NO159806B

NO159806B - Fremgangsmaate og middel for dyrkning av mikroorganismer iet hydrofobt miljoe.

Info

Publication number: NO159806B
Application number: NO813163A
Authority: NO
Inventors: Jacques Tellier; Andre Sirvins; Jean-Claude Gautier; Bernard Tramier
Original assignee: Elf Aquitaine
Priority date: 1980-09-19
Filing date: 1981-09-17
Publication date: 1988-10-31
Also published as: AU7528881A; US4401762A; CH653362A5; IE812170L; AU527434B2; ES8301273A1; IT1139177B; CA1156574A; DK416481A; BR8105993A; ES505525A0; SE8105540L; DK148598B; DE3137020A1; GB2084608A; IT8123992A0; IE51588B1; PT73694B; NO813163L; DK148598C

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte til dyrkning av mikroorganismer i et hydrofobt miljø under anvendelse av næringsstoffer i vandig oppløsning, og det særegne ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er at man i det hydrofobe miljø, som inneholder eller bringes til å inneholde de mikroorganismer som skal dyrkes, innfører en mikroemulsjon fremstilt ved å emulgere den vandige næringsstoff-oppløsning i form av miceller med diametere mellom 80 og 600 Ångstrøm i en væske som ikke er blandbar med vann, men som er blandbar med det hydrofobe miljø, idet vektforholdet mellom mikroemulsjonens ytre fase og den vandige oppløsning som emulgeres er over 0,2.

Oppfinnelsen vedrører også et middel til anvendelse ved utøvelse av den angitte fremgangsmåte, og det særegne ved midlet i henhold til oppfinnelsen er at det utgjøres av en mikroemulsjon frembragt ved å emulgere en vandig nærings-stof f-oppløsning i form av miceller med diametere mellom 80 og 600 Ångstrøm, i en væske som ikke er blandbar med vann, men som er blandbar med det hydrofobe miljø, idet vektforholdet mellom mikroemulsjonens ytre fase og den vandige oppløsning som emulgeres, er over 0,2.

Disse og andre trekk ved oppfinnelsen fremgår av patentkrav-ene.

Industrielle operasjoner hvor kulturer av forskjellige mikroorganismer, fremfor alt bakterier og sopp, er blitt vanlige i den senere tid. Tallrike næringsmiddel-industrier, medisinalvareindustrier, renseprosesser,

etc. er basert på slike operasjoner. Oftest foregår arbeidet i to trinn, først dyrking av angjeldende kultur av mikroorganismen i et passende næringsmiljø, inntil det er oppnådd en tilstrekkelig tallrik populasjon og i det annet trinn bringes denne populasjon i kontakt med de materialer som man ønsker å utsette for mikroorganismenes virkning. Beholderne for dyrking og behandling frembyr ikke spesielle vanskeligheter i arbeidsmessig henseende, idet den begynnende kultur, dvs. formeringen.

i det enkelte tilfellet gjennomføres i en separert beholder eller i den sammen beholder hvor den annen arbeidsfase finner sted- I motsetning hertil, når operasjonene gjennomføres i naturen, på store overflater av jordbunn eller vann, som f.eks. i tilfellet med fjernelse av lag av hydrokarboner ved mikrobiologisk nedbrytning til sjøs, på strendene, elver eller vann, frembyr den begynnende formering av de anvendte mikroorganismer vanskeligheter. Man må tilføre kulturen næringssubstanser, dvs. kilder for C, N og P, såvel som sporelementer, for å sikre formeringen av ajmgjjeldteniGte organismer. I og med at de vanlige kildter sam kartoo>-hydrater, nitrater eller ammoniramsalter eller fosfatsalter er oppløselige i vann, forblir de ikke i overflatelaget som skal behandles for å føre til en kraftig; vekst av nyttige mikroorganismer men substansene dlif"fTomderer i vannet eller underliggende jordbunn og fjernes således fra dyrkingen.

For å avhjelpe disse forhold har man hittil anvendt forskjellige metoder. En av disse metoder består i å omhylle de faste korn av nitrogenforbindelse og fosfat-forbindelse med paraffin for å tilsette dem i denne form til mikroorganismene, som angitt i US patentskrift 1.959.127. Ved en variant i henhold til US patentskrift 3.883.397 foregår den lipofile omhylling med et salt av en fettsyre istedet for paraffin. Men disse metoder tillater ikke hurtig tilføring av de ønskede næringsstoffer til mikroorganismene. Omhyllings-fettstoffet er vanskelig å gjennomtrenge, dvs. å nedbryte, i fravær av utenfra tilgjengelig nitrogen og fosfor. Videre er virkningen av bakterier eller sopp langsom og krever uker eller måneder. Et annet forslag består i at det som kilder for N og P anvendes forbindelser som er uopp-løselig i vann men oppløselige i hydrokarboner, spesielt fosfo-amino-lipider, som beskrevet i den franske patentpublikasjon 2.172.796. De nitrogenforbindelser som er oppløselig i olje har imidlertid et lite innhold av nitrogen og under disse betingelser krever den biologiske nedbrytning av petroleum-hydrokarboner til sjøs 2 til 3 måneder. Man har likeledes i den franske patentpublikasjon 2.2 30.401 antydet anvendelse av amider, organiske ammoniumsalter og fosfoaminolipider i oppløsning i et petroleumsløsningsmiddel idet opp-løsningen er emulgert i vann. Den oppnådde emulsjon forstøves utover et lag hydrokarbon som flyter på

vannet for biologisk nedbrytning av dette lag. Denne metode krever store mengder vandig emulsjon og resultatet oppnås først etter flere uker.

Den foreliggende oppfinnelse realiserer en ny løsning på spørsmålet om tilførsel av næringssubstanser, opp-løselige i vann, til et organisk hydrofobt lag. Når dette lag - som kan være hydrokarbonholdig - flyter på vann eller når det befinner seg på jordbunnen eller på en bærer av bygningsmaterial, vil næringssubstansene, tilført i samsvar med oppfinnelsen, i første rekke forbli på det hydrofobe lag og tillate hurtig formering av mikroorganismene hvis kimer for disse forefinnes.

Den nye fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen består

i å skape en mikroemulsjon av type vann-i-olje, hvor den interne fase er en vandig oppløsning av næringssubstanser og den eksterne fase er en væske som ikke er blandbar med vann og tilsetter denne mikroemulsjon til det hydrofobe lag som skal nedbrytes. Mikroemulsjonen kan inneholde kimer for passende mikroorganismer, hvis miljøet som skal behandles ikke inneholder slike, eller ikke inneholder tilstrekkelige mengder av slike.

Som kjent kan mikroemulsjonen inneholde i det minste et overflateaktivt middel og et koagens som tjener til fremstillingen av mikroemulsjonen.

I motsetning til den tidligere kjente teknikk anvendes næringssubstansene verken i fast tilstand eller i opp-løsning i det løsningsmiddel som ikke er blandbart med vann, eller i vandig makroemulsjon, men anvendes i form av en vandig mikroemulgert oppløsning i en væske som er blandbar med det hydrofobe lag som skal nedbrytes biologisk, dvs. i form av mikrodispergerte miceller, eller sagt på en annen måte med diameter mellom 80 og 600 Ångstrøm og spesielt mellom 100 og 200 Ångstrøm. Denne form fører uventet til det bemerkelsesverdige resultat at den biologiske nedbrytning kan gjennomføres i løpet av noen døgn istedet for uker eller måneder nødvendig ved tidligere kjent teknikk.

Som nitrogenkilde kan man i mikroemulsjonen i henhold

til oppfinnelsen anvende forskjellige forbindelser, opp-løselige i vann, som kan assimileres av mikroorganismene. Disse er f.eks. nitrat, sulfat og/eller fosfat av ammonium, urea, proteiner, peptoner etc. Urea er den mest nitrogenrike næringssubstans og meget oppløselig i vann og anvendes fordelaktig og tillater fremstilling av meget konsentrerte vandige oppløsninger. Man kan f.eks. anvende oppløsninger av urea med 10-60 vekt*, dvs. 11

til 150 vektdeler urea for 100 vektdeler vann.

Fosfor kan tilsettes til oppløsningen i form av en av dets vanlige former, alkalimetall- eller ammonium - fosfater eller fosfitter. Ved en spesiell utførelsesform av oppfinnelsen tilsettes fosfor i form av en overflateaktiv forbindelse, f.eks. et høyere alkyl-fosfat eller et lecitin, og man har da fosforkilden og det overflateaktive middel for mikroemulsjonen i det samme molekyl.

Ved tallrike industrielle operasjoner med dyrking av mikroorganismer er det nødvendig at pH i blandingen inn-stilles til den mest gunstige verdi for bakterieveksten, og generelt er denne verdi for pH i nærheten av nøytral reaksjon, og man kan tilsette fosforsyre som fosforkilde hvis blandingen skal surgjøres eller ammoniakk som nitrogenkilde hvis blandingen skal nøytraliseres med en base.

I tilfellet med bakterienedbrytning av hydrokarboner med mikroorganismer angitt i det følgende, er fosfor-innholdet mye mindre enn nitrogeninnholdet, og på vektbasis kan forholdet P/N variere mellom 0,02 og 0,2, fortrukket mellom 0,05 og 0,15. Med hensyn til formeringen er de mest gunstige forhold P/N så nær 0, 05 som mulig.

Når væsken som ikke er blandbar med vann, foretrukket lipofil, som danner den eksterne fase av mikro-emuls jonen, eller gjerne det hydrofobe lag som skal nedbrytes, kan anvendes av mikroorganismene som karbonkilde, er det ikke lenger nødvendig å tilsette andre assimilerbare karbonkilder til mikroemulsjonen. Hvis derimot den eksterne fase derav og laget som skal nedbrytes angripes vanskelig av mikroorganismene - i det minste ved begynnelsen - er det av interesse i nærings-oppløsningen å inkludere en karbonkilde som lett kan utnyttes, f.eks. oppløselige karbohydrater, som tillater hurtig igangsetning av mikroorganismenes formering.

I alle disse kulturer er sporelementer nødvendige og da spesielt salter av Fe, Mg, K, etc, og de kan da tilsettes i meget små mengder til næringsoppløsningen, på i og for seg kjent måte. For fremstilling av en mikroemulsjon i samsvar med oppfinnelsen anvendes en overflateaktiv forbindelse som kan fremstille en slik mikroemulsjon og valget av en slik forbindelse kan av den fagkyndige gjøres blant de tallrike grupper av overflateaktive midler som ikke er giftige for de til-stedeværende mikroorganismer. Man kan således f.eks.

anvende sulfater av fettalkoholer, sulfosuksinater, oksyetylenerte sorbitanestere, oksyetylenerte alko-

holer, syrer eller oljer, sakkaroseestere, aminosyrer, alfa-amido-aminosyrer, tauriner, sarkosiner, polyglykoler, langkjedede alkylfosfater, etc. Det kan således anvendes et meget stort antall overflateaktive midler, spesielt midler med dispergerende egenskaper overfor hydrokarboner.

Hydrofil-lipofil-balansen av de anvendte emulgerings-midler er foretrukket mellom 10 og 17, og helst mellom 11 og 15.

Når det dreier seg om ©perasj onen-..som gjennomføres i friluft bør selve det overflateaktive middel være biologisk nedbrytbart for å unngå forurensing av naturen.

For det ko-agens nødvendig for dannelse av mikroemulsjonen er antallet også meget stort og det er bare nødvendig å nevne overflateaktive ko-agenser med nitrogeninnhold som karbamater, amider eller aminsalter. Viskositeten av mikroemulsjonen kan nedsettes betraktelig ved tilsetning av en alkohol, spesielt med 6-12 karbonatomer,

en eter eller en ester av polyol, spesielt glykol. Dette letter anvendelsen i sterk grad.

Når den eksterne fase av mikroemulsjonen er blandbar

med den hydrofobe væske som skal nedbrytes biologisk, velges den nødvendigvis alt etter arten av denne væske. I det mest viktige praktiske tilfellet hvor den sistnevnte ut-gjøres av petroleum-hydrokarboner, kan den eksterne lipo-biandbare fase f.eks. utgjøres av alifatiske, aromatiske eller nafteniske hydrokarboner, eller av mineraloljer,

dvs. blandinger av slike hydrokarboner. Den eksterne fase angripes vanskelig av bakterier uten at denne er til-passet tilstrekkelig. Det er da foretrukket å anvende

vegetabilske eller animalske oljer som kan tjene som karbonkilde, og som kan utnyttes av mikroorganismene.

Disse oljer, eller foretrukket deres tilsvarende fettsyrer, tilsvarer hurtig vekst av mikroorganismene nød-vendige for nedbrytning av det hydrofobe lag, spesielt av råolje.

Vektforholdet mellom lipofil væske, dvs. ekstern

fase i mikroemulsjonen og vandig oppløsning som skal emulgeres, er generelt over 0,2. Dette forhold velges slik at den vandige oppløsning befinner seg i den in-

terne fase. Valget av overflateaktivt middel og overflateaktivt ko-agens gjennomføres alt etter naturen av den lipoblandbare væske og etter konsentrasjonen av saltene oppløst i den vandige fase. Man baserer valget på i og for seg kjente begreper innenfor formulering av mikroemulsjoner.

Oppfinnelsen er anvendbar ved dyrking av et stort antall mikroorganismer og spesielt slike som tillater nedbrytning av hydrokarboner, f.eks. bakterier som Pseudomonas, Acinetobakter, Flavobakterium, Artrobakter, Corynebakterium, etc. Mikroorganismene kan også utgjøres av sopparter.

Selv om oppfinnelsen er meget interessant for forskjellige operasjoner med effektiv biologisk nedbrytning, kan den også tjene til forskjellige industrielle fremstillinger når et hydrofobt lag av en substans kommer til anvendelse, således fordelaktig f.eks. ved fremstilling av proteiner fra hydrokarboner med nedbrytning av disse ved hjelp av bakterier og/eller sopparter. I alle disse tilfeller vil den bemerkelsesverdige dispergering av næringssubstansene i vannet, i den hydrofobe fase, oppnådd i henhold til oppfinnelsen, føre til en meget hurtig formering av mikroorganismene og man vinner betraktelig tid ved disse

operasjoner.

Ved anvendelsene i friluft, på overflater av vann eller jordbunn, er nedbrytning av tilfeldig hydrokarbonsøl den viktigste. Av de tidligere angitte grunner skyldes dette at de oppløselige næringssubstanser forblir i det behandlede lag og blir ikke medrevet av vannet slik at oppfinnelsen frembyr en vesenlig fordel i kampen mot oljesøl på sjøen. Det samme prinsipp kan imidlertid anvendes ved operasjoner som rensing av vannveier, bass-enger, jordbunn, beholdere, etc, i form av forurensende hydrokarbonavsetninger. Andre anvendelser omfatter spredning av kunstgjødsel innen landbruket.

Mikroorganismene er vanligvis tilstedte i. dtefc mii.ljø> s;oim skal behandles, men det kan ofte være nø-divendligj a. gjennomføre en poding når dlera initiale populasjon anses å være for liten, eller' nvis Mtiljøe.t ikke inneliioldter de passende bakterier.

Ved en spesiell utførelsesform av oppfinnelsen anvendes urea som nitrogenholdig næringssubstans. Man har konstatert at denne forbindelse spiller samtidig rollen som overflateaktivt ko-agens og det da ikke er nødvendig å tilsette et annet overflateaktivt ko-agens. Videre kan fosfor fordelaktig tilføjres som alkylestere av fosforsyre, som har overflateaktive egenskaper, slik at sammen-setningen av næringsoppløsningen forenkles ved at det er mulig å anvende urea og fosforsyreester uten andre tilsetningsmidler. Det er imidlertid anbefalt å tilsette væsker som tillater nedsettelse av viskositeten av mikroemulsjonen og man har tidligere nevnt noen eksempler på slike tilsetningsmidler og ved en spesiell utførelsesform av oppfinnelsen gir butyleter av etylenglykol utmerkede resultater.

Den lipofile væske, som passer for den eksterne

fase av mikroemulsjonen i henhold til oppfinnelsen,

kan utgjøres aven eller flere estere av fettsyrer, som laurinsyre, myristinsyre, palmitinsyre, arachidinsyre, oljesyre, stearinsyre, kaprinsyre, kapronsyre, kaprylsyre, etc. Glyceridene av disse syrer utgjør lett tilgjengelige industriprodukter idet de utgjør de vegetabilske og animalske oljer. Følgelig kan man f.eks. anvende oljer som f .eks.arachidolje, hvalolje, colzaolje, linolje, mais-olje,ricinusolje, sesamolje, talgolje, etc. Fettsyrene i seg selv er spesielt godt egnet, eventuelt i passende blandinger; til å forbli flytende ved vanlige temperaturer. Som fettsyrer kan spesielt anvendes slike med 6-18 karbon-atoraer som f.eks. kapronsyre, ønantylsyre, kaprylsyre, laurinsyre, palmitinsyre, oljesyre, linolsyre eller stearinsyre. Til fettstoffer som ikke er flytende ved vanlige temperaturer, er det praktisk å tilsette hydrokarboner som f.eks. petroleum eller gassolje i mengder på omtrent 5 til 50%. Fettalkoholene med 6-24 karbonatomer kan ogsa anvendes.

I et spesielt tilfelle, hvor den vandige løsning inneholder urea og laurylfosfater og/eller oleylfosfater er nitrogen-innholdet i hele mikroemulsjonen fordelaktig 4-10 vekt% eller bedre 5-8 vekt%. Vektforholdet mellom nitrogen og lipofil væske er generelt 0,1 til 0,4 og spesielt 0,15 til 0,35.

De foretrukne mikroemulsjoner utgjøres generelt av

10-30 vekt% vann, 4-10 vekt% assimilerbart nitrogen i form av nitrogenforbindelser, 5-35 vektas av alkylfosfat med 10-18 karbonatomer i alkylgruppen eller et etoksylert alkylfenolfosfat, 0-20 vekt% av en alkyleter av alkylen-glykol og 20-50 vekt% av fettester, fettsyre og/eller fettalkohol. De nevnte fettkomponenter kan tilsettes flytende hydrokarboner som paraffin eller derivater derav,

f.eks. i mengder på 5 til 70 vekt*.

En utførelsesform av oppfinnelsen medfører en forbedring som tillater oppnåelse av en hurtigere innvirkning av mikroorganismene idet den gjør det mulig med nedbrytning av hydrokarboner i løpet av meget korte tids-rom under oppnåelse av et meget stort antall mikrober. Man har konstatert at selv med anvendelse av den beste næringssubstans, som er urea - vil en del av de mikroorganismer som normalt er tilstede i sjøvann og som er istand til å nedbryte hydrokarbonene, ikke ut-vikles og følgelig ikke delta i den ønskede nedbrytning. Ved den foreliggende variant kan denne fraksjon av mikroorganismene, som forblir "inaktive", bringes til ut-vikling og delta i nedbrytningen av hydrokarbonene, hvis den nitrogenholdige næringssubstans er fulgt av en eller flere nitrogenholdige substanser med kjemisk sammensetning vesensforskjellig fra den første. Spesielt fordelaktige resultater oppnås når den første næringssubstans er urea og den annen utgjøres av en eller flere aminosyrer.

Det følger derav at en mikroemulsjon i samsvar med oppfinnelsen, for mikrobiologisk behandling av et hydrokarbonmaterial, foretrukket omfatter en vandig opp-løsning av i det minste to nitrogenholdige forbindelser som er vesentlig forskjellige med hensyn til kjemisk struktur og f.eks., hvis den første næringssubstans er et salt som ammonium-sulfat, ammoniumfosfat eller ammoniumnitrat, utgjøres den annen av et amin, et amid, et protein, en aminosyre eller en annen ikke-ammonium-holdig forbindelse.

Når næringsoppløsningen omfatter urea er den annen nitrogenholdige forbindelse f.eks. ammoniumsulfat,

ammoniumfosfat eller ammoniumnitrat eller et aminolipid,

og spesielt en aminosyre. De relative mengdeforhold av de to typer nitrogenholdige materialer kan variere innen vide grenser alt etter naturen av mikrobefloraen i miljøet hvor oppfinnelsen kommer til utøvelse. Oftest er det effektive mengdeforhold av urea, uttrykt som nitrogen, omtrent 50 til 99% av det totalt nitrogeninnhold, dvs. at nitrogeninnholdet fra aminosyren representerer 50 til 1 %. I visse vandige miljøer er det tilstrekkelig med omtrent 1 til 10% nitrogen i denne annen form for oppnåelse av utmerkede resultater.

Aminosyrene, som fordelaktig anvendes ved oppfinnelsen,

kan velges blant de aminsyrer som finnes i naturen,

og blant syntetiske aminer og man kan anvende glycin, alanin, serin, cystein, valin, glutamin, leucin, lycin, arginin, prolin,tyrosin, aspartinsyre og glutaminsyre,

etc. Av økonomiske grunner kan det være av interesse å anvende materialer fra naturprodukter som generelt inneholder rekken av flere aminosyrer. Man kan f.eks. anvende avfall fra dyrking av sukkerbeter, ekstrakter fra knusing av flere planter, spesielt maiskolber, gjærekstrakt, hydrolyseprodukter fra proteiner, biprodukter fra meierier, etc.

Oppfinnelsen fører til den uventede konstatering at

hvis en nitrogenholdig næringssubstans som alene gir gode resultater, og tilsvarende for en annen nitrogenholdig substans anvendt alene med forskjellig kjemisk natur,

blir nedbrytningen av hydrokarborene av mikroorganismene ennå bedre når de to material anvendes samtidig men med samme totale konsentrasjon av assimilerbart nitrogen.

Med mikroemulsjoner kan man med oppfinnelsen f.eks. oppnå en nedbrytning av mer enn 80% av råoljen fordelt på sjø-vann i løpet av 7 døgn når næringsoppløsningen inneholder urea eller aminosyrer mens det samme resultat oppnås i løpet av 6 døgn hvis urea og aminosyrene er samtidig tilstede i oppløsningen idet den totale nitrogenkonsen-trasjon av disse er den samme som i de to foregående tilfeller.

Oppfinnelsen illustreres ved hjelp av følgende ut-førelse seksempler.

EKSEMPLER 1 til 11

For hvert forsøk blandes 1 bestemt volum av vandig

5 0 vekt% ureaoppløsning med et volum oljesyre, i nærvær av en bestemt mengde overflateaktive midler som utgjøres av en blanding av fosforsyreestere av fettalkoholer C12 til C18' 1 noen av disse forsøk tilsettes også butyleter av etylenglykol for nedsettelse av viskositeten. Man bestemmer det temperaturområdet hvor den oppnådde mikroemulsjon er stabil.

Den etterfølgende tabell I angir de sammensetninger av mikroemulsjonene som ble fremstilt, stabilitetsområdene for disse og deres viskositet. Det sees at det kan oppnås en utmerket stabilitet i området fra 0°C til mer enn 40°C i henhold til eksemplene 4,5,6,8,10 og 11. Hva angår viskositeten konstateres det at uten tilsetning av butyleter av etylenglykol er denne meget høy (eksemplene 1 og 2) men tilsetning av denne forbindelse nedsetter verdiene til meget brukbare verdier (eksemplene 3 til 11) .

EKSEMPLER 12- 16

Mikroemulsjonene fremstilles med 33* laurylfosfat. Den lipofile væske er oljesyre i mengde lik

den dobbelte mengde av den vandige oppløsning av urea og fosfat. Prosentandelen av urea i den vandige fase varieres. De følgende resultater angir den maksimale temperatur hvor mikroemulsjonen ennå er stabil.

Disse resultater viser at praktisk brukbare mikroemulsjoner, stabile opptil omtrent 36°C, kan oppnås med ureakonsentrasjoner opptil 50* men ikke over denne verdi.

EKSEMPLER 17 til 19

Med en vandig 50* oppløsning av urea og tilsetning av oleylfosfat inneholdende 30% monoetyleter av etylen-

glykol fremstilles 3 mikroemulsjoner inneholdende varierende mengder oljesyre.

I det følgende angis stabilitetsområder for disse produkter.

Det viser seg at fra et mengdeforhold vandig oppløsning/ oleinsyre på omtrent 0,65, og for en bestemt mengde monoetyler av etylenglykol på 30%, er mikroemulsjonen vanskelig å anvende da den har tendens ti 1 geldannelse I motsetning hertil, under dette forhold, oppnås en utmerket stabilitet.

NEDBRYTNING AV PETROLEUM- HYDROKARBONER

EKSEMPEL 20

I et gjæringskar på 50 liter innføres 30 liter sjøvann sterilisert ved 120°C i 2 timer. På overflaten av dette sjøvann utbredes 30 ml råolje 34° API, inneholdende 15% mettede hydrokarboner og 25% aromatiske hydrokarboner. Petroleumslaget har en tykkelse på 0,5 mm. På dette

lag forstøves 6 ml av en mikroemulsjon i henhold til de foregående eksempler. Blandingen podes deretter med kim fra sjøvann. Disse kimer oppnås ved dyrking i 24 timer på en vandig oppløsning av glukose og inneholder hovedsakelig kimer fra Pseudomonas.

Etter denne inokulering gjennomføres telling av kimene

i petroleumsblandingen og det finnes da 2,5 x 10 3 til

4

4 x 10 kimer pr. ml.

Ved å gå frem som ved aerob dyrking under omrøring av innholdet av gjæringskaret med en røreinnretning med 400 omdreininger/minutt mens 120 liter sterilisert luft føres gjennom pr. time, og denne lufting tilsvarer omtrent luftingen som naturlig foregår i sjøen.

Etter 48 timer foretas en ny telling og resultatene er angitt i det følgende.

Etter 7 døgn bestemmes graden av nedbrytning av petroleumblanding ved ekstcaksjon av rest-hydrokarbonene med CCl^ og infrarød-måling.

I det følgende er anaitt resultatene oppnådd med mikroemulsionene fra eksemplene 1,2,3,10 og 11.

EKSEMPEL 21

Forsøket gjennomføres på samme måte som beskrevet i eksempel 20, men det innføres i gjæringskaret sjøvann som ikke er sterilisert og blandingen blir ikke podet med ekstra bakterier.

Resultatene er:

EKSEMPEL 22

Man gjennomfører et forsøk på samme måte som i eksempel 20, men sjøvannet erstattes med et naturlig vann som er tilsatt forskjellige uorganiske bestanddeler i sjøvann, således 30 ppm sporelementer, spesielt jern, magnesium og kalium. Man forstøver 6 ml mikroemulsjon nr. 11

og blandingen podes med en bakteriekultur.

Etter 7 døgn bestemmes nedbrytningsgraden av petroleum-laget ved ekstraksjon av rest-hydrokarbonene med CCl^ og infrarødmåling og nedbrytningsgraden er 96%.

EKSEMPLER 2 3- 24

Forsøk med biologisk nedbrytning av råolje fra Arabia gjennomføres i havkanten med et basseng med

2 meters dybde, oppdelt i 4 avdelinger, hvert på

3m x 3 m i horisontal retning. Avdelingene kan være isolert eller gjensidig forbundet og alle kan motta sjøvann. Et pumpesystem med hydroejektor sikrer en svak vannsirkulasjon og fornyelse av luft i bassenget.

I hver avdeling innføres 15,6 m 3 sjøvann og 4 liter

av den ovennevnte råolje i form av et 0,45 mm tykt lag på overflaten av vannet.

En av avdelingene tjener som kontroll: vannet og petroleumsinnholdet blir sirkulert som i de andre avdelinger men mottar ikke noen tilsetningsmidler.

Ved slutten av forsøket bestemmes petroleumstapet som skyldes naturlige årsaker for å medregnes ved bedømmelsen av nedbrytningen frembragt ved tilsetningene i samsvar med oppfinnelsen.

I hver av de 3 andre avdelingen innføres 0,4 liter av

en mikroemulsjon av næringsoppløsning sammensatt med vekt%:

Ved begynnelsen av forsøket, inneholder mikrofloraen

i sjøvannet i bassenget 10 2 kimer/ml. Etter 7 døgn bestemmes mengden av petroleum forsvunnet i avdelingene og den etterfølgende tabell viser forholdene som % av

initial mengde ved 2 forskjellige temperaturer.

Det-, sees at uansett den forholdsvis lave temperatur

på 12°C er den biologiske nedbrytning oppnådd i løpet av 7 døgn ved behandling i samsvar med oppfinnelsen bemerkelsesverdig og denne oppnås i motsetning til de fleste av de kjente metoder, uten tilførsel av mikro-organismekultur, idet bare de mikroorganismer som fore-kommer i sjøvannet utnyttes.

EKSEMPEL 25

I et 50 liter gjæringskar innføres 30 liter sjøvann.

På overflaten av dette vann fordeles 30 ml råolje 34° API inneholdende 75% mettede hydrokarboner og 25% aromatiske hydrokarboner. På petroleumslaget dannet på denne måte med tykkelse 0,5 mm forstøves 6 ml mikroemulsjon med følgende vektmessige sammensetning:

Tellingen av kimer i petroleumsblandingen indikerer nærvær

2

av 10 kim pr. ml.

Man går frem som ved aerob dyrking under omrøring av innholdet i gjæringskaret med en røreinnretning med 400 omdreininger/minutt hvorunder 120 liter sterilisert luft innføres pr. time. Denne lufting tilsvarer hovedsakelig den naturlige lufting som foregår i havet.

Etter 48 timer gjennomføres en ny telling og viser nærvær av 2,5 x 10 o kim/ml. Etter 7 døgn bestemmes nedbrytningsgraden av petroleumsblandingen ved ekstraksjon av resthydrokarbonene med CCl^ og infrarød-måling og nedbrytningsgraden er 83*.

EKSEMPEL 26.

Med samme operasjoner som i eksempel 25 men med en mdkroemulsjon hvori en del av urea er erstattet med aminosyren LD-valin, er den vektmessige sammensetning av mikroemulsjonen:

Telling av kimene gir tallet 10 2til å begynne med og

10 g etter 48 timer. Nedbrytningsgraden av petroleumsblandingen er 84* så tidlig som det 6. døgn.

Sammenligningen med eksempel 25 viser at den samtidige anvendelse av aminosyren tillater oppnåelse av 10 9 poder istedet for 2,5 x 10 o med bare urea etter 48 timer. Nedbrytningen av samme størrelsesorden (84* i forhold til 83*, kan oppnås hurtigere, i løpet av 6 døgn, mens det tar 7 døgn i tilfellet med bare urea).

EKSEMPEL 27

Med hjelp av teknikken fra eksemplene 25 og 26 anvendes en mikroemulsjon hvori en del av urea er erstattet med en vandig ekstrakt av maiskolber inneholdende en rekke aminosyrer, med overveiende alanin, arginin, glutaminsyre og leucin. De andre aminosyrer, i synkende mengdeforhold, utgjøres av prolin, isoleucin,treonin, valin, fenylalanin, meteonin og cystin, og innholdet av totalt nitrogen i denne ekstrakt var 1%.

Mikroemulsjonen har følgende vektmessige sammensetning:

Vannet i vannfasen er det samme som i den vandige ekstrakt.

Innholdet av totalnitrogen. i vandig fase er 6%.

Etter å ha gått ut fra 10 2 ' kimer telles 4 x 10Q' kimer etter 48 timer og nedbrytningsgraden av petroleumsblandingen går opp til 88% etter 6 døgn.

Sammenligning av disse resultater med resultatene fra eksempel 25 viser fordelen ved tilsetning av aminosyrer til urea.

EKSEMPLER 2 8- 37

I denne prøveserie analogt med eksempel 27 er laurylfos-fatet erstattet med oleylfosfat og oljesyren med forskjellige væsker angitt i den etterfølgende tabell, som gir ned-brytningsgrader for oljeblandingen oppnådd etter 6 døgn.

Lignende resultater oppnås med en blanding av mono-,di-

og tri(alkyltetraglykoleter)-o-fosfater av CX2~ C14 alkv1'

Claims

1. Fremgangsmåte til dyrkning av mikroorganismer i et hydrofobt miljø under anvendelse av næringsstoffer i vandig oppløsning, karakterise r^t ved at man i det hydrofobe miljø, som inneholder eller bringes til å inneholde de mikroorganismer som skal dyrkes, innfører en mikroemulsjon fremstilt ved å emulgere den vandige næringsstoff-oppløsning i form av miceller med diametere mellom 80 og 600 Ångstrøm i en væske som ikke er blandbar med vann, men som er blandbar med det hydrofobe miljø, idet vektforholdet mellom mikroemulsjonens ytre fase og den vandige oppløsning som emulgeres er over 0,2.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at man til den vandige oppløsning som utgjør den indre fase av mikroemulsjonen, tilsetter to kjemisk forskjellige nitrogenforbindelser som kan assimileres av mikroorganismene.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at man til den vandige oppløsning tilsetter urea og et ailkyl- eller alkenyl-fosfat, og at den ytre fase dannes av en eller flere fettsyreestere, fettsyrer og/eller fettalkoholer.

4. Middel til anvendelse ved utøvelse av fremgangsmåten som angitt i krav 1, karakterisert ved at det utgjøres av en mikroemulsjon frembragt ved å emulgere en vandig nærings-stoff-oppløsning i form av miceller med diametere mellom 80 og 600 Ångstrøm, i en væske som ikke er blandbar med vann, men som er blandbar med det hydrofobe miljø, idet vektforholdet mellom mikroemulsjonens ytre fase og den vandige opp-løsning som emulgeres, er over 0,2.

5. Middel som angitt i krav 4, karakterisert ved at den vandige oppløs-ning som utgjør den indre fase av mikroemulsjonen, inneholder urea og et alkyl- eller alkenyl-fosfat, og at den ytre fase er dannet av en eller flere fettsyreestere, fettsyrer og/ eller fettalkoholer.