ist. Zur Kontrolle kann ein io 17 solcher querverlaufender Klingenabdruck 26 auch auf 18 einem weiteren Medienträger 24 abgedrückt werden, 19 der das gleiche Wachstumsmedium enthält wie der 20 Mediumträger für die zellenförmigen Zellkolonien 27. 21

Die beschriebenen Vorrichtungen können in einer 15 22

weiteren — nicht dargestellten — Vorrichtung gleich- 23

förmig geführt und zur einfachen Handhabung bereitge- 24

stellt werden. 25

Nach dem vorgeschlagenen Verfahren und mit den 26

vorgeschlagenen Vorrichtungen können leicht und 20 27

sicher Einzelzellkolonien in einen vorbestimmbaren 28

Abstand zueinander gebracht werden, um daraus 29

Zellsuspensionen herzustellen. Dabei wird die Eigen- 30

schaft der Zellkolonien, daß sie schneller wachsen, wenn 31

in ihrer näheren Umgebung keine anderen Kolonien 25 32

vorhanden sind, zur Erzielung optimaler Ergebnisse 33

nutzbar gemacht. 34

Bezugszeichenliste

Transportvorrichtung

Trägerplatte

Trägerstifte

Bohrung

Haltekragen

Überstand

Objektträger

Vertiefung

Rundkopf

Haltering

Zeilen-Transportvorrichtung

Klinge

Distanzhalter

Haltemittel

Mediumplatte

zellenförmiger Klingenabdruck

querverlaufender Klingenabdruck

Zeilen-Zellkolonie

Punkt-Zellkolonie

Stiftschaft

Oberseite

Hinterschneidung

Mediumträger

nicht besetzter Schnittpunkt

Abstand

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Zellsuspensionen und deren Übertragung zur weiteren Behändlung, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte:

— auf einer mit Wachstumsmedium behandelten Mediumplatte wird eine ursprüngliche Zellkolonie gezüchtet;

— mit einer mehrere parallel zueinander verlaufende Klingen aufweisenden Klingen-Transportvorrichtung werden Zellen aus der ursprünglichen Zellkolonie in Linien auf eine Mediumplatte gedruckt;

— nach einer vorgegebenen Inkubationszeit wird die Klingentranspoi'tvorrichtung quer zu dem ersten Zeil-Abdruck auf die Mediumplatte gedrückt, dabei Zellen aus den inzwischen entstandenen zellenförmigen Zellkolonien in vorgegebenen Abständen entnommen und auf eine weitere Mediumplatte gedruckt;

— nach einer vorgegebenen Inkubationszeit werden mit einer bewegliche Stifte aufweisenden Stift-Transportvorrichtung, deren Stiftabstand dem Klingenabstand der Klingen-Transportvorrichtung entspricht, Zellen aus den inzwischen gewachsenen Einzelzellkolonien entnommen und auf einen eine Vielzahl von Vertiefungen aufweisenden Multitest-Objektträger übertragen, wobei in die Vertiefungen zuvor Lösungsmittel eingebracht worden ist;

— der Objektträger wird geschüttelt;

— die durch das Schütteln in dem Objektträger entstandene Zellsuspension wird mit einer, eine Vielzahl von Rundkopf-Stiften aufweisenden Rundkopf-Transportvorrichtung auf eine Behandlungs-Mediumplatte übertragen.