SE456745B - Foerfarande och anordning foer injicering av mycket smaa provmaengder i celler - Google Patents

Description

w ».~ 10 15 _ 29 25 30 35 40 456 745 a,- föreslås det att man upprepat, efter ett flertal injiceringar utsätter kapillärhåligheten för högtryck. Högtrycket kan där- vid vara omkring S till 100 gånger, företrädesvis 10 till 30 gånger och bäst omkring 17 gånger så stort som injicerings- -trycket.

Det föreslås att injiceringstrycket uppgår till 0,01 till 0,5 bar, företrädesvis 0,1 till 0,2 bar och bäst omkring 0,12 bar. Härmed later sig ytterst låga injiceringstal uppnås som kan uppgå till mellan 10-11 och 10-13 provvätska per sekund.

Allt efter injiceringens varaktighet kan man i de enskilda cellerna spruta in provmängder i storleksordningen mellan 10- och 10-13 under 100 pm, ja till och med under 60 pm.

Vid det inledningsvis anförda kända förfarandet fylls provvätskan i mikrokapillärröret genom att man doppar spetsen 11 ml. Storleken på ifrågavarande ufller kan därvid ligga i provvätska och bildar ett undertryck i kapillärhâligheten genom att dra ut sprutkolven. Insugningsförloppet varar rela- tivt länge; vidare måste man göra i ordning mer provvätska än som erfordras för injektionen. Denna nackdel undviks när man enligt uppfinningen fyller provvätskan från kapillärrörets andra ände, företrädesvis med ett pàfyllningskapillärrör med mindre ytterdiameter än mikrokapillärrörets innerdiameter, var- vid man skjuter in pàfyllningskapillärröret med avgivníngs- änden först i mikrokapillärröret till närheten av mikro- kapillärrörets spets. Då provvätskan fylls på i närheten av kapillärspetsen bortfaller risken att provvätska som flyter längs kapillärrörets innervägg tar med sig vidhäftande för- oreningar, vilka senare kan leda till igensättning av spetsen.

Vidare får man i motsats till det kända förfarandet praktiskt taget ingen förlust av provvätska genom avdunstning vid på- fyllningen.

Genom det inledningsvis nämnda litteraturcitatet är ett förfarande för framställning av de mikrokapillärrör som används vid injiceringsförfarandet känt. Härvid spänner man fast ett kapillärrör i båda ändar i backarna till en draganordníng och upphettar sedan ett område av röret mellan backarna medelst en röret omslutande värmetrádspole och drar slutligen kapil- lärröret genom att föra bort backarna från varandra, varigenom man erhåller två mikrokapillärrör med spets. Vid detta kända förfarande förs kapillärröret för hand in i en låga från en 10 15 25 30 35 40 (-0 456 745 bunsenbrännare så att nämnda röromràde fràn början är mer eller mindre insnört. En av nackdelarna är därvid att de pá detta sätt erhållna míkrokapillärrören uppvisar från varandra mer eller mindre starkt avvikande dimensioner; särskilt visar spetsarnas innerdiametrar upp betydande skillnader. Vidare är denna framställningsmetod mödosam och relativt tidskrävande.

I motsats därtill erhåller man pà ett enkelt och snabbt sätt mikrokapillärrör med reproducerbara mått när man i draganord- ningen sätter fast utan tidigare manuell dragning ett kapillär- rör vilket är likformigt utefter hela längden.

Genom det inledningsvis angivna litteraturcitatet är det även känt att innan dragningen utsätta kapillärröret för en tvätt för att undvika igensättningar av spetsen till följd av föroreningar i kapillärhàligheten. Medan man vid det kända för- farandet arbetar med en blandning av HZSO4 och HNO3 föreslås enligt uppfinningen, att man före dragningen tvättar kapillär- röret minst en timme med etanol och företrädesvis torkar det omkring so min i anslutning aartiu vid omkring 1so°c. man uppnår härigenom särskilt goda tvättresultat.

Vidare har det visat sig fördelaktigt om man före drag- ningen gör kapillärröret vattenavstötande, förslagsvis genom behandling med dimetyldiklorsilan i etanol eller med silikon- försett lösning i eter (1:3).

Uppfinningen avser också en anordning för genomförande av injiceringsförfarandet. Genom det nämnda litteraturcitatet är det känt att åstadkomma injektionstrycket med hjälp av en handspruta. Detta har nackdelen att man inte kan ställa in injektionstrycket till ett pà förhand, i praktiken reproducer- bart, bestämt konstant värde. Det finns ingen möjlighet till automatisering heller. För att undvika denna nackdel känneteck- nas anordningen enligt uppfinningen genom minst en tryckkälla för konstant tryck, företrädesvis i form av en tryckgasflaska.

För att kunna injicera så många celler som möjligt per tidsenhet bör handhavandet vara så enkelt som möjligt. Man klarar sig med enknappsmanövrering då man, vilket föreslås enligt uppfinningen, kopplar in en handmanövrerad treläges- ventil mellan tryckkällan och mikrokapíllärröret så att pá mikrokapillärröret ligger i ett första ventilläge hålltrycket, i ett andra ventilläge injiceringstrycket och i ett tredje ventilläge högtrycket. Med en hand kan då trelägesventilen '.\\» 10 15 25 30 SS 40' 456 745 manövreras och med den andra handen míkromanipulatorn till mikrokapillärröret. Utan speciell handledning och längre övning láter sig injektionstal från 400 till 800 celler per timme näs.

Man sparar in en särskild hâlltryckskälla då det enligt uppfinningen är anordnade en högtryckskälla och en injektions- tryckkälla som via en högtrycksledníng respektive injektions- trycksledning är förbundna med en gemensam i mikrokapillärröret mynnande huvudledning, varvid eventuellt en backventíl som öpp- nar mot huvudledningen är inkopplad i injektionstrycksledningen och trelägesventilen är inkopplad i högtrycksledningen, varvid vidare trelägesventílen är försedd med en tredje strypt anslut- ning som i det första ventilläget är förbunden med injektions- tryckkällan för reducering av trycket i huvudledningen till hàlltrycket.

Den i injektionstryckledningen anordnade backventilen gör det möjligt att koppla in en tryckmanometer i injektíonstryck- ledningen för kontroll av injektionstrycket och eventuellt hàlltrycket. j För att förhindra att trelägesventilen under injicerandet av misstag kopplas om till det tredje ventilläget med en plötslig utsprutning av provvätska under högtryck som följd kan man i stället för trelägesventilen koppla in en första tvåläges- ventil i högtrycksledningen samt en andra tvalägesventil i en med strypställe försedd sidoledning, varvid sidoledningen an- tingen ständigt är förbunden med huvudledníngen eller ansluten till en tredje med injektionstryckkällan förbindbar utgång på den första tvàlägesventilen. Den andra tválägesventilen tjänar alltså uteslutande som omkoppling mellan hålltrycket och in- jektionstrycket, vilket utesluter fel vid manövreringen. Genom att utforma strypstället som strypventil erbjuder sig möjlig- heten till kontinuerlig fininställning av hålltrycket.

För att personen som handhar injiceringen ska ha båda händerna fria för manövrering av manípulatorn resp mikro- skopet föreslås det enligt uppfinningen att den andra tváläges- ventilen kan ställas om med foten.

Man sparar in en särskilt ínjektionstryckkälla då injek- tionstryckkällan utgörs av en strypt utgång från högtrycks- källan.

För att underlätta service, t ex byte av mikrokapillär- 10 15 2.0 25 30 35 40 456_74s rör, kan en till huvudledningen anslutande avlastningsventil vara anordnad.

En med avstängningsventil försedd tillsatsledning kan vidare vara ansluten till huvudledningen för anslutning av en tillsatskälla för tryck och/eller vakuum. Härvid kan vakuum- källan anslutas för utsugning av anordningen, för rengöring eller också för kontroll av otätheter.

Uppfinningen förklaras i det följande med hjälp av rit- ningar av utföringsexempel. §ig_1 visar ett kopplingsschema av en första utföringsform av ínjiceringsanordningen enligt uppfinningen. §ig_§ visar ett kopplingsschema av en andra utföringsform. §ig_§ visar ett kopplingsschema av en ytterligare utföringsform. §ig_í visar en schematísk framställning av mikrokapillärröret kort före pàfyllingsförloppets början.

Injiceringsanordningen enligt uppfinningen lämpar sig särskilt väl för injicering av provvätska i levande celler, var- vid mycket_smà provvolymer per cell i storleksordningen från 10"" :in 1o" enkelt att genomföra så att man redan efter kort upplärningstid kan na ymptal från 400 till 800 celler/timme. Anordningen 3 ml kan uppnås. Injiceringen gär snabbt och enligt uppfinningen arbetar ytterst tillförlitligt eftersom risken för igensättningar i kapillärspetsen är väsentligt minskad och dessutom är det genomförbart att byta mikrokapillär- rör inom omkring en minut, inklusive framställning och fyllning av det nya mikrokapíllärröret. Det efterföljande beskrivna manuella injiceringsförfarandet låter sig utan vidare ställas om för automatisk drift.

Det i fig 1 till 4 med 10 betecknade mikrokapillärröret med en utdragen spets 12 framställs på följande sätt. Ett tunt glasrör omkring 10 cm långt, med innerdiameter från 0,7-0,8 mm och en ytterdiameter från 1,0 mm,_tvättas först; närmare be- stämt behandlar man röret i en timme med etanol som får droppa av och slutligen torkar man det i omkring 30 minuter vid 130°C.

Man kan även använda en silikon försatt i lösning (tillverk- ningsfirma t ex SERVA) i eter (1:3).

I anslutning därtill sätts kapillärröret in i en icke visad draganordning, närmare bestämt så att de båda rörändarna spänns fast i dragbackar i draganordníngen. En dylik draganord- ning beskrivs till exempel i det nämnda litteraturcitatet. Den 10 15 25 30 35 40 456 745 -f på dragbackarna verkande dragspänningen ställs in till sitt minsta värde och en rörets mittre del omslutande värmetråd- n; spole förses med ström, exempelvis mellan 5,7 och 5,8 A, om det rör sig om en draganordning från firma E. Leitz, Wetzlar.

På grund av uppvärmningen genom värmetrådspolen börjar glaset i detta område att flyta. Under inverkan av backarnas drag- verkan bildas en insnörníng så att man till slut erhåller två rörhälfter som vart och ett bildar ett míkrokapillärrör med 'spets. Kapillärspetsens ytterdiameter ligger vid 1 pm och inner- diametern vid 0,5 pm. På grund av oförändrade dragparametrar (dragbackarnas dragkraft; värmeström; de ilagda rörens mått) erhåller man mikrokapillärrör med reproducerbara matt.

Det så erhållna mikrokapillärröret 10 anordnas nu på en i fig 4 visad hållare 14. Denna består av en kilformig grundkropp 16, som vilar på underlaget med en av sina kilytor och vars andra mot horisontplanet lutande kilyta 18 tjänar som stöd för mikrokapillärröret 10. Kilspetsen är bortfräst så att när man sätter dit mikrokapillärröret 10 med spetsen 12 nedåt utskjutan- de över den övre kilytan undvikes att spetsen 12 skadas. I kilytans 18 övre ändes område är grundkroppen åter avfasad; ett gummimellanskikt 20 är fastklistrat på den bildade fasytan; skiktet 20 bär i sin tur ett likaså kilformigt hållarhuvud 22 som tillsammans med grundkroppen 16 bildar hållarens 14 kilform.

Grundkrpppens 16 kilyta 18 fortsätter alltså i en kílyta 24 på hållarhuvudet 22. Mikrokapillärröret 10 läggs nu upp på ytor- na 18 och 24 och ligger därvid i ett mot ytorna 18 och 24 vinkelrätt vertikalplan. Míkrokapillärröret 10 fastklistras exempelvis på ytorna 18 och 24. I det visade exemplet är mikro- kapillärröret 10 för enkelhets skull fastklämt i ett spår 26 som bildats i det något över ytorna 18 och 24 utskjutande gummimellanskiktet 20.

Som nästa steg fylls provvätska i mikrokapillärröret 10 exempelvis mellan 0,1 och 1 pl av en provvätska. Som provvätska kommer till exempel ifråga en lösning av 0,02 till 1 mg DNA per ml som tidigare centrifugerats omkring 10 minuter och ut- satts för 10 000 g eller högre. För ifyllning av denna prov- vätska tjänar ett ifyllningskapillärrör 28 i form av ett litet tunt rör med ytterdiametern 0,12 mm och en innerdiameter från 0,1 mm. Sådana små glasrör tillhandahålls som röntgenglas- cylindrar (X-ray glass cylinder). Ifyllningskapillärröret 28 _~ _ 10 15 20 25 30 35 40 . _ 2 förs försiktigt in i den spetsen 12 motsatta kapil1ašå§ndZn4š% på mikrokapillärröret och skjuts in så långt att ifyllnings- kapillärspetsen 32 när spetsens 12 närhet i mirkokapillärrörets 10 inre. Därefter avges provvätskan.

Med ett vidare ifyllningskapillärrör med ytterdiameter om- kring 0,52 mm och innerdiameter 0,5 mm kan en eller flera centimeter hög vätskepelare tung paraffinolja skiktas pà prov- vätskan i kapillärhàligheten. Båda ífyllningskapillärrören tvättas före användningen på samma sätt som mikrokapillärröret.

Nu kan det fyllda mikrokapillärröret 10 sättas in i in- jíceringsanordningen vilken visas starkt schematiskt i fig 1 och allmänt betecknas med 34. Härtill spänns mikrokapillärröret 10 fast i en symboliskt visad mikromanipulator 36 som medger en rörelse för kapillärspetsen 12 i rummets samtliga tre dimen- síoner. Två vridknappar 38 antyds i fig 1. Kapillärhàligheten är via kapillärrörsänden 30 ansluten till en gastryckshuvudled- ning 40; en flexibel mellanledning 42 mellan manipulatorn 36 och huvudledningen 40 antyds i fig 1 vilken medger manipula- torns rörelse. Huvudledningen 40 och därmed kapillärhâligheten kan valvis utsättas för tre gastryck, ett högtryck p1, ett in- jektionstryck pz, samt ett hâlltryck ps. För omkoppling från ett tryck till ett annat tjänar en enda ventil, nämligen den i fig 1 visade trelägesventilen 42 med sina kopplingsfunktíoner.

Det är anordnat två tryckkällor i form av trycklufts- eller kvävetryckgasflaskor, en högtryckskälla 44 samt en injektions- tryckkälla 46. En högtrycksledning 49 förbinder högtryckskällan 44 med en förgreningspunkt 48 på huvudledningen 40; på mot- svarande sätt förbinder en injektionstryckledning 50 injek- tíonstryckkällan 46 med samma förgreningspunkt 48 på huvudled- ningen 40. En manuellt inställbar strypventil (reducerventíl resp regulator) 52 i högtrycksledningen 49 (eller vid hög- tryckskällan 44) åstadkommer en noggrann inställning av hög- trycket pï till ett värde från exempelvis 2 bar. Vid behov kan trycket p1 också regleras elektroniskt. I motsvarighet därtill är en strypventil 54 (reducerventíl resp regulator) inbyggd i ledningen 50 för noggrann inställning av trycket pz från 0,12 bar. Mellan strypventilen 54 och förgreníngspunkten 48 är en backventil S6 inkopplad i ledningen 50, vilken öppnar sig i riktning mot punkten 48. Trelägesventilens 42, som är inkopplad mellan strypventilen S2 och förgreningspunkten 48 i ledningen 10 15 25 30 35 40 456 745 _ 49, kopplingsfunktion kan man sluta sig till av fig 1. Tre ventilanslutningar används, en första anslutning 58, till vil- ken ett till strypventilen 52 ledande ledningsstycke 60 av ledningen 49 är anslutet, en därintilliggande anslutning 64 som är strypt (symboliseras i fig 1 genom ett strypställe 66) samt en tredje anslutning 68 som ligger mittemot anslutningen S8 och fràn vilken det till förgreningspunkten 48 ledande led- ningstycket 70 av ledningen 49 utgår.

I den i fig 1 visade ventilens 42 första läge eller vilo- läge är anslutningen 58 stängd under det att anslutningen 68 är förbunden med anslutningen 64. Följaktligen är strypstället 66 förbundet med ínjektionstryckkällan 46. Strypstället 66 är så anpassat att ett tryck på ställer in sig före strypstället, sä- ledes i ledningen 70 och därmed i huvudledningen 40. Det som hålltryck betecknade trycket p3 belöper sig till 0,03 bar. För exakt inställning av hálltrycket p3 kan strypstället 66 bildas av en motsvarande strypventil. Man kan likväl också koppla in en ytterligare strypventil (reducerventil resp regulator) 66 i ledningsstycket 70 mellan ventilen 42 och förgreningspunkten 48, vilket medger en noggrann inställning av hálltrycket ps.

Kopplas nu ventilen 42 manuellt in i ett andra eller mittre kopplingsläge så rör sig i överensstämmelse därmed den i fig 1 symboliskt antydda ventílkroppen mot kraften från en ventil- fjäder 72 åt höger till ett mittre läge. Nu är samtliga ventilens 42 anslutningar 58, 64 och 68 avstängda så att ett injektions- tryck pz ställer in sig i ledningen 70 och därmed i huvudled- ningen 40. _ Kopplas slutligen ventilen 42 in i sitt tredje läge, i vilket ventílkroppen intar läget längst ät höger i fig 1, så är de båda anslutningarna S8 och 68 förbundna med varandra, varemot anslutningen 64 är avstängd. Ledningsstycket 70 och därmed huvudledningen 40 är därmed förbundna med högtryckskällan 44 och ligger på trycket p1. Backventilen 46 förhindrar att stryp- ventilen 54 och injektionstryckkällan 46 skadas. Strypventilen S2 kan eventuellt också bortfalla om det, som är vanligt vid tryckkällor i form av tryckgasflaskor, finns en i fig 1 antydd reducerventil S2' som mfißkartrycket i gasflaskan från 10-150 bar till mellan 0 och 7 bar. 1 detta fall ska reducer- ventilen 52' ställas in så att trycket i ledningsstycket 70 i ventilens 42 tredje läge (när man använder strypventilen 66') 10 15 _30 25 30 35 40 9 456 745 antar ett värde som är lika med det på förhand bestämda värdet pi. Efter det att man satt in mikrokapillärröret 10 i mikro- manipulatorn 36 sätts som första åtgärd kapillärhàligheten under högtryck p1 (tredje ventilläget) för att snabbt fylla spetsen 12 och om det behövs göra spetsen 12 passerbar. Därefter för- sätts kapillärhàlígheten under hàlltryck ps som väljs så stort att á ena sidan ingen väsentlig mängd provvätska flyter ut från spetsen 12 och à andra sidan inga föroreningar kan tränga in i kapillärspetsen 12 utifrân. Nu sticks kapillärspetsen in i en av de celler 74 som visas starkt överdrivna i fig 1 genom mot- svarande manövrering av mikromanipulatorn 36 och observationen genom ett mikroskop, vars míkroskopobjektív 10 avkortat antyds i fig 1. Sá snart som spetsen 12 befinner sig i cellens inre (i cytoplasma eller cellkärnan) försätts kapillärhàligheten under injektionstryck pz (andra ventilläget), vilket får till följd att provvätska strömmar ut genom spetsen 12. Utströmnings- talet belöper sig därvid till mellan 10-11 och 10-13 ml per sekund. För att nà önskad injektionsvolym hålls ventilen 42 motsvarande tid i sitt andra läge och frigörs därefter så att ventilen intar víloläget enligt fig 1 och hálltrycket ps ligger på kapillärhàligheten. Mikrokapíllärröret 10 förs nu till nästa cell 74 och ympar denna pà det ovan beskrivna viset. Om det kvarstår tvivel om att spetsen inte är fullständigt fri kan kapíllärhàligheten ges högtrycket p1 (tredje ventilläget) för att "blåsa igenom" spetsen 12 på nytt.

Ventilens 42 manövrering kan exempelvis ske medelst en i fig 1 antydd ventilmanöverknapp 80 som kan skjutas in mot kraften från fjädern 72.

För avluftning av anordningen 34 är en avlastningsventil 82 i form av en tvàlägesventil inbyggd i en i huvudledningen 40 mynnande sidoledning 84. Vidare är en tillsatsledning 86, som mynnar i huvudledningen 40, försedd med en avstängnings- ventil 88 för valvis anslutning av en tillsatskälla för tryck och/eller vakuum, som exempelvis en akvariepump som kan ställas in såväl som tryckkälla som vakuumkälla. Mellan ledningarnas 84 och 86 mynningar i huvudledningen 40 är en avstängnings- eller strypventil 90 inbyggd i huvudledníngen 40, vilken för anpass- ning till provwüskæß aktuella viskositet medger en samtidig inställning av trycken p1, pz och p3.

Pig 2 visar en ytterligare utföringsform av injektions- 10 456 745 10 15 N29 25 30 35 40 anordningen i fig 1 kan man emellertid också koppla in en anordningen enligt uppfinningen som är betecknad med 134.

Konstruktionselementen i fig Z, vilka motsvarar dem i fig 1, är försedda med samma hänvisningsnummer med tillägg av talet 100. Vid injektionsanordningen 134 används blott en enda tryck- källa, nämligen högtryckskällan 144. En från högtryckskällan 144 utgående begynnelseledning 192 fortsätter i tvâ paral- lella ledningar 149 och 150, vilka motsvarar högtrycksledningen 149 resp injektionstryckledningen 50 i fig 1 och vilka slutligen mynnar i huvudledningens 140 förgreningspunkt 148. Strypventilen 152, vilken medger en exakt inställning av högtrycket p1 i an- slutande ledningsdel, är däremot inkopplad i ledningen 149. Mot- svarande är såväl strypventilen 154 som backventilen 156 in- kopplade i ledningen 150, varvid backventilen 156 utesluter att en mellan ventilerna 154 och 156 i ledningen 150 inkopplad manometer 210 (för trycket pz) tar skada pà grund av det högre trycket ps. Strypventilen 154 åstadkommer den exakta inställ- ningen av trycket pz. I ledningsgrenen 170 mellan strypventilen 152 och förgreningspunkten 148 skulle nu trelägesventilen 42 enligt fig 1 kunna byggas in. I fig 2 är emellertid denna er- satt av två tvålägesventiler, en första tválägesventil 194 samt en andra tvålägesventil 196. Den första tvålägesventilens 194, inbyggd i ledningen 170, båda kopplingslägen framgår av fig 2. I viloläget är förbindelsen mellan förgreningspunkten 148 och strypventilen 152 bruten, varemot_det ligger ett tryck på på strypventilutgángen 164. Strypventilutgången 164, vars strypställe 166 återigen antyds symboliskt, står via en förbindelseledning 198 i förbindelse med tválägesventilen 196.

I ventilens 196 viloläge enligt fig 2 är denna öppen så att hálltrycket ps inställer sig i huvudledningen 140. Bringas emellertid ventilen 196 till sitt andra kopplingsläge stängs förbindelseledningen 198, så att trycket i huvudledningen 140 byggs upp till injektionstrycket pz. Genom manövrering av ventilen 136 kan man sålunda koppla om mellan injektionstryck pz och hälltryck ps utan'fara för att högtrycket pï av misstag kopplas in. För att koppla in högtrycket pï måste man manövre- ra den första tvàlägesventilen 194. För exakt kontinuerlig in- ställning av hålltrycket ps kan strypstället 166 utbildas som en i fig 2 streckat antydd strypventil 166", vilken är inkopp- lad i ledningen 198 mellan ventilerna 194 och 196. Motsvarande 10 15 .20 25 30 35 40 11 456 745 strypventil 166' i ledningen 170 mellan ventilen 194 och för- greningspunkten 148. Slutligen kan eventuellt strypventilen' 152 bortfalla om reducerventílen 152 är tillräckligt noggrann för inställning av högtrycket pï.

Också anordningen enligt fig 2 kan vara försedd med en av- lastníngsventil 182 för avluftning av anordningen 134 inbyggd i en sidoledning 184 som mynnar i huvudledningen 140. I huvud- ledningen 140 är också en avstängnings- eller strypventil 190 inbyggd och slutligen en tillsatsledning 186 med avstängnings- ventil 188.

Den i fig 3 visade injektionsanordningen 234 har en liknan- de konstruktion som injektionsanordningarna 34 och 134 enligt fíg 1 och 2. Konstruktionselement i fíg 3 vilka motsvaras av sådana i fig 1 har försetts med samma hänvisningsnummer ökade med talet 200.

I likhet med anordningen i fig 2 använder sig anordníngen 234 enligt fig 3 blott av en enda tryckkälla, nämligen högtrycks- källan 244. En reducerventil 252' vid högtryckskällan 244 med- ger en noggrann inställning av högtrycket pï i den anslutnade begynnelseledningen 292. Det inställda högtrycket pï låter sig avläsas med en manometer 300 anordnad på reducerventilen 252'. Begynnelseledningen 292 förgrenar sig slutligen vid en förgreningspunkt 302 och fortsätter i tvâ parallella ledningar 249 och 250, vilka slutligen äter löper samman i en ytterligare förgreningspunkt 248 och där mynnar i den anslutande huvudled- ningen 240.

I den undre ledningen 249 i fig 3 är en tválägesventil 294 inkopplad, vilken i det i fig 3 visade viloläget stänger ledningen 249; genom manövrering av tvàlägesventilen 244 öppnas denna, så att högtrycket pï ställer in sig vid förgrenings- punkten 248 och därmed i huvudledningen 240.

I den övre ledningen 250 är en strypventil 254 (precisions- -undertrycks-reducerventil, t ex från Fairchild Ind, modell 10) inkopplad för inställning av injektionstrycket pz i den till ledningen 250 anslutande ledningsdelen 304. I strömnings- riktningen i anslutning till strypventilen 254 mynnar en sido- ledning 306 i ledningen 250 (mynningspunkt 308, se fig 3). En tválägesventil 296 är inkopplad i sidoledningen 306 samt mellan denna ventil och punkten 308 en strypventil 266". Som redan framgått av hänvisningsnumren motsvarar dessa båda ventílers 10 15 20 25 30 35 40 12 4áê" zcáE-šíäó funktion den hos ventiler-na 166" och 196 i-fig 2.

Tvàlägesventilen 296 är följaktligen öppen i det i fig 3 visade viloläget och sörjer för en sänkning av trycket i led- ningen 250 (i anslutning till strypventílen 254) till håll- trycket p3. Den exakta inställningen av hålltrycket p3 åstad- koms med strypventílen 266". Det måste härvid framhållas att inställningen av trycket ps sker utan att respektive tryck- värden pz och p1 influeras. De inställda tryckvärdena pz och ps låter sig avläsas på en manometer 310 vilken via en sidoled- ning 312 är ansluten till ledningen 250 (mynningspunkt 314).

Mellan mynningspunkten 314 och förgreningspunkten 248 är i mot- svarighet till fig 2 återigen en backventil 256 inkopplad, vilken vid inkoppling av tvàlägesventílen 194 förhindrar att högtrycket p1 når in i ledníngsavsnittet mellan strypventilen 254 och backventilen 256 på ledningen 250, nagot som skulle kunna leda till skada pá strypventilen 266" som är inställd på det lägre trycket pz och eventuellt på manometern 310.

Slutligen kan återigen en motsvarande sidoledning 284 till huvudledningen 240 vara-försedd med en avlastningsventil 282 samt en avstängningsventil 288 i en till huvudledningen 240 mynnande tillsatsledning 286. Vidare kan omnämnas en ytter- ligare avstängnings- eller strypventíl 290 mellan ledningarnas 284 och 286 mynningar i huvudledningen 240. Huvudledningen 240 mynnar slutligen i mikrokapíllärröret 10.

Vid det egentliga injiceringsförloppet behöver blott tvâ- lägesventílen 294 manövreras för omkoppling mellan injektions- tryck pz och hàlltryck ps. Da kvarstår inte risken att hög- trycket pl kopplas in av misstag eftersom denna inkoppling åstadkoms med den andra tvalägesventilen 294. För att ytter- ligare förenkla manövreringen kan man anordna så att tvàläges- ventilen 296 är manövrerbar med en fotoomkopplare. Bàda händerna blir då fria för manövrering av míkromanipulatorn och eventuellt observatíonsmikroskopet.

Det är uppenbart att också injektionsanordningen enligt fíg 1 i stället för trelägesventilen 42 kan ersättas med kombinationen av de båda tvàlägesventilerna 194 och 196 (respektive 294 och 296). Ventilerna 42 och 194 är av tvävägs- typ medan ventilen 196 är av envägstyp.

Med hjälp av ovan beskrivna injektionsanordníng kan ytterst små mängder nrovvätska reproducerbart sprutas in i levande '3 456 745 celler, t ex för undersökning av proteínfördelníng som är märkta så att de fluorescerar (fluorescently labelled structural proteins) eller för utskiljande av klonade re- kombínanter (screening of cloned recombinants).

Claims (17)

10 15 20 25 3D 35 40 s 745 i 1* Patggtkggv

1. Förfarande för injicering av mycket små provmångder vätska under användning av ett mikrokapillârrör med en inre hålighet, varvid mikrokapillärröret har en första ände försedd med en spets och en andra ände motsatt spetsen, vilket för- farande innefattar följande eteg: A. fyllning av den inre håligheten med provvåtaka; B. påläggníng av ett injektionstryck på den inre hålig- heten från den andra kapilläränden; C. injicering av en önskad mängd provfluid genom spet- sen; D. minskning av trycket pàlagt på den inre håligheten efter injicering till ett hàlltryck som är lägre än injice- ringstrycket och högre än trycket vid den andra änden utanför den inre haligheten, varigenom i huvudsak ingen provvätska strömmar ut från spetsen; och E. upprätthållande av hålltrycket till början av nästa injicering.

2. Förfarande enligt petentkravet 1, k ä n n e - t e c k n a t av att hàlltrycket är 0,1 till 0,5 gånger in- jiceringstrycket.

3. Förfarande enligt patentkravat 1 eller 2, k ä n - n e t e c k n a t av att trycket pâlagt på den inre hålig- heten ökas till ett högtryck som är högre än injiceringatryc- ket efter steg (A) för att förhindra initial blockering av spetsen.

4. Förfarande enligt något av patentkraven 1-3, k ä n n e t e c k n a t av att trycket pålagt på den inre håligheten ökas till ett högtryck som är högre än injiceringe- trycket efter flera injiceringar för att förhindra blockering eller bildande av avsättning inuti kapillärröreepeteen.

5. Förfarande enligt patentkravet 3 eller 4, k ä n - n e E e c k n a t av att högtrycket är 5 till 10 gånger in- jiceringstrycket.

6. Pörfarande enligt patentkravet 5, k ä n n e - t e c k n a t av att högtrycket är ca. 17 gånger injice- ringstrycket.

7. Förfarande enligt något av patentkraven 1-6, k ä n n e t e c k n a t av att injiceringstrycket ligger a. 10 15 20 25 30 35 40 'F 456 745 mellan 0,1 och 0,5 bar.

8. Förfarande enligt patentkravet 7, k ä n n e - t e c k n a t av att injiceringstrycket är ce. 0,12 ber.

9. Förfarande enligt något av patentkraven 1-8, k ä n n e t e c k n a t av att provvätskan pàfylles från kapillärrörsänden motsatt mikrokapillärröreapetaen.

10. Förfarande enligt patentkravet 9, k å n n e - t e c k n a t av att våtskepàfyllningen åstadkommas medelst ett pàfyllningskapillärrör, vars ytterdiameter är mindre än mikrokapillärröreta innerdiameter, varvid påfyllningskepillär- röret insätts i mikrokapillärrörets kapillärrörände motsatt spetsen och framförs inuti mikrokapillärröret till en punkt nära mikrokapillärrörets spets.

11. Anordning för tillförande av i förväg utvalda tryck till ett mikrokapillärrör för att utföra ett förfaringssätt för kontrollerad injicering av små vätakeprovmängder genom mikrokapillärröret, vilken anordning innefattar: A. en huvudledning förbunden med mikrokepillärröret; B. en högtryckskälla; C. en högtryckstillföreelledning kommunieerande mellan högtryckskällan och huvudledningen; D. en tryckregleringsanordning på högtrycketillförsel- ledningen; ¿E. en trevägsventil förbunden med högtryckstillförael- ledningen; F. en injíceringatryckkälla; G. en injiceringstrycktillföraelledning kommuniserande mellan injiceringstryckkällan och huvudledningen; H. en backventil i en av antingen injiceringstrycktill- förselledningen eller huvudledningen; I. en tryckregleringsledning förbunden med trevägsven- tilen; J. en tryckregleringsanordning i tryckregleringsled- ningen; varvid tryckregleringsledningen förbinds med injicerings- trycktillförselledningen, och högtrycksledningen avstängs från förbindning med huvudledningen, då trevägsventilen är i ett första läge, därigenom skapande ett hålltryck i huvudled- ningen, tryckregleringsledningen och högtryckstillföreelled- lb 456 745 10 15 20 25 30 35 40 ningen avstängs från huvudledningen då trevägsventilen är i ett andra läge och därigenom skapar ett injiceringstryck i huvudledningen, och, högtrycksledningen förbinda med huvudledningen och tryckregleringsledningen avstângs från huvudledningen då trevâgsventilen är i ett tredje läge och därigenom skapar ett högtryck i huvudledningen.

12. Anordning för tillförande av konstanta tryck till ett mikrokapillärrör för att utföra ett förfaringssätt för kontrollerad injicering av små vätskeprovmängder genom mikro- kapillärröret, vilken anordning innefattar: A. en huvudledning förbunden med mikrokapillärröret; B. en tryckkälla; C. en injiceringstrycktillförselledning kommuniserande mellan tryckkällan och huvudledningen; D. en högtryckstillföreelledning kommuniserande mellan tryckkällan och huvudledningen, varvid injiceringstryck- och högtryckstillförselledningarna är förbundna i parallell; E. en backventil i högtryckstillförselledningen; F. en tryckregleringsventil i högtrycketillförlelled- ningen; G. en tvavägsventil i högtryckstillförselledningen; H. en tryckregleringsledning förbunden med tvàvägeventi- len; I. en envägsventil förbunden med tryckregleringsled~ ningen; l J. en tryckregleringsanordning i tryckregleringsled- ningen mellan tvàvägsventilen och envägsventilen, varvid tryckregleringsledningen förbinda med injiceringstryck- ledningen och högtrycktillförselledningen avstängs från huvud- ledningen då tvåvägeventilen är i ett första läge; ett tryckflöde upprättas genom tryckregleringeanord- ningen i tryckregleringsledningen för upprättande av ett håll- tryck'i huvudledningen da envägsventilen är i ett första läge; tryckflödet genom tryckregleringeledningen avatängs för upprättande av ett injiceringstryck i huvudledningen då en- vägsventilen är i ett andra läge; tryckregleringeledningen avstängs och högtrycksledningen förbinda med huvudledningen för upprättande av ett högtryck i huvudledningar då tvåvägsventilen är i ett andra läge. 10 15 20 25 30 35 40 I? 456. 74 5

13. Anordning för tillförande av konstanta tryck till ett mikrokapillärrör för att utföra ett förfaringssätt för kontrollerad injicering av små vätskeprovmängder genom mikro- kapillårröret, vilken anordning innefattar: A. en huvudledning förbunden med mikrokapillärröret; B. en tryckkälla; _ C. en injiceringstrycktillförselledning kommunilerande mellan tryckkällan och huvudledningen; D. en högtryckstillföraelledning kommuníaerande mellan tryckkällan och huvudledningen, injicaringstryck~ och hög- tryckstillförselledningarna förbundna i parallell; E. en envägsventil i högtryckstillföraalledningen; F. en tryckregleringsanordning i injiceringstrycktill- förselledningen; G. en tryckregleringsledning; H. en envägaventil förbunden med injiceringstrycktill- föreelledningen; I. en tryckregleringsanordning insatt i regleringaled- ningen mellan envägsventilen och injiceringstrycktillförael- ledningen; J. en backventil insatt i injiceringstrycktillförselled- ningen mellan punkten för anslutning av regleringsledningen och huvudledningen; varvid Ihögtryckstillförselledningen avstängs från huvudled- ningen då envägsventilen i högtryckatillförselledningen är i sitt företa läge; ett tryckflöde genom tryckregleringsanordningen i regle- ringsledningen tillåts då tryckregleringaledningens envägs- ventil är i sitt företa ventilläge, därigenom upprättas ett hàlltryck i huvudledningen, tryckflödet genom tryckregleringsledningen avatängs då tryckregleringsledningens envägeventil år i sitt andra ventil- läge, därigenom upprättas ett injiceringatryck i huvudled- ningen, och, tryckflöde tillåts genom ventilen då högtryckatillför- selledningena envägsventil år i sitt andra ventillöga, däri- genom upprättas ett högtryck i huvudledningen.

14. Anordning enligt nagot av patentkraven il-13, k ä n n e t e c k n a d av att en hjëlpledning är förbunden med huvudledningen och försedd med en reducerventil och för- \? 456 745 i 10 bunden med en tillsatstryckkälla.

15. Anordning enligt något av patentkraven 11-14, k ä n n e t e c k n a d av att en avlastningsventil är för- bunden med huvudledningen.

16. Anordning enligt något av patentkraven 11-15, k ä n n e t e c k n a d av att en manometer är insatt i in- jiceringstrycktillföraelledningen mellan injiceringstryckkål- len och beckventilen.

17. Anordning enligt något av patentkreven 12-16, k ä n n e t e c k n a d ev organ för menövrering av trevägs- ventilen i tryckregleringsledningen med foten.