DE3137020A1

DE3137020A1 - Verfahren zur kultur von mikroorganismen und fluessige naehrstoffzusammensetzung

Info

Publication number: DE3137020A1
Application number: DE19813137020
Authority: DE
Inventors: Jean-Claude Gautier; André 64000 Pau Sirvins; Jacques 64140 Lons Tellier; Jean-Claude 64140 Billere Tramier
Original assignee: Societe National Elf Aquitaine
Current assignee: Societe National Elf Aquitaine
Priority date: 1980-09-19
Filing date: 1981-09-17
Publication date: 1982-04-15
Also published as: PT73694A; NL8104298A; NO813163L; IE51588B1; AU527434B2; DK148598B; US4401762A; NO159806C; GB2084608B; BR8105993A; OA06902A; ES505525A0; CA1156574A; GR74563B; GB2084608A; CH653362A5; US4460692A; NO159806B; SE449002B; PT73694B

Description

Die Erfindung betrifft eine neue Mikroemulsionsart, das heißt, ein thermodynamisch, stabile Mikroemulsion einer wäßrigen Lösung von Nährmitteln, deren äußere Phase aus einem hydrophoben Milieu besteht. Sie umfaßt ein Verfahren zur Herstellung einer derartigen Mikroemulsion und deren Anwendungen auf dem Gebiet der Ausnutzung von Mikroorganismen, insbesondere bei der Kultur von Mikroorganismen in einem hydrophoben Milieu.

Gegenwärtig sind industrielle Verfahren unter Einsatz von Kulturen verschiedener Mikroorganismen, insbesondere von Bakterien und Pilzen, sehr geläufig. Zahlreiche Nahrungsmittelindustrien, Herstellungen von Arzneimitteln, Eeinigungsverfahren und so weiter basieren auf derartigen Verfahren. Am häufigsten umfaßt der Arbeitsgang zwei Zeiten; zunächst erfolgt die Kultur des betreffenden Mikroorganismus in einem geeigneten Nährmedium bis zum Wachstum einer ausreichend zahlreichen Population; in der zweiten Etappe wird diese Population in Kontakt mit Materialien gebracht, die man der Einwirkung von Mikroorganismen aussetzen will. Diese im Bottich durchgeführten Verfahren bringen in dieser Hinsicht keine speziellen Schwierigkeiten mit sich; die Vorkultur, d. h..die Vermehrung, wird je nach dem speziellen Fall in einem getrennten Raum oder in dem gleichen Bottich durchgeführt, in dem die zweite Arbeitsphase erfolgt. Werden dagegen die Arbeitsgänge in der Natur an großen Boden- oder Wasseroberflächen durchgeführt, wie dies beispielsweise der Fall ist bei der Entfernung von Kohlenwasserstoffteppichen durch mikrobiologische Zersetzung im Meer, an Stränden oder in fließendem Wasser oder in Seen, so bringt die vorausgehende Vermehrung der verwendeten Mikroorganismen

O / U C U

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Schwierigkeiten mit sich. Tatsächlich muß man der Kultur Nährstoffe zuführen, d. h. Quellen für G, U und P, sowie Spurenelemente, um das Wachstum der betreffenden Organismen sicherzustellen; jedoch sind die klassischen Quellen, wie Kohlenhydrate, Nitrate oder ammoniakalische Salze und Phosphate in Wasser löslich und können daher nicht in der zu behandelnden ausgebreiteten Oberflächenschicht verbleiben, wo ein starkes Wachstum der verwendeten Mikroorganismen stattfinden soll; diese Substanzen diffundieren in das Wasser oder den darunterliegenden benachbarten Boden und werden so der Kultur entzogen.

Um dies zu verhindern, wurden bisher verschiedene Methoden angewendet. Eine dieser besteht darin, Körner von festen Stickstoff- und Phosphatverbindungen mit Paraffin zu umhüllen, um sie in dieser Eorm den Mikroorganismen anzubieten, wie in der UiJ-PS 1 959 127 angegeben. Gemäß einer Variante nach der US-PS 3 883 397 erfolgt die lipophile Umhüllung mit einem Settsäuresalz anstelle des Paraffins. Jedoch ermöglichen diese Methoden den Mikroorganismen keine rasche Verfügung über die erforderliche Nahrung; das fette Umhüllungsmaterial· ist schwierig zu durchdringen, d. h. abzubauen, in Abwesenheit von äußerem Stickstoff und Phosphor. Auch ist die Einwirkung der Bakterien oder Pilze langsam und erfordert Wochen oder Monate. Eine andere empfohlene Lösung besteht in der Verwendung von in Wasser unlöslichen Verbindungen als Quellen für Ii und P, die Jedoch in Kohlenwasserstoffen löslich sind, insbesondere Phosphoamino-lipie, wie in der FR-Patentveröffentlichung 2 172 796 beschrieben; jedoch weisen die Stickstoffverbindungen, die in Öl löslich sind, im allgemeinen einen sehr geringen Stickstoffgehalt auf und unter diesen Bedingungen erfordert der biologische Abbau von

Erdölkohlenwasserstoffen im Meer 2 bis 3 Monate. In der FR-Patentveröffentlichung 2 2JO 401 wurde auch die Verwendung von Amiden, von organischen Ammoniumsalzen und Phospho-amino-lipiden in Lösung in einem Erdöllösungsmittel angegeben, wobei die Lösung in Wasser emulgiert wird; die erhaltene Emulsion wird über einen auf Wasser schwimmenden Kohlenwasserstoffteppich zerstäubt, um die Bio-Zersetzung des Teppichs zu bewirken. Diese Methode erfordert hohe Anteile an wäßriger Emulsion und d'as Ergebnis wird erst nach mehreren Wochen erzielt.

Durch die Erfindung wird eine neue Lösung für die Zufuhr von Nährsubstanzen, die in Wasser löslich sind, zu einer organischen hydrophoben Schicht, bereitgestellt. Unabhängig davon, ob diese Schicht, die kohlenwasserstoffhaltig sein kann, auf Wasser schwimmt oder sich auf dem Erdboden oder auf einer Unterlage aus einem Baumaterial befindet, verbleiben die erfindungsgemäß zugesetzten Nährsubstanzen im wesentlichen in der hydrophoben Schicht und ermöglichen die rasche Vermehrung von Mikroorganismen, wenn Keime von diesen vorhanden sind.

Das erfindungsgemäße neue Verfahren besteht darin, eine Mikroemulsion vom Wasser-in-Öl-Typ bereitzustellen, deren innere Phase eine wäßrige Lösung von Nährmaterialien ist und deren äußere Phase eine Flüssigkeit ist, die mit Wasser nicht mischbar ist, und diese Mikroemulsion der hydrophoben Schicht zuzusetzen, die zersetzt werden soll; die Mikroemulsion kann Keime geeigneter Mikroorganismen enthalten,.wenn das zu behandelnde Medium sie nicht enthält oder nicht ausreichend davon aufweist.

O I O / UZU

Es verstellt sich, daß wie auf diesem Gebiet bekannt, die .Mikro emulsion mindestens ein oberflächenaktive³Mittel und ein Koagens enthält, die zu ihrer Herstellung gedient haben.

Im Gegensatz zur bisherigen Technik werden die Nährsubstanzen somit weder im festen Zustand noch gelöst in einem mit Wasser nicht mischbaren Losungsmittel, noch als wäßrige Makroemulsion verwendet, sondern, in der Form einer wäßrigen mikroemulgierten Lösung in einer mit der hydrophoben Schicht, die bio-zersetzt werden soll, mischbaren Flüssigkeit, d. h. in der Form von mikrodispergierten Mizellen, die als umgekehrt bzw. reziprok oder "inversees" bezeichnet werden, deren Durchmesser 8,0 bis 60,0 nm (80 bis 600 Angström) und

ο insbesondere 10,0 bis 20,0 nm (100 bis 200 A) beträgt.

Biese Form führt überraschenderweise zu dem bemerkenswerten Ergebnis, daß die Bio-Zersetzung in einigen Tagen anstelle von Wochen oder Monaten, wie dies bekannte Verfahren erforderten, durchgeführt werden kann.

Als Stickstoffquelle kann man in den erfindungsgemäßen Mikroemulsionen die verschiedenen Verbindungen verwenden, die in Wasser löslich sind und durch die Mikroorganismen assimilierbar sind. Dies sind beispielsweise die Nitrate, Sulfate und/oder Phosphate von Ammonium, Harnstoff, Proteine, Peptone usw.. Da Harnstoff das stickstoffreichste und in Wasser sehr gut lösliche Düngemittel ist, ist er besonders geeignet, da er wäßrige Lösungen ermöglicht, die sehr stark konzentriert sind. Man kann beispielsweise Harnstofflösungen von 10 bis 60 Gew.-96, d. h. 11 bis 150 Teilen Harnstoff pro 100 Teile Wasser, verwenden.

Der Phosphor kann der Lösung in gleicher Weise in einer seiner üblichen Formen, als Alkali- oder Ammoniumphosphate oder -phosphite, zugesetzt werden. Gemäß einer speziellen Ausführungsform der Erfindung wird der Phosphor in der Form einer oberflächenaktiven Verbindung bzw. eines Tensids verwendet, wie beispielsweise eines höheren Alkylphosphats oder eines Lecithins. Man hat so eine Phosphorquelle und ein oberflächenaktives Mittel für die Mikroemulsion im gleichen Molekül.

Bei zahlreichen industriellen Verfahren, die sich der Kultur von Mikroorganismen bedienen, ist es nötig, daß der pH-Wert des Mediums auf den günstigsten Wert für das Wachstum der Bakterien eingestellt wird. Im allgemeinen muß der pH-Wert in der Gegend der Neutrlität liegen und man kann entweder Phosphorsäure, eine Phosphorquelle, zusetzen, wenn das Medium angesäuert werden soll oder auch Ammoniak, eine Stickstoffquelle, wenn das Medium mit einer Base neutralisiert werden soll.

Im Falle der bakteriellen Zersetzung der Kohlenwasserstoffe durch Mikroorganismen, wie nachstehend beschrieben, ist der Bedarf an Phosphor wesentlich geringer als an Stickstoff. Bezogen auf das Gewicht kann das Verhältnis von P/N zwischen 0,02 und 0,2, vorzugsweise zwischen 0,05 und 0,15 variieren; vom Gesichtspunkt des Wachstums her gesehen, liegen die günstigsten P/N-Verhältnisse so nahe wie möglich bei 0,05·

Wenn die mit Wasser nicht mischbare Flüssigkeit, die vorzugsweise lipomischbar ist, die die äußere Phase der Mikroemulsion bildet oder auch die hydrophobe, zu zersetzende Schicht bildet, durch die Mikroorganismen als Kohlenstoffquelle verwertbar ist, so ist es nicht

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J I 3 /UZU

mehr notwendig, der Nikroemulsion andere assimilierbare Kohlenstoffverbindungen zuzusetzen. Werden im Gegensatz hierzu die äußere Phase davon und die zu zersetzende Schicht schwierig durch die Mikroorganismen - zumindest zu Beginn - angegriffen, so ist es günstig, der Nährlösung eine leicht zu verwertende Kohlenstoffquelle zuzusetzen, beispielsweise lösliche Kohlenhydrate, wodurch ein rascher Beginn der Vermehrung der Mikroorganismen ermöglicht wird.

Wie in allen Kulturen sind Spurenelemente nötig, insbesondere Salze von Pe, Mg, K usw. und man fügt daher eine sehr geringe Dosis in an sich bekannter Veise zu der Nährlösung. ~~

Es versteht sich, daß man zur Erzielung einer erfindungsgemäßen Mikroemulsion eine zu deren Herstellung geeignete oberflächenaktive Verbindung verwenden muß. Die Vahl einer geeigneten Bindung durch den Fachmann kann unter den zahlreichen Gruppen nicht-toxischer, oberflächenaktiver Mittel oder Tenside für die vorhandenen Mikroorganismen erfolgen. So kann man beispielsweise Pettalkoholsulfate, Sulfosuccinate, oxyäthylenierte Sorbitanester, oxyäthylenierte Alkohole, Säuren oder Öle, Ester Saccharose, Aminosäuren, alpna-Amido-amino-säuren, Taurine, Sarcosine, Polyglykole, schwere Alkylphosphate usw. verwenden. Diese Aufzählung soll keine Einschränkung darstellen, da andere oberflächenaktive Mittel verwendet werden können, insbesondere solche, die dispergierende Eigenschaften gegenüber Kohlenwasserstoffen aufweisen.

Vorzugsweise liegt das Hydrophil-Lipophil-Gleichgewicht der verwendeten Emulgiermittel bei-10 bis 17 oder besser

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bei 11 bis 15.

im Freien durchgeführte Verfahren handelt,

sollte das oberflächenaktive Mittel selbst bio-zex'setz-lich sein, um Schädigungen der Natur zu vermeiden. Wie für die oberflächenaktiven Mittel, ist auch die Wahl für das ko-oberflächenaktive Mittel breit, das zur Bildung der Mikroemulsion benötigt wird. Derartige Ko-Mittel sind auf diesem Gebiet bekannt und es müssen daher hier nicht viele aufgezählt werden; es sei lediglich festgestellt, daß es ohne eine Einschränkung darzustellen möglich ist, stickstoffhaltige Verbindungen, wie Carbamate, Amide oder Aminsalze zu verwenden. Die Viskosität der Mikroemulsion kann beträchtlich durch Zusatz eines Alkohols, insbesondere mit (L- bis C^? eines Äthers oder eines Polyolesters, insbesondere von Glykol, verringert werden. Dies erleichtert die Handhabungen sehr.

Da die äußere Phase der Mikroemulsion mit der hydrophoben Flüssigkeit mischbar sein muß, die bio-zersetzt werden soll, wird sie gezwungenermaßen, je nach der Natur dieser Flüssigkeit, gewählt. Im wichtigsten praktischen Falle, wenn letztere aus Erdölkohlenwasserstoffen besteht, kann die äußere lipomischbare Phase beispielsweise aus aliphatischen, aromatischen oder naphthenischen Kohlenwasserstoffen oder aus sogenannten Mineralölen bestehen, d. h. aus Gemischen derartiger Kohlenwasserstoffe. Dieser Typ der äußeren Phase wird schwierig durch Bakterien angegriffen, falls diese keiner entsprechenden Anpassung unterzogen wurden. Es ist daher bevorzugt, pflanzliche oder tierische Öle zu verwenden, die als Kohlenstoffquelle dienen können, da sie von den Mikroorganismen verwertbar sind. Diese Öle oder vorzugsweise ihre entsprechenden Fettsäuren

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ermöglichen eine rasche Entwicklung der Mikroorganismen, die zur Zersetzung der hydrophoben Schicht, insbesondere von Rohöl, benötigt werden.

Das Gewichtsverhältnis zwischen der lipomischbaren Flüssigkeit, d. h. der äußeren Phase der Mikroemulsion und der zu emulgierenden wäßrigen Lösung muß im allgemeinen über 0,2 liegen. Dieses Verhältnis wird derart gewählt, daß die wäßrige Lösung sich in der inneren Phase befindet. -Die Wahl der oberflächenaktiven Mittel und der ko-oberflächenaktiven Mittel erfolgt nach der Natur der lipomischbaren Flüssigkeit und nach der Konzentration der in der wäßrigen Phase gelösten Salze. Man stützt sich auf Formulierungskonzepte für Mikroemulsionen, die. an sich bekannt sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist anwendbar auf eine große --Anzahl von Mikroorganismen und insbesondere auf solche, die die Zersetzung von Kohlenwasserstoffen ermöglichen. So kann man die Erfindung zur Verwertung von Bakterien wie Pseudomonas, Acinetobacter, Flavobacterium, Artrobacter, Corynebacterium usw. anwenden. Die Mikroorganismen können auch Pilze sein.

Die Erfindung ist zwar sehr interessant für die verschiedenen Arbeitsgänge zur Bio-Zersetzung, die im Freien durchgeführt wird, sie kann Jedoch auch bei verschiedenen Herstellungen im Bottich dienlich sein, jedesmal wenn eine hydrophobe Schicht einer Substanz bei diesem Verfahren auftritt.Sie läßt sie sich beispielsweise vorteilhaft auf die Herstellung von Proteinen ausgehend von Kohlenwasserstoffen durch Zersetzung der letzteren mit Hilfe von Bakterien und/oder Pilzen anwenden. In jedem Falle führt die beträchtliche Dispersion der wäßrigen Nährsubstanzen in der hydrophoben Phase, die

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dank der Erfindung erhalten wird, zu einer rascheren Ernährung der Mikroorganismen. Hieraus folgt ein nennenswerter Zeitgewinn bei den Verfahren.

"Unter den Anwendungen an der freien Luft, auf großen Wasser- oder Erdbodenoberflächen liegt die wichtigste in der Zersetzung von durch Unfälle verbreiteten Kohlenwasserstoffen. Aus dem vorstehend erläuterten Grund, d. h. da die löslichen Nährsubstanzen in der behandelten Schicht verbleiben, anstatt durch das Wasser mitgeschleppt zu werden, ist die Erfindung sehr wertvoll

* zur Bekämpfung der schwarzen Flut. Jedoch ist das gleiche Prinzip auf Verfahren anwendbar, wie die Reinigung von Straßen, Bassins, Erdboden, !Fässern usw. von Kohlenwasserstoffablagerungen, die sie verschmutzen können. Andere Anwendungsmöglichkeiten umfassen die Ausstreuung von Dünger auf landwirtschaftliche Kulturen.

* bzw Ölpest

Die Mikroorganismen sind im allgemeinen in dem zu behandelnden Milieu bzw. Medium vorhanden. Es ist. jedoch manchmal nötig, eine Animpfung durchzuführen, wenn die ursprüngliche Population als zu schwach beurteilt wird oder auch wenn das Medium keine geeigneten Bakterien enthält.

Bei einer speziellen Ausführungsform der Erfindung verwendet man Harnstoff als stickstoffhaltige Nährsubstanz. Man hat festgestellt, daß diese Verbindung gleichzeitigdie Rolle des k'o-oberflächenaktiven Mittels übernimmt und man ist daher nicht mehr gezwungen, ein anderes ko-oberflächenaktives Mittel zuzusetzen. Da darüber"hinaus der Phosphor vorteilhaft durch Alkylester der Phosphorsäure zugesetzt werden kann, die die Eigenschaften von

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oberflächenaktiven Mitteln übernehmen, wird die erfindungsgemäße Nährstoffzusammensetzung vereinfacht, da es möglich ist, Harnstoff und Phosphorester ohne anderes Adjuvans zu verwenden. Es ist jedoch empfehlenswert, -Flüssigkeiten zuzusetzen, die die Viskosität der Mikroemulsion herabsetzen können. Vorstehend wurden einige Beispiele für derartige Zusätze genannt. Gemäß einer speziellen Ausführungsform der Erfindung ergibt Äthylenglykol-butyläther ausgezeichnete Ergebnisse.

Die lipomischbare Flüssigkeit, die gut für die äußere Phase der Mikrpemulsion gemäß der Erfindung geeignet ist, kann aus einem oder mehreren Estern von Fettsäuren, wie Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Arachin-

•säure, ölsäure ^Stearinsäure, Caprinsäure, Capronsäure, Caprylsäüre^f^w. ^beistehen; die Glyzeride derartiger Säure bilden sehr zugängliche industrielle Produkte, da es sich um pflanzliche und tierische Öle handelt» So kann man beispielsweise Öle verwenden, wie Erdnußöl, Valfischtran, Rapsöl, Leinöl, Maisöl, Rizinusöl, Sesamöl, Talgöl usw.. Die Fettsäuren selbst sind besonders geeignet, gegebenenfalls als geeignete Gemische, um bei Umgebungstemperaturen flüssig zu bleiben; so sind Fettsäuren brauchbar, insbesondere solche mit Cg bis CL□? beispielsweise Capronsäure, Oenanth - säure, Caprylsäure, Laurinsäure, Palmitinsäure, Ölsäure, Linolsäure oder Stearinsäure. Zu solchen fetten Materialien, die bei Umgebungstemperaturen nicht flüssig sind, ist es praktisch, Kohlenwasserstoffe zu fügen, wie beispielsweise Erdöl oder Gasöl in einer Menge von etwa 5 bis 50 % Fettalkohole, d. h. mit Cg bis Co/, sind ebenfalls geeignet.

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In einem speziellen Pall, wo die wäßrige Lösung Harnstoff und Lauryl- und/oder Oleylphosphat> Handelsprodukte beispielsweise der Hoechst unter dem Namen "Hostaphalt", enthält, ist der "bevorzugte Gehalt an Stickstoff in der ganzen Mikroemulsion etwa 4 bis etwa 10 Gew.-% oder besser 5 bis 8 %. Bas Gewichtsverhältnis von Stickstoff zu der lipomischbaren Flüssigkeit liegt im allgemeinen bei 0,1 bis 0,4.und insbesondere bei 0,1^ "bis 0,35.

In allgemeiner Weise bestehen die bevorzugten erfindungsgemäßen Mikroemulsionen, bezogen auf das Gewicht, aus 10 bis 30 % Wasser, M- bis 10 % assimilierbarem Stick-.stoff in der Form von stickstoffhaltigen Verbindungen, 5 bis 35 % eines Alkyiphosphats mit CL_Q bis C.g oder eines äthoxylierten Alkylphenolphosphats, 0 bis 20 % eines Alkylenglykol-alkyläthers und 20 bis 50 °/° eines Esters, einer Säure und/oder eines Fettalkohole bzw. eines Fettesters einer Fettsäure und/oder eines Fettalkohols. Diese Fettverbindungen können mit flüssigen Kohlenwasserstoffen versetzt werden, wie Erdöl oder seinen Derivaten, beispielsweise in einer Menge von 5 bis 70 %.

Eine Variante der Erfindung bringt eine Verbesserung mit sich, die es ermöglicht, eine raschere Wirkung der Mikroorganismen zu erzielen. Sie ermöglicht die Zersetzung der Kohlenwasserstoffe in kürzerer Zeit durch Verwendung für diese Arbeit einer größeren Anzahl an Mikroben. Man hat tatsächlich festgestellt, daß selbst mit der besten Nährsubstanz, die Harnstoff ist, ein Teil der Mikroorganismen, die normalerweise in Meereswasser vorhanden sind und geeignet sind, die Kohlenwasserstoffe abzubauen, sich nicht entwickelt und daher nicht an der gewünschten Zersetzung teilnimmt. Nach der

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vorliegenden Variante bzw. Ausführungsform kann diese Mikroorganismenfraktion, die "inaktiv" geblieben ist, dazu gebracht werden, sich zu entwickeln und an der Zersetzung der Kohlenwasserstoffe teilzunehmen, wenn das stickstoffhaltige Nährmaterial von. einem oder mehreren stickstoffhaltigen Materialien begleitet wird, das eine von dem ersten deutlich unterschiedliche chemische Zusammensetzung aufweist» Besonders günstige Ergebnisse erhält man, wenn das erste Nährmaterial Harnstoff ist und das zweite aus einer oder mehreren Aminosäuren besteht»

Daraus folgt, daß eine erfindungsgemäße Mikroemulsion, die bestimmt ist zur mikrobiologischen Behandlung eines Kohlenwasserstoffmaterials, vorzugsweise eine wäßrige Lösung von mindestens zwei stickstoffhaltigen Verbindungen enthält, die vom chemischen Standpunkt her deutlich unterschiedlich sindο Ist so die erste Nährsubstanz ein Salz, wie das Sulfat, Phosphat oder Nitrat von Ammonium, so besteht die zweite aus einem Amin, einem Amid₉ einem Protein, einer Aminosäure oder einer anderen nicht-ammoniakalischen Verbindung»

Wenn die Nährlösung Harnstoff enthält, ist die zweite stickstoffhaltige Verbindung beispielsweise Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat oder Ammoniumnitrat oder ein Aminolipid und insbesondere eine Aminosäure» Die jeweiligen Anteile der beiden Sorten von stickstoffhaltigen Materialien können weit variieren je nach der Natur der Mikrobenflora des Mediums, wo das erfindungsgemäße Verfahren angewendet wird. Am häufigsten liegt der wirksame Anteil von Harnstoff, ausgedrückt als Stickstoff, bei etwa 50 bis 99 % Gesamtstickstoff, d» ho daß der des Aminosäurestickstoffs 50 ^is 1 % beträgt» In

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bestimmten wäßrigen Medien können etwa 1 bis 10 % Stickstoff in dieser zweiten Form genügen zur Erzielung ausgezeichneter Ergebnisse.

Die Aminosäuren, die vorteilhaft erfindungsgemäß verwendet werden können, können ausgewählt werden unter solchen, die man in der Natur findet und unter synthetischen Aminosäuren. Beispielsweise ohne eine Einschränkung darzustellen, kann man Glycin, Alanin, Serin, Cystein, Valin, Glutamin, Leuein, Lysin, Arginin, Prolin, Tyrosin, Asparaginsäure und Glutaminsäure usw. verwenden. Aus Wirtschaftlichkeitsgründen ist es interessant, Materialien zu verwenden, die von natürlichen Produkten stammen, die im allgemeinen Reihen verschiedener Aminosäuren enthalten. Dies ist beispielsweise der Fall bei Kubenschlempen, bei Extrakten, die von der Mazerxsierung verschiedener Pflanzen stammen, insbesondere von Maisstrünken, Hefeextrakt, Hydrolyseprodukten von Proteinen, Nebenprodukten der Molkerei usw..

Die Erfindung führt zu der unvorhergesehenen Feststellung, daß wenn ein stickstoffhaltiges Nährmaterial allein gute Resultate ergibt, und wenn das gleiche bei einem anderen stickstoffhaltigen Material mit chemisch unterschiedlicher Natur allein der Fall ist, die Zersetzung der Kohlenwasserstoffe durch die Mikroorganismen noch besser ist, wenn die beiden Materialien zusammen verwendet werden, wenn die Gesamtkonzentration an assimilierbarem Stickstoff gleich bleibt.

Durch die erfindungsgemäßen Mikroemulsionen wird es somit möglich, beispielsweise eine Zersetzung von mehr als 80 % des Rohöls, das sich auf dem Meereswasser ausgebreitet hat, in sieben Tagen zu bewirken, wenn die

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Nährlösung Harnstoff oder Aminosäuren enthält. Dasselbe Ergebnis erhält man in sechs Tagen, wenn Harnstoff und die Aminosäuren gleichzeitig in der Lösung vorhanden sind, wobei die Konzentration dieser an Gesamtstick— stoff gleich ist wie in den beiden Torhergehenden Fällen.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiele 1 bis 11

jede Untersuchung vermischt man ein bestimmtes Volumen wäßriger Harnstofflösung von 50 Gew.-% mit einem Volumen an Ölsäure in Anwesenheit einer bestimmten Menge von oberflächenaktiven Mitteln, die aus einem Gemisch^von Fettalkoholphosphorsäureestern^mlC ^i₃ Q bestehen, bei denen es sich um Handelsprodukte von Hoechst mit der Bezeichnung"Hostaphat" handelt. In bestimmten dieser Versuche fügt man gleichzeitig Ithylenglykol-butyläther zu, um die Viskosität zu erniedrigen. Man bestimmt die Temperaturbereiche , in denen die erhaltene . Mikrοemulsion stabil ist.

Die Tabelle der folgenden Seite zeigt die so hergestellten Mikroemulsionzusammensetzungen, deren Stabilitätsbereiche und ihre Viskosität. Es ist ersichtlich, daß eine ausgezeichnete Stabilität im Bereich von O G bis mehr als 4-0 C erzielt werden kann gemäß den Beispielen 4-, 5, 6, 8, 10 und 11. Was die Viskosität betrifft, so stellt man fest, daß sie ohne Zusatz von Äthylenglykol-butyläther sehr hoch ist (Beispiele 1 und 2); im Gegensatz führt dieser Zusatz die Werte auf sehr brauchbare zurück (Beispiele 3 "bis 11) =

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.Tabelle I

	1	1	11,	7	13	3	4	18	i3	6	,1	7	,9	8	19,	9	10	2	11	2
V/asser	11,	1	11«	7	13	,8	14,4	18	»3	20	»1	20	_}9	21_}9	15»	2	20,	6	19,	7
Harnstoff	11»	4	46,	7	36	,8	14,4	36	,6	20	,1	20	,9	7_S2	28	8	16,	4	15,
Ölsäure	44,		0		10	,8	38,4	10	J	32	,6	27	_S4	27,9	17,		29,	2	28	5
Äthylenglykol-batyläther	0	3	=■		25	,6	9,8	=>		11		14		14,4	19	5	16,	8	10,	5
Laurylpho sphat (KL 340)	33 s		30		„		ca			-				esa	»	5 '	8,		19,
Oleylphosphat -■ (KO 380)	ca		=		ca		23	16	J		,1	·=	,9				■=	8	-
äthoxyliertes Alky!phenol·= phosphat	·=■		·=					„-.		16	_	15	^ZJ «ö Ε« er»	15_S9	raeae		8,		-
Mono ammoniakpho sphat	ca	2	5	45	6			CSU				·=	•	2	7
% Stickstoff ,	5,	117	0	,117	0	,44	6,72	0	,23		,29		,35		0	,4		26	-	26
Verhältnis Stickstoff/Öl- saure '	O₅	154	0	,064	0	,175	0,175	0	,099	0	,09	0	,086	0,31	0	,26	0,		0
Verhältnis Phosphor/Stick-	Q,	44		10-46	1	,09	0,043	0	»40	0	0=47	0	»57	0,063	0	,064	=·	-42		»45
Stabilitätsbereich (⁰C)	10-	1200	• 2000		-44	0-44		203			12	141	0-40		»36	0-		0-
Viskosität "bei 20 ⁰C in.cP bzw ο inP 3o s				167	265		197		98	61

Beispiele 12 bis 16

Mikroemulsionen wurden hergestellt mit 33 % Laurylphosphat. Die lipomischbare Flüssigkeit ist Ölsäure, deren Menge gleich zweimal der wäßrigen Harnstoff- und Phosphatlösung ist. Man variiert den Prozentsatz Harnstoff in der wäßrigen Phase. Die nachstehenden Ergebnisse geben die maximale Temperatur an, bei der die Mikroemulsion noch stabil ist.

% Harnstoff in der	obere Temperatur
wäßrigen Phase	grenze ( °C)
22,2	'36
25	32
33	38
50	35
56	keine Mikroemulsion

Diese Ergebnisse zeigen, daß die praktisch brauchbaren Mikroemulsionen, die stabil bis etwa 36 °C sind, erhalten werden können mit Konzentrationen an Harnstoff, die bis zu 50 °/° gehen, jedoch nicht über dies hinaus.

Beispiele 17 bis 19

Mit einer 50 %igen wäßrigen Harnstofflösung und unter Zusatz von Oleylphosphat mit einem Gehalt von 30 % Ä'thylenglykol-monoäthyläther wurden drei Mikro emuls ionen hergestellt, die verschiedene Anteile an Ölsäure enthielten. Im folgenden sind die ßtabilitätsbereiche dieser Produkte angegeben.

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Gewichtsverhältnis Harnstofflösung/ ölsäure

0,5

0,625

0,75

oberflächenaktives Mittel (Oleylphosphat)

25,3 24,2 26,7

Stabilitätsbereich C⁵G)

0-65 0-59 Ogel-64-

Es ist ersichtlich, daß von einem Verhältnis der wäßrigen LÖsung/Ölsäure von etwa(^65 an und für eine feste Menge an Äthylenglykolmonoäthyläther von 30 % die Mikroemulsion schwierig zu verwenden ist, da sie zur Gelbildung neigt. Im Gegensatz stellt man unter diesem Verhältnis eine ausgezeichnete Stabilität fest.

Zersetzung von Erdölkohlenwasserstoffen Beispiel 20

In einen Fermentor von 50 1 bringt man 30 1 Meereswasser, ^sterilisiert bei 120 ⁰C während 2 Stunden ein» Auf die Oberfläche dieses Meereswassers verteilt man 30 ml fiohöl von 34- ° API mit einem Gehalt von 75 % gesättigten Kohlenwasserstoffen und 25 % aromatischen« Die Erdölschicht weist eine Dicke von 0,5 nun. auf. Auf diese Schicht zerstäubt man 6 ml einer der Mikroemulsionen der vorstehenden Beispiele. Das Medium wird anschließend mit Keimen angeimpft, die aus dem Meereswasser stammen-. Diese Keime erhält man- durch 24~-stündige Kultur auf einer wäßrigen Glucoselösung. Sie enthalten als Hauptanteil PseudomonaSe

Nach diesem Inokulieren führt man eine Zählung der Keime in Entnahmen des Erdöls durchs man findet so 2,5 χ 10^ bis 4 χ 10 Keime pro ml»

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Man führt man die aerobe Kultur durch, unter Rühren des Ferment or inhalts mit einem Rührer von 4-00 IJ/min während 120 1 sterilisierte Luft pro Stunde eingeblasen werden. Diese Belüftung entspricht genau der die natürlich im Meer stattfindet.

Nach 48 Stunden wird eine neue Zählung durchgeführt. Die Ergebnisse sind nachstehend aufgeführt.

Nach 7 Tagen bestimmt man den Umwandlungsgrad des Erdöls durch Extrahieren der Kohlenwasserstoffreste mit und mißt im Infrarot.

Im folgenden sind die mit den Mikroemulsionen der Bei spiele 1, 2, 3» ^O und 11 erhaltenen Ergebnisse aufgeführt .

Mikro- Ausgangskeime Keime nach umwandlungsgrad emulsion 48 Stunden nach 7 Tagen von Bsp. ' (%)

1 2,5 x 10⁵ 2,5 χ 10⁸ 83

2 2 χ 10⁴ 9,5 x 10⁸ 90

3 1,5 χ 1(A 2,5 χ io⁸ . 90

10 4-,5 x 10⁵ 2,5 x 10⁸ 86

11 1,5 χ io⁵ 7,5 χ io⁷ 92

Beispiel 21

Man führt einen Versuch nach der in Beispiel 20 beschriebenen Arbeitsweise, durch, führt jedoch in den Fermentor nicht-sterilisiertes Meereswasser ein und das Medium wird nicht mit zusätzlichen Bakterien angeimpft.

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Man erhält folgende Ergebnisse:

Mikroemulsion Keine zu Keime nach. Umwandlungsgrad von Bsp* Beginn 48 Stunden nach 7, Tagen (%

11 2 χ 1O⁵ 5,5 x 1O⁷ 82

Beispiel 22

Man führt einen Versuch nach der Arbeitsweise des Beispiels 20 durch, ersetzt jedoch das Meereswasser durch ein natürliches Wasser, in das man verschiedene mineralische Bestandteile von Meereswasser, sowie 30 ppm Spurenelemente, insbesondere Eisen,. Magnesium, Kalium fügt. Man zerstäubt 6 ml der Mikroemulsion Nr. 11 und impft das Milieu mit einer Kultur von Bakterien an.

Nach 7 Tagen bestimmt man den Zersetzungsgrad des Erdöls durch Extrahieren der verbleibenden Kohlenwasserstoffe mit CCl^ und mißt im Infrarot. Die Umwandlung beträgt 90 %.

Beispiele 23 und 24

Untersuchungen der Bio-Zersetzung von arabischem Rohöl werden an der Meeresküste in einem Bassin von 2 m Tiefe durchgeführt, das in vier Abteilungen aufgeteilt ist von Jeweils 3 χ 3 ι waagerechten Abschnitten. Die Abschnitte können isoliert oder miteinander verbunden sein und alle können Meereswasser aufnehmen.

Ein Hydroinjektor-Pumpsystem sichert eine leichte Yermischung des Wassers und die Erneuerung der Luft in dem Bassin.

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In jede Abteilung bringt man 15?6 nr Meereswasser und 4 1 des vorstehend angegebenen Erdöls ein in einer Schicht von 0,4-5 mm Dicke auf der Oberfläche des Wassers.

Eine der Abteilungen dient als Kontrolle: Das Wasser und das Erdöl, die darin enthalten sind, wurden wie in den anderen Abteilungen vermischt, erhielten jedoch keinen Zusatz. Am Ende der Untersuchungen bestimmte man die Erdölverluste durch natürliche Gründe, um diesen bei der Bewertung der Zersetzung Eechnung zu tragen, die ■ durch die erfindungsgemäßen Zusätze bewirkt wird.

In jedes der drei anderen Abteile bringt man 0,4- 1 einer Mikroemulsion einer Nährlösung ein, mit folgender Zusammensetzung in Gewichtsprozent:

Gew.-%

Harnstoff 17,0

Süßwasser 20,8

Butylglykol 10,8

Laurylphosphat 21,1 .

Ölsäure 30,3

Zu Beginn der Untersuchungen zählte die Mikroflora des

Meereswassers des Bassins 10 Keime/ml. Bach 7 Tagen bestimmte man die in den Abteilungen verschwundenen Erdölmengen. Die nachstehende Tabelle zeigt die Größenausmaße in Prozent der ursprünglichen Menge bei zwei verschiedenen Temperaturen an.

Kontrolle Bsp. 23 Kontrolle Bsp.24 12⁰C 12°C 18°C 18°C

% verschwunden durch

natürliche Gründe 5 5 -17,5 17,5

% verschwunden durch

Behandlung gem.d.Erf. 0 58 % insgesamt verschwunden 5 63

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Es ist ersichtlich, daß selbst bei relativ tiefer Temperatur von 12 ⁰C die in 7 Tagen erhaltene Bio-Zersetzung durch erfindungsgemäße Behandlung beträchtlich ist. Man erhält sie im Gegensatz zu vielen bekannten Verfahren ohne den Zusatz einer Mikroorganismenkultur unter alleiniger Ausnutzung der, die in dem Meereswasser existieren.

Beispiel 25

In einen Fermentor von 50 1 bringt man 30 1 Meereswasser ein. Auf der Oberfläche des Wassers verteilt man 30 ml Rohöl von 34- ° -API mit einem Gehalt von 75 % gesättigten Kohlenwasserstoffen und 25 % aromatischen. Auf die Erdölschicht, die so gebildet wurde, mit einer Dicke von 0,5 nun-, zerstäubt man 6 ml der Mikroemulsion, die folgende Gewichtszusammensetzung aufweist.

Harnstoff	17,3 %
Wasser	21,5
Äthylenglyko1-butyläther	10,8
Laurylphosphat	23,7
Ölsäure	26,7
(8,07 % Stickstoff)	100,0

Die Zählung der Keime in dem Erdöl zeigt die Anwesenheit

von 10 Keimen/ml.

Man führt dann eine aerobe Kultur durch Rühren des Inhalts des Fermentors mit einem Rührer mit 4-00 U/min durch, während 120 1 sterilisierte Luft pro Stunde eingeblasen werden. Diese Belüftung entspricht genau der die natürlich am Meer stattfindet.

- 25 -

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Nach.. 48 Stunden wird eine erneute Zählung durchgeführt. Sie zeigt die Anwesenheit von 2,5 x 10 Keimen/ml.

Nach 7 Tagen bestimmt man den Zersetzungsgrad des Erdöls durch Extrahieren der Rest-Kohlenwasserstoffe mit CCl^ und mißt im Infrarot. Der Grad "beträgt 83 %.

Beispiel 26

Man arbeitet identisch wie im Beispiel 25, jedoch wird in der Mikroemulsion ein Teil des Harnstoffs durch die Aminosäure DL-Valin ersetzt. Die Gewichtszusammensetzung der Mikroemulsion ist:

Harnstoff	16,8 %
DL-Yalin	2,0
Wasser	20,5
Ä thylenglyko1-butyläther	10,8
Laur ylpho sphat	23,7
Ölsäure	26,2

(Gesamtstickstoff des 100,0 Harnstoffs und des Valins beträgt 8,07 %) .

Ο Q

Die Zählung der Keime ergibt 10 zu Beginn und 10^ nach 48 Stunden. Der Umwandlungsgrad des Erdöls beträgt 84 % vom sechsten Tag an.

Der Vergleich mit Beispiel 25 zeigt, daß der Zusatz von

Aminosäure, es ermöglicht hat, 10⁷ Keime anstelle von

2,5 x 10 mit Harnstoff allein nach 48 Stunden zu erreichen. Die Zersetzung in der gleichen Größenordnung (84 % gegen 83 °/°) konnte rascher in sechs Tagen erhalten

- 26 -

werden, wohingegen im Fall von Harnstoff allein 7 Tagen benötigt wurden.
Beispiel 27

Nach der Technik der Beispiele 25 und 26 wurde eine Mikroemulsion verwendet, in der ein Teil des Harnstoffs ersetzt wurde durch einen wäßrigen Maisstrunkextrakt, der eine Reihe von. Aminosäuren, einschließt, wobei Alanin, Arginin, Glutaminsäure und Leucin vorherrschen. Die anderen Aminosäuren, die in geringeren Anteilen vorhanden waren, waren-Prolin., Isoleucin, Threonin, Valin, Phenylalanin, Methionin und Cystein. Der Gesamtstickstoffgehalt in diesem Extrakt betrug 1 %.

Die Mikroemulsion zeigte folgende Gewichtszusammensetzung:

Harnstoff 12,4 %

MaisStrunkextrakt 18,7

Xthylenglykol-butylähter 19,2 Laurylphosphat 29,1

ölsäure 20,6

Das Wasser der wäßrigen Phase war das des wäßrigen Extrakts. Der Stickstoffgesamtgehalt der wäßrigen Phase belief sich auf 6 %.

2 9

Ausgehend von 10 Keimen zählte man 4- χ 1O⁷ nach 48 Stunden und der Umwandlungsgrad des Erdöls erreichte nach 6 Tagen 88 %.

Der Vergleich dieser Resultate mit denen, des Beispiels 25 zeigt wie interessant es ist, Aminosäuren dem Harnstoff zuzusetzen.

- 27 - .

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Beispiele 28 "bis 37

In dieser Versuchsreihe analog zum Beispiel 27 wird das Laury!phosphat durch Oleylphosphat ersetzt und die Ölsäure durch verschiedene, in der folgenden Tabelle angegebene Flüssigkeiten ersetzt, was zu Zersetzungsgraden des Erdöls führte, die in 6 Tagen erhalten wurden.

Bsp. Nr.	verwendete hydrophobe Flüssigkeit	Zersetzung
28	Erdnußöl	88
29	Eapsöl	82
30	Talgöl	86
31	Mischung von Koprafettsäuren mit 10 % Vaselineöl	85
32	Laurinsäure verflüssigt mit 10 % Rohöl	84
33	Butylcaproat	85
34	Äthyllaurat	87
35	Methyloleat	86
36	Amylstearat	88
37	G-asöl mit 10 % Sesamöl	83

Vergleichbare Ergebnisse erhält man mit einem Gemisch von Mono-, Di- und Tri(alkyltetraglykoläther)-o-phosphaten von Alkylen mit C.o "bis G.^, die im Handel unter der Bezeichnung "Hostaphat EL 340 W bekannt sind, anstelle des Oleylphosphats.

- 28 -

Claims

Pat entansprüche

1. Verfahren zur Kultur von Mikroorganismen in einem hydrophoben Milieu unter Verwendung von Nährbubstanzen in wäßriger Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß diese Lösung in einer mit Wasser nicht mischbaren flüssigkeit, die jedoch mit dem hydrophoben Milieu mischbar ist, mikroemulgiert wird und daß die so gebildete Mikroemulsion in das Medium eingebracht wird, das Keime der zu kultivierenden Mikroorganismen enthält. \

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24-3 - 2 -

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Nährstofflösung wasserlösliche Stickstoffverbindungen und wasserlösliche Phosphorverbindungen enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man als Flüssigkeit, die mit Wasser nicht mischbar ist, eine lipomischbare Flüssigkeit verwendet, die Kohlenstoffverbindungen enthält, die durch die jeweiligen Mikroorganismen assimilierbar sind.

3· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung, die die innere Phase der Mikroemulsion bildet, zwei chemisch unterschiedliche Sorten von Stickstoffverbindungen enthält, die durch Mikroorganismen assimilierbar sind.

4-. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3r dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung die die innere Phase der Mikroemulsion bildet, Harnstoff und ein Alkyl- oder Alkenylphosphat enthält, wohingegen die äußere Phase durch einen oder mehrere Ester bzw. Fettester, Säuren bzw. Fettsäuren und/oder Fettalkohole gebildet wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4-, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung, die die innere.Phase der Mikroemulsion bildet, 11 bis 150 Gewichtsteile Harnstoff pro 100 Teile Wasser enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 4- oder 5> dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Harnstofflösung eine oder mehrere Aminosäuren enthält.

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7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil der Aminosäure 1 bis 10 Gewichtsteile pro 99 bis 90 Teile Harnstoff beträgt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophobe Milieu aus Kohlenwasserstoffen besteht, die eine Wasserfläche oder eine Erdbodenfläche bedecken und daß die kultivierten Mikroorganismen geeignet sind, diese Kohlenwasserstoffe zu zersetzen.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroemulsion, bezogen auf das Gewicht, besteht aus 10 bis 30 % Wasser, 4 bis 10 % assimilierbarem Stickstoff in der Form von Stickstoffverbindungen, 5 bis 35 % eines Alkyl- oder Alkenylphosphats mit C-q bis G.g oder eines Phosphats eines

äthoxylierten Alkylphenols, 0 bis 20 % eines Alkylenglykol-alkyläthers und 20 bis 50 % eines Esters bzw. Eettsäureesters, einer Säure bzw. Fettsäure und/oder eines J?ettalkohols.

10. Flüssige Nährstoffzusammensetzung, geeignet zum Zusatz zu einem hydrophoben Medium zur Kultur von Mikroorganismen in diesem Medium, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer Mikroemulsion besteht, deren innere Phase aus einer wäßrigen Lösung gebildet wird, die assimilierbare Verbindungen von Stickstoff und Phosphor enthält, wohingegen die äußere Phase eine organische lipomischbare, mit Wasser nicht mischbare Flüssigkeit ist.

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11. Zusammensetzung nach Anspruch 10, bestimmt zur Zersetzung von Kohlenwasserstoffen durch Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung, die die innere Phase der Mikroemulsion "bildet, Harnstoff und eine oberflächenaktive "Verbindung von Phosphor enthält, die organische Flüssigkeit der äußeren Phase ein Fettester, eine Fettsäure und/oder ein Fettalkohol ist oder das Gemisch eines derartigen Esters,einer derartigen üäure und/oder eines derartigen Alkohols mit flüssigen Kohlenwasserstoffen ist.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroemulsion, bezogen auf das Gewicht, aus 10 bis 30 % Wasser, 4 bis 10 % assimilierbarem Stickstoff von dem 50 tis 99 % ^¹¹ der Form von Harnstoff vorliegen und 50 bis 1 % in der Form von Aminosäure vorliegen, 5 bis 35 % eines Alkyl- oder Alkenylphosphats mit Cq bis C.-g oder eines Phosphats eines äthoxylierten Alkylphenols, 0 bis 20 % eines Alkylenglykol-alkyläthers und 20 bis 50 % eines Fettkörpers oder eines Fettkörpers, vermischt mit flüssigen Kohlenwasserstoffen, besteht.