CH653362A5

CH653362A5 - Procede de culture de microorganismes avec l'emploi de substances nutritives.

Info

Publication number: CH653362A5
Application number: CH5973/81A
Authority: CH
Inventors: Jaques Tellier; Andre Sirvins; Jean-Claude Gautier; Bernard Tramier
Original assignee: Elf Aquitaine
Priority date: 1980-09-19
Filing date: 1981-09-16
Publication date: 1985-12-31
Also published as: DK148598B; DE3137020C2; SE449002B; CA1156574A; GR74563B; BR8105993A; AU7528881A; PT73694A; US4460692A; ES505525A0; NL8104298A; SE8105540L; DE3137020A1; NO813163L; DK416481A; OA06902A; US4401762A; NO159806B; GB2084608A; IE812170L

Description

L'invention a pour but un procédé qui permet d'éliminer des inconvénients des procédés connus.

Ce but est atteint par un procédé du type mentionné au s

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début et caractérisé selon l'invention par la partie caractérisante de la revendication 1.

L'invention concerne en plus des substances nutritives du genre définies dans le préambule dans la revendication 10. Ces substances sont caractérisées selon l'invention par la partie caractérisante de la revendication 10.

La présente invention réalise donc une solution nouvelle de l'apport de substances nutritives, solubles dans l'eau, à une couche organique hydrophobe. Que cette couche - qui peut être hydrocarbonnée - flotte sur l'eau ou qu'elle se trouve sur le sol ou sur un support en matériau de construction, les substances nutritives, apportées selon l'invention, restent principalement dans la couche hydrophobe et permettent la multiplication rapide des microorganismes, si des germes de ceux-ci s'y trouvent.

Le nouveau procédé suivant l'invention consiste donc à créer une microémulsion du type eau-dans-huile, dont la phase interne est une solution aqueuse de matières nutritives et la phase externe un liquide non miscible à l'eau, et à ajouter cette microémulsion à la couche hydrophobe qu'il s'agit de dégrader; la microémulsion peut renfermer les germes des microorganismes appropriés si le milieu à traiter n'en contient pas, ou n'en contient pas suffisamment.

Bien entendu, comme connu dans l'art, la microémulsion peut contenir au moins un agent tensioactif et un co-agent, qui ont servi à sa préparation.

Ainsi, contrairement à la technique antérieure, les substances nutritives ne sont utilisées ni à l'état solide, ni en solution dans un solvant non miscible à l'eau, ni en microémulsion aqueuse, mais sous la forme d'une solution aqueuse mi-croémulsionnée dans un liquide miscible avec la couche hydrophobe à biodégrader, les substances nutritives peuvent donc être sous la forme de micelles micro-dispersées, dites inversées, dont le diamètre peut être compris entre 80 et 600 Angströms et particulièrement entre 100 et 200 Angströms. Cette forme inattendue conduit à ce résultat remarquable que la biodégradation peut être réalisée en quelques jours, au lieu des semaines ou mois que demandent les procédés connus.

En tant que source d'azote on peut employer, dans les mi-croémulsions suivant l'invention, les différents composés, solubles dans l'eau, assimilables par les microorganismes. Ce sont par exemple les nitrate, sulfate ou/et phosphate d'ammonium, l'urée, des protéines, peptones, etc. L'urée étant l'engrais le plus riche en azote et très soluble dans l'eau, elle est particulièrement appropriée, puisqu'elle permet d'avoir des solutions aqueuses fortement concentrées. On peut employer, par exemple, des solutions d'urée à 10 à 60% en poids, c'est-à-dire 11 à 150 parties d'urée pour 100 parties d'eau.

Du phosphore peut être apporté à la solution de même sous une de ses formes habituelles, phosphates ou phosphites alcalins ou d'ammonium. Suivant une forme d'exécution particulière de l'invention, le phosphore est pris sous la forme d'un composé tensioactif, tel que par exemple un phosphate d'alkyle supérieur ou une lécithine: on a ainsi la source de phosphore et l'agent tensioactif de la microémulsion dans la même molécule.

Dans de nombreuses opérations industrielles comportant la culture de microorganismes, il est nécessaire que le pH du milieu soit ajusté à la valeur la plus favorable à la croissance bactérienne; en général ce pH doit être voisin de la neutralité, et l'on peut ajouter soit de l'acide phosphorique, source de phosphore, si le milieu doit être acidifié, ou bien de l'ammoniaque, source d'azote, si le milieu doit être neutralisé par une base.

Dans le cas de la dégradation bactérienne des hydrocarbures par les microorganismes cités ci-dessous, les besoins en phosphore sont beaucoup moindres qu'en azote; exprimé en poids, le rapport P/N peut varier entre 0,02 et 0,2, de préférence entre 0,05 et 0,15; au point de vue de la croissance, les rapports P/N les plus favorables sont aussi proches que possible de 0,05.

Lorsque le liquide non miscible à l'eau, de préférence lipo-5 miscible, formant la phase externe de la microémulsion, ou bien la couche hydrophobe à dégrader, est utilisable par les microorganismes en tant que source de carbone, il n'est plus nécessaire d'ajouter d'autres composés carbonés, assimilables, à la microémulsion. Par contre, si la phase externe de celio le-ci et la couche à degréder sont difficilement attaquées par les microorganismes - du moins au début - il y a intérêt à inclure dans la solution nutritive une source de carbone facile à utiliser, par exemple des hydrates de carbone solubles, permettant ainsi le démarrage rapide de la multiplication des mi-is croorganismes.

Comme dans toutes les cultures, des oligoéléments sont nécessaires en particulier des sels de Fe, Mg, K, etc., il y a donc lieu d'en ajouter une très petite dose à la solution nutritive, à la manière connue en soi.

20 II va de soi que, pour obtenir suivant l'invention une microémulsion, on doit utiliser un composé tensioactif capable d'en produire une. Le choix du composé idoine, à la portée de l'homme de l'art, peut être fait parmi les nombreux groupes de tensioactifs non toxiques pour les microorganismes en pré-25 sence. Ainsi peut-on employer par exemple des sulfates d'alcools gras, des sulfosuccinates, des esters oxyéthylénés de sor-bitan, des alcools, acides ou huiles oxyéthylénés, esters de saccharose, amino-acides, a-amido amino-acides, taurines, sar-cosines, polyglycols, phosphates d'alkyles lourds, etc. Cette 30 énumération n'a rien de limitatif, bien d'autres tensioactifs pouvant être utilisés, en particulier ceux qui ont des propriétés dispersantes vis-à-vis des hydrocarbures.

De préférence, la balance hydrophile-lipophile des agents émulsifiants employés est comprise entre 10 et 17, ou mieux 35 entre 11 et 15.

Lorsqu'il s'agit d'opérations menées dehors, l'agent tensioactif lui-même doit être biodégradable, afin d'éviter des nuisances dans la nature.

Comme pour les tensioactifs, le choix est également vaste 40 en ce qui concerne le co-tensioactif nécessaire à la formation de la microémulsion. De tels co-agents sont connus dans l'art, il n'y a donc pas lieu d'en citer beaucoup ici; on notera seulement, à titre d'indication non limitative, qu'il est possible d'employer des composés azotés, tels que carbamates, amides 45 ou sels d'amines. La viscosité de la microémulsion peut être considérablement abaissée par l'adjonction d'un alcool, en particulier en C6 à Ci2, d'un éther ou d'un ester de polyol, notamment de glycol; cela facilite beaucoup les manipulations.

Puisque la phase externe de la microémulsion doit être so miscible avec le liquide hydrophobe à biodégrader, elle est forcément choisie selon la nature de ce liquide. Dans le cas pratique le plus important, où ce dernier est constitué par des hydrocarbures du pétrole, la phase externe, lipomiscible, peut être constituée par exemple par des hydrocarbures aliphati-55 ques, aromatiques ou naphténiques, ou par des huiles dites minérales, c'est-à-dire des mélanges de tels hydrocarbures. Ce type de phase externe est difficilement attaquée par des bactéries, tant que celles-ci n'ont pas subi l'adaptation suffisante. Il est donc préférable d'utiliser des huiles végétales ou animales 6o qui peuvent servir de source de carbone, parce qu'elles sont utilisables par les microorganismes; ces huiles, ou de préférence leurs acides gras correspondants, permettent un développement rapide des microorganismes nécessaires à la dégradation de la couche hydrophobe, notamment du pétrole brut. 65 Le rapport pondéral entre le liquide lipomiscible, c'est-à dire la phase externe de la microémulsion, et la solution aqueuse à émulsionner, doit en général être supérieur à 0,2; ce rapport est choisi de façon à ce que la solution aqueuse se

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trouve en phase interne. Le choix des tensioactifs et des co-tensioactifs est effectué selon la nature du liquide lipomiscible et suivant la concentration des sels dissous dans la phase aqueuse; on se base pour cela sur les concepts de formulation des microémulsions, connus en soi.

Le procédé de l'invention est applicable à un grand nombre de microorganismes et en particulier à ceux qui permettent de dégrader des hydrocarbures; ainsi peut-on appliquer l'invention à l'utilisation des bactéries telles que Pseudomonas, Acinetobacter, Flavobacterium, Artrobacter, Coryne-bactérium, etc. Les microorganismes peuvent également être des champignons.

Bien que l'invention soit très intéressante pour les différentes opérations de biodégradation effectuées dehors, elle peut également rendre des services dans diverses fabrications en cuve, chaque fois qu'une couche hydrophobe d'une substance est mise enjeu dans le procédé. Ainsi, par exemple, s'ap-plique-t-elle avec avantage à la fabrication de protéines à partir d'hydrocarbures par dégradation de ces derniers, à l'aide de bactéries et/ou de champignons. Dans tous les cas, la remarquable dispersion des substances nutritives, aqueuses, au sein de la phase hydrophobe, obtenue grâce à l'invention, conduit à une multiplication plus rapide des microorganismes; il en résulte un gain de temps appréciable dans les opérations.

Parmi les applications au grand air, sur des surfaces d'eau ou de sol, la plus importante est la dégradation des hydrocarbures répandus accidentellement; pour la raison exposée plus haut, c'est-à-dire du fait que les substances nutritives solubles restent dans la couche traitée au lieu d'être entraînées par l'eau, l'invention présente une grande valeur pour la lutte contre la marée noire. Cependant, le même principe s'applique à des opérations telles que nettoyage des chaussées, bassins, sols, cuves, etc., des dépôts hydrocarbonés qui peuvent les souiller. D'autres applications comprennent l'épandage d'engrais sur des cultures agricoles.

Les microorganismes sont généralement présents dans le milieu à traiter; il est cependant nécessaire parfois d'effectuer un ensemencement, lorsque la population initiale est jugée trop faible, ou bien si le milieu ne contient pas les bactéries appropriées.

Dans une forme particulière d'exécution de la présente invention, on utilise l'urée comme substance nutritive azotée; on a constaté que ce composé joue en même temps le rôle de co-tensioactif, on n'est donc plus obligé d'ajouter un autre co-tensioactif. D'autre part, comme le phosphore peut avantageusement être apporté par des esters alkyliques de l'acide phosphorique, qui jouissent des propriétés tensioactives, la composition de la solution nutritive est simplifiée par le fait qu'il est possible d'employer l'urée et l'ester phosphorique, sans autre adjuvant. Il est cependant recommandable d'ajouter des liquides permettant d'abaisser la viscosité de la microémulsion; on a cité plus haut quelques exemples de tels adjuvants; dans une forme d'exécution particulière de l'invention, le butyléther d'éthylène glycol a donné d'excellents résultats.

Le liquide lipomiscible, convenant fort bien pour la phase externe de la microémulsion, suivant l'invention, peut être constitué par un ou plusieurs esters d'acide gras, tels que les acides laurique, myristique, palmitique, arachidique, oléique, stéarique, caprique, caproïque, caprylique, etc.; les glycérides de tels acides constituent des produits industriels très accessibles, puisque ce sont des huiles végétales et animales. Ainsi peut-on employer, par exemple, les huiles telles qu'huile d'arachide, de baleine, de colza, de lin, de maïs, de ricin, de sésame, de suif, etc. Des acides gras eux-mêmes conviennent particulièrement bien, pris éventuellement en mélanges appropriés, pour rester liquides aux températures ambiantes; sont ainsi utiles des acides gras, en particulier ceux en C6 à

Cj 8, comme, par exemple, caproïque, oenanthylique, caprylique, laurique, palmitique, oléique, linoléique ou stéarique. A celles des matières grasses, qui ne sont pas liquides aux températures ordinaires, il est pratique d'ajouter des hydrocarbures, comme par exemple du pétrole ou du gasoil, à raison d'environ 5 à 50%. Des alcools gras, c'est-à-dire en Q à C24 conviennent également.

Dans un cas particulier, où la solution aqueuse contient de l'urée et des phosphates de lauryle ou/et d'oléyle commercialisés par exemple parla Société Hoechst sous le nom «Hos-taphalt», la teneur préférée en azote de l'ensemble de la microémulsion est d'environ 4 à 10% en poids ou mieux de 5 à 8%. Le rapport pondéral de l'azote sur le liquide lipomiscible est généralement de 0,1 à 0,4 et surtout de 0,15 à 0,35.

D'une façon générale, les microémulsions préférées, suivant l'invention, se composent en poids de 10 à 30% d'eau, 4 à 10% d'azote assimilable, sous la forme de composés azotés, 5 à 35% d'un phosphate d'alkyle en CI0 à C18 ou d'un phosphate d'alkyl-phénol éthoxylé, 0 à 20% d'un alkyl-éther d'alkylène glycol, et 20 à 50% d'un ester, acide ou/et alcool gras. Ces composés gras peuvent être additionnés d'hydrocarbures liquides, tels que pétrole ou ses dérivés, par exemple à raison de 5 à 70%.

Une variante de l'invention apporte un perfectionnement qui permet d'obtenir une action plus rapide des micro-orga-nismes; elle rend possible la dégradation des hydrocarbures en un temps plus court, en attelant à ce travail un nombre plus grand de microbes. On a constaté, en effet, que - même avec la meilleure substance nutritive qu'est l'urée - une partie des micro-organismes, présents normalement dans l'eau de mer, et capables de dégrader les hydrocarbures, ne se développent pas et, par conséquent, ne participent pas à la dégradation voulue. Suivant la présente variante, cette fraction de microorganismes, restés «inactifs», peut être amenée à se développer et à participer à la dégradation des hydrocarbures, si la matière nutritive, azotée, est accompagnée d'une ou de plusieurs matières azotées de composition chimique nettement différente de la première. Des résultats particulièrement favorables sont obtenus, lorsque la première matière nutritive étant l'urée, la seconde est constituée par un ou plusieurs acides aminés.

Il s'en suit qu'une microémulsion suivant l'invention, destinée au traitement microbiologique d'une matière hydrocarbonée, renferme de préférence une solution aqueuse d'au moins deux composés azotés nettement différents au point de vue chimique. Ainsi, par exemple, si la première substance nutritive est un sel tel que sulfate, phosphate ou nitrate d'ammonium, la seconde est constituée par une amine, un amide, une protéine, un amino-acide, ou autre composé non ammonique.

Lorsque la solution nutritive comprend l'urée, le second composé azoté est par exemple du sulfate, phosphate ou nitrate d'ammonium ou un amino-lipide, et tout particulièrement un amino-acide. Les proportions relatives des deux sortes de matières azotées peuvent varier largement, selon la nature de la flore microbienne du milieu où le procédé de l'invention est appliqué. Le plus souvent la proportion efficace de l'urée, exprimée en azote, est d'environ 50 à 99% de l'azote total, c'est-à-dire que celle de l'azote d'aminoacide représente 50 à 1 %. Dans certains milieux aqueux, il peut suffire d'environ 1 à 10% d'azote sous cette seconde forme, pour l'obtention d'excellents résultats.

Les amino-acides, avantageusement utilisables suivant la présente invention, peuvent être choisis parmi tous ceux que l'on trouve dans la nature, et parmi des acides aminés synthétiques. A titre d'exemples non limitatifs, on peut employer les glycine, alanine, sérine, cystéine, valine, glutamine, leucine, lysine, arginine, proline, tyrosine, acides aspartique et gluta-mique, etc. Pour des raisons économiques, il y a intérêt à utili5

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15

20

25

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65

5

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ser des matières issues de produits naturels, qui contiennent généralement des séries de plusieurs amino-acides; c'est le cas, par exemple, des vinasses de betteraves, des extraits provenant de la macération de diverses plantes, notamment de la rafle du maïs, de l'extrait de levure, des produits d'hydrolyse de protéines, des sous-produits de laiterie, etc.

L'invention conduit à cette constatation imprévue que, si une matière nutritive, azotée, seule donne de bons résultats, et s'il en est de même avec une autre matière azotée, seule, de nature chimique différente, la dégradation des hydrocarbures par les micro-organismes est encore meilleure, lorsque les deux matières sont utilisées conjointement, la concentration en azote assimilable, total, étant la même.

C'est ainsi que les microémulsions suivant l'invention permettent d'atteindre, par exemple, une dégradation de plus de 80% du pétrole brut, répandu sur de l'eau de mer, en 7 jours, lorsque la solution nutritive contient de l'urée ou des acides aminés; mais le même résultat est obtenu en 6 jours, si l'urée et les acides aminés sont présents conjointement dans la solution, la concentration de celle-ci en azote total étant la même que dans les deux cas précédents.

L'invention est illustrée par la série d'exemples non limitatifs qui suivent.

Exemples 1 à 11 Pour chacun des essais, on mélange un certain volume de solution aqueuse d'urée à 50% en poids avec un volume d'acide oléique, en présence d'une certaine quantité de tensioac-5 tifs constitués par un mélange d'esters phosphoriques d'alcools gras de C12 à Qg commercialisés par la Société Hoechst sous les noms de «Hostaphat». Dans certains de ces essais, on ajoute également du butyléther d'éthylène glycol pour abaisser la viscosité. On détermine le domaine des températures io dans lequel la microémulsion obtenue est stable.

Le tableau 1, à la page suivante, indique les compositions des microémulsions ainsi préparées, les domaines de stabilité de ces dernières et leur viscosité.

On peut voir qu'une excellente stabilité dans le domaine 15 de 0 °C à plus de 40 °C peut être obtenue suivant les exemples 4, 5,6,8,10 et 11. En ce qui concerne la viscosité, on constate que, sans adjonction de butyléther d'éthylène glycol, elle est très forte (exemples 1 et 2); par contre, cette adjonction la ramène à des valeurs très acceptables (exemples 3 à 11).

20

Tableau 1

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

Eau

11.1

11.7

13,8

14,4

18,3

20,1

20,9

21,9

19,2

20,2

19,2

Urée

11,1

11,7

13.8

14,4

18,3

20,1

20,9

17,2

15,8

16,6

15,7

Acide oléique

44,4

46,7

36,8

38,4

36,6

32,1

27,9

28

29,4

28

Butyl-éther d'éthylène glycol

0

10,6

9,8

10,7

11,6

14,4

17,5

16,2

10,5

Phosphate de lauryle (KL 340)

33,3

-

25

-

19,5

8,8

19,5

Phosphate d'oléyle (KO 380)

-

30

-

23

-

Phosphate d'alkyl phénol éthoxylé

-

16,1

15,9

-

8,8

-

Phosphate mono ammonique

—

2

—

% azote

5,2

5,45

6,44

6,72

—

7,4

_

Rapport azote/acide oléique

0,117

0,175

0,23

0,29

0,35

0,31

0,26

Rapport phosphore/azote

0,154

0,064

0,09

0,043

0,099

0,09

0,086

0,063

0,064

-

Domaine de stabilité °C

10-44

10-46

1-44

0-44

0-40

0-47

12-57

0-40

0-36

0 42

0-45

Viscosité en cps à 20 °C

1200

2000

167

265

203

197

141

98

61

-

Exemples 12 à 16

l'éthylène glycol, on a préparé trois microémulsions renfer-

Des microémulsions ont été préparées avec 33% de phos- 45 mant des proportions variables d'acide oléique. Voici les do-

phate de lauryle; le liquide lipomiscible est d'acide oléique dont la quantité est égale à deux fois la solution aqueuse d'urée et de phosphate. On a fait varier le pourcent d'urée dans la phase aqueuse. Les résultats ci-dessous donnent la températu-

maines de stabilité de ces produits.

Rapport pondéral solution d'urée/

re maximale à laquelle la microémulsion est encore stable. 50 acide oléique

% d'urée dans la phase aqueuse

22,2

25

33

50

56

Limite supérieure de température °C

36 32 38 35

Pas de microémulsion

0,5

0,625

0,75

Ces résultats montrent que des microémulsions pratiquement viables, stables jusqu'environ 36 °C, peuvent être obtenues avec des concentrations en urée allant jusqu'à 50%, mais non pas au-delà.

Exemples 17 à 19 Avec une solution aqueuse à 50% d'urée et l'addition de phosphate d'oléyle renfermant 30% de mono-éthyl-éther de

Tensioactif (Phosphate d'oléyle)

25,3 24,2 26,7

Domaine de stabilité

°C

0-65 0-59 0 gel-64

55

Il en résulte qu'au delà du rapport solution aqueuse/acide oléique d'enviro 0,65, et pour une quantité fixée de mono-éthyl-éther de l'éthylène glycol de 30%, la microémulsion est difficile à utiliser, puisqu'elle tend à se gélifier; par contre, au-60 dessous de ce rapport, on constate une excellente stabilité.

Dégradation des hydrocarbures du pétrole

Exemple 20

65 Dans un fermenteur de 50 litres, on introduit 301 d'eau de mer stérilisée à 120 °C pendant 2 heures. Sur la surface de cette eau de mer, on répand 30 ml de pétrole brut de 34° API, contenant 75% d'hydrocarbures saturés et 25% d'aromati-

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6

ques. La couche de pétrole a une épaisseur de 0,5 mm. Sur cette couche, on pulvérise 6 ml d'une des microémulsions des exemples précédents. Le milieu est ensuite ensemencé avec des germes provenant de l'eau de mer; ces germes sont obtenus par culture pendant 24 heures sur une solution aqueuse de glucose; ils contiennent en majeure partie des Pseudomonas.

Après cette inoculation, on effectue la numération des germes dans des prélèvements de pétrole: on trouve ainsi 2,5 x 103 à 4 x 104 germes par ml.

On procède alors à la culture aérobie, en agitant le contenu du fermenteur avec un agitateur tournant à 400 t/mn, pendant que 120 litres d'air stérilisé sont soufflés, par heure; cette aération correspond sensiblement à celle qui a lieu naturellement en mer.

Après 48 heures, une nouvelle numération est effectuée: ses résultats sont indiqués plus bas.

Après 7 jours, on détermine le taux de dégradation du pétrole, par extraction des hydrocarbures résiduels avec du CC14 et mesure à l'infrarouge.

Voici les résultats obtenus avec les microémulsions des exemples 1,2,3,10 et 11.

10

15

20

Dans chaque compartiment on a introduit 15,6 m3 d'eau de mer et 4 litres de pétrole susindiqué, soit une couche de 0,45 mm d'épaisseur sur la surface de l'eau.

Un des compartiments servait de témoin: l'eau et le pétrole, y contenus, étaient brassés comme dans les autres compartiments, mais ne recevaient aucun additif. A la fin des essais on déterminait les pertes de pétrole, dues aux causes naturelles, pour en tenir compte dans l'évaluation de la dégradation provoquée par les additions suivant l'invention.

Dans chacun des trois autres compartiments on a introduit 0,41 d'une microémulsion de solution nutritive, composée en poids % de:

uree eau douce butyl-glycol phosphate de lauryle acide oléique

17.0 20,8 10,8

21.1 30,3

Microémul- Germes au Germes après Tauxdedégra-sionde départ 48 heures dation après 7jours 25

Au début des essais la microflore de l'eau de mer du bassin comptait 102 germes/ml. Après 7 jours, on déterminait les quantités de pétrole disparu dans les compartiments; le tableau ci-après indique ces grandeurs en % de la quantité initiale, à deux températures différentes.

Témoin Exemple 23 Tém. Ex. 24

Ex. 1

2,5 xlO3

2,5 x 108

83%

12 °C 12 °C

OO

û

O

OO

0

n

2

2 xlO4

9,5 x 108

90%

3

1,5 xlO4

2,5 xlO8

90%

% de disparition

10

4,5 x 103

2,5 x 108

86%

30 due aux causes 5 5

17,5 17,5

11

1,5 x 103

7,5 xlO7

92%

naturelles

Exemple 21

On réalise un essai selon le mode opératoire décrit dans 35 l'exemple 20, mais on introduit dans le fermenteur une eau de mer non stérilisée, et le milieu n'est pas ensemencé par des bactéries supplémentaires.

Les résultats sont:

% dû au traitement suivant l'invention % total disparu

58 63

0 61,3 17,5 78,8

Microémulsion de n° 11

Germes au Germes après Taux de dégra-départ 48 heures dation après

7 jours

2xl03 5,5 xlO7

82%

40

45

Exemple22

On réalise un essai selon le mode opératoire de l'exemple 20, mais on remplace l'eau de mer par une eau naturelle, dans 50 laquelle on rajoute les différents constituants minéraux de l'eau de mer, ainsi que 30 ppm d'oligoéléments, notamment fer, magnésium, potassium. On pulvérise 6 ml de microémulsion n° 11 et on ensemence le milieu avec une culture de bactéries. 55

Après 7 jours on détermine le taux de dégradation du pétrole, par extraction des hydrocarbures résiduels avec du CC14 et mesure à l'infrarouge: ce taux est de 90%.

Exemples 23-24 «0

Des essais de biodégradation du pétrole brut d'Arabie sont effectués au bord de la mer, dans un bassin de 2 m de profondeur, divisé en 4 compartiments, chacun de 3 m x 3 m de section horizontale. Les compartiments peuvent être isolés ou reliés entre eux et tous sont susceptibles de recevoir de l'eau 65 de mer.

Un système à pompe, hydro-éjecteur, assure un léger brassage de l'eau, et le renouvellement de l'air dans le bassin.

Comme on voit, même à la température relativement basse de 12 °C, la biodégradation obtenue en 7 jours, par le traitement de l'invention, est remarquable; elle est obtenue, contrairement à la plupart des procédés connus, sans aucun apport de culture de microorganismes, avec la seule utilisation de ceux qui existaient dans l'eau de mer.

Exemple 25

Dans un fermenteur de 50 litres, on introduit 301 d'eau de mer. Sur la surface de cette eau, on répand 30 ml de pétrole brut de 34° API, contenant 75% d'hydrocarbures saturés et 25% d'aromatiques. Sur la couche de pétrole, ainsi formée, d'une épaisseur de 0,5 mm, on pulvérise 6 ml de micro-émul-sion ayant la composition pondérale suivante:

urée 17,3%

eau 21,5 butyl-éther-éthylèneglycol 10,8

phosphate de lauryle 23,7

acide oléique 26,7

(8,07% d'azote) 100,0

La numération des germes dans le pétrole indique la présence de 102 germes par ml.

On procède alors à la culture aérobie, en agitant le contenu du fermenteur avec un agitateur tournant à 400 t/mn, pendant que 120 litres d'air stérilisé sont soufflés, par heure; cette aération correspond sensiblement â celle qui a lieu naturellement en mer.

Après 48 h, une nouvelle numération est effectuée: elle-montre la présence de 2,5 x 108 germes/ml.

Après 7 jours, on détermine le taux de dégradation du pé-

troie, par extraction des hydrocarbures résiduels avec du CC14 et mesure à l'infrarouge: ce taux est de 83%.

Exemple 26

Des opérations identiques à celles de l'exemple 25 sont effectuées, mais dans la microémulsion une partie de l'urée est remplacée par l'amino-acide, DL valine. La composition pondérale de la microémulsion est:

uree

DL valine eau butyl-éther-éthylèneglycol phosphate de lauryle acide oléique

16,8%

2,0 20,5 10,8 23,7 26,2 100,0

(azote total, de l'urée et de la valine, 8,07%)

La numération des germes donne le nombre de 102 au début et 109 après 48 heures. Le taux de dégradation du pétrole est de 84% dès le 6ème jour.

La comparaison avec l'exemple 25 montre que l'adjonction d'acide aminé a permis d'atteindre 109 germes au lieu de 2,5 x 108 avec l'urée seule, après 48 heures; la dégradation du même ordre (84% contre 83%) a pu être obtenue plus rapidement, en 6 jours, alors qu'il fallait 7 jours dans le cas de l'urée seule.

Exemple 27

Suivant la technique des exemples 25 et 26, une micro-

7 653 362

émulsion fut utilisée, dans laquelle une partie de l'urée était remplacée par un extrait aqueux de rafle de maïs renfermant une série d'acides aminés, avec prédominance d'alanine, d'arginine, d'acide glutamique et de leucine; les autres amino-aci-5 des, présents en proportions moindres, étaient les proline, isoleucine, thréonine, valine, phénylalanine, méthionine et cystine. La teneur en azote total, dans cet extrait, était de 1 %. La microémulsion présentait la composition pondérale:

io urée 12,4%

extrait de rafle de maïs 18,7

butyl-éther-éthylèneglycol 19,2

phosphate de lauryle 29,1

acide oléique 20,6

15

L'eau de la phase aqueuse était celle de l'extrait aqueux. La teneur en azote total de la phase aqueuse ressortait à 6%.

En partant de 102 germes, on en a dénombré 4 x 109 après 48 heures, et le taux de dégradation du pétrole a atteint 88% 20 après 6 jours.

La comparaison de ces résultats avec ceux de l'exemple 25 prouve l'intérêt de l'adjonction des acides aminés à l'urée.

25 Exemples 28 à 37

Dans cette série d'essais analogues à l'exemple 27, le phosphate de lauryle est remplacé par du phosphate d'oléyle et l'acide oléique par les différents liquides indiqués au tableau suivant, qui donne les taux de dégradation du pétrole, obtenus 30 en 6 jours.

Exemple

Liquide hydrophobe utilisé

Dé

n°

%

28

Huile d'arachide

88

29

do. de colza

82

30

do. de suif

86

31

Mélange des acides gras du coprah

avec 10% d'huile de vaseline

85

32

Acide laurique liquéfié par 10%

de pétrole brut

84

33

Caproate de butyle

85

34

Laurate d'éthyle

87

35

Oléate de méthyle

86

36

Stéarate d'amyle

88

37

Gasoil avec 10% d'huile de sésame

83

Des résultats semblables sont obtenus avec un mélange de mono-, di et tri(alkyltétraglycoléther)-o-phosphates d'alkyles en C12 à C14, connus dans le commerce sous la dénomination «HOSTAPHAT KL 340 N», à la place du phosphate d'oléyle.

C

Claims

653 362

1. Procédé de culture de microorganismes dans un milieu hydrophobe, avec l'emploi de substances nutritives en solution aqueuse, caractérisé en ce que cette solution est micro-émulsionnée dans un liquide non miscible à l'eau, mais miscible avec le milieu hydrophobe, et la microémulsion, ainsi formée, est introduite dans ledit milieu contenant des germes des microorganismes à cultiver.

2. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel la solution nutritive contient des composés hydrosolubles de l'azote et des composés hydrosolubles du phosphore, caractérisé en ce qu'on choisit, pour le liquide non miscible à l'eau, un liquide lipomiscible, renfermant des composés du carbone assimilables par les microorganismes concernés.

2

REVENDICATIONS

3. Procédé suivant une des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que la solution aqueuse, qui forme la phase interne de la microémulsion, contient deux sortes chimiquement différentes de composés azotés assimilables par des microorganismes.

4. Procédé suivant une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la solution aqueuse, qui forme la phase interne de la microémulsion, contient de l'urée et un phosphate d'al-kyle ou d'alkényle, tandis que la phase externe est constituée par un ou plusieurs esters, acides ou/et alcools gras.

5. Procédé suivant une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la solution aqueuse, qui forme la phase interne de la microémulsion, contient 11 à 150 parties en poids d'urée pour 100 parties d'eau.

6. Procédé suivant la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que la solution aqueuse d'urée renferme un ou plusieurs acides aminés.

7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que la proportion d'acide aminé est de 1 à 10 parties en poids pour 99 à 90 parties d'urée.

8. Procédé suivant une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le milieu hydrophobe est constitué par des hydrocarbures recouvrant un plan d'eau ou de sol, les microorganismes cultivés étant capables de dégrader ces hydrocarbures.

9. Procédé suivant une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la microémulsion se compose, en poids, de 10 à 30% d'eau, 4 à 10% d'azote assimilable sous la forme de composés azotés, 5 à 35% d'un phosphate d'alkyle ou d'alkényle en C10 à CI8 ou d'un phosphate d'alkyl-phénol éthoxylé, 0 à 20% d'un alkyl-éther d'alkylène-glycol et 20 à 50% d'un ester, acide ou/et alcool gras.

10. Substances nutritives en solution aqueuse, destinées à être ajoutées à un milieu hydrophobe en vue de la culture de microorganismes dans ce milieu pour mettre en œuvre le procédé suivant la revendication 1, caractérisées en ce qu'elles sont sous la forme d'une microémulsion dont la phase interne est formée par une solution aqueuse renfermant des composés assimilables de l'azote et du phosphore, tandis que la phase externe est un liquide organique lipomiscible, non miscible à l'eau.

11. Substances suivant la revendication 10, destinées à la dégradation d'hydrocarbures par des microorganismes, caractérisées en ce que la solution aqueuse, formant la phase interne de la microémulsion renferme de l'urée et un composé tensioactif du phosphore, le liquide organique de la phase externe étant un ester gras, un acide ou/et un alcool gras, ou un mélange d'un tel ester, acide ou/et alcool avec des hydrocarbures liquides.

12. Substances suivant la revendication 11, caractérisées en ce que la microémulsion se compose, en poids, de 10 à 30% d'eau, 4 à 10% d'azote assimilable dont 50 à 99% est sous la forme de l'urée et 50 à 1 % sous celle d'acide aminé, 5 à 35% d'un phosphate d'alkyle ou d'alkényle en C]0 à C18 ou d'un phosphate d'alkyl-phénol éthoxylé, 0 à 20% d'un alkyl-éther d'alkylène-glycol et 20 à 50% d'un corps gras ou d'un corps gras mélangé avec des hydrocarbures liquides.

Des opérations industrielles, mettant en œuvre des cultures de divers microorganismes, surtout bactéries et champignons, sont très courantes à l'heure actuelle. Nombreuses industries alimentaires, fabrications de médicaments, épurations, etc. sont basées sur de telles opérations. Le plus souvent, le travail comporte deux temps: d'abord a lieu la culture du microorganisme concerné, dans un milieu nutritif approprié, jusqu'à la croissance d'une population suffisamment nombreuse; dans la seconde étape, cette population est mise au contact des matières que l'on veut soumettre à l'action des microorganismes. Les opérations en cuve ne comportent pas de difficultés spéciales à ce point de vue, la culture préalable, c'est-à-dire la multiplication, étant effectuée - selon les cas -dans une enceinte séparée ou dans la même cuve où a lieu la seconde phase opératoire. Par contre, lorsque les opérations sont réalisées dans la nature, sur des grandes surfaces de sol ou d'eau, comme c'est par exemple le cas dans l'élimination de nappes d'hydrocarbures par dégradation microbiologique en mer, sur des plages, sur des cours d'eau ou des lacs, la multiplication préalable des microorganismes utiles présente des difficultés. On doit, en effet, fournir à la culture des matières nutritives, c'est-à-dire des sources de C, N et P, ainsi que des oligoéléments, pour assurer la croissance des organismes en question; or les sources classiques, telles qu'hydrates de carbone, nitrates ou sels ammoniacaux et phosphates sont solu-bles dans l'eau, ils ne peuvent donc pas demeurer dans la couche superficielle de l'étendue à traiter, où doit avoir lieu une forte croissance des microorganismes utiles; ces substances diffusent dans l'eau ou le sol sous-jacent et sont ainsi soustraites à la culture.

Pour y remédier, on a appliqué, jusqu'à présent, différentes méthodes. Une d'entre elles consiste à enrober de paraffine des grains de composé azoté et de phosphate solides, pour les offrir sous cette forme aux microorganismes, comme indiqué dans le brevet US 1 959 127. Dans une variante, selon le brevet US 3 883 397, l'enrobage lipophile est un sel d'acide gras, à la place de la paraffine. Mais ces méthodes ne permettent pas aux microorganismes d'avoir rapidement à leur disposition la nourriture voulue; la matière grasse d'enrobage est difficile à percer, c'est-à-dire à dégrader, en l'absence d'azote et de phosphore extérieurs. Aussi l'action des bactéries ou des champignons est-elle lente et demande des semaines ou des mois. Une autre solution proposée consiste à utiliser, en tant que sources de N et P, des composés insolubles dans l'eau, mais solubles dans les hydrocarbures, notamment des phos-pho-amino-lipides, comme décrit dans la publication française n° 2 172 796 de brevet; mais les composés azotés solubles dans l'huile ont en général une assez faible teneur en azote, et dans ces conditions, la dégradation biologique des hydrocarbures du pétrole, en mer, demande 2 à 3 mois. On a également indiqué, dans la publication française n° 2 230 401, l'emploi d'amides, de sels organiques d'ammonium et de phospho-amino-lipides en solution dans un solvant pétrolier, la solution étant mise en émulsion dans l'eau; l'émulsion obtenue est pulvérisée sur une nappe d'hydrocarbure flottant sur l'eau, en vue de la biodégradation de la nappe. Cette méthode exige des fortes proportions d'émulsion aqueuse et le résultat n'est acquis qu'après plusieurs semaines.