DE3147538A1

DE3147538A1 - Verfahren zur bestimmung von transferrin und dazu geeignetes mittel

Info

Publication number: DE3147538A1
Application number: DE19813147538
Authority: DE
Inventors: Paolo Siena Neri; Alessandro Siena Tabacco; Paolo Monteriggioni Siena Tarli
Original assignee: Istituto Sieroterapico e Vaccinogeno Toscano Sclavo SpA
Current assignee: Istituto Sieroterapico e Vaccinogeno Toscano Sclavo SpA
Priority date: 1980-12-11
Filing date: 1981-12-01
Publication date: 1982-06-24
Also published as: IT1148745B; FR2496270A1; IT8026564A0; GB2089505A; ES508226A0; JPH027429B2; ES8303698A1; DE3147538C2; CA1165215A; JPS57122361A; GB2089505B; FR2496270B1

Description

Verfahren zur Bestimmung von Transferrin und dazu geeignetes Mittel

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Eisenbindungsfähigkeit von Transferrin sowie ein spezielles Mittel, das zur Durchführung dieses Verfahrens geeignet ist»
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Transferrin ist ein Glycoproteine das im Blut vorhanden ist und zum Transport des Eisens dient. Jedes Proteinmolekül kann zwei Eisen-III-ionen binden.

10 Der Gehalt an Transferrin im Blut kann entweder direkt mit Hilfe immunologischer Methoden oder über die Bestimmung der Eisenbindungsfähigkeit mit Hilfe chemischer Methoden gemessen werden«,

15 In Beziehung auf die zuletzt genannten Methoden ist aus Chim_e Clin* Acta„ 2„ 221 (1957) ein Verfahren bekannt , das die folgenden Schritte umfaßt?

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- Sättigung des in der Probe, üblicherweise einer Serumprobe, enthaltenen Transferrins mit einer sauren Lösung, die einen Überschuß an Eisen-III-ionen enthält.

- Entfernung der überschüssigen Eisenionen nach einer Inkubationszeit durch Zusatz von festem Magnesiumcarbonat und

- Bestimmung des an das Transferrin gebundenen Eisens, das in der überstehenden Flüssigkeit

enthalten ist_;mit Hilfe eines Reagenzes, das zur Bestimmung des Eisens in dem Serum geeignet ist, nach Zentrifugieren der so erhaltenen. Aufschlämmung.
15'

Bei anderen Verfahren wird umgekehrt unter entsprechenden Bedingungen der Überschuß an Eisenionen bestimmt und durch Differenz das mit Hilfe des Transferrins entfernte Eisen berechnet, aus dem wiederum die vorhandene Menge an Transferrin berechnet werden kann.

Es hat sich nun gezeigt, daß es möglich ist, das in einer Probe enthaltene Transferrin zu bestimmen, ohne daß diese vorher mit einem Überschuß an Eisen-IIJ-ionen in saurer Umgebung gesättigt werden muß.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zu entwickeln, das die Bestimmung der Eisenbindungsfähigkeit von Transferrin ermöglicht, bei dem ein einheitliches Gemisch angewandt wird, das aus einer Lösung eines Eisen-III-Salzes besteht sowie einer Aufschlämmung eines entsprechenden festen Adsorptionsmittels, wobei das letztere' zu der Probe zugesetzt wird, worauf das gesamte Gemisch zentrifugiert und das in der überstehenden Flüssigkeit enthaltene an Transferrin

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gebundene Eisen bestimmt wird.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens werden zahlreiche Vorteile gegenüber den oben angegebenen bekannten Verfahren erreicht. Die wichtigsten dieser Vorteile sind:

- Das Verfahren ist einfacher und die Anzahl der durchzuführenden Stufen, einschließlich der Inkubation_; ist geringer.

- Es sind weniger Manipulationen erforderlich, da

es nicht mehr notwendig ist, das Magnesiumcarbonat in festem Zustand zu dem Reaktionsgemisch zuzusetzen,

- Die Dosierung der Reagenzien ist besser reproduzierbar und

- das Transferrin wird in der Probe mit Eisenionen bei einem basischen pH-Wert gesättigt, wobei dieser in der Literatur als besonders geeignet zur Bindung von Eisen an Transferrin angegeben ist.
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Aufgrund dieser Tatsachen wird eine Vereinfachung und Erhöhung der Genauigkeit der Bestimmung erreicht, wie sie bisher nicht möglich war.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden im einzelnen die folgenden Stufen durchgeführt;

- Zugabe eines einheitlichen Gemisches aus einer Lösung eines Eisen-III-Salzes und eines festen Adsorptionsmittels mit einem pH-Wert zwischen 8 und 9 zu der zu untersuchenden Probe;

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- Zentrifugieren der so erhaltenen Aufschlämmung und

Messung des in der überstehenden Flüssigkeit enthaltenen an Transferrin gebundenen Eisens.

Es ist außerdem Aufgabe der Erfindung, ein spezielles Mittel zur Durchführung des oben angegebenen Verfahrens zur Verfügung zu stellen. Dieses Mittel besteht aus einer Lösung eines Eisen-III-Salzes, das an einem festen Substrat adsorbiert ist.und möglicherweise einem Medium, das einen pH-Wert zwischen 8 und 9 aufrechterhalten kann, und ebenfalls möglicherweise einem colorimetrischen Reagenz zur Bestimmung des Eisens.

Feste Substrate, die für diesen Zweck geeignet sind, sind ausgewählt aus der Gruppe basisches Magnetiumcarbonat und CaCO^, wobei basisches Magnesiumcarbonat bevorzugt ist.

Der mögliche Puffer, der geeignet ist, den pH-Wert konstant zu halten, ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H₇JPO^, HpPOT, Barbi tür säure und Barbituraten, wobei NaHpPO. bevorzugt ist.

Wenn ein colorimetrisches Reagenz angewandt wird, sollte dieses vorzugsweise ausgewählt werden aus den für diesen Zweck üblichen Mitteln oder es kann ein solches angewandt werden, wie es in der IT-OS 20177A/80 angegeben ist.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher.erläutert.

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Beispiel 1 Herstellung einer Reagenzsuspension

In 100 ml Wasser wurden 828 mg NaH₂PO^oH₂O gelöst und anschließend 2,5 g basisches MgCO, aufgeschlämmt. Zu der so erhaltenen Suspension wurde unter Rühren 1 ml 0,01 n-HCl enthaltend 500 mg/dl Fe⁺⁺⁺ gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bis zur Stabilisierung des pH-Werts stehen gelassen.

Beispiel 2

Das in Beispiel 1 beschriebene Reagenz wurde angewandt zur Bestimmung der Eisenbindungsfähigkeit von zusammen gegebenen (pool) Humansera 48-mal, wobei ein Mittelwert von 293,71 ug/dl erhalten wurde mit einem CV. von 3,48 %_a

Es wurden die folgenden Bedingungen eingehalten:

- Reagenzsuspension

- Humanblutserum

- Inkubation

25 - Zentrifugieren

Das in der überstehenden Flüssigkeit enthaltene Eisen wurde abgezogen und mit Hilfe eines üblichen Reagenzes bestimmt.
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Beispiel 3

Zu fraktionierten Proben.eines Grundserums, in dem die Eisenbindungsfähigkeit bestimmt worden war, wurden zunehmende Mengen an Humantransferrin zugegeben.

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	min	1	ml _s
	min	0_y2	ml
5	bei	Raumtemperatur
10	bei	4 000 UpM

1A-55 459 " *"

Die so angereicherten Serumproben wurden nach dem in Beispiel 2 angegebenen Verfahren untersucht sowie nach dem von Ramsay in Chimica Clinicä Acta, 2, 221 (1957) angegebenen Verfahren. Die Werte der Eisenbindungsfähigkeit, wie sie nach diesen beiden Verfahren erhalten worden waren, wurden in Zusammenhang gebracht mit der Gewichtsmenge an zugesetztem Transferrin, wobei man die folgende Regressionskurve. erhielt:
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χ = mg zugesetztes Transferrin y = Eisenbindungsfähigkeit(in ug/dl gefundenem Eisen]

Erfindungsgemäßes Verfahren

y = 0,90 χ + 277,2 mg/dl: Korrelationskoeffizient = 0,998

Ram s ay-Ve rfahren

y = 0,91 x + 277,5 mg/dl: Korrelationskoeffizient = 0,997

Der Wert für die Eisenbindungskraft des Grundserums betrug nach dem erfindungsgemäßen Verfahren 281 ug/dl und nach dem Ramsay-Verfahren 272 ug/dl.·. Beide Werte stimmen zufriedenstellend überein mit den Werten der jeweiligen Sprünge in den Gleichungen der Geraden wie oben angegeben.

Konzentrationsbereiche der Komponenten des Reagenzes:

basisches Magnesiumcarbonat : 0,5 - 10 g/dl Fe⁺⁺⁺ 1 bis 100 mg/dl

0 bis 200 mg/1

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Claims

PATENTANWÄLTE»»- „£„„;., ",,' „J,, dr.-ing. franz \puesthoff

WUESTHOFF-v. PECHMANN-BEHRENS-GOETZ »*■"»«-"»"» westhoff (1917-1956)

DIPL.-ING. GERHARD PULS (1952-1971)

EUROPEAN PATENTATTORNEYS d.pl-chem.dr. e. fre.herk von pechmann

DR.-ING. DIETER BEHRENS

DIPL.-1NC·.; UIPl..-\riRTSC.II.-INU. RUPKRT GOETZ

Istituto Sie ro te rap ic ο D-8000 MONCHIiN

1A-55 459 SCH WHIGKRSTRASSE 2

. . ■-" telefon: (089)662051

telegramm: protectpatent TELEX: J 24 070

Pat.entaxisp rüche

1^) Verfahren zur Bestimmung von Transferring dadurch gekennz e i chne t ·,. daß man zu der zu untersuchenden Probe ein Reagenz zugibt, bestehend aus einer Lösung eines Eisen-III-Salzes, adsorbiert an einer Suspension eines festen Substrats, das so erhaltene Gemisch zentrifugiert und in der überstehenden Flüssigkeit das an Transferrin gebundene Eisen mißt_s

2_O Verfahren nach Anspruch 1_P dadurch gekennzeichnet j, daß man als festes Substrat basisches Magnesiumcarbonat und/oder Calciumcarbonat verwendete

3c Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch

gekennzeichnet , daß das angewandte Reagenz zusätzlich einen Puffer enthält, der im . Stande -ist, den pH-Wert zwischen 8 und 9 einzustellen.

4. Verfahren nach Anspruch 3₉ dadurch gekennzeichnet s, daß der Puffer ausgewählt ist aus der Gruppe H^PO, _p HpPO,, Barbitursäure

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und Barbituraten.

5. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet; daß es aus einer Lösung eines Eisen-III-Salzes sowie einer festen Phase eines Adsorptionsmittels, gegebenenfalls einem Puffer, der den pH-Wert auf 8 bis 9 einstellen kann, und gegebenenfalls einem colorimetrischen Reagenz zur Bestimmung von Eisen besteht. 10

6. Mittel nach Anspruch 5» dadurch ge kennzeichnet, daß das Adsorptionsmittel basisches Magnesiumcarbonat und/oder Calciumcarbonat ist.

7· Mittel nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer besteht aus Phosphorsäure, Phosphaten, Barbitursäure und/oder Barbituraten.

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