JP5272633B2

JP5272633B2 - 注入装置

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Publication number: JP5272633B2
Application number: JP2008260009A
Authority: JP
Inventors: 幸宏陽奥; 昭夫伊藤
Original assignee: Fujitsu Ltd
Current assignee: Fujitsu Ltd
Priority date: 2008-10-06
Filing date: 2008-10-06
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2028-10-06
Also published as: JP2010088324A

Description

本発明は、注入装置に関し、より具体的には、例えばマイクロインジェクション装置等の注入装置に関する。

近年、主にライフサイエンス、再生医療、及びゲノム創薬の分野において、細胞等の導入対象内に例えば遺伝子、抗体、タンパク質といった生体分子や化合物等を導入するために、マイクロインジェクション装置等の注入装置が適用されている。マイクロインジェクション装置は、上記のような導入物質（ｉｎｊｅｃｔａｎｔ）が充填された微細な中空のガラス針（キャピラリ針）を導入対象に突き刺し、該キャピラリ針を介して導入対象内に導入物質を注入する。この手法は、導入物質と導入対象との組合せを選ばずに遺伝子、タンパク質、化合物等を細胞等に確実に導入することができ、遺伝子の導入による人工多能性幹細胞（ＩＰＳ細胞）の作成、タンパク質の導入による機能解析、化合物導入による薬物開発等への応用が期待されている。

例えば、細胞培養マイクロチャンバ内の各培養容器としての穴の中の細胞の核酸成分の定量解析を直接的に行う手段として、マイクロチャンバ内の各容器を光学的に計測する手段と、光学的に加熱する手段と、マイクロチャンバ中の各容器に反応液を導入する手段と、各容器内の反応液が拡散、蒸発しない手段を有する核酸分析装置が、マイクロインジェクション法を用いた装置として提案されている。

また、マイクロインジェクション装置に用いられるキャピラリ針からの導入物質の吐出量を計測する技術として、微少物質吐出部材を用いて蛍光試薬を含んだ第１の溶液を、第１の溶液と界面を生じない第２の溶液中へ吐出して蛍光強度を検出する蛍光強度検出手段、予め計測した吐出量と蛍光強度との相関より吐出量を求める吐出量算出段、算出した吐出量から、微少物質吐出部材１の吐出量と圧力及び加圧時間との相関を求める演算手段、及び、演算した吐出量と圧力及び加圧時間との相関に基づいて圧力及び加圧時間を制御して吐出量を調整する調整手段とを備える物質導入装置が提案されている。
特開２００４−８１０８４号公報特開２００７−２８９０８１号公報

マイクロインジェクションにおいては、マイクロインジェクションの導入対象となる細胞は、数μｍ乃至数十μｍと非常に小さい。従って、マイクロインジェクションを行う場合、細胞内への導入物質の注入をサブピコリットルオーダーで制御する必要がある。

キャピラリ針からの導入物質の吐出量を定量的に計測する方法としては、以下に記す課題がある。

第１に、インジェクションを続けていくと、キャピラリ針の先端に細胞片又は細胞培地の不純物等が付着するなどして、キャピラリ針の針詰まりが発生し、導入物質の吐出量が減少していくおそれがある。或いは、キャピラリ針の先端の欠け等に因り、導入物質の吐出量が増大するおそれがある。従って、キャピラリ針から導入物質を導入対象に定量吐出することは困難である。

第２に、キャピラリ針の針詰まり又はキャピラリ針の先端の欠け等に因り、キャピラリ針の交換の要否を判定する定量的な基準がないため、継続してインジェクションを行った場合に、キャピラリ針から導入対象への導入物質の定量吐出の精度は、作業者の経験に左右されてしまうおそれがある。

第３に、キャピラリ針から導入対象への導入物質の定量吐出の計測は、複数の吐出条件の下で行われる必要があるため、当該計測に数分程度の時間が要される。従って、インジェクションの作業中に、キャピラリ針から導入対象への導入物質の吐出量の計測又は調整を高頻度に行うことは困難である。

そこで、本発明は、上記の点に鑑みてなされたものであって、キャピラリ針からの導入物質の定量吐出又は導入対象への定量注入を実現する注入装置を提供することを本発明の目的とする。

本発明の実施の形態の一観点によれば、キャピラリ針を備えた注入装置であって、当該注入装置には、初期計測におけるキャピラリ針の先端に印加する吐出圧及び吐出時間の積と吐出量との比が記憶され、前記キャピラリ針からの導入物質の吐出後、前記キャピラリ針の先端に印加する吐出圧及び吐出時間の積と吐出量との比を予め計測されたイニシャルポイントと最低１つの吐出条件とに基づいて計測し、当該比の、前記初期計測における比からの変化の割合を算出することを特徴とする注入装置が提供される。

本発明の実施の形態によれば、キャピラリ針からの導入物質の定量吐出又は導入対象への定量注入を実現する注入装置を提供することができる。

以下、本発明の実施の形態について説明する。

先ず、本発明の基本的概念について説明し、次いで、本発明の各実施の形態に用いられる注入装置の装置構成について説明し、しかる後、前記注入装置を用いた本発明の実施の形態について説明する。

１．本発明の基本的概念
本発明の発明者は、マイクロインジェクション法を用いた注入装置において、キャピラリ針からの吐出特性の経時変化は、キャピラリ針の先端に印加する吐出圧及び吐出時間と吐出量との比の変化に起因することに着目した。そして本発明においては、当該比の変化率をキャピラリ針の異常発生率としてキャピラリ針の異常発生の度合いを定量的に評価し、キャピラリ針の交換時期の判定又は吐出特性の変化に対する前記吐出圧及び吐出時間の調整を行っている。

図１に、マイクロインジェクション法を用いたマイクロインジェクション装置（注入装置）における、キャピラリ針の先端に印加する吐出圧及び吐出時間と吐出量との関係を示す。

図１に示すグラフにおいて、縦軸はキャピラリ針からの導入物質の吐出量［ｐＬ］を示し、横軸はキャピラリ針の先端に印加する吐出圧×吐出時間［ｋＰａ・ｍｓ］を示す。また、線Ａは、キャピラリ針の初期計測値を示し、線Ｂは４００回マイクロインジェクションを行った後のキャピラリ針の計測値を示す。

図１に示すように、初期計測（図１の線Ａ参照）において、吐出圧×吐出時間が約１２０［ｋＰａ・ｍｓ］のときに、吐出量は０（ゼロ）［ｐＬ］である（図１の点Ｃ参照）。これは、毛細管現象により、キャピラリ針内に導入物質が吸い上げられてしまわないように、所定の吐出圧を所定の吐出時間作用させて（図１の例では約１２０［ｋＰａ・ｍｓ］）いるからである。以下では、吐出量が（ゼロ）［ｐＬ］のときの吐出圧×吐出時間を、イニシャルポイントという。初期計測において、イニシャルポイントから吐出圧×吐出時間を増加させると、これに伴い、吐出量も増加する。

一方、４００回マイクロインジェクションを行った後（図１の線Ｂ参照）においては、イニシャルポイントは初期計測の場合と変化はないものの、吐出圧×吐出時間の増加に対する吐出量の増加の割合は、初期計測の場合に比し減少する。これは、マイクロインジェクションを４００回行った結果、キャピラリ針の先端に細胞片又は細胞培地の不純物等が付着する等して、キャピラリ針の針詰まりが発生し、導入物質の吐出量が減少したからである。

そこで、本発明の発明者は、マイクロインジェクション法を用いた注入装置において、キャピラリ針からの吐出特性の経時変化は、キャピラリ針の先端に印加する吐出圧及び吐出時間の積と吐出量との比の変化に起因することに着目した。本発明では、当該比のみを計測し、当該比が、予め計測し取得した初期計測における比から変化する割合をキャピラリ針の異常発生率とする。かかる異常発生率を把握することにより、針詰まり、針欠け等のキャピラリ針の異常発生の度合いを定量的に評価し、キャピラリ針の交換時期の判定又は吐出特性の変化に対する前記吐出圧及び吐出時間の調整を行うことができる。

２．本発明の各実施の形態に用いられる注入装置の装置構成
本発明の各実施の形態に用いられる注入装置の例としてのマイクロインジェクション装置の概念的構成を図２に示す。

図２に示すように、本発明の実施の形態に用いられるマイクロインジェクション装置１０は、照明制御装置１１、キャピラリ針位置・吐出制御装置１２、及びステージ制御装置１３に接続している。かかる照明制御装置１１、キャピラリ針位置・吐出制御装置１２、及びステージ制御装置１３は、ＰＣ１４に接続しており、ＰＣ１４により操作される。

マイクロインジェクション装置１０にあっては、対物レンズ１５を上下移動させるフォーカス手段を持つ同軸照明付きの倒立型高倍率顕微鏡１６の上方に、ＸＹステージ１７が設けられている。ステージ制御装置１３に接続しているＸＹステージ１７により、ＸＹステージ１７上に設けられ、細胞１８を収容するシャーレ１９が観察位置まで移動する。

倒立型高倍率顕微鏡１６の内部には、励起光源２０、励起フィルタ２１、冷却ＣＣＤカメラ２２、蛍光フィルタ２３及び反射ミラー２４が設けられている。シャーレ１９内に収容された細胞１８に蛍光試薬が含まれていると、励起光源２０からの励起光によって蛍光試薬が励起されて蛍光が発生し、発生した蛍光は反射ミラー２４を介して蛍光フィルタ２３に入射する。蛍光フィルタ２３によって蛍光波長以外の波長の光がカットされて、蛍光のみが、例えば約−７０℃に冷却された冷却ＣＣＤカメラ２２によって強度検出される。

また、ＸＹステージ１７の上方には、照明制御装置１１に接続された明視野照明ＬＥＤ２５が設けられている。明視野照明ＬＥＤ２５によりシャーレ１９の上面を照射して観察を容易にする。

マイクロインジェクション装置１０には、シャーレ１９内に収容された細胞１８に導入物質としての蛍光試薬を吐出するキャピラリ針２６が設けられている。キャピラリ針２６は、キャピラリ針位置・吐出制御装置１２に接続されており、キャピラリ針位置・吐出制御装置１２により、キャピラリ針２６の位置が制御され、更に、キャピラリ針２６からの蛍光試薬の吐出が制御される。

３．本発明の第１の実施の形態
まず、上述のマイクロインジェクション装置１０を用いた本発明の第1の実施の形態におけるキャピラリ針２６の異常発生のチェック及びキャピラリ針２６の調整の工程について説明する。

本発明の第１の実施の形態におけるキャピラリ針２６の異常発生のチェック及びキャピラリ針２６の調整においては、先ず、予め計測し保持している初期計測における「キャピラリ針２６の先端に印加する吐出圧×吐出時間と吐出量との比、及びイニシャルポイント（図１の点Ｃ参照）」を取得する（ステップＳ１）。なお、初期計測における「キャピラリ針２６の先端に印加する吐出圧及び吐出時間と吐出量との比、及びイニシャルポイント」の取得方法は、公知の定量計測方法を用いてもよい。

次に、キャピラリ針２６からの蛍光試薬の吐出を計測する回数Ｎ、キャピラリ針２６の交換時期を示す詰まり率の最大閾値ＭａｘＲａｔｅ及び最小閾値ＭｉｎＲａｔｅ、及びキャピラリ針２６からの吐出量Ｖを指定する（ステップＳ２）。前記回数Ｎ、最大閾値ＭａｘＲａｔｅ及び最小閾値ＭｉｎＲａｔｅ、及び吐出量Ｖは計測の度に指定してもよく、或いは、これらをパラメータとして保存し、繰り返し適用してもよい。なお、キャピラリ針２６からの蛍光試薬の吐出を計測する回数Ｎの値が小さければ小さいほど、工程時間の短縮を図ることができる。

次に、キャピラリ針位置・吐出制御装置１２を介して、キャピラリ針２６をシャーレ１９内に収容した細胞１８に接触しない、培地の所定の位置に移動させる（ステップＳ３）。キャピラリ針２６の移動位置は、細胞１８に接触しない限りどの位置でもよいが、例えば細胞１８の上方約２０μｍ乃至約１５０μｍであることが望ましい。また、ステージ制御装置１３によりＸＹステージ１７を移動させて、キャピラリ針２６をシャーレ１９内に収容した細胞１８に接触しない、培地の所定の位置に位置させてもよい。

次いで、蛍光フィルタ２３及びミラー２４を、キャピラリ針２６から吐出される蛍光試薬に最適なものに切り替える（ステップＳ４）。しかる後、照明制御装置１１により、明視野照明ＬＥＤ２５の照明をＯＦＦにし（ステップＳ５）、キャピラリ針２６から蛍光試薬を吐出する前の背景画像ＢＧをＣＣＤカメラ２２によって取得する（ステップＳ６）。

次いで、キャピラリ針位置・吐出制御装置１２を介して、ステップＳ２において指定したキャピラリ針２６からの蛍光試薬の吐出量Ｖに対応した吐出圧および吐出時間で、蛍光試薬をキャピラリ針２６から吐出する（ステップＳ７）。吐出量Ｖに対応した吐出圧および吐出時間は、ステップＳ１で取得した「初期計測におけるキャピラリ針２６の先端に印加する吐出圧及び吐出時間と吐出量との比、及びイニシャルポイント）」用いてステップＳ２において指定したキャピラリ針２６からの蛍光試薬の吐出量Ｖから算出する。そして、蛍光試薬をキャピラリ針２６から吐出した直後の蛍光画像ＦＬをＣＣＤカメラ２２によって取得する（ステップＳ８）。

次に、蛍光試薬をキャピラリ針２６から吐出した直後の蛍光画像ＦＬ（ステップＳ８参照）とキャピラリ針２６から蛍光試薬を吐出する前の背景画像ＢＧ（ステップＳ６参照）の差分画像ＤＦから、差分画像の輝度総和Ｉを取得する（ステップＳ９）。

具体的には、画像の横方向のピクセル位置をｘ、縦方向のピクセル位置をｙとし、背景画像ＢＧの各画素の輝度をＢＧｐ（Ｘ，Ｙ）、蛍光画像ＦＬの各画素の輝度をＦＬｐ（Ｘ，Ｙ）とすると、差分画像の輝度総和Ｉは以下の式で表される。

次に、予め求めている輝度総和と吐出量の関係式より、指定した吐出圧・吐出時間に対する吐出量Ｖ'を取得する。輝度総和と吐出量は比例関係にあり、両者の関係係数をα０とすると、吐出量Ｖ'は以下の式で表される。

しかる後、キャピラリ針２６からの蛍光試薬の吐出をＮ回行ったか否かを判定する（ステップＳ１１）。Ｎ回の吐出を終了している場合（ステップＳ１１のＹＥＳ）には、ステップＳ１２に進む。Ｎ回の吐出を終了していない場合（ステップＳ１１のＮＯ）には、ステップＳ６に戻り、Ｎ回の吐出が終了するまでステップＳ６乃至ステップＳ１１を繰り返す。

Ｎ回の吐出を終了している場合には、指定した吐出圧・吐出時間での実際の吐出量Ｖ'とステップＳ１で取得したイニシャルポイントとに基づき、吐出量と吐出圧×吐出時間との比を計測する（ステップＳ１２）。

そして、ステップＳ１２で計測した吐出量と吐出圧×吐出時間との比の、ステップＳ１で取得した吐出量と吐出圧×吐出時間との比からの変化率、即ち、キャピラリ針２６の異常発生率ＣｌｏｇＲａｔｅを算出する（ステップＳ１３）。即ち、図６において、初期計測時における吐出量と吐出圧×吐出時間との比からの、ステップＳ１２で計測した吐出量と吐出圧×吐出時間との比の変化率が、キャピラリ針２６の異常発生率ＣｌｏｇＲａｔｅとなる。上記ＣｌｏｇＲａｔｅは、ステップＳ１２で計測した吐出量と吐出圧×吐出時間との比をη'とし、ステップＳ１で取得した吐出量と吐出圧×吐出時間との比をη０とすると、以下の式で表すことができる。

上記式において、ＣｌｏｇＲａｔｅが正（プラス）の場合はキャピラリ針２６は針欠けの状態の傾向にあり、ＣｌｏｇＲａｔｅが負（マイナス）の場合はキャピラリ針２６は針詰まりの傾向にある。

次に、上記ＣｌｏｇＲａｔｅがキャピラリ針２６の交換時期を示す詰まり率の最大閾値ＭａｘＲａｔｅ及び最小閾値ＭｉｎＲａｔｅを超えていないか否かを判定する（ステップＳ１４）。

具体的には、上記ＣｌｏｇＲａｔｅが最大閾値ＭａｘＲａｔｅを上回っている場合にはキャピラリ針２６は針欠けの状態の傾向にあり、上記ＣｌｏｇＲａｔｅが最小閾値ＭｉｎＲａｔｅを下回っている場合にはキャピラリ針２６は針詰まりの状態にあると判定し、キャピラリ針２６の交換を指示する。このように、本フローにより、マイクロインジェクション装置１０のユーザは、キャピラリ針２６の状態を認知することができる。

上記ＣｌｏｇＲａｔｅが最小閾値ＭｉｎＲａｔｅよりも大きく、且つ、最大閾値ＭａｘＲａｔｅよりも小さい場合には、キャピラリ針２６の状態は正常な許容範囲内にあると判定され、キャピラリ針２６からの吐出量がステップ２で指定した吐出量Ｖになるように、上記ＣｌｏｇＲａｔｅに基づいて、キャピラリ針２６の吐出圧および吐出時間を調整（自動補正）する（ステップＳ１６）。

キャピラリ針２６の吐出圧および吐出時間を調整（自動補正）における計算は、例えば、以下の式に基づいて行うことができる。即ち、当該調整前のキャピラリ針２６の吐出量Ｖは、吐出圧をＰ、吐出時間をＴ、吐出係数(吐出量と吐出圧×吐出時間との比)をηとすると、以下の式で表され、

当該調整後のキャピラリ針２６の吐出圧Ｐ'および吐出時間Ｔ'は以下の式で表すことができる。

上記２つの式が成立する吐出圧Ｐ'および吐出時間Ｔ'を設定することにより、指定した吐出量Ｖでのキャピラリ針２６の吐出を再現することができる。なお、吐出圧Ｐ'および吐出時間Ｔ'の比率は自由に設定することができ、例えば、以下の式にあるように、係数Ｋを使用して吐出圧Ｐ'を設定することができる。

このように、上述の方法によれば、キャピラリ針の先端に印加する吐出圧及び吐出時間と吐出量との比を計測し、予め計測し取得した初期計測における比からの変化率をキャピラリ針の異常発生率としている。かかる異常発生率を把握することにより、針詰まり、針欠け等のキャピラリ針の異常発生の度合いを定量的に評価し、キャピラリ針の交換時期の判定又は吐出特性の変化に対する前記吐出圧及び吐出時間の調整を行うことができる。よって、キャピラリ針からの吐出量を定量化することが可能となる。

更に、前記異常発生率についての一定の閾値が設けられているため、キャピラリ針２６の交換時期をユーザが判定することができる。

また、上記異常発生率の計測は、予め計測されたイニシャルポイントと、最低１つの吐出条件で蛍光試薬を吐出すればよいため、従来の吐出量の定量計測に比べ短時間で吐出特性の変化を計測することが可能であり、高頻度の計測、吐出調整が可能となる。

ところで、図３乃至図５に示すキャピラリ針２６の異常発生のチェック及びキャピラリ針２６の調整作業は、手動で行う場合のほか、予め実行間隔を指定しておき、当該所定の実行間隔で自動で行うことができる。これにより、キャピラリ針２６からの吐出量を一定に保ちながらマイクロインジェクションを行うことができる。

これについて、図７及び図８等を参照して説明する。

まず、ＰＣ１４において、各装置１０乃至１３を操作するためのＧＵＩ（ＧｒａｐｈｉｃａｌＵｓｅｒＩｎｔｅｒｆａｃｅ）表示を行い、ＸＹステージ１７、対物レンズ１５、キャピラリ針２６等の位置の原点出しを行う（ステップＳ２１）。

次いで、細胞１８が収容されたシャーレ１９をＸＹステージ１７上に搭載し（ステップＳ２２）、細胞１８への対物レンズ１５の焦点合せを行う（ステップＳ２３）。なお、対物レンズ１５の位置の調整は手動で行っても電動で行ってもよい。

そして、キャピラリ針２６をマイクロインジェクション装置１０に取り付け（ステップ２４）、キャピラリ針２６の位置を調整する（ステップＳ２５）。例えば、キャピラリ針２６が、ＣＣＤカメラ２２の視野中央であって、且つ、シャーレ１９の底部から上方に約１００μｍ以内の高さに位置するように調整することが望ましい。このように調整することによりキャピラリ針２６の異常発生のチェックの精度を向上させることができる。

次に、初期の「キャピラリ針２６の先端に印加する吐出圧及び吐出時間と吐出量との比、及びイニシャルポイント」を計測し記録する（ステップＳ２６）。当該計測は、公知の定量計測方法を用いてもよい。

しかる後、異常発生のチェックを行うマイクロインジェクションの間隔（実行間隔）を指定又は設定値を読み込む（ステップＳ２７）。上記実行間隔の指定は、例えば１０回のマイクロインジェクション毎等、インジェクションの回数で行ってもよく、或いは経過時間で行ってもよい。また、設定方法についても、マイクロインジェクション装置のユーザが手入力で行ってもよく、予め登録してあるパラメータを呼び出して行ってもよい。

次に、詳細は後述するが、マイクロインジェクションの対象となる細胞１８の位置を指定し（ステップＳ２８）、指定した細胞１８にキャピラリ針２６を挿入し、蛍光試薬を指定した吐出量吐出し（ステップＳ２９）、その後キャピラリ針２６を細胞１８から抜く。

このようにマイクロインジェクション動作を終了した後に、マイクロインジェクションを終了するか否かの決定を行い（ステップＳ３０）、マイクロインジェクションを終了する（ステップＳ３０がＹＥＳ）の場合には、細胞１８を収容したシャーレ１９及びキャピラリ針２６をマイクロインジェクション１０から取り外し（ステップＳ３１）、マイクロインジェクションを終了する。

マイクロインジェクションを終了しない（ステップＳ３０がＮＯ）の場合には、マイクロインジェクションをステップＳ２７で指定した間隔分行った否かを確認する（ステップＳ３２）。

マイクロインジェクションをステップＳ２７で指定した間隔分行った場合には、ステップＳ３３に進む。ステップＳ３３では、図３乃至図５を参照して説明したステップＳ１乃至ステップＳ１６が実行される。即ち、キャピラリ針２６の異常発生のチェック及びキャピラリ針２６の調整が行われる。

ステップＳ３２において、マイクロインジェクションをステップＳ２７で指定した間隔分行っていないと判定される場合には、マイクロインジェクションをステップＳ２７で指定した間隔分行っていないと判定される迄、ステップＳ２８乃至Ｓ３２の工程を繰り返す。

上述の、マイクロインジェクション動作（ステップＳ２８及びステップＳ２９）と、キャピラリ針２６の異常発生のチェック及びキャピラリ針２６の調整の動作（ステップＳ３３）におけるキャピラリ針２６の位置について、図９及び図１０を参照して説明する。なお、図９は側面図であり、図１０は、対物レンズ１５による観察イメージ図である。

ステップＳ２８においては、図９のＳ２８及び図１０（ａ）に示すように、マイクロインジェクションの対象となる細胞１８の位置（図１０（ａ）において十字で示す箇所）を指定する。このとき、キャピラリ針２６の先端は、シャーレ１９内に収容された培地の上方に位置している。

ステップ２９においては、図９のＳ２９及び図１０（ｂ）に示すように、指定した細胞１８にキャピラリ針２６を挿入し、蛍光試薬を指定した吐出量吐出する。このとき、キャピラリ針２６の先端は細胞１８内に位置している。

マイクロインジェクションをステップＳ２７で指定した間隔分行い、ステップ３３に進むと、図９のＳ３３及び図１０（ｃ）に示すように、キャピラリ針２６は、細胞１８に接触しない位置に上昇し、蛍光試薬が吐出されて、キャピラリ針２６の先端に印加する吐出圧及び吐出時間と吐出量との比が計測される。これにより、キャピラリ針２６の異常発生のチェック及びキャピラリ針２６の調整が行われる。

本実施の形態の一例として、本発明の発明者は、キャピラリ針２６からの吐出量を０．５[ｐＬ]と指定し、マイクロインジェクション２０回毎にキャピラリ針２６の針詰まり率を計測した。この結果を図１１（ａ）に示す。図１１（ａ）から明らかなように、マイクロインジェクションを行う毎に（マイクロインジェクションの回数が増加するほど）、キャピラリ針２６の針詰まりが進行することが分かった。

更に、図１１（ｂ）に示すように、上述のキャピラリ針２６の異常発生のチェック及びキャピラリ針２６の調整を行った場合（図１１（ｂ）における「補正あり」で示す曲線）は、当該チェック及び調整を行わなかった場合（図１１（ａ）における「補正なし」で示す曲線）の場合に比し、高精度にキャピラリ針２６の吐出量の調整が可能であることが分かった。

このように、図７及び図８に示す工程によれば、図３乃至図５に示す工程と同様に、キャピラリ針の先端に印加する吐出圧及び吐出時間と吐出量との比を計測し、当該比が、予め計測し取得した初期計測における比からの変化率をキャピラリ針の異常発生率としている。かかる異常発生率を把握することにより、針詰まり、針欠け等のキャピラリ針の異常発生の度合いを定量的に評価し、キャピラリ針の交換時期の判定又は吐出特性の変化に対する前記吐出圧及び吐出時間の調整を行うことができる。

更に、予め指定した所定の実行間隔で、キャピラリ針２６の異常発生のチェック及びキャピラリ針２６の調整作業を自動で行っているため、キャピラリ針２６からの吐出量を一定に保ちながらマイクロインジェクションを行うことができる。

なお、図７及び図８に示す工程では、マイクロインジェクションを行った後に、キャピラリ針２６の異常発生のチェック及びキャピラリ針２６の調整作業を行っているが、これとは逆に、まずキャピラリ針２６の異常発生のチェック及びキャピラリ針２６の調整作業を行い、次いで、マイクロインジェクションを行ってもよい。これにより、所定の実行間隔でキャピラリ針２６の異常発生のチェック及びキャピラリ針２６の調整作業を行いながら、安定した吐出量でマイクロインジェクションを行うことができる。

４．本発明の第２の実施の形態
マイクロインジェクション装置１０のキャピラリ針２６から吐出された導入物質は１００％、導入対象に注入されるわけではない。一方、マイクロインジェクション装置のユーザにとっては、導入対象に実際にどれだけの量の導入物質が注入されたのかを把握することは重要である。しかるに、従来においては、ＬＥＤ明視野により細胞を目視して当該注入量を推定するしか術はなかった。本発明の第２の実施の形態では、以下の工程により、マイクロインジェクションによる細胞１８への導入物質を計測・表示している。

なお、本発明の第２の実施の形態の説明にあたり参照する図面において、先に参照した図面において示した箇所・工程と同じ箇所・工程には同じ符号を付して、その説明を省略する。

本発明の第２の実施の形態においては、図７に示すステップＳ２１乃至ステップＳ２６及び図８・図１２に示すステップＳ２７及びステップＳ２８の動作終了後、図８・図１２に示すステップＳ３０の動作開始前に、細胞１６への蛍光試料の注入量の計測が行われる（ステップＳ４０）。

細胞１６への蛍光試料の注入量の計測（ステップＳ４０）の工程フローの詳細について、図１３を参照して説明する。また、図１４に、図１３に示すステップＳ４０−１、ステップＳ４０−３、及びステップＳ４０−４における、対物レンズ１５による観察イメージ図を示す。

先ずキャピラリ針２６を細胞１６に挿入する前の背景画像ＢＧ２を取得する（ステップＳ４０−１）。このときの画像の横方向のピクセル位置をｘ、縦方向のピクセル位置をｙとすると、背景画像ＢＧ２の各画素の輝度はＢＧ２ｐ（ｘ，ｙ）と表される。

次に、細胞１６にキャピラリ針２６を挿入し、蛍光試薬を指定した吐出量で吐出し、キャピラリ針２６を抜き（ステップＳ４０−２）、キャピラリ針２６を抜いた後の細胞の蛍光画像ＦＬ２を取得する（ステップＳ４０−３）。このときの画像の横方向のピクセル位置をｘ、縦方向のピクセル位置をｙとすると、蛍光画像ＢＧ２の各画素の輝度はＦＬ２ｐ（ｘ，ｙ）と表される。

しかる後、前記ＦＬ２とＢＧ２との差分画像ＤＦ２から、差分画像の輝度総和Ｉ２を取得する（ステップＳ４０−４）。具体的には、差分画像の輝度総和Ｉ２は、以下の式で表される。

次いで、蛍光試薬体積と蛍光総和の相関から細胞１６への蛍光試薬の注入量Ｖ２'を取得する（ステップＳ４０−５）。蛍光試薬体積と蛍光強度とは比例関係にあり、両者の相関係数をα０'とすると、細胞１６への蛍光試薬の注入量Ｖ２'は以下の式で表される。

なお、蛍光試薬体積と蛍光強度の相関係数をα０'として、輝度総和と吐出量の関係係数をα０（数式２参照）を用いてもよい。

しかる後、細胞１６への蛍光試薬の注入量Ｖ２'をＰＣ１４に表示する（ステップＳ４０−６）。

このように、細胞１６への蛍光試薬の注入量Ｖ２'の計測は、細胞１６の内部への吐出という点以外は、本発明の第１の実施の形態で示した指定した吐出圧・吐出時間での吐出量Ｖ'の計測と同様のアルゴリズムにより計算することができる。

図１３に示すステップＳ４０−１乃至ステップ４０−６に示す動作により、指定した吐出量での蛍光試薬のインジェクションに対する、当該蛍光試薬の細胞１６内への実際の注入量を確認することができる。更に、マイクロインジェクション装置１０を用いてマイクロインジェクションを行いながら、細胞１６内への蛍光試薬の注入量をリアルタイムで計測することができ、マイクロインジェクション装置１０のユーザが容易に蛍光試薬の注入量を確認できる。

５．本発明の第３の実施の形態
本発明の第３の実施の形態は、本発明の第２の実施の形態における蛍光試薬のインジェクションの前後に、画像のバックグランド輝度の補正を行って、細胞への蛍光試薬の注入量のより高精度な計測を実現するものである。

即ち、本発明の第３の実施の形態においては、図７に示すステップＳ２１乃至ステップＳ２６及び図８・図１２に示すステップＳ２７及びステップＳ２８の動作終了後、図８・図１２に示すステップＳ３０の動作開始前に、図１５に示す細胞１６への蛍光試料の注入量の計測が行われる（ステップＳ５０）。

なお、図１６に、図１３に示すステップＳ５０−１、ステップＳ５０−３、及びステップＳ５０−４における、対物レンズ１５による観察イメージ図を示す。

また、本発明の第３の実施の形態の説明にあたり参照する図面において、先に参照した図面において示した箇所・工程と同じ箇所・工程には同じ符号を付して、その説明を省略する。

同時に、前記ＢＧ２のバックグラウンド計測領域（図１６（ａ）参照）の平均輝度ＢＧ２ｐ_ＡＶＲを取得する。

ここで、バックグラウンド計測領域とは、画像の上、下、右の端辺より一定の幅の領域をさす。一辺の幅は、例えば３０ピクセル以下が望ましいが、当該幅の長さに特に限定はない。また、図１６に示す例では、画像の３辺を使用しているが、蛍光試薬の蛍光が影響しない領域である限り、画像の１乃至４辺を用いてもよい。

前記ＢＧ２のバックグラウンド計測領域の各画素の輝度をＢＧ２ｐｂ（ｘ，ｙ）、バックグラウンド計測領域の画素数をＢＧＡとすると、平均輝度ＢＧ２ｐ_ＡＶＲは以下の式で表される。

次に、細胞１６にキャピラリ針２６を挿入し、蛍光試薬を指定した吐出量で吐出し、キャピラリ針２６を細胞１６から抜き（ステップＳ５０−２）、キャピラリ針２６を抜いた後の細胞の蛍光或いは明視野−蛍光同時観察画像ＦＬ２を取得する（ステップＳ５０−３）。このときの画像の横方向のピクセル位置をｘ、縦方向のピクセル位置をｙとすると、蛍光画像ＢＧ２の各画素の輝度はＦＬ２ｐ（ｘ，ｙ）と表される。

同時に、前記ＦＬ２のバックグラウンド計測領域（図１６（ｂ）参照）の平均輝度ＦＬ２ｐ_ＡＶＲを取得する。

前記ＦＬ２のバックグラウンド計測領域の各画素の輝度をＦＬ２ｐｂ（ｘ，ｙ）、バックグラウンド計測領域の画素数をＦＬＡとすると、平均輝度ＦＬ２ｐ_ＡＶＲは以下の式で表される。

しかる後、前記ＦＬ２ｐ（ｘ，ｙ）とＢＧ２ｐ（ｘ，ｙ）との差分画像から、差分画像の輝度総和Ｉ２を取得する（ステップＳ５０−４）。このとき、上記の平均輝度ＢＧ２ｐ_ＡＶＲ及びＦＬ２ｐ_ＡＶＲから、以下の式で表されるバックグランド輝度差Ｐ_ＯＦＳを求める。

そして、前記ＦＬ２、ＢＧ２、及びＰ_ＯＦＳからバックグラウンド輝度差を補正した差分画像ＤＦ２を計算し、差分画像の輝度総和Ｉ２を取得する。具体的には、差分画像の輝度総和Ｉ２は、以下の式で表される。

次いで、蛍光試薬体積と蛍光総和の相関から細胞１６への蛍光試薬の注入量Ｖ２'を取得する（ステップＳ５０−５）。蛍光試薬体積と蛍光強度とは比例関係にあり、両者の相関係数をα０'とすると、細胞１６への蛍光試薬の注入量Ｖ２'は以下の式で表される。

しかる後、細胞１６への蛍光試薬の注入量Ｖ２'をＰＣ１４に表示する（ステップＳ５０−６）。

このように、本発明の第３の実施の形態に示す工程によれば、画像のバックグランド輝度の補正を行っており、明視野照明及び励起照明の輝度ばらつきの影響を低減することができる。よって、細胞１６への蛍光試薬の注入量のより高精度な計測を実現することができる。

以上、本発明の実施の形態について詳述したが、本発明は特定の実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨の範囲内において、種々の変形及び変更が可能である。

マイクロインジェクション法を用いた注入装置における、キャピラリ針の先端に印加する吐出圧及び吐出時間と吐出量との関係を示すグラフである。本発明の実施の形態に用いられるマイクロインジェクション装置の概念的構成図である。本発明の第１の実施の形態におけるキャピラリ針の異常発生のチェック及び調整を説明するための工程フロー図（その１）である。本発明の第１の実施の形態におけるキャピラリ針の異常発生のチェック及び調整を説明するための工程フロー図（その２）である。本発明の第１の実施の形態におけるキャピラリ針の異常発生のチェック及び調整を説明するための工程フロー図（その３）である。初期計測時における吐出量と吐出圧×吐出時間との比と、ステップＳ１２で計測した吐出量と吐出圧×吐出時間との比との変化を説明するためのグラフである。本発明の第１の実施の形態におけるキャピラリ針の異常発生のチェック及び調整を、所定の実行間隔で自動で行う場合の工程を説明する工程フロー図（その１）である。本発明の第１の実施の形態におけるキャピラリ針の異常発生のチェック及び調整を、所定の実行間隔で自動で行う場合の工程を説明する工程フロー図（その２）である。図８のステップＳ２８、ステップＳ２９、及びステップＳ３３におけるキャピラリ針２６の位置を説明するための図（その１）である。図８のステップＳ２８、ステップＳ２９、及びステップＳ３３におけるキャピラリ針２６の位置を説明するための図（その２）である。本発明の第１の実施の形態の効果を説明するための図である。本発明の第２の実施の形態における工程フローを説明するための図である。図１２に示すステップＳ４０の詳細を説明するための工程フロー図である。図１３に示すステップＳ４０−１、ステップＳ４０−３、及びステップＳ４０−４を説明するための図である。本発明の第３の実施の形態における工程フローを説明するための図である。図１５に示すステップＳ５０−１、ステップＳ５０−３、及びステップＳ５０−４を説明するための図である。

符号の説明

１０マイクロインジェクション装置
１１照明制御装置
１２キャピラリ針位置・吐出制御装置
１３ステージ制御装置
１４ＰＣ
１５対物レンズ
１６顕微鏡
１７ＸＹステージ
１８細胞
１９シャーレ
２０励起光源
２１励起フィルタ
２２ＣＣＤカメラ
２３蛍光フィルタ
２４反射ミラー
２５明視野照明ＬＥＤ
２６キャピラリ針

Claims

キャピラリ針を備えた注入装置であって、
当該注入装置には、初期計測におけるキャピラリ針の先端に印加する吐出圧及び吐出時間の積と吐出量との比が記憶され、
前記キャピラリ針からの導入物質の吐出後、前記キャピラリ針の先端に印加する吐出圧及び吐出時間の積と吐出量との比を予め計測されたイニシャルポイントと最低１つの吐出条件とに基づいて計測し、当該比の、前記初期計測における比からの変化の割合を算出することを特徴とする注入装置。
請求項１記載の注入装置であって、
前記キャピラリ針からの導入物質の吐出後に計測される、前記キャピラリ針の先端に印加する吐出圧及び吐出時間の積と吐出量との比の、前記初期計測における比からの変化の割合が、所定の閾値を超える場合に、異常発生と判断されることを特徴とする注入装置。
請求項１記載の注入装置であって、
前記キャピラリ針からの導入物質の吐出後に計測される、前記キャピラリ針の先端に印加する吐出圧及び吐出時間の積と吐出量との比の、前記初期計測における比からの変化の割合が、所定の閾値を超えない場合には、予め指定した吐出量になるように前記吐出圧及び吐出時間が調整されることを特徴とする注入装置。
請求項１乃至３いずれか一項記載の注入装置であって、
前記キャピラリ針から蛍光試薬が吐出され、
前記キャピラリ針から前記蛍光試薬が吐出される前の背景画像と、指定された吐出圧及び吐出時間で前記蛍光試薬が吐出された後の蛍光画像との差分画像の輝度総和が計測され、
前記輝度総和に基づき前記吐出量が算出され、前記指定された吐出圧及び吐出時間の積と前記吐出量との比が計測されることを特徴とする注入装置。
請求項１乃至４いずれか一項記載の注入装置であって、
指定した間隔で前記キャピラリ針を導入対象に接触しない位置に移動させて、前記キャピラリ針の先端に印加する吐出圧及び吐出時間の積と吐出量との比が計測されることを特徴とする注入装置。