JP5011812B2 - 細胞内への液体吐出方法及びマイクロインジェクション装置 - Google Patents

Description

本発明は細胞内への液体吐出方法及びマイクロインジェクション装置に関し、更に詳しくはライフサイエンス分野、特に再生医療、新薬開発に関する分野に用いられる細胞内への液体吐出方法及びマイクロインジェクション装置に関する。

新薬開発分野においては、細胞内に液体（通常は薬液）を吐出させるためにマイクロインジェクション装置が用いられる。図６は従来装置の構成例を示す図である。図において、１は正圧ポンプ、２は負圧ポンプである。３は正圧ポンプ１及び負圧ポンプ２と接続され、その内部の圧力を一定に保つためのレギュレータである。

４はレギュレータ３の圧力により、細胞内に液体を吐出させるキャピラリである。該キャピラリ４は注射器のようなものであり、その先端の針の内径は０．５μｍ、外径が１μｍ程度と極めて細いものである。６はレギュレータ３からキャピラリ４に圧力を伝える管、５は該管６の途中に設けられた圧力センサである。

圧力センサ５の出力は、レギュレータ３に与えられ、該レギュレータ３は圧力センサ５の出力が一定になるように、内部の圧力を調整する。或いは、その内部に圧力センサを持ち、この圧力センサの出力が一定となるように内部圧力を調整するようにしてもよい。ここで、レギュレータ３には制御信号として電圧が入力されており、入力電圧に応じた圧力を発生させるようにいる。

キャピラリ４の先端の針には予め液体が充填されている。そして、レギュレータ３からの圧力によりキャピラリ４のシリンダが押し出され、針の先端から液体が細胞に吐出（注入）される。そして、薬液が吐出された細胞の状態変化を観察する。レギュレータ３内の圧力を大気圧に戻す場合には、負圧ポンプ２でレギュレータ３内の圧力を引き、速やかに大気圧に戻すようにしている。

図７は従来装置の圧力応答を示す図である。横軸は時間、縦軸は圧力である。最初の状態では圧力は逆流防止圧に維持されている。そして、到達時間Ｔ１の後、圧力がインジェクション圧になると、キャピラリ４は細胞内に液体を吐出する。この吐出時間が所定時間続くと、次に圧力は徐々に下がり、逆流防止圧になったところで、吐出動作を終了する。

従来のこの種装置としては、遺伝子導入装置において、細胞観察装置により微細流路を流れてくる細胞を観察し、細胞捕捉装置により細胞を個々に捕捉して遺伝子導入微小針を用いて細胞内に遺伝子溶液及び薬剤溶液を注入する技術が知られている（例えば特許文献１参照）。また、その先端に微小器具がマイクロシリンジと接合されて装着され、マイクロシリンジ内に入れた液体をプランジャを雄ねじにより回すことにより、プランジャをマイクロシリンジ内に移動させ、微小器具から液体を吐出させるマイクロインジェクション装置が知られている（例えば特許文献２参照）。
特開２００４−１６６６５３号公報（段落００１０〜００１４、図１、図２） 特開平３−１１９９８９号公報（第３頁右下欄第３行〜第４頁右上欄第１９行、第１図、第２図）

マイクロインジェクション装置によるマイクロインジェクション法は、先端がμｍオーダの極細キャピラリに所定の薬液を充填し、キャピラリを加圧することで薬液を細胞に注入し、反応を見るという手法である。この際、薬液を細胞に吐出させるための圧力、キャピラリへの薬液の逆流を防止するための圧力の２つを順次切り替えて制御する必要がある。

しかしながら、従来のマイクロインジェクション装置は、図６に示すような装置を用いているため、圧力の過渡応答を考慮していない。このため、動物細胞へのインジェクション等、ｐｌ（ピコリットル）オーダ以下の微量の薬液吐出が必要な場合、吐出サイクルを上げるため導入時間を１秒以下にすると、設定圧力、設定時間と実際の応答が乖離し、吐出量の調整が困難となる。

このため、従来のマイクロインジェクション装置では、熟練者が細胞の膨張の加減等により、圧力と加圧時間を調整しながら薬液の吐出（インジェクション）を行なっていた。従って、細胞への吐出量の定量性は全く不明であった。

本発明はこのような課題に鑑みてなされたものであって、細胞への液体吐出の際に、過渡応答の影響が小さく、吐出量の制御が容易で、かつ微量吐出の高速化、安定化が可能な細胞内への液体吐出方法及びマイクロインジェクション装置を提供することを目的としている。

（１）請求項１先端が細い中空キャピラリに充填した液体を空気の圧力によって細胞内に吐出させる液体吐出方法であって、レギュレート室とキャピラリとを弁を介して接続し、レギュレート室で空気を所定の圧力にレギュレートしてから弁を開閉することにより加圧圧力を矩形波状とし、キャピラリから細胞内への液体吐出量を定量的に制御することを特徴とする細胞内への液体吐出方法において、前記キャピラリ内の圧力を検出し、検出した圧力と気体の状態方程式に基いてレギュレート室内の圧力を調整することを特徴とする。
（２）請求項２記載の発明は、前記キャピラリに加える圧力と時間の積分値が所定の値になるように制御することで、細胞内に吐出させる液体量を定量的に制御することを特徴とする。
（３）請求項３記載の発明は、圧力ポンプと、該圧力ポンプと接続され、圧力を一定にするためのれぎレギュレータと、該レギュレータと接続され、その内部を所定圧に維持するためのレギュレート室と、該レギュレート室と接続されるバルブと、該バルブと接続される中空キャピラリと、を含み、前記バルブを開閉して前記キャピラリから液体を吐出させるように構成されることを特徴とするマイクロインジェクション装置において、前記キャピラリ内の圧力を検出し、検出した圧力と気体の状態方程式に基いてレギュレート室内の圧力を調整することを特徴とする。
（４）請求項４記載の発明は、前記パルプを開いた後、バルブを閉じて細胞内にキャピラリから液体を吐出させている間に、前記レギュレート室を逆流防止圧よりも低い圧力にレギュレートすることを特徴とする。
（５）請求項５記載の発明は、前記レギュレータとレギュレート室との間に第２のバルブを更に設けたことを特徴とする。

（１）請求項１記載の発明によれば、レギュレート室とキャピラリとの間にバルブを設け、このバルブを開閉することにより、キャピラリから細胞内への液体吐出量を制御することができ、細胞への液体吐出の際に、過渡応答の影響が小さく、吐出量の制御が容易で、かつ微量吐出の高速化、安定化が可能となる。
（２）請求項２記載の発明によれば、キャピラリに加える圧力と時間との積分値が所定の値になるように制御するので、細胞内に吐出させる液体量を一定に制御することができる。
（３）請求項３記載の発明によれば、レギュレート室とキャピラリとの間にバルブを設け、このバルブを開閉することにより、キャピラリから細胞内への液体吐出量を制御することができ、細胞への液体吐出の際に、過渡応答の影響が小さく、吐出量の制御が容易で、かつ微量吐出の高速化、安定化が可能となる。
（４）請求項４記載の発明によれば、バルブを解放してキャピラリに圧力を印加した後、前記バルブを閉じ、細胞内にキャピラリから液体を吐出させている間に、レギュレート室を逆流防止圧よりも低い圧力に設定しておくことにより、バルブが再び解放された時に、レギュレート室が丁度逆流防止圧になるようにすることができ、キャピラリの液体の逆流を防止することができる。
（５）請求項５記載の発明によれば、第２のバルブを更に設けることにより、第１のバルブの開閉に伴う圧力のゆらぎを防止することができる。
６．また、この発明において、キャピラリに印加する圧力を所定圧に維持するためのレギュレート室を２系統設けることにより、バルブの開閉を速やかに行なうことができる。
７．また、この発明において、レギュレータとレギュレート室を２系統設けることにより、バルブの切り替えをより速やかに行なうことができる。

以下、図面を参照して本発明の実施の形態例を詳細に説明する。
図１は本発明の第１の実施の形態例を示す構成図である。図６と同一のものは、同一の符号を付して示す。図において、１は正圧ポンプ、２は負圧ポンプである。３は空気圧を一定に維持するレギュレータ、１０はレギュレータ３により圧力が一定に維持された空気を貯留するレギュレート室である。５はレギュレート室１０の圧力を検出する圧力センサ２であり、その出力はレギュレータ３に入力される。

レギュレート室１０の空気の圧力をＰ２、体積をＶ２とする。４は動物等の細胞に液体を吐出するキャピラリ、１１はレギュレート室１０とキャピラリ４の間に設けられたバルブである。該バルブ１１としては、例えば電磁ソレノイドを用いたものが使用され、レギュレート室１０からの空気をキャピラリ４へ印加するための開閉を行なう。１２はキャピラリ４に印加する空気の圧力を検出する圧力センサ１である。該キャピラリ４内の空気圧をＰ１、体積をＶ１とする。このように構成された装置の動作を説明すれば、以下の通りである。

先ず、レギュレータ３によりレギュレート室１０の圧力をインジェクション圧力よりもやや高めに設定しておく。オペレータは、顕微鏡（図示せず）を見ながらキャピラリ４の針が細胞に到達したことを確認すると、バルブ１１を開き、全体をインジェクション圧にする。そこで、すぐにバルブ１１を閉じる。そして、キャピラリ４から細胞に液体を吐出（インジェクト）している間に、レギュレート室１０を逆流防止圧よりも低い圧力になるようにレギュレータ３により調整する。

この後、バルブ１１を開くとレギュレート室１０とキャピラリ４の空気圧が丁度逆流防止圧になるので、キャピラリ４内に吐出液が逆流することがなくなる。予め、レギュレート室１０を逆流防止圧よりも低い圧力になるように設定しておくことにより、バルブ１１を開いた時の全体の圧力を逆流防止圧になるようにすることができる。

ここで、バルブ解放前の圧力と解放後の圧力の関係は、気体の状態方程式により求まる。Ｐをバルブ解放後の圧力、Ｐ１をバルブ解放前のキャピラリ側圧力、Ｐ２をバルブ解放前のレギュレータ側圧力、キャピラリ側の気体の体積をＶ１、レギュレータ側の気体の体積をＶ２とすると、バルブ解放後の圧力Ｐと、体積比η（＝Ｖ２／Ｖ１）は、それぞれ次式のように表される。

Ｐ＝ηＰ１＋（Ｐ２／（η＋１）） （１）
η＝Ｖ２／Ｖ１＝（Ｐ−Ｐ２）／（Ｐ１−Ｐ） （２）
（１）式によりバルブ解放前のレギュレータ側圧力Ｐ２は、次式のように表される。

Ｐ２＝（η＋１）（Ｐ−ηＰ１） （３）
ηは（２）式より求まり、またバルブ解放後の圧力Ｐは予め指定されており、バルブ解放前のキャピラリ４側圧力Ｐ１は圧力センサ１２の出力から予め分かっているので、（３）式よりバルブ解放前のレギュレート側圧力Ｐ２は求めることができる。そこで、バルブ解放前のレギュレータ側圧力Ｐ２を（３）式により求めた値に設定しておけば、バルブ１１を解放した時の圧力はＰになり、レギュレーションが行えることになる。即ち、レギュレート室とキャピラリの圧力を維持圧にすることができる。

通常のマイクロインジェクション装置では、圧力応答は図７に示すようなものとなる。これに対して、バルブを瞬時に切り替えた場合には、圧力伝播そのものは音速のため、模式的には図２に示すようなものとなる。図２は本発明の圧力応答を示す図である。横軸は時間、縦軸は圧力である。

バルブ１１を開くと圧力は、逆流防止圧から到達時間Ｔ２をへた後、インジェクション圧となる。また、バルブ１１を閉めると、図に示すようにインジェクション圧から逆流防止圧に速やかに低下する。図７に示す従来装置の特性よりも圧力の立ち上がり、立ち下がりは速くなる。

反射等の影響で、図に示すように多少の過渡応答を生じるものの、図７に示すレギュレーションを含めた応答よりも到達時間は速くなる。また、レギュレーションの過渡応答で、図７に示す従来装置の特性では単に目標値への到達時間が遅いのに対し、本発明の過渡応答は目標近傍での振動であり、その積分値は０と見なせるため、総吐出量は目標圧力×加圧時間に比例すると考えられる。

このように、本発明の実施の形態例によれば、レギュレート室とキャピラリとの間にバルブを設け、このバルブを開閉することにより、キャピラリから細胞内への液体吐出量を制御することができ、細胞への液体吐出の際に、過渡応答の影響が小さく、吐出量の制御が容易で、かつ微量吐出の高速化、安定化が可能となる。本発明によれば、キャピラリへの加圧応答の立ち上がりが高速で矩形波状となるため、加圧時間の精度が高まり、インジェクションサイクルの高速化、吐出量の精度の向上が可能となる。

また、通常、吐出量は圧力と加圧時間に比例するため、過渡応答があっても、圧力の時間積分により吐出量を制御する方法も、吐出量精度に関しては同様の効果がある。即ち、本発明によれば、キャピラリに加える圧力と時間との積分値が所定の値になるように制御するので、細胞内に吐出させる液体量を一定に制御することができる。

図３は本発明の第２の実施の形態例を示す構成図である。図１と同一のものは、同一の符号を付して示す。この実施の形態例は、レギュレータ３とレギュレート室１０との間に第２のバルブ１５を設けたものである。その他の構成は、図１と同じである。

このような構成にすると、第１のバルブ１１の開閉時において、第２のバルブ１５を閉じておき、その圧力変動がレギュレータ３に伝わらなくなり、圧力のゆらぎが発生するのを防止することができる。

図４は本発明の第３の実施の形態例を示す構成図である。図３と同一のものは、同一の符号を付して示す。図において、２５はレギュレータ３と接続されるバルブ２、２０は該バルブ２と接続されるレギュレート室２、２１は該レギュレート室２と接続されるバルブ４である。２２はレギュレート室１の圧力Ｐｉを検出する圧力センサ、２３はレギュレート室２の圧力Ｐｃを検出する圧力センサである。１２はキャピラリの圧力を検出する圧力センサである。

１５はレギュレータ３と接続されるバルブ１、１０は該バルブ１と接続されるレギュレート室、１１は該レギュレート室１と接続されるバルブ３である。バルブ１と２は共通にレギュレータ３と接続され、バルブ３とバルブ４は共通にキャピラリ４と接続されている。

このように、この実施の形態例によれば、バルブとレギュレート室とバルブよりなるレギュレート手段が２系統設けられている。このように構成することにより、バルブ３が閉じて、キャピラリ４が細胞にインジェクションしている間にレギュレート室１０をレギュレートする必要がなくなる。つまり、一系統がキャピラリ４を動作させている間に他の系統はレギュレート室をレギュレートしておき、キャピラリ４のインジェクション動作が終了した時に、他のバルブ４を開くことにより、バルブ解放後のレギュレーションを速やかに行なうことができる。従って、この実施の形態例によれば、バルブの切り替え時間を短縮することができる。

図５は本発明の第４の実施の形態例を示す構成図である。図４と同一のものは、同一の符号を付して示す。この実施の形態例は、図４の構成のうち、第２のレギュレーション系統に第２のレギュレータ３０を設けることにしたものである。第２のレギュレータ３０は正圧ポンプ１及び負圧ポンプ２と接続され、第１のレギュレータ３とは独立している。そして、第２のレギュレータ３０はバルブ２に接続される。以降の構成は、図４と同じである。

このように構成すると、レギュレータ３と３０が独立してレギュレート室の空気圧を調整するので、２つの系統は全く独立に動作することができ、図４に示す構成よりも更に高速の動作を行なうことができる。

（付記１）
先端が細い中空キャピラリに充填した液体を空気の圧力によって細胞内に吐出させる液体吐出方法において、
レギュレート室とキャピラリとを弁を介して接続し、
レギュレート室で空気を所定の圧力にレギュレートしてから弁を開閉することにより加圧圧力を矩形波状とし、キャピラリから細胞内への液体吐出量を定量的に制御する
ことを特徴とする細胞内への液体吐出方法。

（付記２）
前記キャピラリに加える圧力と時間の積分値が所定の値になるように制御することで、細胞内に吐出させる液体量を定量的に制御することを特徴とする付記１記載の細胞内への液体吐出方法。

（付記３）
圧力ポンプと、
該圧力ポンプと接続され、圧力を一定にするためのレギュレータと、
該レギュレータと接続され、その内部を所定圧に維持するためのレギュレート室と、
該レギュレート室と接続されるバルブと、
該バルブと接続される中空キャピラリと、
とを含んで構成されることを特徴とするマイクロインジェクション装置。

（付記４）
前記バルブを開いた後、バルブを閉じて細胞内にキャピラリから液体を吐出させている間に、前記レギュレート室を逆流防止圧よりも低い圧力にレギュレートすることを特徴とする付記３記載のマイクロインジェクション装置。

（付記５）
前記レギュレータとレギュレート室との間に第２のバルブを更に設けたことを特徴とする付記３記載のマイクロインジェクション装置。

（付記６）
前記キャピラリに印加する圧力を所定圧に維持するためのレギュレート室を２系統設けたことを特徴とする付記３記載のマイクロインジェクション装置。

（付記７）
前記圧力を一定にするためのレギュレータと、その内部を所定圧に維持するためのレギュレート室を２系統設けたことを特徴とする付記３記載のマイクロインジェクション装置。

このように、本発明よれば、キャピラリへの加圧応答の立ち上がりが高速で加圧波形が矩形波状となるため、加圧時間の精度が高まり、インジェクションサイクルの高速化、吐出量の精度の向上が可能となる。

本発明の第１の実施の形態例を示す構成図である。 本発明の圧力応答を示す図である。 本発明の第２の実施の形態例を示す構成図である。 本発明の第３の実施の形態例を示す構成図である。 本発明の第４の実施の形態例を示す構成図である。 従来装置の構成例を示す図である。 従来装置の圧力応答を示す図である。

符号の説明

１ 正圧ポンプ
２ 負圧ポンプ
３ レギュレータ
４ キャピラリ
５ 圧力センサ２
１０ レギュレート室
１１ バルブ
１２ 圧力センサ１

Claims (5)

1. 先端が細い中空キャピラリに充填した液体を空気の圧力によって細胞内に吐出させる液体吐出方法であって、
   レギュレート室とキャピラリとを弁を介して接続し、
   レギュレート室で空気を所定の圧力にレギュレートしてから弁を開閉することにより加圧圧力を矩形波状とし、キャピラリから細胞内への液体吐出量を定量的に制御する
   ことを特徴とする細胞内への液体吐出方法において、
   前記キャピラリ内の圧力を検出し、検出した圧力と気体の状態方程式に基いてレギュレート室内の圧力を調整することを特徴とする細胞内への液体吐出方法。
2. 前記キャピラリに加える圧力と時間の積分値が所定の値になるように制御することで、細胞内に吐出させる液体量を定量的に制御することを特徴とする請求項１記載の細胞内への液体吐出方法。
3. 圧力ポンプと、
   該圧力ポンプと接続され、圧力を一定にするためのれぎレギュレータと、
   該レギュレータと接続され、その内部を所定圧に維持するためのレギュレート室と、
   該レギュレート室と接続されるバルブと、
   該バルブと接続される中空キャピラリと、
   を含み、
   前記バルブを開閉して前記キャピラリから液体を吐出させるように構成されることを特徴とするマイクロインジェクション装置において、
   前記キャピラリ内の圧力を検出し、検出した圧力と気体の状態方程式に基いてレギュレート室内の圧力を調整することを特徴とするマイクロインジェクション装置。
4. 前記パルプを開いた後、バルブを閉じて細胞内にキャピラリから液体を吐出させている間に、前記レギュレート室を逆流防止圧よりも低い圧力にレギュレートすることを特徴とする請求項３記載のマイクロインジェクション装置。
5. 前記レギュレータとレギュレート室との間に第２のバルブを更に設けたことを特徴とする請求項３記載のマイクロインジェクション装置。

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