DE3137020C2

DE3137020C2 - Verfahren zur Kultur von Mikroorganismen und flüssige Nährstoffzusammensetzung

Info

Publication number: DE3137020C2
Application number: DE3137020A
Authority: DE
Inventors: Jean-Claude Gautier; André 64000 Pau Sirvins; Jacques 64140 Lons Tellier; Bernard 64140 Billere Tramier
Original assignee: Societe Nationale Elf Aquitaine Production SA
Current assignee: Societe Nationale Elf Aquitaine Production SA
Priority date: 1980-09-19
Filing date: 1981-09-17
Publication date: 1983-10-13
Also published as: PT73694A; NL8104298A; NO813163L; IE51588B1; AU527434B2; DK148598B; US4401762A; NO159806C; GB2084608B; BR8105993A; OA06902A; ES505525A0; CA1156574A; GR74563B; GB2084608A; CH653362A5; US4460692A; NO159806B; SE449002B; PT73694B

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Kultur von Mikroorganismen in einem Medium, das ein hydrophobes Material enthält, das Mikroorganismen enthält, unter Anwendung von Nährsubstanzen in mikroemulgierter wäßriger Lösung in einer mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit. Man verwendet als Stickstoffquelle wasserlösliche Verbindungen wie Harnstoff, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, als Phosphorquelle Verbindungen, die in Wasser löslich sind. Das Medium kann auch eine Quelle für direkt assimilierbaren Kohlenstoff enthalten. Die Anwendung dieses Verfahrens bei der Kultur von Mikroorganismen ermöglicht den Einsatz bei der Zersetzung von Kohlenwasserstoffen, die eine Wasserfläche oder Erdbodenfläche bedecken. Der Einsatz ist besonders interessant für die Bekämpfung von Ölpest durch biologische Zersetzung.

Description

Gegenwärtig sind industrielle Verfahren unter Einsatz von Kulturen verschiedener Mikroorganismen, Insbesondere von Bakterien und Pilzen, sehr geläufig. Zahlreiche Nahrungsmittelindustrien, Herstellungen von Arzneimitteln, Reinigungsverfahren und so welter basieren auf derartigen Verfahren. Am häufigsten umfaßt der Arbeltsgang zwei Stufen, zunächst erfolgt die Kultur des betreffenden Mlkrooganlsmus In einem geeigneten Nährmedium bis zum Wachstum einer ausreichend zahlreichen Population; In der zweiten Stufe wird diese Population In Kontakt mit Malerlallen gebracht, die man der Einwirkung von Mikroorganismen aussetzen will. Diese Im Bottich durchgeführten Verfahren bringen in dieser Hinsicht keine speziellen Schwierigkeiten mit sich; die Vorkultur, d. h. die Vermehrung, wird je nach dem speziellen Fall in einem getrennten Raum oder In dem gleichen Bottich durchgeführt. In dem die zweite Arbcltsphase erfolgt. Werden dagegen die Arbeltsgänge in der Natur an großen Boden- oder Wasseroberflächen durchgeführt, wie' dies beispielsweise der Fall ist bei der Entfernung von Kohlenwasserstoffteppiichen durch mikrobiologische Zersetzung im Meer, an Stränden oder In fließendem Wasser oder In Seen, so bringt die vorausgehende Vermehrung der verwendeten Mikroorganismen Schwierigkellen mit sich. Tatsächlich muß man der Kultur Nährstoffe zuführen, d. h. Quellen für C, N und P, sowie Spurenelemente, um das Wachstum der betreffenden Organismen sicherzustellen; jedoch sind die klassischen Quellen, wie Kohlenhydrate, Nitrate oder ammoniakallsche Salze und Phosphate In Wasser löslich und können daher nicht In der zu behandelnden ausgebreiteten Oberflächenschicht verbleiben, wo ein starkes Wachstum der verwendeten Mikroorganismen stattfinden soll; diese Substanzen diffundieren In das Wasser oder den darunterliegenden benachbarten Boden und werden so der Kultur entzogen.

Um dies zu verhindern, wurden bisher verschiedene Methoden angewendet. Eine dieser besteht darin. Körner von festen Stickstoff- und Phosphatverbindungen mit Paraffin zu umhülien, um sie in dieser Form den Mlkro-5 Organismen anzubieten, wie in der US-PS 39 59 127 angegeben. Gemäß einer Variante nach der US-PS 3 883 397 erfolgt die lipophile Umhüllung mit einem Fellsäuresaiz anstellendes Paraffins. Jedoch ermöglicher, diese Methoden den Mikroorganismen keine rasche Verfügung über

ίο die erforderliche Nahrung; das fette Umhüllungsmaterial ist schwierig zu durchdringen, d. h. abzubauen. In Abwesenheit von äußerem Stickstoff und Phosphor. Auch ist die Einwirkung der Bakterien oder Pilze langsam und erfordert Wochen oder Monate. Eine andere empfohlene Lösung besteht in der Verwendung von In Wasser unlöslichen Verbindungen als Quellen für N und P, die jedoch In Kohlenwasserstoffen löslich sind. Insbesondere Phosphoramlno-llpide, wie in der FR-Patentveröffentlichung 21 72 796 beschrieben; jedoch weisen die StlckslofTver bindungen, die in Öl löslich sind, im allgemeinen einen sehr geringen Stickstoffgehalt auf und unter diesen Bedingungen erfordert der biologische Abbau von Erdölkohlenwasserstoffen im Meer 2 bis 3 Monate. In der FR-Palentveröffentlichung 22 30 401 wurde auch die Ver- wendung von Amiden, von organischen Ammoniumsalzen und Phospho-amino-llplden In Lösung in einem Erdöllösungsmitiel angegeben, wobei die Lösung In Wasser emulglert wird; die erhaltene Emulsion wird über einen auf Wasser schwimmenden Kohlenwasserstofftep pich zerstäubt, um die Bio-Zersetzung des Teppichs zu bewirken. Diese Methode erfordert hohe Anteile an wäßriger Emulsion und das Ergebnis wird erst nach mehreren Wochen erzielt. Durch die Erfindung wird eine neue Lösung für die Zufuhr von Nährsubstanzen, die in Wasser löslich sind, zu einer organischen hydrophoben Schicht, bereitgestellt. Unabhängig davon, ob diese Schicht, die kohlenwasserstoffhaltig sein kann, auf Wasser schwimmt oder sich auf dem Erdboden oder auf einer Unterlage aus einem Bau material befindet, verbleiben die erfindungsgemäß zuge setzten Nährsubstanzen Im wesentlichen in der hydrophoben Schicht und ermöglichen die rasche Vermehrung von Mikroorganismen, wenn Keime von diesen vorhanden sind.

Der Gegenstand der Erfindung Ist Im Patentanspruch 1 angegeben. Die Patentansprüche 2 und 3 nennen Ausgestaltungen der Erfindung.

Es versteht sich, daß, wie auf diesem Gebiet bekannt, die Mlkroemulsion mindestens ein oberflächenaktives Mittel und ein Koagens enthält, die zu ihrer Herstellung gedient haben.

Im Gegensatz zur bisherigen Technik werden die Nährsubstanzen somit weder im festen Zustand noch gelöst In einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungs mittel, noch als wäßrige Makroemulsion verwendet, son dern in der Form einer wäßrigen mikroemulglerten Lösung in einer mit der hydrophoben Schicht, die biozersetzt werden soll, mischbaren Flüssigkeit, d. h. in der Form von mlkrodlspergierten Mizellen, die als umge kehrt bzw. reziprok bezeichnet werden, deren Durchmes ser 8,0 bis 60,0 nm und insbesondere 10,0 bis 20,0 nm beträgt. Diese Form fahrt überraschenderweise zu dem bemerkenswerten Ergebnis, daß die Blo-Zerseizung In einigen Tagen anstelle von Wochen oder Monaten, wie dies bekannte Verfahren erforderten, durchgeführt werden kann.

Als Stlckstoffquclle kann man in den erfindungsgemäßen Mlkroemulslonen die verschiedenen Verbindungen

verwenden, die In Wasser löslich sind und durch die Mikroorganismen assimilierbar sind. Dies sind beispielsweise die Nitrate, Sulfate und/oder Phosphate von Ammonium, Harnstoff, Proteine, Peptone usw. Da Harnstoff das stickstoffreichste und in Wasser sehr gut lösliche Düngemittel Ist, ist er besonders geeignet, da er wäßrige Losungen ermöglicht, die sehr stark konzentriert sind. Man kann beispielsweise Harnstofflösungen von 10 bis 60 Gew-%, d. h. 11 bis ISO Teilen Harnstorf pro 100 Teile Wasser, verwenden.

Der Phosphor kann der Lösung in gleicher Weise in einer seiner üblichen Formen, als Alkali- oder Ammoniumphosphate oder -phosphite, zugesetzt werden. Gemäß einer sepziellen Ausführungsform der Erfindung wird der Phosphor In der Form einer oberflächenaktiven Verbindung bzw. eines Tenslds verwendet, wie beispielsweise eines höheren Alkylphosphats oder eines Lecithins. Man hat so eine Phospiiorquelle und ein oberflächenaktives Mittel für die Mlkroemulslon im gleichen Molekül.

Bei zahlreichen Industriellen Verfahren, die sich der Kultur von Mikroorganismen bedienen, ist es nötig, daß der pH-Wert des Mediums auf den günstigsten Wert für das Wachstum der Bakterien eingestellt wird. Im allgemeinen muß der pH-Wert Im Bereich des Neutralpunkts liegen und man kann entweder Phosphorsäure, eine Phosphorquelle, zusetzen, wenn das Medium angesäuert werden soll oder auch Ammoniak, eine Stlcksloff^uelle, wenn das Medium mit einer Base neutralisiert werden soll.

Im Falle der bakteriellen Zersetzung der Kohlenwasserstoffe durch Mikroorganismen, wie nachstehend beschrieben. Ist der Bedarf an Phosphor wesentlich geringer als an Stickstoff. Bezogen auf das Gewicht kann das Verhältnis von P/N zwischen 0,02 und 0,2, vorzugsweise zwischen 0,05 und 0,15 variieren; vom Gesichtspunkt des Wachstums her gesehen, liegen die günstigsten P/N-Verhältnlsse so nahe wie möglich bei 0,05.

Wenn die mit Wasser nicht mischbare Flüssigkeit, die vorzugsweise llpomlschbar Ist, die die äußere Phase der Mlkroemulslon bildet oder auch die hydrophobe, zu zersetzende Schicht bildet, durch die Mikroorganismen als Kohlenstoffquelle verwertbar Ist, so 1st es nicht mehr notwendig, der Mlkroemulslon andere assimilierbare Kohlenstoffverbindungen zuzusetzen. Werden im Gegensatz hierzu die äußere Phase davon und die zu zersetzende Schicht schwierig durch die Mikroorganismen -zumindest zu Beginn - angegriffen, so Ist es günstig, der Nährlösung eine leicht zu verwertende Kohlenstoffquelle zuzusetzen, beispielsweise lösliche Kohlenhydrate, wodurch ein rascher Beginn der Vermehrung der Mikroorganismen ermöglicht wird.

Wie in allen Kulturen sind Spurenelemente nötig, insbesondere Salze von Fe, Mg, K usw. und man fügt daher eine sehr geringe Dosis in an sich bekannter Weise zu der Nährlösung.

Es versteht sich, daß man zur Erzielung einer erfindungsgemäßen Mlkroemulslon eine zu deren Herstellung geeignete oberflächenaktive Verbindung verwenden muß. Die Wahl einer geeigneten Bindung durch den Fachmann kann unter den zahlreichen Gruppen nichttoxischer, oberflächenaktiver Mittel oder Tenside für die vorhandenen Mikroorganismen erfolgen. So kann man beispielsweise Fettalkoholsulfate, Sulfosuccinate, oxyäthylenierte Sorbitanester, oxyäthylenlerte Alkohole, Säuren oder Öle, Ester von Sacharose, Aminosäuren, alpha-Amldo-amino-säuren, Taurine, Sarcosln, PoIyglykole, schwere Alkylphosphate usw. verwenden. Diese Aufzählung soll keine Einschränkung darstellen, da andere oberflächenaktive Mittel verwendet werden können. Insbesondere solche, die dispergierende Eigenschaften gegenüber Kohlenwasserstoffen aufweisen.

Vorzugsweise Hegt das Hydrophil-Lipophil-Gleichgewicht der verwendeten Emulgiermittel bei 10 bis 17 oder besser be! Il bis 15.

Wenn es sich um im Freien durchgeführte Verfahren handelt, sollte das oberflächenaktive Mittel selbst biozersetzlich sein, um Schädigungen der Natur zu vermei- den. Wie für die oberflächenaktiven Mittel, ist auch die Wahl für das ko-oberflächenaktive Mittel breit, das zur Bildung der Mikroemulsion benötigt wird. Derartige Ko-Mittel sind auf diesem Gebiet bekannt und es müssen daher hier nicht viele aufgezählt werden; es sei lediglich

is festgestellt, daß es ohne eine Einschränkung darzustellen möglich ist, stickstoffhaltige Verbindungen, wie Carbamate, Amide oder Aminsalze zu verwenden. Die Viskosität der Mikroemulsion kann beträchtlich durch Zusatz eines Alkohols, insbesondere mit Ct bis C₁₂, eines Äthers oder eines Polyolesters, insbesondere von Glykol, verringert werden. Dies erleichiert die Handhabungen sehr.

Da die äußere Phase der Mikroemulsion mit der hydrophoben Flüssigkeit mischbar sein muß, die bio-zersetzt werden soll, wird sie gezwungenermaßen, je nach der Natur dieser Flüssigkeit, gewählt. Im wichtigsten praktischen Falle, wenn letztere aus Erdölkohlenwasserstoffen besteht, kann die äußere llpomlschbare Phase beispielsweise aus aliphatischen, aromatischen oder naphthenischen Kohlenwasserstoffen oder aus sogenannten Mineralölen bestehen, d. h. aus Gemischen derartiger Kohlenwasserstoffe. Dieser Typ der äußeren Phase wird schwierig durch Bakterien angegriffen, falls diese keiner entsprechenden Anpassung unterzogen wurden. Es ist daher bevorzugt, pflanzlich oder tierische Öle zu verwen den, die als Kohlenstoffquelle dienen können, da sie von den Mikroorganismen verwertbar sind. Diese Öle oder vorzugsweise Ihre entsprechenden Fettsäuren ermöglichen eine rasche Entwicklung der Mikroorganismen, die zur Zersetzung der hydrophoben Schicht, insbesondere von Rohöl, benötigt werden.

Das Gewichtsverhältnis zwischen der lipomischbaren Flüssigkeit, d. h. der äußeren Phase der Mikroemulsion und der zu emulglerenden wäßrigen Lösung muß über 0,2 liegen. Dieses Verhältnis wird derart gewählt, daß die wäßrige Lösung sich In der inneren Phase befindet. Die Wahl der oberflächenaktiven Mittel und der ko-oberflächenaktlven Mittel erfolgt nach der Natur der lipomischbaren Flüssigkeit und nach der Konzentration der in der wäßrigen Phase gelösten Salze. Man stützt sich auf For-

SO mulierungskonzepte für Mikroemulsionen, die an sich bekannt sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren Ist anwendbar auf eine große Anzahl von Mikroorganismen und Insbesondere auf solche, die die Zersetzung von Kohlenwasser- stoffen ermöglichen. So kann man die Erfindung zur Verwertung von Bakterien wie Pseudomonas, Acinetobacter, Flavobacterium, Artrobacter, Corynebacterium usw. anwenden. Die Mikroorganismen können auch Pilze sein.

Die Erfindung Ist zwar sehr interessant für die verschiedenen Arbeitsgänge zur Bio-Zersetzung, die im Freien durchgeführt wird, sie kann jedoch auch bei verschiedenen Herstellungen im Bottich dienlich sein, jedesmal wenn eine hydrophobe Schicht einer Substanz bei diesem Verfahren auftritt. Sie läßt sie sich beispielsweise vorteilhaft auf die Herstellung von Proteinen, ausgehend von Kohlenwasserstoffen durch Zersetzung der , letzteren mit Hilfe von Bakterien und/oder Pilzen,

anwenden. In jedem Falle führt die beträchtliche Dispersion der wäßrigen Nährsubstanzen in der hydrophoben Phase, die dank der Erfindung erhalten wird, zu einer rascheren Ernährung der Mikroorganismen. Hieraus folgt ein nennenswerter Zeitgewinn bei den Verfahren.

Unter den Anwendungen an der freien Luft, auf großen Wasser- oder Erdbodenoberflächen liegt die wichtigste in der Zersetzung von durch Unfälle verbreiteten Kohlenwasserstoffen. Aus dem vorstehend erläuterten Grund, d. h., da die löslichen Nährsubstanzen in der behänderen Schicht verbleiben, anstatt durch das Wasser mitgeschleppt zu werden, ist die Erfindung sehr wertvoll zur Bekämpfung der schwarzen Flut bzw. Ölpest. Jedoch ist das gleiche Prinzip auf Verfahren anwendbar, wie die Reinigung von Straßen, Bassins, Erdboden, Fässern usw. von Kohlenwasserstoff ablagerungen, die sie verschmutzen können. Andere Anwendungsmöglichkeiten umfassen die Ausstreuung von Dünger auf landwirtschaftliche Kulturen. Die Mikroorganismen sind im allgemeinen In dem zu behandelnden Milieu bzw. Medium vorhanden. Es ist jedoch manchmal nötig, eine Animpfung durchzuführen, wenn die ursprüngliche Population als zu schwach beurteilt wird oder auch wenn das Medium keine geeigneten Bakterien enthält.

Bei einer speziellen Ausführungsform der Erfindung verwendet man Harnstoff als stickstoffhaltige Nährsubstanz. Man hat festgestellt, daß diese Verbindung gleichzeitig die Rolle des ko-oberflächenaktiven Mittels übernimmt und man Ist daher nicht mehr gezwungen, ein anderes ko-oberflächenaktlves Mittel zuzusetzen. Da darüber hinaus der Phosphor vorteilhaft durch Alkylester der Phosphorsäure zugesetzt werden kann, die die Eigenschaft von oberflächenaktiven Mitteln übernehmen, wird die erfindungsgemäße Nährstoffzusammensetzung vereinfacht, da es möglich ist. Harnstoff und Phosphorester ohne anderes Adjuvans zu verwenden. Es Ist jedoch empfehlenswert. Flüssigkeiten zuzusetzen, die die Viskosität der Mlkroemulslon herabsetzen können. Vorstehend wurden einige Beispiele für derartige Zusätze genannt. Gemäß einer speziellen Ausführungsform der Erfindung ergibt Äthylenglykol-butyläther ausgezeichnete Ergebnisse.

Die lipomischbare Flüssigkeit, die gut für die äußere Phase der Mlkroemulslon gemäß der Erfindung geeignet ist, kann aus einem oder mehreren Estern von Fettsäuren, wie Laurinsäure, Myristlnsäure, PalmlSlnsäure, Arachinsäure. Ölsäure, Stearinsäure, Caprinsäure, Capronsäure, Caprylsäure usw. bestehen; die Glyzeride derartiger Säure bilden sehr zugängliche industrielle Produkte, da es sich um pflanzliche und tierische Öle handelt. So kann man beispielsweise Öle verwenden, wie Erdnußöl, Walflschtran, Rapsöl, Leinöl, Maisöl, Rizinusöl, Sesamöl, Talgöl usw. Die Fettsäuren selbst sind besonders geeignet, gegebenenfalls als geeignete Gemische, um bei Umgebungstemperaturen flüssig zu bleiben; μ sind Fettsäuien brauchbar. Insbesondere solche mit C« bis Cu, beispielsweise Capronsäure, Oenanthsäure, Caprylsäure, Laurinsäure, Palmltinsäure, Ölsäure, Llnolsäure oder Stearinsäure. Zu solchen fetten Materialien, die bei Umgebungstemperaturen nicht flüssig sind. Ist es praktisch. Kohlenwasserstoffe zu fügen, wie beispielsweise Erdöl oder Gasöl In einer Menge von etwa 5 bis 50%. Fettalkohole, d. h. mit Ct bis C₁, sind ebenfalls geeignet.

In einem speziellen Fall, wo die wäßrige Losung Harnstoff und Lauryl- und/oder Oleylphosphat enthält. Ist der bevorzugte Gehalt an Stickstoff In der ganzen Mlkroemulslon etwa 4 bis etwa 10 Gew.-% oder besser 5 bis 8%. Das Gewichtsverhältnis Von Stickstoff zu der llpomlsch baren Flüssigkeit liegt im allgemeinen bei 0,1 bis 0,4 und insbesondere bei 0,15 bis 0,35.

In allgemeiner Welse bestehen die bevorzugten erfindungsgemäßen Mikroemulsionen, bezogen auf das Gewicht, aus 10 bis 30% Wasser, 4 bis 10% assimilierbarem Stickstoff in der Form von stickstoffhaltigen Verbindungen, 5 bis 35% eines Alkylphosphats mit Ci₀ bis Ci₁ oder eines äthoxylierten Alkylphenolphosphats, 0 bis 20% eines Alkylenglykol-alkyläthers und 20 bis 50% eines ίο Esters, einer Säure und/oder eines Fettalkohols bzw. eines Fettesters einer Fettsäure und/oder eines Fettalkohols. Diese Fettverbindungen können mit flüssigen Kohlenwasserstoffen versetzt werden, wie Erdöl oder seinen Derivaten, beispielsweise in einer Menge von 5 bis 70%. Eine Variante der Erfindung bringt eine Verbesserung mit sich, die es ermöglich, eine raschere Wirkung der Mikroorganismen zu erzielen. Sie ermöglicht die Zersetzung der Kohlenwasserstoffe in kürzerer Zeit durch Verwendung für diese Arbeit einer größeren Anzahl an Mikroben. Man hat tatsächlich festgestellt, daß selbst mit . der besten Nährsubstanz, die Harnstoff ist, ein Teil der Mikroorganismen, die normalerweise in Meereswasser vorhanden sind und geeignet sind, die Kohlenwasserstoffe abzubauen, sich nicht entwickelt und daher nicht an der gewünschten Zersetzung teilnimmt. Nach der vorliegenden Variante bzw. Ausführungsform kann diese Mikroorganismenfraktion, die »inaktiv« geblieben ist, dazu gebracht werden, sich zu entwickeln und an der Zersetzung der Kohlenwasserstoffe teilzunehmen, wenn das stickstoffhaltige Nahtmaterial von einem oder mehreren stickstoffhaltigen Materlallen begleitet wird, das eine von dem ersten deutlich unterschiedliche chemische Zusammensetzung aufweist. Besonders günstige Ergebnisse erhält man, wenn das erste Nährmaterial Harnstoff ist und das zweite aus einer oder mehreren Aminosäuren besteht.

Daraus folgt, daß eine erfindungsgemäße Mlkroemulslon, die bestimmt ist zur mikrobiologischen Behandlung eines Kohlenwassersloffmaterlals, vorzugsweise eine wäßrige Lösung von mindestens zwei stickstoffhaltigen Verbindungen enthält, die vom chemischen Standpunkt her deutlich unterschiedlich sind. Ist so die erste Nährsubstanz ein Salz, wie das Sulfat, Phosphat oder Nitrat von Ammonnlum, so besteht die zweite aus einem ^s AmIn, einem Amid, einem Protein, einer Aminosäure oder einer anderen nicht-ammoniakalischen Verbindung. Wenn die Nährlösung Harnstoff enthält, ist die zweite stickstoffhaltige Verbindung beispielsweise Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat oder Ammoniumnitrat oder so ein Aminolipld und insbesondere eine Aminosäure. Die jeweiligen Anteile der beiden Sorten von stickstoffhaltigen Materialien können weit variieren je nach der Natur der Mlkrobenflora des Mediums, wo das erflndungsge-. mäße Verfahren angewendet wird. Arn häufigsten Hegt der wirksame Anteil von Harnstoff, ausgedrückt als Stickstoff, bei etwa 50 bis 99% Gesamtstickstoff, d. h. daß der des AminosäurestickstofTs 50 bis 1% beträgt. In bestimmten wäßrigen Medien können etwa 1 bis 10% Stickstoff in dieser zweiten Form genügen zur Erzielung ausgezeichneter Ergebnisse.

Die Aminosäuren, die vorteilhaft erfindungsgemäß verwendet werden können, können ausgewählt werden unter solchen, die man in der Natur findet und unter synthetischen Aminosäuren. Beispielswelse ohne eine Einschränkung darzustellen, kann man Glycin, Alanin, Serin, Cystein, Valin, Glutamin, Leucin, Lysin, Arginin, Prolin, Tyrosin, Asparaginsäure und Glutaminsäure usw. verwenden. Aus Wirtschaftlichkeitsgründen ist es inter-

essant. Materlallen zu verwenden, die von natürlichen Produkten stammen, die Im allgemeinen Reihen verschiedener Aminosäuren enthalten. Dies ist beispielsweise der Fall bei Rübenschlempen, bei Extrakten, die von der Mazerlslerung verschiedener Pflanzen stammen, Insbesondere von Malsstrünken, Hefeextrakt, Hydrolyseprodukten von Proteinen, Nebenprodukten der Molkerei usw.

Die Erfindung führt zu der unvorhergesehenen Feststellung, daß, wenn ein stickstoffhaltiges Nährmaterial allein gute Resultate ergibt, und wenn das gleiche bei einem anderen stickstoffhaltigen Material mit chemisch unterschiedlicher Natur allein der Fall Ist, die Zersetzung der Kohlenwasserstoffe durch die Mikroorganismen noch besser Ist, wenn die beiden Materialien zusammen verwendet werden, wenn die Gesamtkonzcntratlon an assimilierbarem Stickstoff gleich bleibt.

Durch die erfindungsgemäßen Mikroemulslonen wird es somit möglich, beispielsweise eine Zersetzung von mehr als 80% des Rohöls, das sich auf dem Meereswasser ausgebreitet hat. In sieben Tagen zu bewirken, wenn die Nährlösung Harnstoff oder Aminosäuren enthält. Dasselbe Ergebnis erhält man in sechs Tagen, wenn Harnstoff und die Aminosäuren gleichzeitig in der Lösung vorhanden sind, wobei die Konzentration dieser an Gesamtstickstoff gleich ist wie In den beiden vorhergehenden Fällen.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.

Beispiele 1 bis 11

Für jede Untersuchung vermischt man ein bestimmtes Volumen wäßriger Harnstofflösung von 50 Gew.-% mit einem Volumen an Ölsäure In Anwesenheit einer bestimmten Menge von oberflächenaktiven Mitteln, die aus einem Gemisch von Fettalkoholphosphorsäureestern mit Cu bis Cig bestehen. In bestimmten dieser Versuche fügt man gleichzeitig Äthylenglykol-butyläther zu, um die Viskosität zu erniedrigen. Man bestimmt die Temperaturbereiche, In denen die erhaltene Mlkroemulslon stabil ist.

Die Tabelle der folgenden Seite zeigt die so hergestellten Mlkroemulslonzusammensetzungen, deren Stabllltätsberelche und ihre Viskosität. Es Ist ersichtlich, daß eine ausgezeichnete Stabilität im Bereich von 0° C bis mehr als 40⁰C erzielt werden kann gemäß den Beispielen 4, 5, 6, 8, 10 und 11. Was die Viskosität betrifft, so stellt man fest, daß sie ohne Zusatz von Äthylenglykolbutyläther sehr hoch Ist (Beispiele 1 und 2); im Gegensatz führt dieser Zusatz die Werte auf sehr brauchbare zurück (Beispiele 3 bis 11).

Tabelle I	1	11,1	2	11,7	3	13,8	4	14,4	5	18,3	6	20,1	7	20,9	8	9	10	11
	11,1	11,7	13,8	14,4	18,3	20,1	20,9	21,9	19,2	20,2	19,2
Wasser	44,4	46,7	36,8	38,4	36,6	32,1	27,9	17,2	15,8	16,6	15,7
Harnstoff	0	0	10,6	9,8	10,7	11,6	14,4	27,9	28	29,4	28
Ölsäure								14,4	17,5	16,2	10,5
Äthylenglykol-	33,3	-	25	-	-	-	-
butyläther								-	19,5	8,8	19,5
Laurylphosphat	-	30	-	23	-	-	-
(KL 340)								-	-	-	-
Oleylphosphat	-	-	-	-	16,1	16,1	15,9
(KO 380)								15,9	-	8,8	-
äthoxyliertes Alkyl-	-	-	-	-	-	-	-
phenolphosphat								2	-	-	-
Monoammoniak-
phosphat

% Stickstoff 5,2 5,45 6,44 6,72 - 7,4

Verhältnis Stickstoff/ 0,117 0,117 0,175 0,175 0,23 0,29 0,35 0,31 0,26 0,26 0,26

Ölsäure

Verhältnis Phosphor/ 0,154 0,064 0,09 0,043 0,099 0,09 0,086 0,063 0,064 -

Stickstoff

Stabilitätsbereich 10-44 10-46 1-44 0-44 0-40 0-47 12-57 0-40 0-36 0-42 0-45

Viskosität bei 20 ⁰C 1200 2000 167 265 203 197 141 98 61 -

in cP bzw. mPas

Beispiele 12 bis 16

Mikroemulslonen wurden hergestellt mit 3i% Laurylphosphat. Die lipomlschbare Flüssigkeit 1st Ölsäure, deren Menge gleich zweimal der wäßrigen Harnstoff- und

65 Phosphatlösung ist. Man variiert den Prozentsatz Harnstoff in der wäßrigen Phase. Die nachstehenden Ergebnisse geben die maximale Temperatur an, bei der die Mikroemulsion noch stabil ist.

% Harnstoff in der wäßrigen Phase

obere Temperalurgrenze (⁰C)

36
32
38
35
keine Mikrocmulsion

Diese Ergebnisse zeigen, daß die praktisch brauchbaren Mikroemulsionen, die stabil bis etwa 36° C sind, erhalten werden können mit Konzentrationen an Harnstoff, die bis zu 50% gehen, jedoch nicht über dies hinaus.

Beispieie i7 bis Ί9

Mit einer 50%igen wäßrigen Harnstofflösung und unter Zusatz von Oleylphosphat mit einem Gehalt von 30% Äthylenglykol-monoäthyläther wurden drei Mikroemulsionen hergestellt, die verschiedene Anteile an Ölsäure enthielten. Im folgenden sind die Stabilitätsbereiche dieser Produkte angegeben.

Gewichtsverhältnis oberflächenaktives Stabilitatsbereich Harnstofflösung/ Mittel (⁰C)

Ölsäure (Oleylphosphat)

0,5	25,3	0-65
0,625	24,2	0-59
0,75	26,7	Ogel-64

Es ist ersichtlich, daß von einem Verhältnis der wäßrigen Lösung/Ölsäure von etwa 0,65 an und für eine feste Menge an Äthylenglykolmonoäthyläther von 30% die Mikroemulslon schwierig zu verwenden ist, da sie zur Gelbildung neigt. Im Gegensatz stellt man unter diesem Verhältnis eine ausgezeichnete Stabilität fest.

Zersetzung von Erdöl kohlenwasserstoffen
Beispiel 20

In einen Fermentor von 50 1 bringt man 30 I Meereswasser, sterilisiert bei 120⁰C während 2 Stunden ein. Auf die Oberfläche dieses Meereswassers verteilt man 30 ml Rohöl von 34° API mit einem Gehalt von 75% gesättigten Kohlenwasserstoffen und 25% aromatischen. Die Erdölschicht weist eine Dicke von 0,5 mm auf.Auf diese Schicht zerstäubt man 6 ml einer der Mikroemulsionen der vorstehenden Beispiele. Das Medium wird anschließend mit Keimen angeimpft, die aus dem Meereswasser stammen. Diese Keime erhält man durch 24stündige Kultur auf einer wäßrigen Glucoselösung. Sie enthalten als Hauptantel! Pseudomonas.

Nach diesem Inokulieren führt man eine Zählung der Keime in Entnahmen des Erdöls durch: man findet so 2,5 χ 10-' bis 4x10* Keime pro ml.

Man führt nun die aerobe Kultur durch unter Rühren des Fermentorinhalts mit einem Rührer von 400 U/min, während 1201 sterilisierte Luft pro Stunde eingeblasen werden. Diese Belüftung entspricht genau der. die natürlicherweise im Meer stattfindet.

Nach 48 Stunden wird eine neue Zählung durchgeführt. Die Ergebnisse sind nachstehend aufgeführt.

Nach 7 Tagen bestimmt man den Umwandlungsgrad des Erdöls durch Extrahieren der Kohlenwasserstoffreste mit CCIi und mißt im Infrarot.

Im folgenden sind die mit den Mikroemulsionen der Beispiele 1, 2, 3, 10 und Il erhaltenen Ergebnisse aufgeführt.

Mikroemulsion von Bsp.

Ausgangskeime

Keime nach 48 Stunden

Umwandlungsgrad nach 7 Tagen (%)

Man führt einen Versuch nach der in Beispiel 20 beschriebenen Arbeltsweise durch, führt jedoch in den Fermentor nlcht-sterillsiertes Meereswasser ein und das Medium wird nicht mit zusätzlichen Bakterien angeimpft.

Man erhält folgende Ergebnisse:

2,5	X	10³	2,5	x 10⁸	83
2	X	10«	9,5	X 10⁸	90
1,5	X	10«	2,5	X 10⁸	90
4,5	X	10³	2,5	X 10»	86
1,5	X	10³	7,5	X 10⁷	92
			Beispiel	21

Mikro- Keime zu emulsion Beginn von Bsp.

Keime nach Umwandlungs-48 Stunden grad nach 7 Tagen (%)

2 X 10³

5,5 X 10⁷ 82

Beispiel 22

Man führt einen Versuch nach der Arbeitsweise des Beispiels 20 durch, ersetzt jedoch das Meereswasser durch ein natürliches Wasser, in das man verschiedene mineralische Bestandteile von Meereswasser, sowie 30 ppm Spurenelemente, Insbesondere Elsen, Magnesium, Kalium fügt. Man zerstäubt 6 ml der Mikroemulsion Nr. 11 und impft das Milieu mit einer Kultur von Bakterien an.

Nach 7 Tagen bestimmt man den Zersetzungsgrad des Erdöls durch Extrahieren der verbleibenden Kohlenwasserstoffe mit CCI₄ und mißt im Infrarot. Die Umwandlung beträgt 90%.

Beispiele 23 und 24

Untersuchungen der Bio-Zersetzung von arabischem Rohöl werden an der Meeresküste in einem Bassin von 2m Tiefe durchgeführt, das In vier Abteilungen aufgeteilt 1st von jeweils 3 χ 3 m waagerechten Abschnitten. Die Abschnitte können isoliert oder miteinander verbunden sein und alle können Meereswasser aulnehmen. Ein Hydrolnjektor-Pumpsystem sichert eine leichte Vermischung des Wassers und die Erneuerung der Luft in dem Bassin.

In jede Abteilung bringt man 15,6 m' Meereswasser und 4 1 des vorstehend angegebenen Erdöls ein in einer Schicht von 0,45 mm Dicke auf der Oberfläche des Was sers.

Eine der Abteilungen dient als Kontrolle: Das Wasser und das Erdöl, die darin enthalten sind, wurden wie in den anderen Abteilungen vermischt, erhielten jedoch keinen Zusatz. Am Ende der Untersuchungen bestimmte man die Erdölverluste durch natürliche Gründe, um diesen bei der Bewertung der Zersetzung Rechnung zu tragen, die durch die erfindu:igsgemäßen Zusätze bewirkt wird.

In jedes der drei anderen Abteile bringt man 0,4 I einer Mikroemulsion einer Nährlösung ein, mit folgender Zusammensetzung in Gewichtsprozent:

Harnstoff

Süßwasser

Butylglykol

Laurylphosphat

Ölsäure

Gew.-%

17,0 20,8 10,8 21,1 30,3

Zu Beginn der Untersuchungen zählte die Mlkroflora des Meereswassers des Bassins I0² Keime/ml. Nach 7 Tagen bestimmte man die in den Abteilungen verschwundenen Erdölmengen. Die nachstehende Tabelle zeigt die Größenausmaße in Prozent der ursprünglichen Menge bei zwei verschiedenen Temperaturen an.

Kontrolle Bsp. 23 Kontrolle Bsp. 24 12°C 12-C 18°C 18°C

% verschwunden
durch natürliche
Gründe

% verschwunden
durch Behandlung
gem.d.Erf.

% insgesamt
verschwunden

5 17,5 17,5

58 0 61,3

63 17,5 78,8

Es ist ersichtlich, daß selbst bei relativ tiefer Temperatur von 12° C die in 7 Tagen erhaltene Bio-Zersetzung durch erfindungsgemäße Behandlung betrachtlich ist. Man erhält sie im Gegensatz zu vielen bekannten Verfahren ohne den Zusatz einer Mikroorganismenkultur unter alleiniger Ausnutzung der, die in dem Meereswasser existieren.

Beispiel 25

In einen Fermentor von 501 bringt man 30 I Meereswasser ein. Auf der Oberfläche des Wassers verteilt man 30 ml Rohöl von 34° API mit einem Gehalt von 75% gesättigten Kohlenwasserstoffen und 25% aromatischen. Auf die Erdölschlchl, die so gebildet wurde, mit einer Dicke von 0,5 mm, zerstäubt man 6 ml der Mikroemulsion, die folgende Gewichtszusammensetzung aufweist.

Harnstoff

Wasser

Äthylenglykol-butyläther

Laurylphosphat

Ölsäure

(8,07% Stickstoff)

Die Zählung der Keime in dem Erdöl zeigt die Anwesenheit von 10² Keimen/ml.

Man führt dann eine aerobe Kultur durch Rühren des Inhalts des Fermentors mit einem Rührer mit 400 U/min durch, während 120 I sterilisierte Luft pro Stunde eingeblasen werden. Diese Belüftung entspricht genau der, die natürlich am Meer stattfindet.

Nach 48 Stunden wird eine erneute Zählung durchgeführt. Sie zeigt die Anwesenheit von 2,5 χ 10⁸ KeI-men/ml.

Nach 7 Tagen bestimmt man den Zersetzungsgrad des Erdöls durch Extrahieren der Rest-Kohlenwasserstoffe U CCI₄ und mißt im Infrarot. Der Grad beträgt 83%.

Beispiel 26

Man arbeitet identisch wie im Beispiel 25, jedoch wird in der Mikroemulsion ein Teil des Harnstoffs durch die Aminosäure DL-Valin ersetzt. Die Gewichtszusammensetzung der Mikroemulsion ist:

Harnstoff 16,8%

DL-Valin 2,0

Wasser 20,5

Äthylenglykol-butyläther . 10,8

Laurylphosphat 23,7

Ölsäure 26,2

(Gesamtstickstoff des Harnstoffs und des 100,0
Valins beträgt 8,07%)

Die Zählung der Keime ergibt 10-' zu Beginn und 10" nach 48 Stunden. Der Umwandlungsgrad des Erdöls beträgt 84% vom sechsten Tag an.
Der Vergleich mit Beispiel 25 zeigt, daß der Zusatz von Aminosäure es ermöglicht hat, 10' Keime anstelle von 2,5 χ I0⁸ mit Harnstoff allein nach 48 Stunden zu erreichen. Die Zersetzung in der gleichen Größenordnung (84% gegen 83%) konnte rascher in sechs Tagen erhalten werden, wohingegen im Fall von Harnstoff allein 7 Tage benötigt wurden.

Beispiel 27

Nach der Technik der Beispiele 25 und 26 wurde eine Mikroemulsion verwendet. In der ein Teil des Harnstoffs ersetzt wurde durch einen wäßrigen Maisstrunkextrakt, der eine Reihe von Aminosäuren einschließt, wobei Alanin, Arginin, Glutaminsäure und Leucin vorherrschen. Die anderen Aminosäuren, die in geringeren Anteilen vorhanden waren, waren Prolin, Isoleucin, Threonin, Valin, Phenylalanin, Methionin und Cystein. Der Gesamtstickstoffgehalt in diesem Extrakt betrug 1 %.

Die Mikroemulsion zeigte folgende Gewichtszusammensetzung:

17,3%

21,5

10,8

23,7

26,7

100,0

Harnstoff

Malsstrunkextrakt

Älhyienglykol-butyläther

Lpurylphosphat

Ölsäure

12,4% 18,7% 19,2% 29,1% 20,6%

Das Wasser der wäßrigen Phase war das des wäßrigen Extrakts. Der Stickstoffgesamtgehalt der wäßrigen Phase belief sich auf 6%.

Ausgehend von XO² Keimen zählte man 4 χ 10' nach 48 Stunden und der Umwandlungsgrad des Erdöls erreichte nach 6 Tagen 88%.

Der Vergleich dieser Resultate mit denen des Beispiels 25 zeigt, wie Interessant es Ist, Aminosäuren dem Harnstoff zuzusetzen.

Beispiele 28 bis 37

In dieser Versuchsreihe analog zum Beispiel 27 wird das Laurylphosphat durch Oleylphosphat ersetzt und die

Ölsäure durch verschiedene. In der folgenden Tabelle angegebene Flüssigkeiten ersetzt, was zu Zersetzungsgraden des Erdöls führte, die In 6 Tagen erhallen wurden.

Bsp. Nr.	verwendete hydrophobe Flüssigkeit	Zersetzung (%)
28	Erdnußöl	88
29	Rapsöl	82
30	Talgöl	86
31	Mischung von Koprafettsäuren mit 10% Vaselineöl	85
32	Laurinsäurc verflüssigt mit 10% Rohöl	84
33	Butylcaproat	85
34	Äthyllaurat	87
35	Methyloleat	86
36	Amylstearat	88
37	Gasöl mit 10% Sesamöl	83

Vergleichbare Ergebnisse erhält man mit einem Gemisch von Mono-, Di- und Tri(alkylteiraglykoläther)-o-phosphaten von Alkylen mit C_!2 bis C₁₄ anstelle des üleylphosphats.

Claims

3! 37 020 Palentansprüche:

1. Verfahren zur Kultur von Mikroorganismen in einem hydrophoben Milieu unter Verwendung von Nährsubstanzen in wäirlger Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß diese Lösung in einer mit Wasser nicht mischbaren Flüssigkeit, die jedoch mit dem hydrophoben Milieu mischbar ist, so mlkroemulgiert wird, daß ihre Mizellen einen Durchmesser von 8,0 bis 60,0 nm aufweisen, und das Gewichtsverhältnis zwischen der äußeren Phase der Mlkroemulsion und der zu emulgierenden wäßrigen Lösung über 0,2 liegt, und daß die so gebildete Mlkroemulsion in das Medium eingebracht wird, das Keime der zu kultivierenden Mikroorganismen enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß man in der wäßrigen Lösung, die die innere Phase der Mikroemulsion bildet, zwei chemisch unterschiedliche Sorten von Stickstoffverbin düngen einsetzt, die durch Mikroorganismen assimilierbar sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man in der wäßrigen Lösung Harnstoff und ein Alkyl- oder Alkenylphosphat einsetzt und die äußere Phase durch einen oder mehrere Fettsäureester, Fettsäuren und/oder Fettalkohole gebildet wird.