DE3204040C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Injektion von sehr kleinen Probenmengen insbesondere in Zellen nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Bei einem bekannten Verfahren dieser Art (Graessmann A., Graessmann M. und Müller C. "Methods in Enzymology", Band 65 (1980), Seiten 816 bis 825), ist der Kapillaren­ innenraum an eine Handspritze angeschlossen. Zum Inji­ zieren der Probenmenge wird entsprechend lang auf den Spritzenkolben von Hand gedrückt. Es hat sich jedoch ge­ zeigt, daß häufig nach der Impfung einer Anzahl von Zellen die Spitze der Mikrokapillare nicht mehr durch­ gängig ist, woraufhin eine neue Mikrokapillare einzu­ setzen ist.

Bei einem weiteren bekannten Verfahren dieser Art (Denis W. Stacey "Methods in Enzymology" Band 79 (1980),Seiten 76 bis 88) wird die Mikrokapillare bei erfolgter Ver­ stopfung durch Ausübung eines maximal möglichen Innen­ drucks auf den Kapillarinnenraum gereinigt. Tritt die erhoffte Reinigung nicht ein, wird die verstopfte Kapil­ lare undefiniert abgebrochen, in der Hoffnung, daß der verbleibende Kapillarquerschnitt des Innendurchmessers des Kapillarendes für eine Injektion weiterhin geeignet ist.

Demgegenüber ist es Aufgabe der Erfindung bei einem Ver­ fahren eingangs genannter Art die Verstopfungsgefahr der Mikrokapillarenspitze während des Gebrauchs zumindest stark zu verringern.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren nach Anspruch 1 gelöst. Es hat sich gezeigt, daß der in Anspruch 1 an­ gegebene Haltedruck ein Blockieren der Spitze während wiederholter Injektionen zuverlässig verhindert. Als besonders wirksam hat sich dabei ein Haltedruck nach Anspruch 2 erwiesen.

Um das erste Austreten der in den Kapillarinnenraum ein­ gefüllten Probenflüssigkeit aus der Spitze zu beschleu­ nigen und ggf. eine Anfangsverstopfung der Spitze aufzu­ heben, wird bevorzugt nach Anspruch 3 vorgegangen. Um auszuschließen, daß sich auch bei einer Vielzahl auf­ einanderfolgender Injektionen keine Verstopfungen oder Ablagerungen im Inneren der Kapillarenspitze bilden, wird bevorzugt nach Anspruch 3 wiederholt, jeweils nach mehreren Injektionen, der Kapillareninnenraum mit dem Hochdruck beaufschlagt. Der Hochdruck wird dabei be­ vorzugt nach Anspruch 4 eingestellt. Bevorzugt wird der Injektionsdruck gemäß Anspruch 5 eingestellt. Hier­ durch lassen sich äußerst geringe Injektionsraten er­ reichen, die zwischen 10^-11 bis 10^-13 ml Probenflüssig­ keit pro Sekunde betragen können. Je nach Injektions­ dauer kann man in die einzelnen Zellen Probenmengen im Bereich zwischen 10^-11 und 10^-13 ml injizieren. Die Größe der in Frage kommenden Zellen kann dabei unter 100 µm, ja sogar unter 60 µm, liegen.

Bei dem erstgenannten bekannten Verfahren wird die Probenflüssigkeit dadurch in die Mikrokapillare einge­ füllt, daß man die Spitze in Probenflüssigkeit taucht und durch Herausziehen des Spritzenkolbens einen Unter­ druck im Kapillareninnenraum erzeugt. Der Einsaugvor­ gang dauert relativ lang; auch muß mehr Probenflüssig­ keit als für die Injektion benötigt, bereitgestellt werden. Um dies zu vermeiden, wird bevorzugt nach Anspruch 6 vorgegangen.

Da dabei die Probenflüssigkeit im Bereich der Kapilla­ renspitze eingefüllt wird, entfällt die Gefahr, daß die entlang der Kapillareninnenwand fließende Probenflüs­ sigkeit dort anhaftende Verunreinigungen mitnimmt, was wiederum zur Verstopfung der Spitze führen kann. Weiter­ hin gibt es im Gegensatz zu dem bekannten Verfahren prak­ tisch keine Verdampfungsverluste an Probenflüssigkeit beim Einfüllen.

Die Erfindung betrifft auch eine Vorrichtung zur Durch­ führung des Injektionsverfahrens. Aus der erstgenannten Literaturstelle ist es bekannt, den Injektionsdruck mittels einer handbetätigten Spritze zu erzeugen. Dies hat den Nachteil, daß man den Injektionsdruck praktisch nicht reproduzierbar auf einen vorgegebenen konstanten Wert einstellen kann. Auch besteht nicht die Möglichkeit für einen automatischen Betrieb. Zur Vermeidung dieser Nachteile ist die erfindungsgemäße Vorrichtung nach An­ spruch 7 ausgebildet.

Um möglichst viele Zellen pro Zeiteinheit injizieren zu können, sollte die Bedienung möglichst einfach sein. Man kommt mit einer Ein-Knopf-Bedienung aus, wenn man die Vor­ richtung gemäß Anspruch 8 ausbildet. Mit einer Hand kann dann das Drei-Stellungs-Ventil bedient werden und mit der anderen Hand der Mikromanipulator für die Mikrokapillare. Ohne besondere Einweisung und längere Übung lassen sich In­ jektionsraten von 400 bis 800 Zellen pro Stunde erreichen.

Man erspart sich eine eigene Haltedruckquelle, wenn man die Vorrichtung gemäß Anspruch 9 ausbildet.

Das in der Injektionsdruckzuleitung vorgesehene Rück­ schlagventil ermöglicht es, die Vorrichtung zur Kontrolle des Injektionsdrucks und ggf. des Haltedrucks gemäß Anspruch 10 auszubilden.

Um zu verhindern, daß es während des Injizierens durch versehentliches Umschalten des Drei-Stellungs-Ventils in die dritte Ventilstellung zu einem plötzlichen Aus­ stoßen von Probenflüssigkeit unter der Wirkung des Hoch­ druckes kommt, wird die Vorrichtung bevorzugt gemäß An­ spruch 11 ausgebildet. Das zweite Zwei-Stellungs-Ventil dient demnach ausschließlich zur Umschaltung zwischen dem Haltedruck und dem Injektionsdruck, was Bedienungs­ fehler ausschließt. Bei Ausbildung der Drosselstelle als Drosselventil ergibt sich die Möglichkeit einer kon­ tinuierlichen Feineinstellung des Haltedrucks.

Damit die Bedienungsperson während des Injizierens der Zellen beide Hände frei zur Bedienung des Manipulators bzw. des Mikroskops hat, ist die Vorrichtung bevorzugt gemäß Anspruch 12 ausgebildet.

Man erspart sich eine eigene Injektionsdruckquelle, wenn die Vorrichtung gemäß Anspruch 13 ausgebildet ist.

Um Wartungsarbeiten, z. B. das Auswechseln von Mikro­ kapillaren, zu erleichtern, ist die Vorrichtung bevorzugt gemäß Anspruch 14 ausgebildet.

Ferner ist bevorzugt eine Ausbildung der Vorrichtung gemäß Anspruch 15 vorgesehen. Die Vakuumquelle kann dabei zum Aussaugen der Vorrichtung, zu Reinigungszwecken oder auch zur Prüfung auf Undichtigkeiten eingesetzt werden.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der Zeichnung an Ausführungsbeispielen erläutert.

Es zeigt:

Fig. 1 eine Schemaansicht einer ersten Ausführungsform der Injektionsvorrichtung;

Fig. 2 eine Schemaansicht einer zweiten Ausführungsform,;

Fig. 3 eine Schemaansicht einer weiteren Ausführungsform;

Fig. 4 eine schematische Darstellung einer Mirkokapillare kurz vor Beginn des Einfüllvorgangs.

Eine Mikrokapillare 10 mit einem Außendurchmesser ihrer Kapillarenspitze bei 1 µm, und einem Innendurchmesser bei 0,5 µm ist an einem in Fig. 4 dargestellten Halter 14 an­ gebracht. Dieser besteht aus einem keilförmigen Grund­ körper 16, dessen eine Keilfläche auf dem Untergrund auf­ liegt und dessen andere gegen die horizontale geneigte Keilfläche 18 als Auflage für die Mikrokapillare 10 dient. Die Keilspitze ist weggefräst, so daß beim Aufsetzen der Mikrokapillare 10 mit über die obere Keilfläche 18 nach unten vorstehender Spitze 12 eine Beschädigung der Spitze 12 vermieden wird. Im Bereich des oberen Endes der Keil­ fläche 18 ist der Grundkörper 16 wieder abgeschrägt; eine Gummizwischenschicht 20 ist auf die entstandene Schräg­ fläche geklebt; die Schicht 20 wiederum trägt einen eben­ falls keilförmigen Halterkopf 22, der zusammen mit dem Grundkörper 16 die Keilform des Halters 14 bildet. Die Keilfläche 18 des Grundkörpers 16 setzt sich demzufolge in einer Keilfläche 24 des Halterkopfs 22 fort. Die Mikro­ kapillare 10 wird nunmehr auf die Flächen 18 und 24 auf­ gelegt und liegt dabei in einer zu den Flächen 18 und 24 senkrechten Vertikalebene. Die Mikrokapillare 10 wird beispielsweise auf die Flächen 18 und 24 aufgeklebt. Im dargestellten Beispiel ist die Mikrokapillare 10 der Einfachheit halber in eine Nut 26 eingeklemmt, die von der über die Flächen 18 und 24 etwas vorstehenden Gummi­ zwischenschicht 20 gebildet ist.

Als nächstes wird Probenflüssigkeit in die Mikrokapillare 10 eingefüllt, beispielsweise 0,1 bis 1 µl einer Proben­ flüssigkeit. Als Probenflüssigkeit kommt beispielsweise eine Lösung aus 0,02 bis 1 mg DNA pro ml in Frage, die vorher etwa 10 Minuten mit 10000 g oder höher zentri­ fugiert worden ist. Zum Einfüllen dieser Probenflüssigkeit dient eine Einfüllkapillare 28 in Form eines dünnen Glas­ röhrchens mit Außendurchmesser 0,12 mm und einem Innen­ durchmesser von 0,1 mm. Derartige Glasröhrchen sind als Röntgen-Glaszylinder (X-ray glass cylinder) erhältlich. Die Einfüllkapillare 28 wird vorsichtig in das der Spitze 12 gegenüberliegende Kapillarenende 30 der Mikrokapillare 10 eingeführt und soweit eingeschoben, bis die Einfüll­ kapillarenspitze 32 den Bereich der Spitze 12 im Inneren der Mikrokapillare 10 erreicht. Dann erfolgt die Proben­ flüssigkeitsabgabe.

Mit einer weiteren Einfüllkapillare mit Außendurchmesser ca. 0,52 mm und Innendurchmesser 0,5 mm kann eine ein oder mehrere cm hohe Flüssigkeitssäule eines schweren Paraffin­ öls auf die Probenflüssigkeit im Kapillareninnenraum auf­ geschichtet werden. Beide Einfüllkapillaren werden vor der Verwendung in gleicher Weise wie die Mikrokapillare ge­ waschen.

Nunmehr kann die gefüllte Mikrokapillare 10 in die in Fig. 1 grobschematisch dargestellte, allgemein mit 34 be­ zeichnete Injektionsvorrichtung eingesetzt werden. Hier­ zu wird die Mikrokapillare 10 in einen symbolisch darge­ stellten Mikromanipulator 36 eingespannt, der eine Bewe­ gung der Kapillarenspitze 12 in sämtlichen drei Raum­ achsen erlaubt. Zwei Drehknöpfe 38 sind in Fig. 1 ange­ deutet. Der Kapillareninnenraum ist über das Kapillaren­ ende 30 vgl. Fig. 4 an eine Gasdruck-Hauptleitung 40 angeschlossen; eine die Bewegung des Mikromanipulators 36 erlaubende flexible Zwischenleitung 41 zwischen Manipulator 36 und Hauptleitung 40 ist in Fig. 1 angedeutet. Die Hauptlei­ tung 40 und damit der Kapillareninnenraum kann wahlweise mit drei Gasdrücken beaufschlagt werden, einem Hochdruck p ₁, einem Injektionsdruck p ₂ sowie einem Haltedruck p ₃. Zum Umschalten von einem Druck auf den anderen dient ein einziges Ventil, nämlich das in Fig. 1 in seinen Schalt­ funktionen dargestellte Drei-Stellungs-Ventil 42. Es sind zwei Druckquellen in Form von Preßluft- oder Stickstoff- Druckgasflaschen vorgesehen, eine Hochdruckquelle 44 so­ wie eine Injektionsdruckquelle 46. Eine Hochdruckzulei­ tung 49 verbindet die Hochdruckquelle 44 mit einem Ver­ zweigungspunkt 48 der Hauptleitung 40; dementsprechend verbindet eine Injektionsdruckzuleitung 50 die Injektions­ druckquelle 46 mit demselben Verzweigungspunkt 48 der Hauptleitung 40. Ein manuell einstellbares Drosselventil (Druckminderer bzw. Regulator) 52 in der Hochdruckzulei­ tung 49 (oder an der Hochdruckquelle 44) gestattet ein genaues Einstellen des Hochdrucks p ₁ auf einen Wert von beispielsweise 2 bar. Erforderlichenfalls kann der Druck p ₁ auch elektronisch geregelt werden. Dementsprechend ist in die Leitung 50 ein Drosselventil 54 (Druckminderer bzw. Regulator) zur genauen Einstellung des Drucks p ₂ von 0,12 bar eingebaut. Zwischen Drosselventil 54 und Verzweigungspunkt 48 ist in der Leitung 50 ein Rückschlag­ ventil 56 eingeschaltet, welches in Richtung zum Punkt 48 öffnet. Die Schaltfunktion des zwischen das Drosselventil 52 und den Verzweigungspunkt 48 in die Leitung 49 einge­ schalteten Drei-Stellungs-Ventils 42 sind aus Fig. 1 zu ent­ nehmen. Drei Anschlüsse des Ventils 42 sind in Gebrauch, ein erster Anschluß 58, an den das zum Drosselventil 52 führende Leitungsstück 60 der Leitung 49 angeschlossen ist, ein daneben liegender Anschluß 64, der gedrosselt ist (in Fig. 1 durch eine Drosselstelle 66 symbolisiert) sowie ein dritter Anschluß 68, der dem Anschluß 58 gegen­ überliegt und von dem das zum Verzweigungspunkt 48 füh­ rende Leitungsstück 70 der Leitung 49 aus geht.

In der in Fig. 1 dargestellten ersten Stellung oder Ruhe­ stellung des Ventils 42 ist der Anschluß 58 gesperrt, wohin­ gegen der Anschluß 68 mit dem Anschluß 64 verbunden ist. Dem­ zufolge ist die Drosselstelle 66 mit der Injektionsdruck­ quelle 46 verbunden. Die Drosselstelle 66 ist so einge­ stellt, daß sich ein Druck p ₃ vor der Drosselstelle, also in der Leitung 70 und damit in der Hauptleitung 40, ein­ stellt. Der als Haltedruck bezeichnete Druck p ₃ beträgt 0,03 bar. Zur genauen Einstellung des Haltedrucks p ₃ kann die Drosselstelle 66 von einem entsprechenden Drosselventil gebildet werden. Man kann jedoch auch in das Leitungsstück 70 zwischen dem Ventil 42 und dem Verzweigungspunkt 48 ein weiteres Drosselventil (Druckminderer bzw. Regulator) 66′ einschalten, welches eine genaue Einstellung des Haltedrucks p ₃ erlaubt.

Wird nunmehr das Ventil 42 in eine zweite oder mittlere Schaltstellung manuell umgeschaltet, so bewegt sich dem­ entsprechend der in Fig. 1 symbolisch angedeutete Ventil­ körper entgegen der Kraft einer Ventilfeder 72 in eine mittlere Stellung nach rechts. Nunmehr sind sämtliche An­ schlüsse 58, 64 und 68 des Ventils 42 abgesperrt, so daß sich in der Leitung 70 und somit in der Hauptleitung 40 der Injektionsdruck p ₂ einstellt.

Wird schließlich das Ventil 42 in seine dritte Stellung umgeschaltet, in der der Ventilkörper seine in Fig. 1 rechteste Stellung einnimmt, so sind die beiden Anschlüs­ se 58 und 68 miteinander verbunden, wohingegen der An­ schluß 64 abgesperrt ist. Das Leitungsstück 70 und somit die Hauptleitung 40 sind somit mit der Hochdruckquelle 44 verbunden und liegen auf Druck p ₁. Das Rückschlagven­ til 56 verhindert eine Beschädigung des Drosselventils 54 und der Injektionsdruckquelle 46. Das Drosselventil 52 kann ggf. auch entfallen, falls ein bei Druckquellen in Form von Druckgasflaschen üblicherweise vorgesehener in Fig. 1 angedeuteter Druckminderer 52′ vorhanden ist, der den Gas­ flascheninnendruck von 10 bis 150 bar auf 0 bis 7 bar reduziert. In einem solchen Falle ist der Druckminderer 52′ so einzustellen, daß in der dritten Stellung des Ventils 42 der Druck im Leitungsstück 70 (im Falle der Verwendung des Drosselventils 66′ anschließend an das Drosselventil 66 ) gerade den vorgegebenen Wert p ₁ annimmt.

Nach dem Einbau der Mikrokapillare 10 in den Mikromani­ pulator 36 wird als erstes der Hochdruck p ₁ auf den Kapillareninnenraum gegeben (dritte Ventilstellung), um rasch die Spitze 12 zu füllen und um die Spitze 12 er­ forderlichenfalls durchgängig zu machen. Anschließend wird der Haltedruck p ₃ auf den Kapillareninnenraum ge­ geben, der so groß gewählt ist, daß einerseits im we­ sentlichen keine Probenflüssigkeit aus der Spitze 12 aus­ fließt und andererseits nichts von außen her in die Ka­ pillarenspitze 12 eindringen kann. Nun wird die Kapillaren­ spitze in eine der in Fig. 1 übertrieben groß dargestell­ ten Zellen 74 gestochen durch entsprechende Betätigung des Mikromanipulators 36 unter der Beobachtung durch ein Mikroskop, dessen Mikroskopobjektiv 76 in Fig. 1 abge­ brochen angedeutet ist. Sobald die Spitze 12 im Zellen­ inneren (im Cytoplasma oder im Zellkern) sich befindet, wird der Injektionsdruck p ₂ (zweite Ventilstellung) auf den Kapillareninnenraum gegeben, der ein Ausströmen von Probenflüssigkeit aus der Spitze 12 zur Folge hat. Die Ausströmrate beträgt dabei zwischen 10^-11 und 10^-13 ml pro Sekunde. Dem gewünschten Injektionsvolumen entspre­ chend lang wird das Ventil 42 in seiner zweiten Stellung gehalten und anschließend losgelassen, so daß sich die Ruhestellung des Ventils gemäß Fig. 1 einstellt und der Haltedruck p ₃ am Kapillareninnenraum anliegt. Die Mikro­ kapillare 10 wird nun zur nächsten Zelle 74 bewegt und diese in der vorstehend beschriebenen Weise geimpft.

Falls Zweifel bestehen, ob die Spitze 12 vollständig durch­ gängig ist, kann man den Hochdruck p ₁ (dritte Ventilstel­ lung) auf den Kapillareninnenraum geben, um die Spitze 12 wieder "durchzublasen".

Die Bedienung des Ventils 42 kann beispielsweise über einen in Fig. 1 angedeuteten Ventilbetätigungsknopf 80 erfolgen, der gegen die Kraft der Feder 72 einschiebbar ist.

Zum Entlüften der Vorrichtung 34 ist ein Entspannungs­ ventil 82 in Form eines Zweiwegeventils in eine in die Hauptleitung 40 mündende Nebenleitung 84 eingebaut. Ferner ist eine in die Hauptleitung 40 mündende Zusatzleitung 86 vorgesehen mit einem Absperrventil 88 zum wahlweisen Anschluß einer zusätzlichen Druck- und/oder Vakuumquelle, wie beispielsweise einer Aquariumpumpe, die sowohl als Druck- als auch Vakuumquelle einsetzbar ist. Zwischen den Einmündungen der Leitungen 84 und 86 in die Hauptlei­ tung 40 ist in die Hauptleitung 40 ein Absperr- oder Drosselventil 90 eingebaut, welches in Anpassung an die jeweilige Viskosität der Probenflüssigkeit eine gleich­ zeitige Verstellung der Drucke p ₁, p ₂ und p ₃ zuläßt.

Fig. 2 zeigt eine weitere Ausführungsform der erfindungs­ gemäßen Injektionsvorrichtung, die mit 134 bezeichnet ist. Bauelemente in Fig. 2, die solchen in Fig. 1 ent­ sprechen, sind mit denselben Bezugsziffern, oder jeweils ver­ mehrt um die Zahl 100 versehen. Bei der Injektionsvor­ richtung 134 wird lediglich eine einzige Druckquelle, nämlich die Hochdruckquelle 144 benötigt. Eine von der Hochdruckquelle 144 ausgehende Anfangsleitung 192 setzt sich in zwei parallelen Leitungen 149 und 150 fort, die der Hochdruckzuleitung 49 bzw. der Injektionsdruckzuleitung 50 gemäß Fig. 1 entsprechen und die schließlich in den Ver­ zweigungspunkt 148 der Hauptleitung 140 münden. In der Leitung 149 ist wiederum das Drosselventil 152 einge­ schaltet, welches die genaue Einstellung des Hochdrucks p ₁ im anschließenden Leitungsteil erlaubt. Dementsprechend ist in die Leitung 150 sowohl das Drosselventil 154 als auch das Rückschlagventil 156 eingeschaltet, wobei das Rückschlagventil 156 eine Beschädigung eines zwischen die Ventile 154 und 156 in die Leitung 150 eingeschalteten Manometers 210 (für den Druck p ₂) durch den höheren Druck p ₃ ausschließt. Das Drosselventil 154 gestattet die ge­ naue Einstellung des Drucks p ₂. In den Leitungszweig 170 zwischen Drosselventil 152 und Verzweigungspunkt 148 könnte nun das Drei-Stellungs-Ventil 42 gemäß Fig. 1 eingebaut werden. In Fig. 2 ist dieses jedoch durch zwei Zwei-Stellungs-Ventile ersetzt, ein erstes Zwei-Stel­ lungs-Ventil 194 sowie ein zweites Zwei-Stellungs-Ventil 196. Die beiden Schaltstellungen des ersten, in die Leitung 170 eingeschalteten Zwei-Stellungs-Ventils 194 sind aus Fig. 2 ersichtlich. In der Ruhestellung ist die Verbindung zwischen dem Drosselventil 152 und dem Verzweigungspunkt 148 unterbrochen, wohingegen ein Drosselausgang 164 an p ₂ anliegt. Der Drosselausgang 164, dessen Drosselstelle 166 wiederum symbolisch ange­ deutet ist, steht über eine Verbindungsleitung 198 mit dem Zwei-Stellungs-Ventil 196 in Verbindung. In der in Fig. 2 dargestellten Ruhestellung des Ventils 196 ist die­ ses durchgängig, so daß sich in der Hauptleitung 140 der Haltedruck p ₃ einstellt. Wird jedoch das Ventil 196 in seine andere Schaltstellung gebracht, so wird die Verbin­ dungsleitung 198 abgesperrt, so daß sich der Injektions­ druck p ₂ in der Hauptleitung 140 aufbaut. Durch Betätigen des Ventils 196 kann daher zwischen dem Injektionsdruck p ₂ und dem Haltedruck p ₃ umgeschaltet werden, ohne daß die Gefahr besteht, daß versehentlich der Hochdruck p ₁ zugeschaltet wird. Zum Zuschalten des Hochdrucks p ₁ ist das erste Zwei-Stellungs-Ventil 194 zu betätigen. Zur genauen kontinuierlichen Einstellung des Haltedrucks p ₃ kann die Drosselstelle 166 wiederum von einem in Fig. 2 mit unterbrochener Linie angedeuteten Drosselventil 166′′ gebildet sein, welches zwischen die beiden Zwei-Stellungs- Ventile 194 und 196 in die Leitung 198 eingeschaltet ist. Entsprechend der Anordnung in Fig. 1 kann man jedoch auch ein Drosselventil 166′ in die Leitung 170 zwischen dem Ventil 194 und dem Verzweigungspunkt 148 einschalten. Schließlich kann ggf. auch das Drosselventil 152 entfallen, falls der Druckminderer 152′ ausreichend genau genug ist zur Einstellung des Hochdrucks p ₁.

Auch in der Anordnung gemäß Fig. 2 kann ein Entspannungs­ ventil 182 zum Entlüften der Vorrichtung 134 vorgesehen sein, eingebaut in eine in die Hauptleitung 140 mündende Nebenleitung 184. Auch ist ein Absperr- oder Drosselventil 190 in die Hauptleitung 140 eingebaut und schließlich eine Zusatzleitung 186 mit Absperrventil 188.

Die in Fig. 3 dargestellte Injektionsvorrichtung 234 hat ähnlichen Aufbau wie die Injektionsvorrichtungen 34 und 134 gemäß Fig. 1 und 2. Bauelemente in Fig. 3, die solchen in Fig. 1 entsprechen, sind mit denselben Bezugs­ ziffern, jeweils vermehrt um die Zahl 200 versehen.

Ähnlich der Anordnung in Fig. 2 benötigt die Vorrichtung 234 gemäß Fig. 3 lediglich eine einzige Druckquelle, näm­ lich die Hochdruckquelle 244. Ein Druckminderer 252′ an der Druckquelle 244 erlaubt die genaue Einstellung des Hochdrucks p ₁ in der sich anschließenden Anfangsleitung 292. Der eingestellte Hochdruck p ₁ läßt sich an einem am Druckminderer 252′ vorgesehenen Manometer 300 ablesen. Die Anfangsleitung 292 verzweigt sich schließlich an einem Verzweigungspunkt 302 und setzt sich in zwei parallelen Leitungen 249 und 250 fort, welche schließlich in einem weiteren Verzweigungspunkt 248 wieder zusammenlaufen und dort in die sich anschließende Hauptleitung 240 einmünden.

In der in Fig. 3 unteren Leitung 249 ist ein Zwei-Stellungs- Ventil 294 eingeschaltet, welches in seiner in Fig. 3 dargestellten Ruhestellung die Leitung 249 absperrt; bei Betätigung des Zwei-Stellungs-Ventils 294 wird dieses durchgängig, so daß sich am Verzweigungspunkt 248 und damit in der Hauptleitung 240 der Hochdruck p ₁ einstellt.

In der oberen Leitung 250 ist ein Drosselventil (Präzi­ sions-Niederdruck-Druckminderer, z. B. von Fairchild Ind. Model 10) 254 eingeschaltet zur Einstellung des Injektions­ drucks p ₂ im sich anschließenden Leitungsteil 304 der Leitung 250. In Strömungsrichtung anschließend an das Drosselventil 254 mündet eine Nebenleitung 306 in die Leitung 250 (Einmündungspunkt 308, siehe Fig. 3). In die Nebenleitung 306 ist ein Zwei-Stellungs-Ventil 296 eingeschaltet sowie zwischen dieses Ventil und dem Punkt 308 ein Drosselventil 266′′. Wie bereits aus den Bezugs­ ziffern erkennbar, entsprechen diese beiden Ventile 266′′ und 296 ihrer Funktion nach den Ventilen 166′′ und 196 in Fig. 2. Das Zwei-Stellungs-Ventil 296 ist demnach in seiner in Fig. 3 dargestellten Ruhestellung durchgängig und sorgt für eine Erniedrigung des Druckes in der Lei­ tung 250 (anschließend an das Drosselventil 254) auf den Haltedruck p ₃. Die genaue Einstellung des Haltedrucks p ₃ erfolgt durch das Drosselventil 266′′. Hierbei ist hervor­ zuheben, daß eine Verstellung des Drucks p ₃ ohne Einfluß auf die jeweiligen Druckwerte p ₁ und p ₂ bleibt. Die je­ weils eingestellten Druckwerte p ₂ und p ₃ lassen sich an einem Druckmanometer 310 ablesen, welches über eine Ne­ benleitung 312 an die Leitung 250 (Einmündungspunkt 314) angeschlossen ist. Zwischen dem Einmündungspunkt 314 und dem Verzweigungspunkt 248 ist entsprechend Fig. 2 wiederum ein Rückschlagsventil 256 eingeschaltet, welches bei Zu­ schalten des Zwei-Stellungs-Ventils 294 verhindert, daß der Hochdruck p ₁ in den Leitungsabschnitt der Leitung 250 zwischen dem Drosselventil 254 und dem Rückschlagsventil 256 gelangt, was zu einer Beschädigung des auf den niedri­ geren Druck p ₂ eingestellten Drosselventils 266′′ und ggf. des Manometers 310 führen könnte.

Schließlich kann wiederum in einer entsprechenden Neben­ leitung 284 der Hauptleitung 240 ein Entspannungsventil 282 vorgesehen sein sowie ein Absperrventil 288 in einer in die Hauptleitung 240 mündenden Zusatzleitung 286. Zu erwähnen ist ferner noch ein Absperr- oder Drosselven­ til 290 zwischen den Einmündungen der Leitungen 284 und 286 in die Hauptleitung 240. Die Hauptleitung 240 mündet schließlich in die Mikrokapillare 10.

Bei dem eigentlichen Injektionsvorgang ist lediglich das Zwei-Stellungs-Ventil 296 zu betätigen zur Umschaltung zwi­ schen dem Injektionsdruck p ₂ und dem Haltedruck p ₃. Dabei besteht nicht die Gefahr, daß versehentlich der Hochdruck p ₁ zugeschaltet wird, da dieses Zuschalten über das an­ dere Zwei-Stellungs-Ventil 294 erfolgt. Zur weiteren Be­ dienungsvereinfachung kann vorgesehen sein, daß das Zwei- Stellungs-Ventil 296 über einen Fußschalter betätigbar ist. Es sind dann beide Hände frei zur Betätigung des Mikromanipulators und ggf. des Beobachtungsmikroskopes.

Es liegt auf der Hand, daß auch in der Injektionsvorrich­ tung 34 gemäß Fig. 1 anstelle des Drei-Stellungs-Ventils 42 die Kombination aus den beiden Zwei-Stellungs-Ventilen 194 und 196 (bzw. 294 und 296) eingesetzt werden kann. Die Ventile 42 und 194 sind vom Zwei-Wege-Typ, wohingegen das Ventil 196 ein Einwegventil ist.

Mit Hilfe der vorstehend beschriebenen Injektionsvorrich­ tungen können sehr geringe Mengen an Probenflüssigkeit reproduzierbar in lebende Zellen eingespritzt werden, z. B. zur Untersuchung der Verteilung von Proteinen, die fluores­ zierend markiert worden sind (fluorescently labelled structural proteins) oder zur Aussonderung von geklonten Rekombinanten (screening of cloned recombinants).

Claims (15)

1. Verfahren zur Injektion von sehr kleinen Probenmengen insbesondere in Zellen mittels einer Mikrokapillare, deren eines Kapillarende mit einer einen Innendurchmesser im µm-Bereich aufweisenden Spitze versehen ist, wobei man in die Mikrokapillare Probenflüssigkeit einfüllt und während des Injizierens den Kapillareninnenraum von dem anderen Kapillarende her mit einem ein Ausströmen von Probenflüssigkeit aus der Spitze bewirkenden Injek­ tionsdruck beaufschlagt, dadurch gekennzeichnet, daß man nach erfolgter Injektion der gewünschten Proben­ menge den Kapillareninnendruck vom Injektionsdruck auf einen den Injektionsdruck unterschreitenden, von Null verschiedenen Haltedruck, bei dem im wesentlichen keine Probenflüssigkeit mehr aus der Spitze ausströmt, ab­ senkt, und daß man diesen Haltedruck bis zum Beginn der nächsten Injektion beibehält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Haltedruck das 0,1 bis 0,5-fache, vorzugsweise 0,2 bis 0,3-fach, am besten etwa das 0,25-fache des Injek­ tionsdrucks beträgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich­ net, daß man nach dem Einfüllen der Probenflüssigkeit und vor der ersten Injektion, vorzugsweise auch wieder­ holt jeweils nach mehreren Injektionen, den Kapillaren­ innenraum mit einem den Injektionsdruck übersteigenden Hochdruck beaufschlagt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Hochdruck etwa das 5 bis 100-fache,vorzugsweise das 10 bis 30-fache, am besten etwa das 17-fache des Injek­ tionsdrucks beträgt.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß der Injektionsdruck 0,01 bis 0,5 bar, vorzugsweise 0,1 bis 0,2 bar, am besten etwa 0,12 bar beträgt.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß man die Probenflüssigkeit vom anderen Kapillarenende her einfüllt, vorzugsweise mittels einer Einfüllkapillare geringeren Aussendurchmessers als der Innendurchmesser der Mikrokapillare, die man mit ihrem Abgabeende voraus in die Mikrokapillare bis in den Bereich der Spitze der Mikrokapillare einschiebt.

7. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch wenigstens eine Druckquelle (44, 46; 144; 244) für konstanten Druck, vorzugsweise jeweils in Form einer Druckgasflasche.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch ein derart zwischen die wenigstens eine Druckquelle (44, 46) und die Mikrokapillare (10) derart eingeschaltetes, handbetätigtes Drei-Stellungs-Ventil (42), daß an der Mikrokapillare (10) in einer ersten Ventil-Stellung der Haltedruck (p ₃), in einer zweiten Ventil-Stellung der Injektionsdruck (p ₂) und in einer dritten Ventil- Stellung der Hochdruck (p ₁) anliegt.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß eine Hochdruckquelle (44) und eine Injektionsdruck­ quelle (46) vorgesehen sind, die über eine Hochdruck­ zuleitung (49) bzw. eine Injektionsdruckzuleitung (50) mit einer gemeinsamen, in die Mikrokapillare (10) mün­ denden Hauptleitung (40) verbunden sind, und daß in der Injektionsdruckzuleitung (50) ggf. ein zur Hauptleitung (40) hin öffnendes Rückschlagventil (56) und in der Hochdruckzuleitung (49) das Drei-Stellungs-Ventil (42) eingeschaltet ist, wobei das Drei-Stellungs-Ventil (42) mit einem dritten, gedrosselten Anschluß (64) versehen ist, der in der ersten Ventilstellung mit der Injek­ tionsdruckquelle (46) verbunden ist, zur Reduzierung des Drucks in der Hauptleitung (40) auf den Halte­ druck (p ₃).

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß in die Injektionsleitung (150; 250) zwischen der Injektionsdruckquelle und dem Rückschlagventil (156; 256) ein Druckmanometer (210; 310) eingeschaltet ist.

11. Vorrichtung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekenn­ zeichnet, daß anstelle des Drei-Stellungs-Ventils ein erstes Zwei-Stellungs-Ventil (194; 294) in die Hoch­ druckzuleitung (149; 249) eingeschaltet ist, und daß ein zweites Zwei-Stellungs-Ventil (196; 296) in eine eine Drosselstelle (166), vorzugsweise in Form eines Drosselventils (166′′; 266′′) aufweisende Nebenleitung (198; 306) eingeschaltet ist, wobei die Nebenleitung entweder mit der Hauptleitung (240), ggf. über eine weitere Leitung wie z. B. die Injektionsdruckleitung (250), ständig verbunden ist (Fig. 3) oder an einen dritten, mit der Injektionsdruckquelle verbindbaren Ausgang (164) des ersten Zwei-Stellungs-Ventils (194) angeschlossen ist (Fig. 2).

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Zwei-Stellungs-Ventil (196; 296) fuß­ betätigbar ist.

13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 12, da­ durch gekennzeichnet, daß die Injektionsdruckquelle von einem Drosselausgang (192, 150, 154; 292, 302, 250, 254) der Hochdruckquelle (144; 244) gebildet ist.

14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 13, ge­ kennzeichnet durch ein an die Hauptleitung (40; 140; 240) angeschlossenes Entspannungsventil (82; 182; 282).

15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 12, gekenn­ zeichnet durch eine an die Hauptleitung (40; 140; 240) angeschlossene, mit einem Absperrventil (88; 188; 288) versehene Zusatzleitung (86; 186; 286) zum Anschluß an eine zusätzliche Druck- und/oder Vakuumquelle.